专利名称：一种治疗结核杆菌感染的基因工程合成多肽药物制备和应用的制作方法
技术领域：
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本发明提供一种合成抗菌肽药物及其制备方法，用于治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌的感 染，属于生物医学技术领域。
背景技术：
(一) 多耐药结核病现状
结核病是对人类健康威胁最大的传染性疾病之一 。据WHO统计，目前全球约有20亿人口感染结核 杆菌，每年新发病例达800万左右，死亡人数约3百万，占人口死亡率的7%。结核病发病率及死亡率上 升的最主要原因之一就是结核杆菌耐药株的出现和传播。据报道，全球结核病人中约有36%感染了耐药 菌，这种现象在发展中国家及AIDS病人中尤为重要。此外，全球五大洲35个国家和地区报告的各常用 抗结核药原发耐药率为异烟肼(7.3%),链霉素(7.3%),利福平(1.8%)，乙胺丁醇(1.0%)，而获 得性耐药率还原高于此值。因此，研发一种新型的治疗多耐药结核杆菌感染的药物有着十分重要的意义。
(二) 抗菌肽的应用
抗菌肽(antimicrobialpeptides)是生物体中经诱导而合成的一种内源性多肽，在机体抵抗病原微生物 的入侵方面起着重要的作用，更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽的作用机理 与常用的抗生素明显不同，它主要通过在细胞膜表面形成离子通道来杀死细菌，现在有报道广泛被研究 应用于抗菌、抗结核、抗癌。在目前结核菌的耐药性明显增强，而寻找新的抗生素又极为困难的情况下， 寻找一种新的抗结核菌多肽药物具有非常重要意义。
(三) 两栖类动物提取中药研究现状 两栖类动物在中国属于传统中药和民族药而广泛应用，如中华蟾蜍、大蹼铃蟾、黑斑蛙、沼蛙和
泽蛙。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道的有广谱抗微生物作用、 抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用。
在国外，从两栖类动物寻求药理活性单体化合物已是新药发明的热点，国外报道，从爪蟾皮肤分泌 液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，； Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78用于治疗糖尿病患者足部 溃疡与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。国外学者也已报道从东方铃蟾和花铃蟾中分离出 若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等， 有机小分子多肽类物质的研究还较少。
天龙属爬行纲，蜥蝎目，壁虎科，其又名守宫、壁虎等，现代医药书籍或杂志上收载品种为无蹼壁虎(Gekko swinhonis Gunther)和多痣壁虎(多疣壁虎G.japonicus)及其它几种壁虎的干燥全体。壁虎，咸 寒有小毒，入心、肝经，具有补肺肾、养精血、止咳平喘、祛风定惊、解毒通络散结等功效。早在1978 年，骆和生等人经实验证明天龙对结核杆菌有抑制作用，对致病性真菌有抑制作用，此后关于天龙在临 床结核病的应用日渐增多，并显示出很好的疗效。主要用于肺结核、脊柱结核、胸腰椎结核、淋巴结核、 颈淋巴结核或肿大以及骨与关节结核(骨痨)等。如焦起周等用回生膏外敷加服复方中药汤剂治疗结核 病355例；李守信等用攻瘰丹、化离散加消核膏埋入或外贴治疗淋巴结核1239:例，治愈率98.3%总有效 率99.9%。于立君等人的专利申请"治疗结核病的中药及其制作方法"(专利号03132605.6)报道了天龙 用于治疗瘰疬结核，虽然天龙治疗结核有效，但是关于天龙抗结核的药理活性成分未有相关的文献报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗多耐药结核杆菌的抗菌多肽及其制备方法和在制药中的应用。 本发明所述抗菌肽用于但不限于结核分枝杆菌的抑制。 本发明所述抗菌肽用于但不限于多耐药结核菌感染的治疗。
