肾茶抗泌尿系统结石提取物及其制备方法

专利名称：肾茶抗泌尿系统结石提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中草药的提取物与应用技术领域，尤其涉及肾茶抗泌尿系统结石提取物及其制备方法。
背景技术：
肾结石、膀胱结石、尿路结石等是泌尿系统的常见病，文献报道欧洲为5％～9％，加拿大为12％，美国为13％左右，我国发病率9％～15％左右，广东地区泌尿结石的发病率高达20％。发病随年龄增加，危险性也增大。气候较热的地区、嗜食动物蛋白人群，尤其是男性30～50岁的青、中年，发病率较高，男女之比为2～3∶1。近年的流行病学调查，其发病率呈上升趋势，尤其中青年增加更明显，严重影响了人们的健康。
目前泌尿系结石，尤其是肾结石治疗主要运用体外冲击波碎石术(ESWL)和腔内泌尿外科手术，常引起肾脏的损伤和严重的并发症，可使肾组织退行性病变，产生肾小球玻璃样变和纤维化，间质充血，炎症细胞浸润，且ESWL及手术治疗都难以根治肾结石，其术后复发率高约78％～80％。如何采用药物无创排除结石、并防止结石的形成和复发，是近代医学领域的重点研究课题。而我国的传统中医药资源为泌尿系药物排石、预防结石形成和复发开辟了广阔的前景。
肾茶为唇形科肾茶属Clerodendranthus植物肾茶C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li，又名猫须草。为多年生草本；茎直立，高0.5～1m，四棱形；叶对生，菱状卵形或卵状披针形，长3～10cm，宽1.5cm～5cm，叶缘具粗大牙齿，两面被毛，具腺点，叶柄长达1.2cm；轮伞花序4～8朵排成顶生总状花序，花唇形，花冠淡紫或白色，雄蕊4枚，2长2短，花丝超出花冠2～4cm；小坚果卵形，具皱纹；花果期5～10月。气淡，味微甘，稍苦。肾荼喜欢温暖湿润的气候，原产地年平均气温19.6～23.8℃，年降雨量1157.6～2103mm，生长适宜温度为26～30℃。
肾茶全世界约有五种，广泛分布于印度东部、泰国、印度尼西亚与澳大利亚等地。在印尼民间肾茶作为一种治疗糖尿病、高血压、风湿病、扁桃体炎、月经不调等的有效药物；在越南肾茶地上部分被用于治疗泌尿系结石、浮肿、急性发热、流感、肝炎和黄疸等；在缅甸肾茶被认为是一种抗糖尿病药，干叶的水煎剂用于治疗尿道和肾脏疾病；在日本冲绳，肾茶被称作爪哇茶可促进身体解毒。我国仅有一种即肾茶[C.spicatus(Thunb).C.Y.Wu ex H.W.Li]，主产于广西、广东、云南、福建、台湾等地。我国民间使用肾茶历史悠久，在西双版纳，傣医药名称“雅娜妙”。全草入药，认为有利尿、抗菌、消炎、溶石、排石等作用，常用于急、慢性肾炎、膀胱炎、尿路结石、咽炎及风湿性关节炎。从临床文献和民间用药跟踪调查，肾茶能预防和降低肾结石复发，促进尿路结石排出，改善病人的生活质量。
目前已从肾茶的地上部分提取出14个黄酮类化合物，12个黄酮苷元，2个为黄酮醇苷。8个酚酸类成分，即咖啡酸、咖啡酸的二聚体迷迭香酸、咖啡酸与酒石酸的缩合物caffeoyl tartrate及dicaffeoyl tartrate和四个咖啡酸四聚物。此外还有泽兰黄素、琥珀酸、苯甲酸、乳酸、胡萝卜苷、熊果酸、葡萄糖、戊糖、油脂、酒石酸、柠檬烯、龙脑、麝香草酚、消旋肌醇和一个香豆素等成分。
肾茶一直以来作为民间用药，用途广泛，其利尿、排石方面有显著的功效，受到人们的广泛关注，医药界也对其进行了一定的研究。泰国的Premgamone等对肾茶进行了长达18个月的临床研究表明肾茶治疗肾结石的效果优于枸橼酸钾钠。黄荣桂等临床研究证明肾茶对泌尿系感染、治疗尿路结石有较好疗效。近年来国内外对肾茶的化学成分及其生物活性的研究主要集中在抗肿瘤、抗菌消炎、利尿和补肾的作用表面上，而对其在泌尿系的利尿、排石、消炎等具体作用上究竟是什么活性化学成分起主导作用、其作用的机理是什么等了解甚少。为了加深肾茶在排泌尿系结石方面的开发应用，我们对肾茶与抗泌尿系结石有关的3种提取物的作用、作用机理作了深入的研究。

发明内容本发明的目的，是针对目前肾茶在抗泌尿系结石利用上存在不明其有效主导成份是什么及其作用机理的缺陷，在探明肾茶提取物中与泌尿系的结石、尿少、尿路感染和结石对脏器的损伤等症状有关物质的作用效果及其机理基础上，提出3种分别对泌尿系的抗结石、排石、利尿、消炎、抗氧化损伤等有效，可直接、复合或作为中间产品可进一步开发成药用产品的肾茶活性提取物；本发明的另一目的是提出这3种肾茶活性提取物的具体制备方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现(一)肾茶提取物A组分，可按以下方法制得(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质成分后，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得黑褐色粘稠状的肾茶提取物A组分。
肾茶提取物A组分，经过鉴定分析为脂溶性的黄酮甙元类化合物。
