专利名称：具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与该融合蛋白的表达方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。
背景技术：
近年来，中国的癌症患者人数一直居高不下，据《中国人口学报》统计，2005年中国的癌症患者人数达200万，其中140万不能得到有效医治，因此抗癌药物的研制成为了科技工作者的研究重点。传统的肿瘤治疗方法主要是针对肿瘤细胞，但在治疗过程中，常常由于肿瘤细胞发生遗传突变而产生抗药性，或由于化疗药物的毒副作用累积，导致整个治疗失败。
70年代，Judah Folk man提出了对抗肿瘤血管可以治疗肿瘤的假说[石伟，蔡瑞，张延龄，等.肿瘤血管生成抑制物作用机制及应用研究进展.国外医学肿瘤学分册，2001，28(1)36-39]从而将抗肿瘤药物的研究带入了一个新的时代。肿瘤的生长和转移离不开新生血管。诸多研究表明，肿瘤血管生成是一个多因子参与的多步骤过程，基本步骤包括①肿瘤组织释放血管生成刺激因子；②血管周围细胞外基质重塑，基膜降解；③内皮细胞增殖、迁移；④新生血管成形。阻断其中任何一步，都将阻碍肿瘤血管生成。近20多年来，许多具有抗血管生成作用的物质相继被报道，它们在血管生成的各个环节发挥作用，从而抑制肿瘤血管生成。
内皮抑素(Endostatin)是近年来发现的具有上述特异抗肿瘤作用的最有效血管生成抑制因子之一。1997年，美国哈佛大学医学院O’Reilly和Folk man等[O′ReillyMS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatinan endogenous inhibitor of angiogenesisand tumor growth.Cell，1997，88(2)277-285]首先从鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)培养液中分离纯化到Endostatin。Endostatin为胶原蛋白XVIII的C末端片段，编码184个氨基酸，分子量为20kDa。内皮抑素抗肿瘤作用是通过抑制血管内皮细胞的增殖，增加凋亡，使肿瘤细胞维持在持续休眠状态实现的。采用内皮抑素作为抗肿瘤药物具有靶向性强、毒副作用小及不产生耐药性等优点。以血管内皮细胞为靶向的内皮抑素不会发生耐药性的根本原因在于内皮细胞是人体的正常细胞，具有相对的基因稳定性。内皮抑素是当前抗血管疗法中最具潜力的药物蛋白。早在1999年，美国FDA就批准了由巴斯德毕赤酵母表达的重组人内皮抑素作为治疗肿瘤药物的I期临床试验，2001年此项研究进入II期临床阶段。近年来，我国也开展了相关研究，但也存在着一些问题其一，内皮抑素表现出明显的剂量依赖性的抑制作用，动物(鼠)试验表明，注射剂量为100ng内皮抑素/mL时，可抑制内皮细胞的增殖，当达到或超过600ng/mL时，抑制效应达到最大值，可见内皮抑素的需求量比较大；其二，内皮抑素的半衰期比较短，约为(10.7±4.1)h，病人需要每天大剂量注射，因此很多患者难以承受昂贵的医药费。
大肠杆菌具有产量高、成本低、生产周期短的特点，但胞内高水平表达的外源蛋白大多以不溶解、无活性的包涵体形式存在，而目前由包涵体中提取高水平、高比活的目标蛋白的最大问题是回收率低，大部分目标蛋白在复性中析出丢失；杆状病毒存在糖基化序列与天然蛋白不一致且蛋白表达产量不稳定等缺点，因此上述表达系统均不适用于外源蛋白的表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种效果显著且半衰期较长的具有抗血管生成作用的融合蛋白。
本发明所提供的融合蛋白，命名为Endo-Albu，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)将序列表中SEQ ID NO1-3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗血管生成作用的蛋白质。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
序列表中的SEQ ID NO1由790个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第6-188位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第204-788位为人白蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第189至203位为连接肽(Gly4Ser)3序列；序列表中的SEQ ID NO2由785个氨基酸残基组成，自氨基端第6-188位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第199-783位为人白蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第189-198位为连接肽(Gly4Ser)2序列；序列表中的SEQ ID NO3由780个氨基酸残基组成，自氨基端第6-188位为人内皮抑素的氨基酸残基序列，自氨基端第194-778位为人白蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第189-193位为连接肽(Gly4Ser)序列。