本发明所述天龙抗菌肽全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。 使用本发明所述的天龙抗菌肽，对于结核分支杆菌生长有抑制作用。
本发明所述的抗菌肽、多耐药结核病、结核分枝杆菌，是本领域的技术人员所熟知的，现代的医学 书籍中有其准确的定义。
通过以下实施例对本发明的天龙抗菌肽的制备和应用进行描述。需说明的是，下述实施例只是用来 说明而非限制本发明，本领域技术人员所熟知的其他常用制备方法及其他引起结核病的分支杆菌均在本 发明的范围内。
实施例一天龙抗菌肽的制备方法
将天龙干药材粉碎过80目筛，称取2500g药粉，用4500ml用蒸馏水混匀泡胀，4度冰箱静置24hr, 低温高速离心得上清800ml， 0.45um膜过滤即得到天龙抗菌肽粗提液，将粗提液过固相萃取柱ODS -SPE (C18，封端)，分别用水和甲醇洗脱，冻干得到水溶部分和醇溶部分，经HPLC色谱分析(ODS C18柱， SHIMADZU 150L*4.6),甲醇溶部分经凝胶过滤柱层析，透析脱盐和反相高压液相色谱分离纯化即得多肽。 其中
凝胶过滤柱层析为将收集的天龙冻干粉溶于蒸馏水后上样于S印hadex G-50凝胶过滤柱，凝胶过滤 柱长1000mm,直径26mm,用0.01MNa2HPO4—NaH2PO4 pH6.5缓冲液洗脱,收集70分钟以后的峰。
反相高压液相色谱为:凝胶过滤柱层析得到的活性成分峰上样于经含0.1%三氟醋酸的超纯水平衡的 C18反相柱,柱长250mm直径10mm，用含0.1%三氟醋酸的甲醇从10%到100%的梯度洗脱,收集时间为 16.2分钟处的峰。
然后用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
在上述制备所得的天然提取抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成，即得到一种合成抗菌肽， 肽一级全序列结构为缬氨酸一半胱氨酸一谷氨酸一组氨酸一异亮氨酸一组氨酸一亮氨酸一异亮氨酸一精氨酸一甘氨酸一亮氨酸一半胱氨酸一 组氨酸一组氨酸一亮氨酸一甲硫氨酸一组氨酸一半胱氨酸一酪 氨酸一异亮氨酸一赖氮酸 一精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCHHLMHCYIKR-COOH)
天然抗菌肽衍生物的制备过程包括首先设计合成编码抗菌肽基因，将抗菌肽的编码基因克隆到载 体pPIC9载体中，然后转化毕氏酵母菌株，甲醇诱导表达蛋白。有关的DNA分离、纯化、PCR扩增、 质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙穆克鲁克等编著的《分子克隆试验指南》 进行。
实施例二抗菌肽对分支杆菌的抑菌作用研究
1. 培养基
7H9琼脂半流培养基Middlebrook 7H9干粉(SIGMA M0178) 4. 7g，丙三醇4ml，琼脂粉0. 5g，加 蒸馏水至900ml， 15磅121。C高压灭菌10分钟，冷却后加入0ADC至1000ml，待用。 苏通半流体培养基称取谷氨酸钠4.0 g,枸橼酸1 g, K2HP040.25 g， MgS04 7H20 0.25 g，枸橼酸 铁铵0.025 g,甘油15ml,琼脂粉0.25 g,加入蒸馏水后加热使其完全溶解，冷却后以8% Na0H调 pH至7.2，用蒸馏水定容至500ml,分装，121'C高压灭菌20分钟，待用。
2. 药物对照药品为异烟肼；测试药品为天龙抗菌肽。
3. 菌株结核分枝杆菌标准株6)fyco6a"eWuffl z^6ercwiosi's H37Rv, ATCC 27294);金色分枝杆菌 況at/27碼^ rc^^6e;;耐异烟肼结核杆菌株；多耐药结核杆菌株:耐利福平结核杆菌株
4. 药效评价标准肉眼观察各个培养管中分支杆菌的生长，并同麦氏比浊管1号、2号、3号、4号比 浊，无分支杆菌生长表示有分支杆菌生长并同1号比浊管相近表示"+";同2号比浊管相近 表示"++"，依次类推,其中+号的多少反映出分支杆菌相对生长的多少。