肾茶提取物A组分，具有明显改善结石症状，减少肾脏组织中钙和草酸的含量，减轻肾脏组织病变程度，减少结石量；增加肾结石者的尿量，尤其在0～4h时的作用点尿量增加较显著；增加膀胱平滑肌收缩幅度，加快节律，松驰输尿管、尿道平滑肌，有助于对泌尿系结石的排出；消炎；在一定程度上降低肾结石肾组织LPO含量，改善对肾组织的损伤等作用，可直接、复合或作为中间体进一步分离提取出药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿和消炎等的药物。
所述肾茶提取物A组分的制备方法，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质成分后，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得肾茶提取物A组分产品。
(二)肾茶提取物B组分，可按以下方法制得(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3-5次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得浅褐色粘稠状的肾茶提取物B组分。
肾茶提取物B组分，经过鉴定分析为脂溶性的黄酮醇甙类化合物。
肾茶提取物B组分，具有明显改善结石症状，减少肾脏组织中钙和草酸的含量，减轻肾脏组织病变程度，减少结石量；增加肾结石者的尿量；增加膀胱平滑肌收缩幅度，加快节律，松驰输尿管、尿道平滑肌，有助于对泌尿系结石的排出；消炎；在一定程度上降低肾结石肾组织LPO含量，改善对肾组织的损伤等作用，可直接、复合或作为中间体进一步分离出提取药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿、消炎等的药物。
所述肾茶提取物B组分的制备方法，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3-5次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得肾茶提取物B组分产品。
(三)肾茶提取物C组分，可按以下方法制备获得(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，浸泡2-3周后，滤去甲醇溶液至充分挥发干燥，备用；
(2)将步骤(1)处理后肾茶，用水浸没后煮3-4次，每次4小时，合并水煮液、浓缩；(3)将步骤(2)浓缩液，分别用浓度为65％、75％、85％、95％的乙醇进行分级沉降，收集后得黑色粘稠状的肾茶提取物C组分。
肾茶提取物C组分，经过鉴定分析为多糖类化合物。
肾茶提取物C组分，具有明显改善结石症状，减少肾脏组织中钙和草酸的含量，减轻肾脏组织病变程度，减少结石量；可延长利尿的时间，明显增加肾结石者的尿量；增加膀胱平滑肌收缩幅度，加快节律，松驰输尿管、尿道平滑肌，有助于对泌尿系结石的排出；明显降低肾结石肾组织LPO含量，改善对肾组织的损伤等作用，可直接、复合或作为中间体进一步分离提取出药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿、抗肾结石损伤等的药物。
所述肾茶提取物C组分的制备方法，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，浸泡2-3周后，滤去甲醇溶液至充分挥发干燥，备用；(2)将步骤(1)处理后肾茶，用水浸没后煮3-4次，每次4小时，合并水煮液、浓缩；(3)将步骤(2)浓缩液，分别用浓度为65％、75％、85％、95％的乙醇进行分级沉降，收集后得肾茶提取物C组分产品。
本发明的有益效果是一、肾茶提取物A组分，通过动物试验明确[1]在草酸钙肾结石模型试验中，结石小鼠、大鼠在体重减轻，肾体比增加等的症状较对照得到明显改善(见表1、表4、表5)；肾脏组织中钙和草酸的含量较对照明显减少(表2、表6)；肾结石小鼠、大鼠肾脏组织病变程度，肾组织草酸钙结石评分较对照明显减轻(表3、表7)；上述肾组织中草酸和钙含量的测定与肾组织病理切片观察的结果相一致，表明肾茶提取物A组分具有抗肾结石的作用。[2]在对鼠尿量试验中，肾茶A组分对正常小鼠在0～4h时的作用点尿量增加较显著，具有明显的统计学意义(P＜0.01)；而对肾结石小鼠的尿量有增加，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表9)；此外，肾茶提取物A组分可明显增加肾结石大鼠的尿量，与模型组比较具有统计学意义(P＜0.05)(见表10)。[3]在对动物泌尿系平滑肌的试验中，肾茶A组分对豚鼠、新西兰兔膀胱平滑肌有增加收缩幅度，加快节律的作用；而对输尿管、尿道平滑肌均有松驰作用(见图1、图2、图3)，这有助于对泌尿系结石的排出。[4]在对小鼠二甲苯致耳炎的抗炎试验中，与对照组比较，肾茶A组分与消炎痛组一样对耳炎肿胀度降低有明显的统计学意义(P＜0.01)(见表11)，具较好的消炎作用。[5]在对肾结石小鼠抗过氧化脂质的试验中，小鼠形成肾结石后，肾组织LPO含量明显上升，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，肾茶A组分和排石颗粒组一样可使肾结石小鼠的肾组织LPO含量下降，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表12)。因此，肾茶A组分可直接、复合或作为中间体进一步分离提取出药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿和消炎等的药物。