编码上述具有抗血管生成作用的融合蛋白的基因(Endo-Albu)也属于本发明的保护范围，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO5的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)编码序列表中SEQ ID NO1-3的DNA序列；5)与序列表中SEQ ID NO4-6限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有抗血管生成作用的核苷酸序列；6)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO4-6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO4由2375个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2373位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第16-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第610-2367位碱基为人白蛋白的编码序列，自5’端第565-609位碱基为连接肽(Gly4Ser)3的编码序列；序列表中的SEQ ID NO5由2360个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2358位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第16-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第595-2352位碱基为人白蛋白的编码序列，自5’端第565-594位碱基为连接肽(Gly4Ser)2的编码序列；序列表中的SEQ ID NO6由2345个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2343位碱基，编码具有序列表中SEQID NO3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第16-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第580-2337位碱基为人白蛋白的编码序列，自5’端第565-579位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种表达上述具有抗血管生成作用的融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述具有抗血管生成作用的融合蛋白方法，是将含有上述具有抗血管生成作用融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抗血管生成作用的融合蛋白。
上述具有抗血管生成作用融合蛋白编码基因在上述重组表达载体中的拷贝数至少为1。
为便于分泌蛋白的翻译后加工，上述重组表达载体中具有抗血管生成作用融合蛋白编码基因的5’端还连接有酵母分泌信号序列；所述酵母分泌信号序列可为α因子前导肽、蔗糖酶或酸性磷酸酯酶信号肽的编码序列，优选为α因子前导肽的编码序列，其中α因子前导肽编码序列中具有信号指引作用的部分序列可具有序列表中SEQ IDNO7的核苷酸序列。
所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)。
所述大肠杆菌可为E.coli JM109、E.coli HB101或E.coli Top10。
用于构建所述重组酵母表达载体的出发载体为任意一种可在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9、pPIC6α、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K等。
以pPIC9为出发载体构建的重组酵母表达载体为Endo-Albu/pPIC9；以Endo-Albu/pPIC9和pPIC9K为出发载体构建的重组酵母表达载体为Endo-Albu/pPIC9/9K。
当所述宿主为巴氏毕赤酵母时，需用甲醇进行诱导表达，甲醇的终浓度可为0.25-1％(体积/体积百分比浓度，V/V)，优选为0.5％。
上述重组表达载体Endo-Albu/pPIC9和Endo-Albu/pPIC9/9K可按照常规方法构建。
培养含有本发明的具有抗血管生成作用的融合蛋白编码基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
本发明还提供了一种抗血管生成和/或肿瘤治疗性药物。
本发明所提供的抗血管生成和/或肿瘤治疗性药物，它的活性成分为上述具有抗血管生成作用的融合蛋白。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊或口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的用量一般为1-50μg具有抗血管生成作用的融合蛋白/kg体重，每隔7-14天给药一次，疗程一般为3至12个月。
本发明提供了一种具有抗血管生成作用的融合蛋白Endo-Albu及其编码基因。该融合蛋白是以柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3作为连接肽(linker)，将人内皮抑素(Endostatin)与人血清白蛋白(Human Serum Albumin)融合在一起得到的融合蛋白，该融合蛋白具有下述优点1)人内皮抑素能特异性地抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制新生血管的生成，其突出特点是疗效显著，特异性强；无明显毒副作用，对人正常成熟状态下静止的内皮细胞或其它细胞无影响；反复用药，不产生耐药性。实验结果表明，该融合蛋白既能特异性地抑制血管内皮细胞地增殖，从而抑制新生血管地生成，又能特异性诱导肿瘤细胞凋亡。
2)本发明将人内皮抑素与人血清白蛋白融合，可显著延长内皮抑素的半衰期，实现重组内皮抑素的长效性。
