专利名称：一种修饰的猪圆环病毒2型orf2基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学与基因工程学技术领域。具体地说涉及一种猪圆环病毒2型ORF2基因的修饰，还涉及该基因修饰后的免疫原性评价及其在新型DNA疫苗中的应用。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，简称PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic syndrome，PMWS)的主要病原。该病最早于1991年在加拿大西部发现(Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am Assoc Swine Pract，1997，28499-501)，其临床症状主要表现为进行性消瘦，呼吸道症状、发热及黄疸等。随后，该疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国或地区出现(Daft B等.Interstitial pneumoniaand lymphadenophathy associated with circoviral infection in a six week-old pig.Proc Am AssocVet Lab Diag，1996，3932；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.Vet Rec，1998，142495-496；LeCann P等.Piglet wasting disease.Vet Rec，1997，141660；Segales J等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141600-660)。在国内，郎洪武等(郎洪武等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，303-5)和曹胜波等(曹胜波等.猪II型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析.病毒学报，2000，18137-141)分别通过血清学和病原学调查表明，我国已有PCV2的流行。目前，PCV2已在世界各地广泛存在并流行，给全球养猪业造成了相当大的经济损失。
由于PCV2的生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，虽然使用D-氨基葡萄糖处理细胞后病毒滴度可以升高(Tischer I等.Replication of porcine circovirusinduction by glucosamine and cell cycle dependence.Arch Virol，1987，9639-57)，但D-氨基葡萄糖有细胞毒性而使细胞很快死亡，因此用于发展预防PCV2的灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大。基于此，利用基因工程方法用于研制PCV2的疫苗(DNA疫苗、亚单位疫苗等)将成为防制该病的重要方向。但亚单位疫苗由于成本过高，在临床应用上将受到很大限制。而DNA疫苗与传统疫苗相比具有许多优越性首先是DNA疫苗制备工艺简单，只需提取质粒即可；其次是DNA疫苗所含的抗原很纯，没有蛋白质的污染；此外，DNA疫苗可以突破机体母源抗体的干扰，无论机体内母源抗体是否存在，DNA疫苗都可以产生相应的免疫应答，这对断奶仔猪免疫保护反应的产生与维持相当重要。因此，DNA疫苗在PCV2相关疾病的防制方面具有很广泛的应用前景。
猪圆环病毒2型ORF2基因是PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，主要定位于细胞核质内，可自我装配成病毒样粒子(Nawagitgul P等.Open reading frame 2 ofporcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein.J Gen Virol，2000，812282-2287)，并且McNeilly等(McNeilly F等.Production，characterization and applications of monoclonalantibodies to porcine circovirus 2.Arch Virol，2001，146909-922)研究证实ORF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，因此是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。Blanchard等(Blanchard P等.Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)by porcine circovirus type 2(PCV2)proteins.Vaccine，2003，214565-4575)利用PCV2ORF1和ORF2基因的DNA疫苗和亚单位疫苗研究发现，无论是DNA疫苗还是亚单位疫苗对PCV2感染都具有一定的免疫保护效果，且ORF1和ORF2联合免疫的疫苗可诱导中和抗体的产生。Kamst等(Kamstrup S等.Immunisation against PCV2 structural protein by DNAvaccination of mice.Vaccine，2004，221358-1361)也用ORF2基因的核酸疫苗免疫小白鼠，发现在首免后62d小鼠体内可检测到较高的抗体水平。但上述研究均发现表达ORF2蛋白的DNA疫苗诱导的中和抗体及细胞免疫水平不高。Andrew等(Andrew M等.The immunogenicityof VP7，a rotavirus antigen resident in the endoplasmic reticulum，is enhanced by cell surfaceexpression.J Virol，1990，644776-4783)用重组痘苗病毒作为载体研究轮状病毒VP7蛋白的免疫原性时发现，野生型VP7的胞内定位限制了它免疫原性的发挥，而表达可锚定于宿主细胞膜表面的修饰型VP7基因可诱导更高的抗体的水平，免疫原性较野生型大大提高。