二、肾茶提取物B组分，通过动物试验明确[1]在草酸钙肾结石模型试验中，结石小鼠、大鼠在体重减轻，肾体比增加等的症状较对照得到明显改善(见表1、表4、表5)；肾脏组织中钙和草酸的含量较对照明显减少(表2、表6)；肾结石小鼠、大鼠肾脏组织病变程度，肾组织草酸钙结石评分较对照明显减轻(见表3、表7)；上述肾组织中草酸和钙含量的测定与肾组织病理切片观察的结果相一致，表明肾茶提取物B组分具抗肾结石作用。[2]在对鼠尿量试验中，小鼠形成肾结石后，尿量明显下降，肾茶B组分可增加肾结石小鼠的尿量，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表9)；肾茶B组分可明显增加肾结石大鼠的尿量，与模型组比较具有统计学意义(P＜0.05)(见表10)。[3]在对动物泌尿系平滑肌的试验中，肾茶B组分对豚鼠、新西兰兔膀胱平滑肌有增加收缩幅度，加快节律的作用；对输尿管、尿道平滑肌均有松驰作用(见图1、图2、图3)，这有助于对泌尿系结石的排出。[4]在对小鼠二甲苯致耳炎的抗炎试验中，对照组小鼠二甲苯致炎后右耳明显肿胀，而肾茶B组分与消炎痛组一样对耳炎肿胀度降低有明显的统计学意义(P＜0.01)(见表11)，具较好的消炎作用。[5]在对肾结石小鼠抗过氧化脂质的试验中，小鼠形成肾结石后，肾组织LPO含量明显上升，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)；肾茶B组分与排石颗粒组一样可使肾结石小鼠的肾组织LPO含量下降，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表12)。因此，肾茶B组分可直接、复合或作为中间体进一步分离提取出药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿、消炎等的药物。
三、肾茶提取物C组分，通过动物试验明确[1]在草酸钙肾结石模型试验中，结石小鼠、大鼠在体重减轻，肾体比增加等的症状较对照得到明显改善(见表1、表4、表5)；肾脏组织中钙和草酸的含量较对照明显减少(见表2、表6)；肾结石小鼠、大鼠肾脏组织病变程度，肾组织草酸钙结石评分较对照明显减轻(见表3、表7)；上述肾组织中草酸和钙含量的测定与肾组织病理切片观察的结果相一致，表明肾茶提取物C组分具抗肾结石作用。[2]在对鼠尿量试验中，小鼠形成肾结石后，尿量明显下降，肾茶C组分可增加肾结石小鼠的尿量，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表9)；但肾茶C组分可明显增加肾结石大鼠的尿量，其作用时间较长，可持续24小时有效(见表10)，具有较好的利尿作用。[3]在对动物泌尿系平滑肌的试验中，肾茶C组分对豚鼠、新西兰兔膀胱平滑肌均有增加收缩幅度，加快节律的作用；对输尿管、尿道平滑肌均有松驰作用(见图1、图2、图3)，这有助于对泌尿系结石的排出。[4]在对小鼠二甲苯致耳炎的抗炎试验中，对照组小鼠二甲苯致炎后右耳明显肿胀，肾茶C组分小鼠的耳廓肿胀度有所下降，但不明显，与对照组比较无统计学意义(P＞0.05)(见表11)。[5]在对肾结石小鼠抗过氧化脂质的试验中，小鼠形成肾结石后，肾组织LPO含量明显上升，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，肾茶C组分与排石颗粒组一样可使肾结石小鼠的肾组织LPO含量明显下降，与模型组比较具有统计学意义(P＜0.05)(见表12)，对肾结石抗过氧化脂质具较好的作用。因此，肾茶C组分可直接、复合或作为中间体进一步分离提取出药用有效活性成份，用于泌尿系抗结石、排石、利尿、抗肾结石损伤等的药物。
四、肾茶提取物A、B、C组分仅是单一提取物，可根据不同需求从中选择单独使用或以不同的组合入药来治疗和消除泌尿系的结石症状，如抗结石、排石、利尿、抗炎、抗损伤等。

图1肾茶提取物A、B、C组分对豚鼠膀胱平滑肌的作用曲线图；图2肾茶提取物A、B、C组分对豚鼠输尿管平滑肌的作用曲线图；图3肾茶提取物A、B、C组分对豚鼠尿道平滑肌的作用曲线图。
具体实施方式通过以下实施例和试验例对本发明作进一步详细说明，但这并不是对本发明的具体限定。
与以下实施例有关的材料、设备等作说明如下肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]溶解液水与甲醇按1∶5～12体积混合而成石油醚批号20030610，浙江巨化集团公司试剂厂生产乙酸乙酯批号20031009，浙江巨化集团公司试剂厂生产正丁醇批号20021217，浙江巨化集团公司试剂厂生产甲醇批号20021201，浙江巨化集团公司试剂厂生产乙醇(95％)批号2003042012，安徽特酒总厂生产柱层析硅胶青岛海洋化工厂生产旋转蒸发仪R203B型，上海申生科技有限公司生产辅剂车前子、沉香、白芍、鸡内金均购自温州中药店，经鉴定分别为Plantago asiatica L.(车前子)、Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg(沉香)、Paeonialactiflora Pall.(白芍)、Gallus gallus domesticus Brisson(鸡内金)。