3)柔性肽易于弯曲，可使表达蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。本发明所用的甘氨酸接头-Gly4Ser、(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3除具有上述优点外，还富含甘氨酸和丝氨酸，其构象一般在X-射线和NMR的结构分析中都难于测定，但这种构象常常对蛋白质的功能发挥具有特定意义，即通过这种柔性肽段的运动，既可以将蛋白质的活性中心打开，也可以将其关闭，以适应在活性发挥不同阶段对不同立体化学环境的要求。
4)分泌信号肽的作用是引导分泌蛋白在细胞内沿着正确的途径转移到胞外，对于分泌蛋白的翻译后加工和生物学活性具有重要意义。本发明利用甲醇营养型酵母-Pichia.pastoris表达系统进行该融合基因的表达，该表达系统不仅可对表达蛋白进行正确的加工、修饰，以及合理的空间折叠，还可提高蛋白质的表达量，特别是在目的基因前加上α因子前导肽编码序列中具有信号指引作用的部分序列“CTCGAGAAAAGA”后，既保证了蛋白质的正确分泌，又可使目的蛋白具有天然活性。因此，用该系统进行外源基因的表达具有表达产物易纯化，生产周期短，生产规模大，制备成本低的优点，适合工业化生产。
综上所述，本发明的融合蛋白及其编码基因将在医学和生物制药领域，尤其是抗血管生成和/或肿瘤治疗性药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为PCR扩增的Endostatin的琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为PCR扩增的Albumin的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为重叠PCR扩增的Endo-Albu的琼脂糖凝胶电泳检测结果图4A1为对构建的Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9进行的PCR鉴定结果图4B1为对构建的Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9进行的酶切鉴定结果图4A2为对构建的Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9/9K进行的PCR鉴定结果图4B2为对构建的Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9/9K进行的酶切鉴定结果图5A为转化有Endo-Albu/pPIC9的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子的菌落PCR检测结果图5B为转化有Endo-Albu/pPIC9/9K的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子的菌落PCR检测结果图6为表达EndoAlbu的阳性转化子的原位双膜法鉴定结果图7为重组毕赤酵母经诱导培养后的总分泌蛋白表达量的BCATM蛋白检测试剂盒测定结果图8为转化有Endo-Albu/pPIC9的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子经诱导表达后分泌表达的外源蛋白Endo-Albu的SDS-PAGE检测结果图9A和图9B为转化有Endo-Albu/pPIC9/9的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子表达的分泌性外源蛋白Endo-Albu的Western Blot鉴定结果图10为经纯化的Endo-Albu融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图11为Endo-Albu融合蛋白对CAM血管生成抑制作用的实验结果图12为不同Endo-Albu蛋白浓度下的ECV-304细胞增殖抑制率的检测结果图13为不同浓度的Endo-Albu与人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖抑制率的指数曲线拟合图14为重组酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9/9K的构建流程图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有引物合成和测序工作均由三博公司完成。
实施例1、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的获得一、人内皮抑素基因(Endostatin)片段的克隆1、引物设计根据人内皮抑素基因的mRNA序列(GenBank号AJ494837)设计PCR扩增该基因的引物，并在上游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I识别位点及α因子前导肽编码序列中具有信号指引作用的部分序列，引物序列如下EndoF(上游引物)5’-CCG CACAGCCACCGCGACTTCCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点；方框内碱基为为α因子前导肽编码序列中具有信号指引作用的部分序列，即序列表中的SEQ ID NO7)；EndoR(下游引物)5’-CCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT-3’。
2、Endostatin片段的PCR扩增及纯化1)人胎肝总RNA的提取取液氮冻存的新鲜人胎肝0.75g，迅速加入Trizol试剂7.5mL，研磨至液体澄清后，加入等体积氯仿/异戊醇，12000g离心10min，吸取上清，用无水乙醇沉淀后，溶于50μL经DEPC处理的水中，-20℃保存备用。