基于这一发现，我们对猪2型圆环病毒的ORF2基因进行了修饰，即根据人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator，tpA)的信号肽序列(Tong T Z等.C3d enhanced DNAvaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)和禽流感病毒HA基因跨膜区的氨基酸序列(Melikyan G B等.Amino acid sequence requirements of thetransmembrane and cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membranefusion.Molecular Biology of the Cell，1999，101821-1836)，对ORF2基因进行添加信号肽和跨膜区的修饰，以达到修饰后的ORF2基因表达蛋白锚定于细胞膜表面，并以DNA疫苗的方式比较了修饰与未修饰的ORF2基因的免疫原性及其诱发的免疫反应。
发明内容
本发明的第一个目的是对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行修饰，使其表达后可锚定于宿主细胞膜表面，获得一种免疫原性更好的ORF2基因。
本发明的第二个目的是提供一种表达猪圆环病毒2型修饰的ORF2基因的DNA疫苗。
本发明的第三个目的是利用本发明经过改造和修饰ORF2基因及表达质粒在制备猪断奶多系统衰竭综合症疫苗中的应用。
本发明通过以下技术方案实施一种修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
一种修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因是利用人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(humantissue plasminogen activator，tpA)的信号肽序列替换天然ORF2基因N-端的41个氨基酸，并缺失ORF2基因终止子，在其C端融合禽流感病毒HA基因跨膜区序列而获得。
所述的表达猪圆环病毒2型修饰的ORF2基因的DNA疫苗是将修饰的ORF2基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamHI与XhoI位点构建而成，包含该真核质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/pcDNA-spORF2Δ41TM，于2007年5月16日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NOM207069。
本发明还包括上述修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因及真核表达质粒在制备猪断奶多系统衰竭综合症疫苗中的应用。
更详细的方案如下列步骤所述一、PCV2 ORF2基因的修饰和表达修饰的ORF2基因的DNA疫苗的构建1、引物的设计根据人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator，简称tpA)tpA的信号肽(Tong T Z等.C3d enhanced DNA vaccination induced humoral immune response toglycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)和禽流感病毒HA基因跨膜区的氨基酸序列(Melikyan G B等.Amino acidsequence requirements of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza virushemagglutinin for viable membrane fusion.Molecular Biology of the Cell，1999，101821-1836)，利用PCR扩增结合DNA拼接、克隆的方法(参见J.萨姆布鲁克等，王嘉玺等译.分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002年版)对ORF2基因进行添加信号肽和跨膜区的修饰。通过PCR的方法缺失ORF2基因N端的41个氨基酸，获得ORF2Δ41基因。在此基础之上进一步通过PCR方法去掉ORF2Δ41基因的终止子，在其C端融合禽流感病毒HA跨膜区的氨基酸序列(Melikyan G B，等.Amino acid sequence requirements of the transmembraneand cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membrane fusion.MolecularBiology of the Cell，1999，101821-1836)，从而获得修饰型的ORF2基因(spORF2Δ41TM)。将spORF2Δ41TM基因插入真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建重组质粒pcDNA-spORF2Δ41TM。引物P8和P17用于扩增缺失ORF2基因的全部核定位序列(即缺失ORF2基因N端41个氨基酸)和不含终止子的ORF2基因片段，扩增片段大小为582bp，两端依次设计EcoRV位点和Not I位点。引物P18和P11用于扩增禽流感病毒HA跨膜区的氨基酸序列，片段大小为126bp，两端依次设计Not I位点和Xho I位点。引物PtPAF和PtPAR可以直接退火，形成长度为63bp编码21个氨基酸的双链tPA序列(Tong T Z等.C3d enhancedDNA vaccination induced humoral immune response to glycoprotein C of pseudorabies virus.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，347845-851)，两端依次设计BglII位点和BamH I位点。引物P3和P4可用于扩增ORF2基因的完整编码区，上下游引物两端分别设计了Hind III和Sal I位点。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下
