专利名称：青蒿素及其衍生物与抗菌药物的联合应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物应用领域，尤其涉及青蒿素及其衍生物的抗菌应用。
背景技术：
感染性疾病是由于病原微生物侵入体内，在体内大量地繁殖所引起的疾病，是临床病人死亡的重要原因之一。造成患者死亡的原因其一是细菌大量繁殖释放毒素导致组织器官的损伤；其二是细菌成分通过激活免疫细胞，诱导TNF-α、IL-1、IL-6、NO等致炎细胞因子释放，引起多种炎症介质所形成的瀑布效应，可使炎症反应扩大甚至失去控制，最终导致以细胞自身性破坏为特征的全身性炎症即脓毒症的发生。细菌感染曾是人类第一死因，抗生素的发明带给了人类希望之光。但抗生素的普遍使用使越来越多的细菌产生了耐药性，如果不解决抗生素滥用的问题，等待人类的将是下一次黑暗。
青蒿提取物用来治疗疟疾相关的发热已经有一千多年的历史，除传统的抗疟作用外，青蒿类物质还具有其它方面的作用，如平喘、抗癌、抗血吸虫及对免疫系统的调节等。国内外有关青蒿素及其衍生物的研究很多，但研究范围主要集中在抗疟、抗癌、抗血吸虫的作用及其机制上。
青蒿琥酯(Artesunate)，化学名为二氢青蒿素-1，2-α-琥珀酸单酯，分子式为C19O8 H28，分子量384，是具有倍半萜结构的抗疟药青蒿素的衍生物。青蒿琥酯是新型的抗疟药，较之青蒿素，青蒿琥酯可配制成任何常规的制剂形式，包括固体和液体形式，给药非常方便。青蒿琥酯作为抗疟药，不但效价高，而且不易产生耐受性。
对青蒿素及其衍生物的抗炎作用已有报道，研究发现青蒿素可抑制LPS/TNF-α诱导性NO合酶的合成及NF-κB的激活；青蒿琥酯对LPS及合并干扰素刺激小鼠腹腔巨噬细胞NO的合成有明显的抑制作用；青蒿琥酯对LPS刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7也具有相似的保护作用；谭余庆等还发现青蒿提取物、青蒿素可降低内毒素休克小鼠LPO、ACP、内毒素、TNF-α、P450浓度，升高SOD活性，降低小鼠死亡率，延长小鼠的平均生存时间，对小鼠肝、肺组织形态也有一定的保护作用；王俊等发现青蒿素能抑制CpGODN、LPS、热灭活的EC诱导细胞释放炎症因子，并对脓毒症模型小鼠具有显著保护作用。但是青蒿琥酯是否具有抗菌作用，是否能改善细菌对抗生素的耐药，增强抗生素的抗菌效力和对细菌导致的感染是否有效，未见报告。我国是青蒿素和其衍生物的主要生产地，由于该药物疗效高、毒性低，WHO已经将青蒿素列为世界治疗疟疾的主要药物，我国正在扩大青蒿种植和青蒿素生产，因此扩宽青蒿素类衍生物的适应症，将其应用于细菌感染疾病的防治，无疑对提高青蒿素类衍生物的利用、增加其经济价值并改善抗生素滥用所导致的耐药现象具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于将青蒿素及其衍生物，特别是青蒿琥酯应用到抗菌领域，不仅拓宽青蒿素及其衍生物，特别是青蒿琥酯的用途，而且可以减轻现有抗菌药物的滥用及其导致的耐药现象。
基于上述目的，本发明使用的技术方案是将青蒿素及其衍生物中的一种与抗菌药物中的一种进行联合应用，该应用不是做为疾病的治疗方法的应用，而是在配备治疗疾病(抗菌)的药物中的应用，其中上述两种成分的比例为1∶1～4096∶1，上两种成分可以制备成组合物，也可以是两种单独的药剂。上述两种成分能够产生协同抗菌效力，能够降低抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
上述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；上述衍生物包括二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯；上述抗菌药物包括β-内酰胺类抗生素(青霉素类、头孢菌素类、非典型β-内酰胺类抗生素)、氨基糖苷类、克林霉素类、喹诺酮类的药物，在一较佳实施例中，上述抗菌药物为青霉素G、氨苄西林、头孢呋辛、头孢匹胺、庆大霉素、克林霉素、洛美沙星、加替沙星、舒氨西林和泰能，优选为庆大霉素、舒氨西林、头孢匹胺和加替沙星。
上述应用优选为青蒿琥酯与抗菌药物的联合应用。
青蒿琥酯单独使用可抑制革兰阴性菌和革兰阳性菌的生长，与抗菌药物联合应用后可明显增强抗菌药物的抗菌效力，减少抗菌药物的使用剂量；实验表明青蒿素及青蒿琥酯与抗菌药物联合应用可明显降低细菌(包括革兰阴性、阳性菌)攻击小鼠死亡率，显著抑制小鼠血清LPS含量和细胞因子TNF-α释放。
本发现人对青蒿琥酯体内外的抗菌和抗炎作用进行了研究。
首先，本研究人员对本青蒿琥酯的体外抗菌作用进行了药理学分析，并与抗生素联合应用后发现青蒿琥酯单独使用可抑制革兰阴性菌和革兰阳性菌的生长，与抗生素联合应用后可明显增强抗生素的抗菌效力，减少抗生素的使用剂量；其次，青蒿琥酯与抗生素联合应用和可明显降低细菌(包括革兰阴性、阳性菌)攻击小鼠死亡率，显著抑制小鼠血清LPS含量和细胞因子TNF-α释放。
因此本发明拓宽了青蒿素及其衍生物，特别是青蒿琥酯的用途，提高了抗菌药物的抗菌效力，减轻了抗菌药物滥用和导致的耐药现象。