2)Endostatin片段的PCR扩增及纯化利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胎肝总RNA经反转录合成的cDNA中钓取人内皮抑素基因Endostatin的cDNA，具体方法如下首先以人胎肝总RNA为模板，反转录合成其第一链cDNA，反应体系及反应条件为人胎肝总RNA 3μg，5×反应缓冲液4μL，40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，500μg/mLOligo(dT)15引物1μL(购自Promega公司)，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10U/μL AMV反转录酶1μL(购自Promega公司)，加无核酸酶去离子水补充总反应体系至20μL，室温放置10min后，于42℃水浴1h，最后99℃保温3min以灭活反转录酶。
再以反转录获得的cDNA为模板，在引物EndoF和EndoR的引导下，进行PCR扩增。PCR反应体系为上述反转录合成的第一链cDNA 7.5μL，10×反应缓冲液5μL，引物EndoF和EndoR各25pmol，2.5mmol/L dNTP 4μL，Pyrobest DNA聚合酶2.5U，加去离子水补充总反应体系至50μL。PCR反应条件为先94℃预变性4min；然后94℃30sec，58℃45sec，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图1所示(泳道a为PCR扩增的Endostatin，泳道b为DL2000分子量标准)，扩增出了约560bp的条带，与预期的Endostatin的大小一致。将PCR扩增产生的目的DNA片段应用Promega公司的DNA片段纯化试剂盒并参照试剂盒说明书进行纯化，具体过程包括以下步骤a.切取含目的DNA片段的凝胶块，大小约300ng，将凝胶块放入1.5mL EP管中，70℃温育至凝胶完全融化；b.加入1mL纯化树脂，充分混匀20sec(不能用旋涡器混匀)；
d.将3mL一次性注射器活塞拔出，微柱与注射器相连；e.将制备好的树脂凝胶/DNA混合物移入注射器桶，插入活塞，轻轻推样品入微柱；f.移入2mL 80％异丙醇于注射器中，用异丙醇洗微柱一次；g.将微柱置于1.5mL Ep管中，10000g室温离心2min，以干燥树脂；h.移微柱到一新的无菌EP管中，加50μL去离子水或TE缓冲液于微柱中，室温放置1min后，10000g离心20sec，以洗脱DNA片段。洗脱后的DNA于4℃(或-20℃)贮存。
对纯化的DNA片段进行测序，测序结果表明PCR扩增的Endostatin片段具有序列表中SEQ ID NO8的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO8由595个碱基组成，其编码序列为自5’端第16-564位碱基。
二、人白蛋白基因(Albumin)片段的克隆1、引物设计根据人白蛋白基因的mRNA序列(GenBank号CR607928)设计PCR扩增该基因的引物，并在下游引物的5’端引入限制性内切酶EcoRI识别位点，引物序列如下Abf(上游引物)5’-GGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’；Abr(下游引物)5’-CCGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)。
2、Albumin片段的PCR扩增及纯化以人胎肝总RNA经反转录合成的cDNA为模板，在引物Abf和Abr的引导下，进行PCR扩增。除模板和引物外，PCR反应体系和反应条件与步骤一相同。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图2所示(泳道a为DL2000分子量标准，泳道b为阴性对照，泳道c为PCR扩增的Albumin)，扩增出了约1800bp的条带，与预期的Albumin的大小一致。用与步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
对纯化的DNA片段进行测序，测序结果表明PCR扩增的Albumin片段具有序列表中SEQ ID NO9的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO9由1797个碱基组成，其编码序列为自5’端第32-1789位碱基。
三、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的PCR扩增及纯化取步骤一和步骤二回收的目的DNA片段各1μL，混匀，将其作为重叠PCR反应的模板，然后在引物EndoF和Abr的引导下，用重叠PCR法扩增Endo-Albu。除模板和引物外，PCR反应体系与步骤一相同，PCR反应条件为先94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min40s，共30个循环后，72℃再延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图3所示(泳道a为PCR扩增的Endo-Albu，泳道b为阴性对照，泳道c为DL2000分子量标准)，扩增出了约2400bp的条带，与预期大小一致。用与步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
四、融合基因Endo-Albu的克隆及鉴定将步骤三扩增的Endo-Albu与载体pGEM-T(Promega公司)进行连接，10μL连接体系及连接条件为按3∶1的摩尔比加入目的基因片段与载体DNA，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶2U，4-6℃水浴连接12-24小时。然后将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，将转化细胞涂布于含60mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板上，随机挑选长出的白色单菌落，37℃活化12小时，提取质粒DNA，并以此为模板，用引物EndoF和Abr进行PCR检测，转化有Endo-Albu的阳性克隆可扩增出约2400bp的条带。