P35’-CAAAAGCTTACCATGACGTATCCAAGGAGG-3’P45’-TATGTCGACTCACTTAGGGTTAAGTGG-3’P85’-CATGATATCATGAATGGCATCTTCAACACC-3’P115’-AGGCTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTG-3’P175’-TATGCGGCCGCCTTAGGGTTAAGTGGGGG-3’P185’-ATAGCGGCCGCAACTTACCAAATACTG-3’PtPAF5’-GATCTATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGG-3’PtPAR5’-GATCCCAGAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCAGCACACAGCAGAGCCCTCTCTTCATTGCATCCATA-3’2、PCR扩增以含PCV2豫A株(Genebank登录号AY035820)完整基因组的质粒pT-PCV2(郗鑫等，猪II型圆环病毒全基因组的克隆及感染性鉴定.微生物学报，2004，44172-176)为模板进行ORF2基因的扩增，ORF2基因序列的扩增条件为95.0℃ 5min变性后进入循环，循环参数为95.0℃ 1min，55.0℃ 1min，72.0℃ 1min，35个循环后72.0℃延伸10min。以含禽流感病毒H9亚型的HA基因的质粒pMD-HA(张瑞华等，禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用.生物工程学报，2005，21315-319)为模板进行扩增，HA的跨膜区(TM)的氨基酸序列的PCR扩增条件为94℃ 5min；进入PCR循环，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，进行35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。tPA双链DNA可以通过引物PtPAF和PtPAR混合，94℃ 5min后于42℃直接退火10min获得。
3、修饰ORF2基因的获得及其真核表达质粒的构建利用引物P8、P17进行PCR扩增ORF2基因，获得缺失ORF2基因N端41个氨基酸和终止子的ORF2Δ41基因片段，回收该基因片段并用EcoR□和Not I双酶切后，插入到pcDNA3.1(+)(购自美国Invitrogen公司)的EcoRV和Not I位点之间，获得重组质粒pcORF2Δ41。进一步利用P11、P18引物扩增HA基因的跨膜区(TM)序列，将获得跨膜区PCR产物用Not I和Xho I双酶切后，与Not I和Xho I酶切的pcORF2Δ41质粒连接，获得ORF2Δ41基因C端添加跨膜区序列的ORF2Δ41TM基因片段。利用PtPAF、PtPAR引物直接退火获得的tPA双链DNA的两端粘性末端直接插入包含ORF2Δ41TM基因片段的真核质粒pcDNA-ORF2Δ41TM的BamHI为点，从而完成对ORF2基因添加信号肽和跨膜区的工作，获得修饰型的ORF2基因(spORF2Δ41TM)和表达该修饰型基因的真核表达质粒pcDNA-spORF2Δ41TM，其经酶切与PCR鉴定证实构建正确。spORF2Δ41TM基因经测序表明构建正确，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
二、用于对比试验的表达未修饰ORF2基因的DNA疫苗pcORF2的构建以包含PCV2豫A株((Genebank登录号AY035820))全基因组的重组质粒pT-PCV为模板(曹胜波等，猪II型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析，病毒学报，2002，18(2)137-141)，以P3、P4为引物进行ORF2基因完整编码区的PCR扩增，扩增大小为705bp。PCR反应条件为94℃ 5min；进入PCR循环，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。纯化回收目的片段，纯化的扩增产物经Hind III、Sal I双酶切后，直接克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)(购自美国Invitrogen公司)的Hind III、Sal I位点间，获得表达天然ORF2基因的重组真核质粒pcORF2，经HindIII、Sal I和HindIII和Sal I酶切与PCR鉴定证实构建正确，测序证实无碱基误配。
三、质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大量制备(1)挑取含有质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的菌落接种于75mL LB培养液，37℃ 300r/min培养过夜，6000r/min 5min，收集细胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，按照常规高压灭菌方法在121℃灭菌20分钟后后置4℃保存备用)悬浮(吹散或涡旋)。
(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，现配现用)，冰浴7-10min。
(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃10000r/min 10-15min。
(4)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，-20℃ 30min或室温5min。室温，10000r/min6-15min。
(5)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/LTris-HCl，1.0mmol/L EDTA)悬浮(洗壁20min左右)。