浓缩包括涉及的浸提液、萃取液和水煮液，均采用在40-60℃水温控制下减压使水分充分蒸馏进行浓缩(特别说明除外)。
实施例1(肾茶提取物A组分的制备1)所述肾茶提取物A组分的制备，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶4的比例，共浸泡3次，每次10天，合并浸提液在60℃水温控制下减压蒸馏浓缩后，得浸膏混合物；(2)将步骤(1)浸膏混合物与水-甲醇按1∶5体积混合的溶解液按重量(g)∶体积(ml)＝1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚萃取4次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质成分，再用乙酸乙酯萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并在60℃水温控制下减压蒸馏浓缩后得黑褐色粘稠状的肾茶提取物A组分。
实施例2(肾茶提取物A组分的制备2)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶7的比例浸泡；合并浸提液在50℃水温控制下减压蒸馏浓缩；水-甲醇按1∶9体积混合成溶解液；层析、洗脱、收集液在50℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例1。
实施例3(肾茶提取物A组分的制备3)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶10的比例浸泡；合并浸提液在40℃水温控制下减压蒸馏浓缩；水-甲醇按1∶12体积混合成溶解液；层析、洗脱、收集液在40℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例1。
实施例4(肾茶消石汤A)将车前子30克、沉香3克、白芍10克、鸡内金15克，加水1000ml浸泡半小时，煎煮15分钟倒出煎剂，同法再煎煮1次，合并两次煎剂，用无菌水补足至1200ml后，加入实施例1、2或3所制备的肾茶提取物A组分1克，搅拌至溶解后即成肾茶消石汤A。每日1剂，服药后20分钟进行跳跃运动15分钟，并尽量多饮水、多排尿，三个月为一疗程，具抗结石、排石溶石、利尿、消炎止痛功效。
实施例5(肾茶提取物B组分的制备1)所述肾茶提取物B组分的制备，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并浸提液在40℃水温控制下减压蒸馏浓缩后，得浸膏混合物；(2)将步骤(1)浸膏混合物与水-甲醇(按1∶5体积混合)的溶解液按重量(g)∶体积(ml)＝1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，充分去除树脂、叶绿素等低极性的杂质和脂溶性成分，再用正丁醇充分萃取4次，合并浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并在40℃水温控制下减压蒸馏浓缩后得浅褐色粘稠状的肾茶提取物B组分。
实施例6(肾茶提取物B组分的制备2)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶8的比例浸泡；合并浸提液在60℃水温控制下减压蒸馏浓缩；水-甲醇按1∶9体积混合成溶解液；石油醚萃取浸膏溶解液4次；乙酸乙酯萃取浸膏溶解液4次；层析、洗脱、收集液在50℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例5。
实施例7(肾茶提取物B组分的制备3)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶5的比例浸泡；合并浸提液在50℃水温控制下减压蒸馏浓缩；水-甲醇按1∶12体积混合成溶解液；石油醚萃取浸膏溶解液5次；乙酸乙酯萃取浸膏溶解液5次；层析、洗脱、收集液在60℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例5。
实施例8(肾茶消石汤B)将车前子30克、沉香3克、白芍10克、鸡内金15克，加水1000ml浸泡半小时，煎煮15分钟倒出煎剂，同法再煎煮1次，合并两次煎剂，用无菌水补足至1200ml后，加入实施例5、6或7所制备的肾茶提取物B组分0.5克，搅拌至溶解后即成肾茶消石汤B。每日1剂，服药后20分钟进行跳跃运动15分钟，并尽量多饮水、多排尿，三个月为一疗程，具抗结石、排石溶石、利尿、消炎止痛功效。
实施例9(肾茶提取物C组分的制备1)所述肾茶提取物C组分的制备，按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶5的比例，浸泡2-3周后，滤去甲醇溶液至充分挥发干燥，备用；(2)将步骤(1)处理后肾茶，用水浸没后煮3次，每次4小时，合并水煮液，在50℃水温控制下减压蒸馏浓缩；(3)将步骤(2)浓缩液，分别用浓度为65％、75％、85％、95％的乙醇进行分级沉降，收集后得黑色粘稠状的肾茶提取物C组分。