再对PCR鉴定的阳性克隆质粒用限制性内切酶Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定，经酶切，阳性克隆质粒可获得3000bp和2375bp的DNA片段，挑选阳性克隆，测序，所扩增的Endo-Albu具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO4由2375个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2373位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第16-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第610-2367位碱基为人白蛋白的编码序列，自5’端第565-609位碱基为连接肽(Gly4Ser)3的编码序列，表明所克隆的Endo-Albu序列正确。
实施例2、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的获得一、Endostatin片段的PCR扩增及纯化取实施例1中步骤一回收的Endostatin片段为模板，在引物EndoF和EndoR25’-CCGACCCACCACCGCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT-3’引导下，进行PCR扩增，除模板和引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
二、Albumin片段的PCR扩增及纯化取实施例1中步骤一回收的Albumin片段为模板，在引物Abf5’-GGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’和Abr引导下，进行PCR扩增，除模板和引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
三、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的PCR扩增及纯化取步骤一和步骤二回收的目的DNA片段各1μL，混匀，将其作为重叠PCR反应的模板，然后在引物EndoF和Abr的引导下，用重叠PCR法扩增Endo-Albu。PCR反应条件与体系与实施例1步骤三相同。
四、融合基因Endo-Albu的克隆及鉴定与实施例1步骤四相同。所扩增的Endo-Albu具有序列表中SEQ ID NO5的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO5由2360个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2358位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第6-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第595-2352位碱基为人白蛋白的编码序列，自5’端第565-594位碱基为连接肽(Gly4Ser)2的编码序列，表明所克隆的Endo-Albu序列正确。
实施例3、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的获得一、Endostatin片段的PCR扩增及纯化取实施例1中步骤一回收的Endostatin片段为模板，在引物EndoF和EndoR35’-CGACCCACCACCGCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT-3’引导下，进行PCR扩增，除模板和引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
二、Albumin片段的PCR扩增及纯化取实施例1中步骤一回收的Albumin片段为模板，在引物Abf5’-GGCGGTGGTGGGTCGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’和Abr引导下，进行PCR扩增，除模板和引物外，PCR反应体系、条件与实施例1步骤一相同。用与实施例1步骤一相同的方法回收并纯化该目的片段。
三、具有抗血管生成作用的融合蛋白基因Endo-Albu的PCR扩增及纯化取步骤一和步骤二回收的目的DNA片段各1μL，混匀，将其作为重叠PCR反应的模板，然后在引物EndoF和Abr的引导下，用重叠PCR法扩增Endo-Albu。PCR反应条件与体系与实施例1步骤三相同。
四、融合基因Endo-Albu的克隆及鉴定与实施例1步骤四相同。所扩增的Endo-Albu具有序列表中SEQ ID NO6的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID NO6由2345个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2343位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第6-564位碱基为人内皮抑素的编码序列，自5’端第580-2337位碱基为凋亡素的编码序列，自5’端第565-579位碱基为连接肽(Gly4Ser)的编码序列，表明所克隆的Endo-Albu序列正确。