(6)加1.5ml即1倍体积冰预冷的5mol/L NH4Ac，混匀。4℃10000r/min 10min。
(7)将上清转移至7mL的离心管，加1倍体积(3mL)的异丙醇混匀，-20℃作用30min。12000r/m 15min。
(8)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE悬浮(洗壁20min左右)，并转移至1.5mL的离心管。
(9)加入适量的RNase，37℃ 1h，去RNA。
(10)加1倍体积的13％的聚乙二醇8000(PEG8000)(含1.6mol/L NaCl)，混匀，-20℃ 30min(可以过夜)。离心，弃上清，用400μL TE重溶。
(11)加等体积酚∶仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次。
(12)加100μl 10mol/L NH4Ac，充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃ 12000r/min离心5-10min。
(13)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50μL TE或H2O重溶，置-20℃备用。
四、猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗的生产工艺猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗生产工艺的主要流包括质粒的转化、质粒的大量提取、质粒浓度的测定与稀释。
1、质粒的转化将DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2(氨苄抗性)分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。具体操作是1)取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入10μl连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。4)每管加400μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。5)取100μl转化的感受态细胞转移到含氨苄抗性的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。
2、质粒的大量提取同上述“二、质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大量制备”的方法(本处省略该详细制备步骤)。
3、质粒浓度的测定、稀释利用分光光度计测定大提质粒的浓度，用磷酸盐缓冲液(简称PBS，配方如下NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaHPO4(12H2O)2.9g，KH2PO40.2g，pH7.4)将其稀释到1μg/μl，即可用于Balb/c小鼠注射。
五、猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗的免疫效力检验将DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2(分别经后腿肌肉注射6周龄的Balb/c小鼠)，每组6只，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫2次，间隔2周；同时用空白载体质粒pcDNA3.1(+)作为核酸免疫的阴性对照。于首次免疫后2、4、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测中和抗体；于首免后6周，通过颈椎处死所有免疫小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液(购自天津TBD公司)分离脾淋巴细胞，进行细胞免疫(包括脾淋巴细胞刺激增殖指数和IFN-γ的mRNA转录、分泌水平检测(Xiao等Comparison of immuneresponses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine and conventional DNA vaccineencoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice.Vaccine.2004，22，345-351)。结果显示本发明构建的表达修饰ORF2基因的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM诱导中和抗体与细胞免疫反应均明显高于表达未修饰的ORF2基因的DNA疫苗pcORF2，展示了本发明修饰的ORF2基因(spORF2Δ41TM)更好的免疫原性。
序列表SEQ ID NO1是本发明中修饰的ORF2基因序列图1显示了本发明中的表达修饰的PCV2豫A株(GenBank登录号AY035820)ORF2基因DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和未修饰的ORF2基因DNA疫苗pcORF2的结构2显示了本发明中的表达修饰的ORF2基因DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM的酶切和PCR鉴定结果图3显示了猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后的中和抗体水平图4显示了猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后诱导的脾淋巴细胞刺激增殖指数图5显示了猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后，用ELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-γ的水平图6显示了猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM和pcORF2免疫Balb/c小鼠后，用荧光定量RT-PCR方法检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-γ的mRNA相对水平。