实施例10(肾茶提取物C组分的制备2)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶8的比例浸泡；滤去甲醇溶液至充分挥发干燥后的肾茶，用水浸没后煮4次；在60℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例9。
实施例11(肾茶提取物C组分的制备3)本制备例中，所述肾茶干品粉碎后与甲醇按重量(g)∶体积(ml)＝1∶10的比例浸泡；滤去甲醇溶液至充分挥发干燥后的肾茶，用水浸没后煮4次；在40℃水温控制下减压蒸馏浓缩，其余制备步骤与工艺条件均同于实施例9。
实施例12(肾茶消石汤C)将车前子30克、沉香3克、白芍10克、鸡内金15克，加水1000ml浸泡半小时，煎煮15分钟倒出煎剂，同法再煎煮1次，合并两次煎剂，用无菌水补足至1200ml后，加入实施例9、10或11所制备的肾茶提取物C组分6克，搅拌至溶解后即成肾茶消石汤C。每日1剂，服药后20分钟进行跳跃运动15分钟，并尽量多饮水、多排尿，三个月为一疗程，具利尿通淋、消炎止痛、抗肾结石损伤功效。
与以下试验例有关的材料、设备等作说明如下1实验材料1.1动物ICR小鼠，SD大鼠，由浙江省实验动物中心提供，实验动物质量合格证号码SCXK(浙)2003-0001。新西兰兔，DPH豚鼠，实验动物质量合格证号码SCXK(浙)2003-0002。由浙江省实验动物中心提供。饲养条件室温18℃～20℃，相对湿度40％～70％，喂以全价营养颗粒饲料，自由饮水。
1.2药物肾茶提取物A组分(实施例1、2或3产品)称取肾A适量，用1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)碾磨均匀配成所需浓度，备用。(小鼠使用浓度6.4mg/ml，灌胃体积0.5ml/20g，剂量为160mg/kg；大鼠使用浓度16mg/ml，灌胃体积1ml/100g，剂量为160mg/kg。下同。)肾茶提取物B组分(实施例5、6或7产品)称取肾B适量，用蒸馏水碾磨均匀配成所需浓度，备用。
肾茶提取物C组分(实施例9、10或11产品)称取肾C适量，用蒸馏水碾磨均匀配成所需浓度，备用。
吲哚美辛(消炎痛)原料药，宁波制药厂惠赠，临用以1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)碾磨均匀配成所需浓度，备用。
呋塞米片(速尿)20mg/片，批号0311131，江苏林海药业有限公司制造分公司，用1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成所需浓度，备用。
排石颗粒20g/袋，批号050109，南京同仁堂药业有限责任公司，用蒸馏水碾磨均匀配成所需浓度，备用。
1.3试剂生理盐水，批号20040115，浙江平湖莎普爱思制药有限公司。
乙二醇，批号990332，余杭市城南化学试剂厂。
氯化铵，批号20030603，衢州巨化试剂有限公司。
钙测定试验盒(甲基百里酚蓝法)批号030927，宁波市慈城生化试剂厂。
台氏液(自配)依次溶解8g NaCl、2ml10％KCl、2.6ml10％MgSO4·7H2O、1g NaHCO3于500ml蒸馏水中(试剂I)，1.8ml 1mol/L CaCl2单独溶于200ml蒸馏水(试剂II)，缓慢将试剂II加入试剂I中，边加边搅拌，并定容至1000ml(试剂III)。1g葡萄糖于临用时加入试剂III，即为台氏液。
丙二醛MDA测定试剂盒，批号20040219，南京建成生物工程研究所。
其它试剂均为分析纯。
1.4仪器721型分光光度计，上海第三分析仪器厂。
离心机，LXJ-II，上海医用分析仪器厂。
电子分析天平，AEL-200，岛津。
Medlab-U/4cs生物信号采集处理系统，南京美易科技有限公司。
SC-15数控超级恒温槽，宁波天恒仪器厂。
Motic显微图像处理系统，麦克奥迪实业集团有限公司。
试验例1(肾脏中草酸和钙含量的测定)按以下步骤进行1)肾组织处理取供试动物一侧肾组织加1M HCl，用匀浆器制成组织匀浆，3000r/min离心10min，取上清液2ml用1M氢氧化钠调pH至5.0，补充去离子水至5ml，摇匀；2)肾脏中草酸含量的测定(高锰酸钾褪色法)取200μl步骤1)肾组织处理液，加500mM氯化钙0.1ml混匀，加无水乙醇2ml充分混匀，4℃放置过夜，3000r/min离心10min，弃上清液后加0.02M乙酸一草酸钙平衡液5ml充分混匀。3000r/min离心10min，弃上清。加去离子水5ml，充分混匀，3000r/min离心10min，弃上清。试管倒置于滤纸上沥干水分，沉淀加1mol/L硫酸1ml及去离子水1ml充分混匀，溶解沉淀物。加高锰酸钾应用液3.0ml混匀，60℃水浴10min，3000r/min离心10min。取上清液525nm比色。同时做空白及标准测定管(标准管草酸1mM，1ml)。按下列公式计算测定管草酸浓度＝(空白管A-测定管A)/(空白管A-标准管A)×13)肾脏中钙含量的测定(甲基百里酚蓝法)另取肾处理液50μl，加3ml显色剂，混匀，同时作空白及标准管(标准钙2.5mM)，用610nm波长，空白管调零，读取测定管和标准管分吸光度(A)，按下列公式计算测定管钙浓度＝测定管A/标准管A×2.5试验例2(肾脏结石组织病理学观察)供试动物末次药后水负荷法收集6h尿液。处死动物，肾脏称重后，取一侧肾用10％甲醛固定，常规切片，HE染色后进行肾脏结石组织病理学观察。其中，组织病理学观察肾脏结石评分标准为0分无结晶；1分局部或散在少到多量沙状结晶；2分局部有单个细小结晶；3分局部有多量细小结晶或有1个大颗粒单晶；4分仅有3～4个大颗粒单晶散在或多量细小结晶；5分局部有3～4处多量大结石积集成堆；6分满视野多量大结石积集成堆。