实施例4、Endo-Albu在巴斯德毕赤酵母中的表达及表达产物的鉴定与纯化一、Endo-Albu的巴斯德毕赤酵母表达载体的构建将实施例1获得的融合基因Endo-Albu纯化后，用限制性内切酶Xho I和EcoR I进行双酶切，然后将该基因的双酶切产物与经同样酶双酶切的酵母分泌表达载体pPIC9(Invitrogen公司)进行连接，10μL连接反应体系为按目的基因片段与载体3∶1的摩尔比加入目的基因片段与载体DNA、10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶2U，然后在4-6℃水浴中连接12-24小时。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化产物涂布于含60mg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上，在37℃下进行培养，随机挑选长出的白色单菌落，37℃活化12h以上后，提取质粒DNA，用引物EndoF和Abr进行PCR检测，并用限制性内切酶Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定，PCR鉴定结果如图4A1所示(泳道a为PCR阳性菌落鉴定结果，泳道b为DL2000Marker，泳道c为阴性对照，泳道d为阴性菌落)，双酶切鉴定结果如图4B1所示(泳道a为DL15000Marker，泳道b为Xho I和EcoR I双酶切鉴定结果)，阳性克隆质粒可扩增出约2400bp大小的条带，经Xho I和EcoR双酶切可得到8000bp和2375bp的条带，再对阳性克隆质粒进行测序，表明获得插入序列正确的Endo-Albu的巴斯德毕赤酵母表达载体，命名为Endo-Albu/pPIC9；将构建好的Endo-Albu/pPIC9用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切后与经相同酶双酶切的载体pPIC9K进行连接，得到重组酵母表达载体，命名为Endo-Albu/pPIC9/9K，该载体的构建流程图参见图14，按照上述方法进行转化，提质粒，用引物EndoF和Abr进行PCR检测，并分别用限制性内切酶SalI、Xho I进行单酶切鉴定及用Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定，PCR鉴定结果如图4A2所示(泳道a为DL2000Marker，泳道b.d.e.f为不同的克隆，泳道c为阴性对照)，酶切鉴定结果如图4B2所示(泳道a为SalI单酶切产物，泳道b为Xho I单酶切产物，泳道c为DL15000Marker)。
二、巴斯德毕赤酵母转化子的制备1、酵母表达载体的线性化对步骤一构建的Endo-Albu的巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9用限制性内切酶Sal I进行单酶切使其线性化，以利于其整合入酵母基因组中。50μL单酶切反应体系为重组质粒Endo-Albu/pPIC9 2μg，Sal I 1μL，10×H Buffer 5μL。37℃水浴3h后，65℃灭活20min，以终止反应。取5μL样品于0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收并纯化10398bp的目的片段，-20℃保存备用。对构建好的重组酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9/9K采用相同的方法进行线性化。
2、酵母感受态细胞的制备按如下步骤制备毕赤酵母GS115感受态细胞a.挑取酵母表达宿主菌pichia.Pastoris GS115单菌落至50mL YPD培养基中，30℃、275rpm振荡培养至OD600≈0.8~1.0；b.收集细胞，用25mL的无菌三蒸水洗涤，室温下以1500g离心10min，弃上清；c.加入1mL 0.1M LiCl液(LiCl必须采用去离子水配制，过滤灭菌)重悬细胞；d.将细胞悬液转移到1.5mL EP管中，12000g，室温离心15s，用枪头吸出残余licL；e.用400μL 0.1M LiCl重悬沉淀；f.将悬液分装于8个无菌的EP管中，每管50μL(不要放置于冰上或-20℃)，即可用于转化。
上述YPD培养基的配方为酵母提取物1％，蛋白胨2％，D-葡萄糖2％。
3、转化毕赤酵母GS115感受态细胞及阳性重组子的鉴定1)转化毕赤酵母GS115感受态细胞用氯化锂法分别将线性化的质粒Endo-Albu/pPIC9和Endo-Albu/pPIC9/9K分别导入毕赤酵母GS115感受态细胞中，包括以下步骤a.取步骤一获得的线性化的质粒DNA约5-10μg，溶于50μL无菌去离子水中；b.将1mL单链DNA样品(2mg/mL)煮5min，快速转入冰水中；c.取两管感受态细胞，4500rpm室温离心5min，弃残余的LiCl，按下列步骤加入以下各组分240μL 50％PEG(PEG-3350必须采用去离子水配制，过滤灭菌，放在高度密封的瓶中保存)，36μL 1M LiCl，25μL 2mg/mL单链DNA，线性化的pPIC9-EndoAlbu(5-10μg)于50μL无菌蒸馏水中；e.剧烈振荡1min，使之与细胞沉淀完全混合，30℃温育30min，静置；f.42℃热休克25min，8000rpm室温离心沉淀5sec，弃上清；g.用1mL无菌水重悬沉淀，取25-100μL涂于MD/His-平板上；h.30℃孵育2-4天至出现转化子菌落。
上述MD平板的配方为酵母基础氮源培养基(含硫酸铵，无氨基酸)1.34％，生物素4×10-5％，D-葡萄糖2％，琼脂1.5％。
2)阳性重组子的鉴定对获得的酵母转化子用菌落的PCR方法进行鉴定，包括以下步骤从MD平板上挑取单个菌落(pPIC9-EndoAlbu/GS115)，均匀涂布于200ul PCR管底部，开盖在微波炉中中档加热1min，液氮中放置2min，再在微波炉中加热1min(通过这种“煮-冻-煮”的方法使酵母细胞壁裂解，从而使酵母基因组DNA释放出来)，加入20μL去离子水清洗PCR管壁，取2μL上清为模板进行PCR鉴定，PCR反应体系为10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，引物EndoF和Abr各100pmol，Taq DNA聚合酶5U，上清2μL，加去离子水至25μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃60sec，52℃45sec，72℃2min40sec，35次循环后，72℃继续延伸5min。