专利名称：辐照交联异种皮脱细胞基质制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明属于医学用生物皮制品领域，具体地说属于生物皮脱细胞网状支架领域。
背景技术：
生物材料在治疗大面积烧烫伤患者中具有重要作用。近年来，国内外皮肤专家一直 在寻求良好的创面修复覆盖材料，以消除抗原性和排异反应为目的，制作异种皮冷冻保 存，永久性皮肤创面替代材料是当前急需的新技术。为提高抢救大面积烧伤病人的疗效， 具有广阔的前景。
在中国专利CN1266716A中公开了一种交联型猪脱细胞皮片。采用0.25%的胰蛋白 酶在4'C下，浸泡16-24小时脱细胞，然后揭去表皮。之所以要这么长时间是因为在4 'C下胰蛋白酶脱细胞水平极低，即使是这么长时间，也达不到完全脱除的目的。另外， 表皮覆盖在真皮上，阻止了胰蛋白酶对真皮细胞的浸入，也对脱细胞不利。
在中国专利CN1522766A中公开了 一种脱细胞真皮基质的制备方法，采用 0.04~0.06%的胰蛋白酶在2~4'。下，浸泡16~20小时脱细胞，然后揭去表皮；再次浸入 0.04~0.06%的胰蛋白酶在36.8~37.2°(:下消化30~60分钟，之后预冷，在-70~-80冷冻和 37 39'C融化的冻融，反复冻融3次，治如含抗生素的磷酸盐缓冲液中保存。该方法的 缺点是 一、如此低浓度的胰蛋白酶在此温度下脱细胞不完全；二、反复冻融会损伤支 架结构的柔软性和随意性。
在中国专利CN1268401C中公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，也是将带 有表皮的皮片加酶涂覆剂后放置长达18-50小时，脱细胞后再将表皮与真皮分离。最后 采用剂量为6 30KGry/h600)所产生的Y射线辐照灭菌。由于表皮覆盖在真皮上，阻止 了胰蛋白酶对真皮细胞的浸入，对脱细胞不利。另外，采用^Co为放射源，即使装源 50万居里，要想以6~30KGry/h的放射剂量满足对生物皮制剂的灭菌要求，需时长达 15小时以上，在实际生产中会造成极大的不便。
在中国专利CN1732867A中公开了一种真皮面脱细胞、去抗原的敷料皮，是指对真 皮部分进行脱细胞、去抗原的处理，而完整地保留了表皮的结构。严格地说，这不能算 作猪皮脱细胞网状支架。
在中国专利CN1775189A中公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法，提出的用氢 氧化钠和去污剂脱细胞的方案；该方案脱细胞的机理不明。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种辐照无菌异种皮基质制备方法及其 产品。
辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括
1、 取皮，用5%碘伏浸泡10~30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪，用纯净水清洗，甩 干至含水量15~25%之间；
2、 上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3~0.8mm， (0.5mm ±0. 04mm最佳)
3、 脱细胞
一脱上述真皮部分首先用1~15%的氯化钠水溶液浸泡30分钟后用纯净水清 洗；然后用10~20%的胰蛋白酶在36-40。C下，浸泡30~50分钟后用纯净水清洗； 使细胞核与细胞壁分离后，用36 4(TC生理盐水清洗2 4次甩干，再用纯净水清洗
32~4次甩干，沥水30分。
一脱后脱去80%以上组织细胞，只留残余细胞核与细胞碎片； 二脱将上述沥水后含水量在10-30% (25%最佳)的皮片，再用10~20%的 脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、10~30%的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36~40 'C下，每次浸泡20~40分钟；各浸泡2~4次后，使细胞核与细胞碎片与细胞床完全 分离；再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5~1.5%， 36 40'C下再次浸泡5~30分钟， 使成纤维细胞与细胞床壁分离。
4、 除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质将前述处理后的材料用PH值 7.5 8. 5的纯水清洗甩干；采用常规固定剂，如福尔马林20%， 25 36。C下，浸 泡50~120分钟；
5、 中间体检验(显微镜下看)
物理性能——乳白色、有弹性、弯曲不断裂、微网状； 组织学结构与正常人体真皮内的细胞外基质结构相同的真皮结构组织； 细菌和异菌检验无菌 6、辐照灭菌经过电子加速器或Co-60进行Y射线辐照灭菌。辐照剂量150万~400
万拉德。照射时间60~180秒，(120秒最佳)，使产品成细网结构。放置皮片的吊具与
放射源以20~60度角接触，距离10公分。
图1是本发明制备方法制得的产品；
图2是实施例1患者术后半年愈合效果图3是实施例2患者术后半年愈合效果图。
具体实施例方式
1、 取皮，引用标准GB16548-1996，猪皮表面无瘢痕，无硬皮，柔软有弹性。 取2 4个月白皮白毛猪皮背部，用5%碘伏浸泡10~30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪； 用纯净水清洗，甩干至含水量15~25%之间；放置手术台上进行裁剪与机器刀架相适合
(大小在350~600m之间)后进入下道工序；
去脂脱脂，先将手工去脂的全皮放入36 37t:温水中加入5%洗涤剂(如白猫洗洁 精)浸泡10-20分钟，手工轻揉，将真皮底层油脂去掉后再用同温度清水冲洗10分钟， 手感皮片涩感。
手工拔毛，将上述浸泡后的皮片上的毛连同毛囊一起拔出后，放入36 37'C温水中， 加入10%洗涤剂(如白猫洗洁精)浸泡10~20分钟，手工轻揉，将真皮底层油脂去掉后 再用同温度清水冲洗10分钟，手感皮片涩感。使皮片囊孔中的皮屑一起清除掉。
2、 上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.34.8mm，(最 佳厚度0.5 111111±0.04 111111)，注意保留基底膜的完整性。将去脂去毛后的猪皮固定在鼓 式切皮机的鼓轮上，将皮片完全贴敷在鼓轮上，并用力加压至使皮片绷紧。用切皮机切 皮，分离表皮，留下真皮厚度0.3mm~0.8mm。用机器切皮比通常用手工撕皮的好处是: 可以更加彻底地准确地清除干净表皮上层细胞和胶原蛋白质。
3、 脱细胞