试验例3(肾茶提取物对小鼠草酸钙肾结石模型的影响)取小鼠66只，随机分为6组，每组11只，除对照组小鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％的乙二醇+1％氯化铵)，连续饮用6周，造成小鼠肾结石模型。造模同时各组按下述剂量给药。①对照组，ig水；②模型组，ig水；③排石颗粒组，ig排石颗粒6g/kg；④肾茶A组，ig肾茶A溶液160mg/kg；⑤肾茶B组，ig肾茶B溶液160mg/kg；⑥肾茶C组，ig肾茶C溶液160mg/kg；每日给药1次，给药体积0.5ml/20g，连续6周。
末次药后水负荷法收集6h尿液，处死动物，肾脏称重后，一侧肾按试验例1方法测定肾组织内草酸及钙含量；另一侧肾按试验例2方法进行肾脏结石组织病理学观察，结果如下(1)一般情况肾结石成分以草酸钙和磷酸钙结石为主，占全部尿路结石的80％～84％，其中草酸钙结石占58.8％。乙二醇是草酸的前体，进入体内后转化成羟乙酸，后者既可在羟乙酸氧化酶的作用下直接转化为草酸，也可以通过乳酸脱氧酶的催化转化成乙醛酸，乙醛酸又可以直接在酶或非酶促作用下转化为草酸。因此，给动物喂食乙二醇进入体内代谢后最终转化为草酸，经尿排出，增加尿中草酸的浓度，加服氯化铵，肾内结石形成率极高。实验结果表明，在饮水中加入1％乙二醇+1％氯化铵，可以形成理想的肾结石模型以供实验研究。小鼠给予成石水4周后，精神萎靡，畏寒卷缩，体毛干枯，无光泽，毛色变黄，呈耸毛状，体重减轻较明显，肾体比明显增加，6周内部分动物因肾脏严重病变而死亡。而排石颗粒组与肾茶给药各组与模型组相比，症状有所改善。结果见表1。
表1 肾茶对肾结石小鼠体重和肾脏重量的影响(x±s)
注与对照组比较***P＜0.001(2)肾茶对肾结石小鼠肾脏钙和草酸含量的影响小鼠饮用1％乙二醇和1％氯化胺后，草酸钙结晶在肾内大量聚积，实验显示肾组织中钙、草酸含量显著增加。而肾A、B、C组的肾钙、肾草酸含量明显少于模型组，其中，肾A组的肾草酸含量与模型组比较有明显的差异(P＜0.001)，甚至明显优于排石颗粒组。结果见表2。
表2 肾茶对肾结石小鼠肾脏钙和草酸含量的影响(x±s)
注与对照组比较###P＜0.001；与模型组比较***P＜0.001，*P＜0.05(3)肾组织形态学和肾组织草酸钙结晶观察肾脏组织肉眼观察，模型组动物肾脏水肿，表面苍白，质地变硬，肾脏表面可见散在白色小点。而排石颗粒组与肾茶A、B、C各组症状较轻，表而红润，质地正常。病理切片组织学观察，模型组动物肾脏病变程度较严重，肾皮质部、髓部、肾盏、肾盂内存在大量草酸钙结石，严重者多量大结石积集成堆或满视野多量大结石积集成堆。与模型组比较，排石颗粒组和肾茶A、B、C各组肾组织病变程度较轻，肾组织草酸钙结石评分较低，表明有抗肾结石作用。结果见表3。
表3 肾茶对肾结石小鼠肾脏草酸钙结石形成的影响(n＝11，x±s)
注与模型组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05试验例4(肾茶提取物对大鼠草酸钙肾结石模型的影响)取雄性大鼠30只，随机分为6组，每组5只。除对照组大鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％乙二醇+1％氯化铵)，连续饮用10天，造成大鼠肾结石模型。造模同时各组按下述剂量给药。①对照组，ig水；②模型组，ig水；③排石颗粒组，ig排石颗粒6g/kg；④肾茶A组，ig肾茶A溶液160mg/kg；⑤肾茶B组，ig肾茶B溶液160mg/kg；⑥肾茶C组ig肾茶C溶液160mg/kg；每日给药1次，给药体积1ml/100g，连续10天。于末次药后，大鼠代谢笼法收集24h尿液，测尿液量及尿液pH后，处死动物，取肾脏称重，一侧肾按试验例1方法测定肾组织内草酸及钙含量；另一侧肾按试验例2方法进行肾脏结石组织病理学观察，结果如下(1)一般情况大鼠给予成石水5天后，开始出现精神萎靡，畏寒卷缩，体毛干枯，无光泽，毛色变黄，呈耸毛状，个别动物尚有脱毛发生，体重减轻较明显，肾体比明显增加。而排石颗粒组与肾茶A、B、C各组与模型组相比，症状有所改善。结果见表4、5。
表4 肾茶对肾结石大鼠体重的影响(x±s)
注与对照组比较###P＜0.001，#P＜0.05；与模型组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
表5 肾茶对肾结石大鼠肾体比的影响(x±s)
(2)肾茶对肾结石大鼠肾脏钙和草酸含量的影响大鼠饮用乙二醇和氯化胺后，肾内草酸钙结晶大量聚积，显示肾组织中钙、草酸含量显著增加。肾A、B、C组肾钙、肾草酸含量明显下降(大鼠比小鼠有更明显的效果)，与模型组比较肾A、C组有显著差异。结果见表6。
表6 肾茶对肾结石大鼠肾脏钙和草酸含量的影响(x±s)