反应结束后，取5μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，转化有Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9的毕赤酵母GS115转化子的PCR鉴定结果如图5A所示(泳道a为DL2000Marker，泳道b、c、d、e为不同的单克隆，泳道f为阴性对照)，阳性单克隆可扩增出约2375bp的条带，表明获得了正确转化有Endo-Albu巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9的毕赤酵母GS115转化子。并用相同方法得到转化有巴斯德毕赤酵母表达载体Endo-Albu/pPIC9/9K的毕赤酵母GS115转化子，其PCR鉴定结果如图5B所示(泳道d为DL2000Marker，泳道a为阳性对照，泳道b为阴性对照，泳道c、e、f、g、h为不同的阳性单克隆)，阳性单克隆可扩增出约2375bp的条带。
三、原位双膜法快速检测阳性表达株a.将醋酸纤维素膜(0.45μm，φ77mm)放置在步骤二筛选出的阳性克隆(pPIC9-EndoAlbu/GS115)上，用涂布器轻轻地将滤膜压下直至滤膜完全潮湿且没有气泡，使转化子转移至醋酸纤维素膜上；b.将硝酸纤维素膜(0.45μm，φ77mm)放置在BMMY固体培养基(2％琼脂)上，将醋酸纤维素膜(使克隆向上放置)放置在硝酸纤维素膜上，将平板倒置，在30℃下孵育18h；c.将醋酸纤维素膜移去，放置在MD平板上4℃保存；d.将硝酸纤维素薄膜取下，用6％小牛血清在37℃下封闭2h；e.用TBST(20mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH 7.5)洗膜3次(每次10min)；f.加山羊抗人内皮抑素抗体(购自晶美生物公司，1∶500倍稀释，5μL抗体用5mL含1％BSA的TBST稀释)室温孵育2h；g.重复e步骤；h.加碱磷酶标记兔抗山羊IgG(用含1％BSA的TBST进行1∶500稀释)室温孵育2h；i.重复e步骤；j.用显色液(工作液∶NBT∶BCIP＝50∶1∶1)显色，显色结果如图6所示，图中A、B为染色最深的转化子；k.挑选染色最强的克隆，诱导表达以进行进一步的验证。
四、分泌性外源蛋白Endo-Albu在毕赤酵母GS115中的诱导表达BMGY培养基配方酵母提取物1％，蛋白胨2％，磷酸钾100mM(pH 6.0)，酵母基础氮源培养基(含硫酸铵，无氨基酸)1.34％，生物素4×10-5％，甘油1％。
BMMY培养基配方酵母提取物1％，蛋白胨2％，磷酸钾100mM(pH 6.0)，酵母基础氮源培养基(含硫酸铵，无氨基酸)1.34％，生物素4×10-5％，甲醇0.5％。
用步骤三获得的转化有Endo-Albu/pPIC9的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子进行分泌性外源蛋白Endo-Albu的诱导表达，包括以下步骤a.接种阳性克隆菌株(pPIC9-EndoAlbu/GS115)于装有25mL BMGY液体培养基的250mL的三角瓶中，在28-30℃、250rpm下振荡培养至OD600≈2(约需20h)，此时细胞处于对数生长期；b.室温下1500-3000g离心5min，弃上清，用BMMY重悬酵母细胞至OD600≈1.0(约10-20mL)；c.置于1000mL三角瓶中，以2层灭菌纱布封口，在28-30℃、250rpm下振荡培养，每天添加甲醇至终浓度0.5％(V/V)诱导外源蛋白表达。
用上述相同方法对转化有Endo-Albu/pPIC9/9K的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子进行分泌性外源蛋白Endo-Albu的诱导表达。
五、阳性克隆表达蛋白的鉴定1、BCA法检测重组毕赤酵母经甲醇诱导培养后的总分泌蛋白1)样品收集用步骤四中的方法对筛选到的阳性克隆进行甲醇诱导表达，间隔24h分别收集酵母培养液1mL，于4℃、3000g离心5min，取上清于-70℃贮存备用。
2)用BCATM蛋白检测试剂盒测定总分泌蛋白表达结果取步骤1中不同时间采集的样品，采用BCATM蛋白检测试剂盒(PIERCE)测定总分泌蛋白的表达情况，结果如图7所示，由图7可以看出经诱导培养后120h蛋白表达水平达到高峰。
2、SDS-PAGE检测取步骤1中不同时间采集的样品各15μL，用常规的10％SDS-PAGE方法检测蛋白表达情况，检测结果如8所示(泳道M为低分子量蛋白质Marker175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25kDa，16.5kDa，6.5kDa；泳道a为0小时的表达上清；泳道b为24小时的表达上清；泳道c为48小时的表达上清；泳道d为72小时的表达上清；泳道e为96小时的表达上清；泳道f为120小时的表达上清)，结果经诱导表达获得了86.5kDa的重组蛋白，与预期结果相符。
3、Western Blot检测洗涤缓冲液配方20mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，浓HCl调pH至7.5。
抗体稀释液配方为20mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，浓HCl调pH至7.5，0.05％Tween-20。