操作步骤
将药液倍比稀释为3个梯度，分别为20ng/ml ， 1(Hig/ml , 5ng/ml， 2.5pg/ml, 1.25ng/m。 接种菌株取分枝杆菌新鲜分支杆菌，加0.5先Tween-80生理盐水磨菌稀释，与1号麦氏比浊管比浊，制 成lmg/ml菌液上述新鲜菌落，稀释成10—3ntg/ml菌液，每管培养基接种0. lml。最终接种量为10 4mg。 37'C温箱孵育15天观察结核菌生长
实验为双管平行操作，每次实验重复两次，取平均值，结果如表一
表一天龙抗菌肽抑制结核菌生长的作用
最小抑菌浓度(ug/ml)
菌株
天龙抗菌肽结核分枝杆菌标准株H37Rv2. 5
金色分枝杆菌
5.0
耐异烟肼结核杆菌株10.0
耐利福平结核杆菌株10.0
多耐药结核杆菌株10.0实施例三
女，41岁，2000年时因咳嗽、咳痰，拍片检査诊断为肺结核，用异烟肼、利复平、吡嗪酰胺、乙胺 丁醇治疗后病情无明显好转，药敏试验为多耐药难治性结核(耐异烟肼、利复平)，咳嗽、咳痰，痰菌 阳性，且肺上有空洞。口服所述抗菌肽20mg, tid，维持3周，空洞闭合，痰菌阴转，临床症状消失，遂 停药。
实施例四
男，59岁。2001年时因咳嗽、咳痰、乏力不适，拍片检査发现患空洞型肺结核，用异烟肼、利福平、 乙胺丁醇等抗结核治疗，病情无明显好转，经常咳嗽、咳痰、盗汗、纳差，痰菌3(+),且药敏试验为多耐 药难治性结核，胸片显示两肺继发型肺结核伴空洞。2004年用天龙抗菌肽40mg， tid,治疗4周，患者无 不适症状，痰菌阴转，空洞闭合，胸片上病灶稳定，遂停药。序列表
<110>工鹤尧
< 120〉 ■-种治疗结核杆齒感染的基W 丁程合成多肽药物制备和应用 <丄60〉 I <400〉 J
Vai Cys Glu Arg I,eu Arg Val Va.l Arg Ala 1 5 10
I-euCys ArgArg Va'lMet Arg Trp Val His
15 20
Arg
<210> 1 <211〉 21 <213>人T.序列 <220〉
<221> Cf腦
权利要求
1.一种合成抗菌肽，其特征在于该抗菌肽是依据天龙中天然分离多肽而衍生合成得到的一种单链多肽。
2. 权利要求1所述多肽全序列结构为缬氨酸一半胱氨酸一谷氨酸一组氨酸一异亮氨酸一组氨酸一亮 氨酸一异亮氨酸一精氨酸一甘氨酸一亮氨酸一半胱氨酸一组氨酸一组氨酸一亮氨酸一甲硫氨酸一组 氨酸一半胱氨酸一酪氨酸一异亮氨酸一赖氨酸一精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCH肌MHC YIKR-COOH )。
3. 权利要求1所述的合成抗菌肽在治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染疾病的药物中的应用。
4. 权利要求1所述的合成抗菌肽在制备治疗多耐药结核杆菌包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染 疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，提供一种天龙抗菌肽衍生物制备方法，用于治疗结核杆菌的感染。天龙抗菌肽衍生物，为依据中国两栖类动物天龙中分离得到的天然多肽而合成的一种单链多肽，多肽一级全序列结构为缬氨酸—半胱氨酸—谷氨酸—组氨酸—异亮氨酸—组氨酸—亮氨酸—异亮氨酸—精氨酸—甘氨酸—亮氨酸—半胱氨酸—组氨酸—组氨酸—亮氨酸—甲硫氨酸—组氨酸—半胱氨酸—酪氨酸—异亮氨酸—赖氨酸—精氨酸(NH2-VCEHIHLIRGLCHHLMHCYIKR-COOH)。天龙抗菌肽衍生物药物可显著抑制包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌生长，可应用于治疗包括多耐药结核杆菌在内的结核杆菌感染的药物。
文档编号A61P31/04GK101293928SQ20071009728
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者孔繁翠, 王鹤尧, 葵 邱, 郑文婕, 昊 顾 申请人:王鹤尧;郑文婕