图1表示青蒿琥酯协同庆大霉素、头孢匹胺、舒氨西林对大肠埃希菌ATCC35218的联合抑菌曲线；图2表示青蒿琥酯协同氨苄西林、加替沙星、舒氨西林对金葡菌ATCC25923的联合抑菌曲线；图3表示青蒿琥酯协同庆大霉素、加替沙星、舒氨西林对大肠埃希菌临床分离株的联合抑菌曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
青蒿琥酯(AS)与抗菌药物按照表1、表2中的配比，能够产生协同抗菌效力，降低抗菌药物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。
实验例1本实验例在于研究青蒿琥酯与十种抗菌药物对不同细菌的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)采用微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内，青蒿琥酯和青霉素钠、氨苄西林等10种抗菌药物分别以生理盐水稀释为5.14mg/ml。加入各种药物至含细菌培养孔内，依次倍比稀释，第1～10孔药物的最终浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5ug/ml。置37℃培养箱孵育24h和48h，读取阳性和阴性对照孔，阴性对照孔清亮，阳性对照孔混浊。药物对细菌的MIC为24h后抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度，药物对细菌的MBC为48h后抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度。此次实验结果表明青蒿琥酯单独使用不能完全抑制细菌生长，并观察了不同抗菌药物对该五种细菌的抑菌效力。(见表3)。
表310种抗菌药物和AS的单独使用时对不同细菌的MIC及MBC
实验例2本实验例在于研究青蒿琥酯与抗菌药物联合应用后对大肠埃希菌MIC和MBC的影响。
采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内，将对五种细菌中等敏感的抗菌药物用低于MIC的剂量与不同浓度青蒿琥酯分别配伍，观察配伍后的药物对大肠埃希菌的MIC和MBC。此次实验结果表明青蒿琥酯单独使用虽不能完全抑制细菌生长，但与抗菌药物联合应用后可明显降低抗菌药物的MIC和MBC，说明青蒿琥酯与抗菌药物协同后对细菌有协同的抑菌效力。(见表4)。
表4各抗菌药物与青蒿琥酯协同后的最低抑菌浓度
实验例3本实验例在于研究青蒿琥酯与1/2MIC浓度的不同抗菌药物协同后对大肠埃希菌生长的抑制强度。
调整细菌浓度为106CFU/ml，测定菌液OD600为0.002(1OD＝5×108CFU/ml)，参照实验例1结果，分别单独加入终浓度为256μg/ml青蒿琥酯或1/2MIC浓度的抗菌药物，以及同时加入256μg/ml青蒿琥酯和1/2MIC浓度的抗菌药物后，至于37℃恒温摇床150rpm振摇，分别测定1、3、5、7、9、12、16、24h时菌液的OD值，计算各时间点的细菌量。研究结果表明青蒿琥酯256μg/ml可使大肠埃希菌ATCC35218，金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌临床分离株生长速度明显减慢，与单独使用抗菌药物相比，联合了青蒿琥酯后明显抑制细菌生长，抑制程度比单独使用抗菌药物或青蒿琥酯均强(图1、2、3)。
实验例4本实验例在于研究青蒿琥酯联合应用抗菌药物对革兰阴性细菌攻击小鼠的保护作用清洁级昆明种小白鼠70只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、青蒿琥酯组、大肠埃希菌组，大肠埃希菌+庆大霉素组，青蒿琥酯(1.5、5、15mg/kg)+庆大霉素+大肠埃希菌组。每组10只动物。对照不给予任何试剂；青蒿素组肌肉注射15mg/kg的青蒿琥酯；大肠埃希菌组，给予0.8×106/kg活的大肠埃希菌ATCC35218；大肠埃希菌+庆大霉素组，给予庆大霉素0.5mg/kg肌肉注射后给予活大肠埃希菌ATCC35218；庆大霉素+青蒿琥酯+大肠埃希菌组，在给予青蒿琥酯后，立即给予庆大霉素及大肠埃希菌。给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率(表5)。结果显示青蒿琥酯协同抗菌药物后可明显降低小鼠的死亡率，表明对青蒿琥酯与抗菌药物联合后出现协同保护作用。
表5青蒿琥酯协同庆大霉素对大肠埃希菌ATCC35218攻击小鼠的保护作用