一脱上述真皮部分首先用1 15%的氯化钠水溶液浸泡30分钟后用纯净水清 洗；然后用10~20%的胰蛋白酶在36~401:下，浸泡30~50分钟后用纯净水清洗； 使细胞核与细胞壁分离后，用36-40。C生理盐水清洗2 4次甩干，再用纯净水清洗 2 4次甩干，沥水30分。
4一脱后脱去80%以上组织细胞，只留残余细胞核与细胞碎片；
二脱将上述沥水后含水量在10~30% (25%)的皮片，再用10~20%的脱氧 核糖核酸酶(DNA酶)、10~30%的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36~40°C 下，每次浸泡20~40分钟；各浸泡2~4次后，使细胞核与细胞碎片与细胞床完全分 离；再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5~1.5%， 36~40°0下再次浸泡5~30分钟， 使成纤维细胞与细胞床壁分离。
4、 除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质将前述处理后的材料用PH值 7.5 8.5的注射用水清洗甩干；采用常规固定剂，如碘伏0.1%，在36'C下，浸泡 50~120分钟；将脱细胞后的皮片定型。
定尺在无菌室内操作，将己甩干的脱细胞真皮用无菌刀裁剪成临床应用尺寸。 压平、进行测量中间体检验、包装、封口、速冻。
5、 中间体检验内容(肉眼或显微镜下) 物理性能——乳白色、有弹性、弯曲不断裂、微网状；
组织学结构与正常人体真皮内的细胞外基质结构相同的真皮结构组织； 无菌1t验；细菌数为零 6、辐照灭菌经过电子加速器或Co-60进行Y射线辐照灭菌。辐照剂量150万 ~400万拉德。照射时间60~180秒，(120秒最佳)，使产品成细网结构。放置皮片的吊 具与放射源以20~60度角接触，距离10公分。 产品质量符合国家质量标准。 参见附图1，依上述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质，在高倍显微镜下观 察，其大体形态及组织学变化结果该异种皮脱细胞基质无细胞成分，胶原纤维排列有 序，基底膜结构完整。
参见附图2，实施例l
患者为男性，49岁，火焰烧伤，烧伤总面积79%，左腿部深度烧伤；采用托细胞 猪真皮移植，网状爬皮均匀，3~4周后愈合；治疗半年后伤口凭证无疤痕。 参见附图3，实施例2
患者为女性，67岁，糖尿病史10年；烧伤发生3个月后，创面被葡萄球菌感染。 移植自体微粒皮后覆盖猪皮真皮脱细胞支架后，创面4周愈合。 临床试验
采用去细胞异体真皮或以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质加自 体刃厚皮移植的方法，修复各种创面119例，比较各种创面的植皮成活率，观察应用不 同部位的皮肤覆盖、去细胞异体真皮或以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞 基质与植皮成活的关系，并对部分病例进行了组织学观察和随访。结果削痂、切痂和 切瘢创面植皮成活率分别为(93.4±4.8) %， (92.1 ±4.6) %和(94.5±3.8) %，三者间 差异无显著意义。结论以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质加自体刃 厚皮移植修复深度烧伤创面或切瘢后创面不失为一种较为理想的材料。
权利要求
1、辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括以下步骤a、取皮，用5％碘伏浸泡10～30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪，用纯净水清洗，甩干至含水量15～25％之间；其特征在于b、上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3～0.8±0.04mm；c、. 脱细胞一脱上述真皮部分首先用1~15％的氯化钠水溶液浸泡30分钟后用纯净水清洗；然后用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分钟后用纯净水清洗；使细胞核与细胞壁分离后，用36～40℃生理盐水清洗2~4次甩干，再用纯净水清洗2~4次甩干，沥水30分；二脱将上述沥水后含水量在10～30％的皮片，最佳含水量25％，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，每次浸泡20～40分钟；各浸泡2～4次后，再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟；d、. 除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质将前述处理后的材料用PH值7.5~8.5的纯水清洗甩干；采用常规固定剂在25～36℃下，浸泡50～120分钟；e、辐照灭菌经过电子加速器或Co-60进行γ射线辐照灭菌；辐照剂量150万～400万拉德；照射时间60～180秒。
2、 根据权利要求l所述的辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，其特征在于所 述的保留基底膜的真皮部分厚度为0.5mm±0. 04mm最佳。
3、 根据权利要求1所述的辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，其特征在于所 述的辐照灭菌放置皮片的吊具与放射源以20-60度角接触，距离10公分。
4、 一种辐照无菌异种皮脱细胞基质，其特征在于所述的辐照无菌异种皮脱细胞 基质是采用权利要求1~3的方法制得。
全文摘要
本发明属于医学用生物皮制品领域。辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括取皮；上机切皮，真皮、表皮分离，脱细胞一脱用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分钟后用纯净水清洗；二脱将上述沥水后含水量在10～30％的皮片，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，各浸泡2～4次后，再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟，除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质；将前述处理后的材料采用常规固定剂，浸泡50～120分钟；辐照灭菌经过电子加速器或Co-60进行γ射线辐照灭菌。
文档编号A61L27/00GK101468213SQ200710060519
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者翔 郭 申请人:翔 郭