注与对照组比较###P＜0.001；与模型组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05(3)肾组织形态学检查和肾组织草酸钙结晶观察肾脏组织肉眼观察，模型组动物肾脏水肿，表面苍白，肾脏表面可见散在白色小点。而排石颗粒组与肾茶各组症状较轻，表面红润。肾脏组织病理学观察，模型组动物肾脏病变程度较严重，肾皮质部、髓部、肾盏、肾盂内存在大量草酸钙结石，严重者多量大结石积集成堆或满视野多量大结石积集成堆。与模型组比较，排石颗粒组和肾茶各组肾组织病变程度较轻，肾组织草酸钙结石评分较低，表明有抗肾结石作用。结果见表7。
表7 肾茶对肾结石大鼠肾脏草酸钙结石形成的影响(n＝5，x±s)
注与模型组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05试验例5(肾茶提取物对小、大鼠尿量的影响)(1)肾茶提取物对正常小鼠利尿作用的影响取正常小鼠55只随机分为5组，每组11只。①对照组，ig等体积水；②速尿组，ig 25mg/kg；③肾茶A组，ig 160mg/kg；④肾茶B组，ig 160mg/kg；⑤肾茶C组，ig 160mg/kg。各组连续灌胃给药3次，第1天上、下午各1次(8:30AM，4:30PM)，次日上午1次。实验前禁食16h(前1天5:00PM～次日9:00AM)，腹腔注射0.9％氯化钠溶液1ml/只给予水负荷，并挤压小鼠下腹部，使膀胱排空。水负荷0.5小时后开始给药，给药完毕，立即将小鼠放入350ml的广口瓶内，瓶底放已称重的棉球，每隔2h收集棉球称重，以其重量差为小鼠排尿量，连续6h，比较组间差异，结果如下与对照组比较，小鼠给予速尿25mg/kg后小鼠排尿量增加，利尿作用强，作用时间长，差异非常显著，具有明显的统计学意义(P＜0.001)；而小鼠给予肾茶A、B、C后，只有肾茶A的0～4h作用点尿量增加较显著，具有明显的统计学意义(P＜0.01)；肾茶B、C作用不明显。肾茶A、B、C各组比较，利尿作用A＞C＞B，但三组间比较无明显的统计学意义(P＞0.05)。结果见表8。
表8 肾茶提取物对正常小鼠的利尿作用(x±s)
注与对照组比较**P＜0.01；***P＜0.001(2)肾茶提取物对肾结石小鼠尿量的影响取小鼠66只，随机分为6组，每组11只。除对照组小鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％的乙二胺+1％氯化铵)，连续饮用6周，造模同时各组按下述剂量给药。①对照组，ig等体积水；②模型组，ig等体积水；③排石颗粒组，ig 600mg/kg；④肾茶A组，ig 160mg/kg；⑤肾茶B组，ig 160mg/kg；⑥肾茶C组，ig 160mg/kg，末次给药以后进行利尿实验，方法同上，结果如下表9 肾茶对肾结石小鼠尿量的影响(x±s)
注与对照组比较***P＜0.001
小鼠形成肾结石后，尿量明显下降，与对照组比较有显著的统计学意义(P＜0.001)。肾茶各组分可增加肾结石小鼠的尿量，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)。结果见表9。
(3)肾茶提取物对肾结石大鼠尿量的影响取大鼠30只，随机分为6组，每组5只。除对照组大鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％的乙二胺+1％氯化铵)，连续饮用10天造成肾结石模型。造模同时各组按下述剂量给药，连续10天。①对照组，ig等体积水；②模型组，ig等体积水；③排石颗粒组，ig 600mg/kg；④肾茶A组，ig 160mg/kg；⑤肾茶B组，ig 160mg/kg；⑥肾茶C组，ig 160mg/kg，末次给药以后进行利尿实验，方法同上，结果如下肾茶提取物A、B、C可明显增加肾结石大鼠的尿量，其中肾C作用时间较长，可持续24小时有效。结果见表10。
表10 肾茶对肾结石大鼠尿量的影响(x±s)
注与对照组比较#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05现代医学认为肾结石病的病因，一方面是由于尿量减少、脱水或尿浓缩等原因引起尿液中的晶体物质浓度增高，使尿液中晶体(如草酸钙、磷酸钙等物质)和胶体(如粘蛋白等物质)之间的平衡失调，导致尿中晶体物质的析出，沉积而形成结石。因此尿量增加可以降低尿中晶体物质的浓度，及时排出尿中晶体，预防尿中晶体物质沉淀、附着，凝聚成肾结石，其作用可能是排石的机理之一。
试验例6(肾茶提取物对动物泌尿系平滑肌的影响)实验使用豚鼠或新西兰兔，雌雄不拘。处死后迅速取出膀胱、输尿管、尿道置于37℃台氏液中，去除表面的脂肪和其他结缔组织。制成膀胱环和输尿管、尿道条，用手术线结扎两端，一端固定在标本钩上，另一端则与10g张力换能器相连，并置于含8ml台氏液的麦氏浴槽中，37℃保温，通氧。静止张力0.5g，稳定30min后通过Medlab-U/4cs生物信号采集处理系统记录平滑肌的舒缩变化。待基线平稳后，在浴槽中加入药物(肾A/或肾B/或肾C)，观察并记录平滑肌反应约5～10min，用预温的台氏液洗去药物，连续3次，约稳定15min待基线基本恢复后，再加药物观察。其它处理同上。记录观察肾A、肾B、肾C对豚鼠(新西兰兔)膀胱、输尿管、尿道平滑肌的影响。