具体实施例方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。
实施例1含有本发明修饰的基因的质粒和含有对照基因的质粒的制备1、表达未修饰的ORF2基因的真核质粒pcORF2的构建以pT-PCV为模板，P3和P4为引物扩增ORF2基因，回收并纯化扩增产物，用Hind III、Sal I双酶切后，直接克隆到用相同酶切处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)的Hind III、Sal I位点间，获得重组质粒pcORF2。其结构见图1。
2、表达修饰的ORF2基因的真核质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的构建利用引物P8、P17进行PCR扩增ORF2基因，获得缺失ORF2基因N端41个氨基酸和终止子的ORF2Δ41基因片段，回收该基因片段并用EcoR□和Not I双酶切后，插入到pcDNA3.1(+)(购自美国Invitrogen公司)的EcoR V和Not I位点之间，获得重组质粒pcORF2Δ41。进一步利用P11、P18引物扩增HA基因的跨膜区(TM)序列，将获得跨膜区PCR产物用Not I和Xho I双酶切后，与Not I和Xho I酶切的pcORF2Δ41质粒连接，获得ORF2Δ41基因C端添加跨膜区序列的ORF2Δ41TM基因片段。利用PtPAF、PtPAR引物直接退火获得的tPA双链DNA的两端粘性末端直接插入包含ORF2Δ41TM基因片段的真核质粒pcDNA-ORF2Δ41TM的BamHI为点，从而完成对ORF2基因添加信号肽和跨膜区的工作，获得修饰型的ORF2基因(spORF2/Δ41TM)和表达该修饰型基因的真核表达质粒pcDNA-spORF2Δ41TM，其经酶切与PCR鉴定证实构建正确。该真核表达质粒pcDNA-spORF2Δ41TM结构见图1，鉴定结果见图2。
实施例2本发明的猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗和对照疫苗对小鼠免疫效力的生物学实验1)Balb/c小鼠的免疫程序将Balb/c小鼠分为3组，分别为本发明的猪断奶多系统衰竭综合症DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM、pcORF2免疫组和空白载体pcDNA3.1(+)对照组，每组6只，采用后腿肌肉注射，每只小鼠100μl(含100μg质粒)，共免疫2次，间隔2周。在首免后2、4、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测中和抗体。于首免后6周，通过颈椎处死所有免疫小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液(购自天津TBD公司)分离脾淋巴细胞，进行细胞免疫(包括脾淋巴细胞刺激增殖指数和IFN-γ的mRNA转录、分泌水平)检测(Xiao等Comparison of immune responses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine andconventional DNA vaccine encoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice.Vaccine.2004，22，345-351)。
2)中和抗体水平检测采用Wang等报道(Wang X等.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirusexpressing the capsid protein of porcine circovirus 2(PCV2)in mice.Vaccine，2006，243374-3380)的PCV2的中和抗体检测方法，检测血清中特异性抗PCV2的中和抗体水平，结果表明未经修饰的DNA疫苗pcORF2免疫组的中和抗体水平不高，并且上升得较为缓慢，而本发明修饰改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫组的中和抗体快速上升，达到较高水平，与pcORF2免疫组相比差异显著(P＜0.05，t-test)，试验结果如图3。
3)脾淋巴细胞刺激增殖指数检测采用MTT法测定小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)(沈关心等主编.现代免疫学实验技术.湖北科学技术出版社，1998年版)。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫组的刺激增殖指数要显著高于未经修饰的DNA疫苗pcORF2免疫组(P＜0.01，t-test)。试验结果如图4。
4)ELISPOT方法检测脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平采用ELISPOT方法(龙振洲.医学免疫学(第2版).北京人民卫生出版社，2000年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后分泌IFN-γ的能力。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫组的分泌IFN-γ水平要显著高于未经修饰的DNA疫苗pcORF2免疫组(P＜0.01，t-test)。试验结果如图5。