实验例5本实验例在于研究青蒿琥酯联合应用抗菌药物对革兰阳性细菌攻击小鼠的保护作用清洁级昆明种小白鼠70只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、青蒿琥酯组、金葡菌组，金葡菌+加替沙星组，青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+加替沙星+金葡菌组。每组10只动物。对照不给予任何试剂；青蒿素组肌肉注射45mg/kg的青蒿琥酯；金葡菌组，给予1.0×107/kg活的金葡菌ATCC25923；金葡菌+加替沙星组，给予加替沙星0.5mg/kg肌肉注射后给予活金葡菌ATCC25923；加替沙星+青蒿琥酯+金葡菌组，在给予青蒿琥酯后，立即给予加替沙星及金葡菌。给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率(表6)。结果显示青蒿琥酯协同抗菌药物后可明显降低小鼠的死亡率，表明对青蒿琥酯与抗菌药物联合后出现协同保护作用。
表6 青蒿琥酯协同加替沙星对金葡菌ATCC25923攻击小鼠的保护作用
实验例6本实验例在于研究青蒿琥酯对灭活大肠埃希菌攻击小鼠的保护作用。
清洁级昆明种小白鼠60只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、青蒿琥酯组、灭活大肠埃希菌组，青蒿琥酯(5、15、45mg/ml)+灭活大肠埃希菌组。每组8只动物。对照不给予任何试剂；青蒿琥酯组肌肉注射给予45mg/kg的青蒿琥酯，4h，24h，48h后重复给药一次；灭活大肠埃希菌组，给予1.25×1011/kg的灭活大肠埃希菌ATCC35218；青蒿琥酯+灭活大肠埃希菌组，在肌肉注射给予青蒿琥酯后，立即给予灭活大肠埃希菌ATCC35218，4h、24h、48h后重复肌肉注射给药青蒿琥酯1次。给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率(表7)。结果显示青蒿琥酯可降低小鼠的死亡率，表明对致炎因子攻击的小鼠具有保护作用。
表7青蒿琥酯对灭活大肠埃希菌攻击小鼠的保护作用
*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli实验例7本实验例在于研究青蒿琥酯对灭活大肠埃希菌攻击小鼠血清细胞因子释放影响清洁级昆明种小白鼠40只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、青蒿琥酯组、灭活大肠埃希菌组、青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+灭活大肠埃希菌组，每组动物3只。对照不给予任何试剂。青蒿琥酯组肌肉注射给予45mg/kg的青蒿琥酯；青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+灭活大肠埃希菌组给予青蒿琥酯后立即给予灭活大肠埃希菌ATCC35218；给药完毕4h后摘眼球取血立即离心留置上清保存于-20℃，待测定细胞因子TNF-α(表8)。结果显示青蒿琥酯可显著降低灭活大肠埃希菌攻击小鼠血清细胞因子释放。
表8青蒿琥酯降低灭活大肠埃希菌ATCC35218攻击小鼠血清细胞因子TNF-α释放(n＝6，
)
*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli本发明将青蒿琥酯与抗菌药物的联合应用，提高了抗生素的抗菌效力，将青蒿琥酯与抗生素联合应用还可以预防、治疗细菌感染。
本领域技术人员可以根据本发明所述内容，将青蒿素及其衍生物与抗菌药物的联合同样可以达到本发明所述效果。
权利要求
1.青蒿素及其衍生物中的一种与抗菌药物中的一种的联合应用，其能够产生协同抗菌效力，降低抗菌药物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。
2.根据权利要求1所述的应用，其中青蒿素及其衍生物中的一种与抗菌药物中的一种的质量比为1∶1～4096∶1。
3.根据权利要求1所述的应用，上述菌为革兰阳性菌或革兰阴性菌。
4.根据权利要求1所述的应用，上述衍生物为二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯。
5.根据权利要求4所述的应用，该应用为青蒿琥酯与一种抗菌药物的联合应用。
6.根据权利要求1所述的应用，上述抗菌药物为β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类、克林霉素类和喹诺酮类抗菌药物。
7.根据权利要求6所述的应用，上述抗β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢菌素类和非典型β-内酰胺类抗生素。
全文摘要
本发明公开了一种现有的抗疟药青蒿素及其衍生物二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯新的用途，即，与抗菌药物联合应用抑制细菌生长，增强抗菌药物抗菌效力。尤其是使得青蒿琥酯除作为治疗疟疾药物外，能够在预防及治疗细菌感染性疾病中得到应用。
文档编号A61P31/00GK101020056SQ20071007825
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月2日 优先权日2007年3月2日
发明者周红, 李斌, 郑江 申请人:中国人民解放军第三军医大学