结果如下肾茶A、B、C三个组分对豚鼠、新西兰兔膀胱平滑肌均有增加收缩幅度，加快节律的作用。而三者对输尿管、尿道平滑肌均有松驰作用，如说明书附1、图2、图3所示。肾茶可能通过扩张输尿管-收缩膀胱-扩张尿道，从而使泌尿道通畅排出结石。
试验例7(肾茶提取物对小鼠抗炎作用二甲苯致耳炎的影响)取小鼠60只随机分成5组，12只/组，，雌雄各半。①对照组，ig等体积水；②消炎痛组，ig 20mg/kg；③肾茶A组，ig 160mg/kg；④肾茶B组，ig 160mg/kg；⑤肾茶C组，ig 160mg/kg。连续给药5天，于末次给药后30min，用二甲苯涂擦小鼠右耳致炎，致炎后15min处死小鼠，剪下左右耳片，用9mm打孔器在相同部位打下圆耳片，计算左右耳片重量之差作为肿胀度。结果如下
对照组小鼠二甲苯致炎后右耳明显肿胀，而各组小鼠的耳廓肿胀度均有下降。与对照组比较，消炎痛组、肾茶A和B组的肿胀度降低有明显的统计学意义(P＜0.01)。但肾茶C组肿胀度降低不明显，无统计学意义(P＞0.05)。结果见表11。
表11 肾茶提取物对小鼠抗炎作用的影响(x±s)
注与对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05试验例8(肾茶提取物对肾结石小鼠抗过氧化脂质的影响)取小鼠60只，随机分为6组，每组10只。除对照组小鼠每日饮用正常水外，其它各组均饮用成石水(1％乙二胺+1％氯化铵)，连续饮用6周，同时各组按下述剂量给药。①对照组，ig等体积水；②模型组，ig等体积水；③排石颗粒组，ig 600mg/kg；④肾茶A组，ig 160mg/kg；⑤肾茶B组，ig160mg/kg；⑥肾茶C组，ig 160mg/kg，末次给药以后，处死动物，解剖小鼠，肾脏称重，取一侧肾脏加预冷的生理盐水，用玻璃匀浆器研磨均匀，制成10％的匀浆，吸取匀浆0.1mL测LPO(过氧化脂质)含量(按丙二醛MDA测定试剂盒方法进行)。实验数据以x±s表示。经t检验，P＜0.05为有统计学意义。结果如下小鼠形成肾结石后，肾组织LPO含量明显上升，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。肾茶各组和排石颗粒可使肾结石小鼠的肾组织LPO含量下降，与模型组比较肾C组有统计学意义(P＜0.05)，而其它组均无统计学意义(P＞0.05)。结果见表12。
表12 肾茶提取物对肾结石小鼠LPO的影响(x±s)
注与对照组比较#P＜0.05；与模型组比较*P＜0.05正常人的肾小管上皮细胞可抵制晶体的粘附，尿液中也含有草酸钙结晶生长和聚集的抑制物和促进物。当肾小管上皮细胞损伤时，晶体可粘附于肾盂内壁、输尿管内壁等处粘膜，结石机械刺激可致组织的充血、水肿等炎症反应。本实验证明了肾茶提取物有抗炎作用，提示其可能通过抑制肾脏组织的损伤，减少晶体在肾上皮细胞的粘附机率，利于小结晶的排出，达到抑制肾结石的作用。
权利要求
1.肾茶提取物B组分，其特征在于可按以下方法制得(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3-5次，充分去除树脂、叶绿素低极性的杂质和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得浅褐色粘稠状的肾茶提取物B组分。
2.一种制备权利要求1所述肾茶提取物B组分的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)将肾茶[C.spicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li]干品粉碎后与甲醇按克重量∶毫升体积为1∶4～10的比例，共浸泡3次，每次10天，合并、浓缩浸提液得浸膏混合物；(2)先将水与甲醇按1∶5～12体积比混配成溶解液，再将步骤(1)浸膏混合物与溶解液按克重量∶毫升体积为1∶1比例混合、搅拌至充分溶解；(3)将步骤(2)浸膏溶解液先用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3-5次，充分去除树脂、叶绿素低极性的杂质和脂溶性成分后，再用正丁醇萃取4次，合并、浓缩萃取物；(4)将步骤(3)萃取物进行硅胶柱层析、梯度洗脱、收集并浓缩得肾茶提取物B组分产品。
全文摘要
本发明公开了肾茶抗泌尿系统结石提取物及其制备方法，属于中草药的提取物与应用技术领域。该方法包括(1)将肾茶与甲醇按重量体积1∶4～10的比例，浸泡、提取、浓缩得浸膏混合物；(2)将浸膏混合物与溶解液按重量体积1∶1比例混合、溶解；(3)将溶解液先用石油醚萃取，再用乙酸乙酯萃取、浓缩后得到萃取物；(4)将萃取物层析、洗脱、收集并浓缩得肾茶提取物A组分。属脂溶性黄酮甙元类化合物，具明显改善泌尿系结石症状、减少结石量、增加尿量、有助于结石排出及消炎等效果。可直接、复合或进一步分离提取，用于泌尿系抗结石、排石、利尿和消炎等的药物。
文档编号A61P13/00GK101066292SQ20071006918
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年6月5日
发明者陶正明, 蔡华芳, 顾雪萍, 李林 申请人:浙江省亚热带作物研究所