5)荧光相对定量RT-PCR方法检测淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-γ的mRNA水平采用荧光相对定量RT-PCR方法(参见章静波等.细胞生物学实验技术.化学工业出版社，2006年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN-γ的mRNA水平。小鼠脾淋巴细胞在体外经特异抗原(PCV2)刺激后，提取总RNA，利用oligo dT将mRNA体外转录成cDNA。利用引物β-actins5’-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-3’，B-actinr5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’扩增小鼠看家基因β-actin，并将其作为相对定量RT-PCR的内参；引物IFN-γs5’-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3’，IFN-γr5’-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3’，扩增小鼠IFN-γ基因。荧光定量PCR反应体系(25μl)包括IFN-γ和β-actin上下游引物各0.5μl(10μM)，2×SYBRGreen Realtime PCR MasterMix(包括反应缓冲液、dNTP、Mgcl2、SYBR Green□、Taq酶)(购自ToYoBo公司，上海)12.5μl，双蒸水11.0μl，cDNA样品0.5μl。每个样品做三个重复。反应扩增条件为50℃2min，94℃预变性10min紧接着40个循环的94℃变性15s和60℃退火与延伸1min。整个反应过程中的荧光信号的变化由ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪(购自美国Applied Biosystems公司)检测。结果本发明经修饰改造后的DNA疫苗pcDNA-spORF2Δ41TM免疫组IFN-γ的mRNA水平要明显高于未经修饰的DNA疫苗pcORF2免疫组(P＜0.01，t-test)。试验结果如图6。
附录术语定义
序列表<110>华中农业大学<120>一种修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因及应用<130>
<141>2007-04-11<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>822<212>DNA<213>猪圆环病毒(Porcine circovirus)<220>
<221>gene<222>(1)..(822)<223>
<400>1atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60tcgggatcca ctagtccagt gtggtggaat tctgcagata tcatgaatgg catcttcaac120acccgcctct cccgcacctt cggatatact gtcaagaaaa ccacagtcag aacgccctcc180tgggcggtgg acatgatgag atttaatatt aacgatttcc ttcccccagg agggggctca240aaccccctca ctgtgccctt tgaatactac agaataagaa aggttaaggt tgaattctgg300ccctgctccc caatcaccca gggtgacagg ggagttggat ccactgctgt tattctagat360gataactttg taacaaaggc cacagccctg acttatgatc cctatgtaaa ctactcctcc420cgccatacca taacccagcc cttctcctac cactcccggt actttacccc gaaacctgtt480cttgattcca ctattgatta cttccaacca aataacaaaa ggaatcagct ttggctgagg540ctacaaacct ctgcaaatgt ggaccacgta ggcctcggca ctgcgttcga aaacagtata600tacgaccagg actacaatat ccgtgtaacc atgtatgtac aattcagaga atttaatctt660aaagaccccc cacttaaccc taaggcggcc gcaacttacc aaatactgtc aatttattca720acagtggcga gttccctagc actggcaatc atggtagctg gtctatcttt atggatgtgc780tccaatggat cgttacaatg cagaatttgc atttaactcg ag 82权利要求
1.一种修饰的猪圆环病毒2型的ORF2基因，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.表达权利要求1中所述基因的真核质粒pcDNA-spORF2Δ41TM的大肠杆菌DH5α/pcDNA-spORF2Δ41TM，其保藏号为CCTCC NOM207069。
3.一种包含权利要求1所述基因的DNA疫苗。
4.一种包含权利要求2所述质粒的DNA疫苗。
5.权利要求1所述的基因在制备猪断奶多系统衰竭综合症疫苗中的应用。
6.权利要求2所述的质粒在制备猪断奶多系统衰竭综合症疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于动物基因工程与动物病毒学技术领域。具体涉及一种修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因及其应用。其特征在于，将人组织纤维蛋白溶酶原激活剂的信号肽序列替换天然ORF2基因N－端的41个氨基酸，并缺失ORF2基因终止子，在其C端融合禽流感病毒HA基因跨膜区序列而获得的一种修饰型ORF2基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。表达所述基因的真核质粒pcDNA－spORF2△41TM的大肠杆菌DH5α/pcDNA－spORF2△41TM，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NOM207069。本发明还公开了该基因与质粒在制备猪断奶多系统衰竭综合症疫苗中的应用。
文档编号A61K48/00GK101092631SQ20071009988
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者肖少波, 樊惠英, 方六荣, 江云波, 谢立兰, 陈焕春 申请人:华中农业大学