取15μL步骤1中的样品先进行10％SDS-PAGE分离蛋白，转硝酸纤维素膜(利用北京六一仪器厂的电泳和电转系统进行)后用蛋白质印迹法(Western Blot)对表达的蛋白做进一步鉴定，其中，以鼠抗人白蛋白(购自Absera公司)多抗为第一抗体，以AP标记的羊抗鼠IgG(购自华美生物工程公司)为第二抗体，BCIP/NBT底物显色，具体步骤如下a.封闭用封闭液5％BSA浸没硝酸纤维素膜，4℃封闭12-24h；b.洗膜用洗涤缓冲液洗硝酸纤维素膜3次，每次10min；c.与鼠抗人白蛋白多抗反应用抗体稀释液按1∶1000稀释多抗，浸没硝酸纤维素膜，摇床轻轻振摇(70rpm)，室温1h；d.洗膜弃去多抗，用洗涤液漂洗膜3次，每次10min；e.与酶标二抗反应用抗体稀释液按1∶750稀释酶标二抗，浸没硝酸纤维素膜，摇床轻轻振摇，室温1h；f.洗膜弃去酶标二抗，用洗涤液漂洗膜3次，每次10min；g.显色按1∶1∶50稀释NBT/BCIP(购自华美生物工程公司)，将膜浸于其中，室温下轻摇，约3-5min后，用蒸馏水冲洗硝酸纤维素膜，终止反应，拍照留作永久实验记录。Western Blot检测结果如图9A所示(泳道MP7708V Marker，泳道a、bEndo-Albu/pPIC9/GS115的诱导表达株)。
以山羊抗人内皮抑素(R&D公司)为第一抗体，以AP标记的兔抗山羊IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)为第二抗体，采用相同的方法进行Western Blot检测，检测结果如图9B所示(泳道M为P7708V Marker，泳道a、b、d为Endo-Albu/pPIC9/GS115的诱导表达株，泳道c为非表达株)用上述相同方法对转化有Endo-Albu/pPIC9/9K的阳性巴斯德毕赤酵母GS115转化子表达的分泌性外源蛋白进行鉴定，同样获得了人内皮抑素和人白蛋白的融合蛋白Endo-Albu。
此外，用上述相同的表达方法将实施例2、3构建的人内皮抑素基因和人白蛋白基因的融合基因在毕赤酵母GS115中表达，得到了分别具有(Gly4Ser)2和(Gly4Ser)连接肽序列的人内皮抑素和人白蛋白的融合蛋白。
六、Endo-Albu融合蛋白的纯化按照步骤四中的方法诱导表达至表达高峰时，于4℃、3000g离心5min，收集上清，采用60％硫酸铵沉淀与蓝色琼脂糖凝胶FF染料配体亲和层析的方法对表达的目的蛋白Endo-Albu进行纯化，对经纯化的蛋白进行10％SDS-PAGE检测蛋白表达情况，检测结果如10所示(泳道M为低分子量蛋白质Marker175kDa，83kDa，62kDa，47.5kDa，32.5kDa，25kDa，16.5kDa，6.5kDa；泳道a、b为经纯化的表达蛋白)，表明获得了纯度较高的目的蛋白Endo-Albu。
实施例5、细胞和动物实验1、鸡胚血管(CAM)生成抑制试验9日龄的鸡胚在气室下方开0.5cm2的小洞露出尿囊膜，实施例4表达的分别具有(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)2和(Gly4Ser)不同连接肽序列的不同剂量(20、30、40μL，浓度为228μg/mL，即蛋白量分别为4.56、6.84、9.12μg)的人内皮抑素和人白蛋白的融合蛋白Endo-Albu，以生理盐水为对照，放在无菌滤纸小片(φ5mm)放于尿囊膜上，用无菌透明胶封口，于37℃孵箱中继续培养48h，取出尿囊膜观察血管生长抑制情况。部分实验结果如图11所示，在本发明重组蛋白Endo-Albu(以(Gly4Ser)3为连接肽)作用处新生血管的生成得到明显抑制，表明本发明的人内皮抑素和人白蛋白的融合蛋白Endo-Albu具有抑制新血管生成的作用。
2、体外细胞实验分别向人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞株(购自中国细胞保藏中心)的培养液中添加228μg/mL的实施例4表达的具有不同连接肽的人内皮抑素和人白蛋白的融合蛋白Endo-Albu，以用常规培养液培养的肿瘤细胞为对照，结果在三种具有不同连接肽的Endo-Albu作用下，ECV-304的增值速率均得到显著抑制，不同蛋白浓度下的ECV-304细胞增殖抑制率的统计结果如图12所示，实验结果表明融合蛋白Endo-Albu能明显抑制ECV-304细胞的增殖，且浓度越高对细胞增殖的抑制作用越大，应用ELISACalc-回归/拟合计算程序分析，分析结果如表1所示，其简单判定系数的值为0.97657，Endo-Albu浓度与ECV-304抑制率的关系曲线如图13所示，表明两者具有显著的剂量依赖抑制关系。其IC50为8.376μg/mL，这和国外文献报道的8.6μg/mL[Yokoyama Y，Dhanabal M，Griffioen AW，et al.Syergy between angiostatin andendostatininhibition of ovarian cancer growth.Cancer Res.2000，602190-2196]相当。上述实验结果表明本发明的融合蛋白具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备抗肿瘤药物。
表1 ELISA Calc-回归/拟合计算程序分析结果
实施例6、半衰期测定给小鼠分别静脉注射本发明的人白蛋白的融合蛋白Endo-Albu及内皮抑素标准品，注射剂量为0.5mg/kg，每天定时取样，利用同位素标记法(或光电比色法)测定给药前后不同时间血浆药物浓度的变化，分别计算融合蛋白及内皮抑素标准品的半衰期。实验结果显示，本发明所制备的人内皮抑素融合蛋白Endo-Albu的半衰期约为5.5天，远远长于内皮抑素标准品的(10.7±4.1)h个小时。表明本发明的融合蛋白Endo-Albu与内皮抑素单独作用相比，能明显延长内皮抑素的半衰期，是一种长效的新生血管抑制剂。
序列表<160>9<210>1<211>790<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Pro Leu Glu Lys Arg His Ser His Arg Asp pHe Gln Pro Val Leu His1 5 10 15Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg20 25 30Gly Ala Asp pHe Gln Cys pHe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala35 40 45Gly Thr pHe Arg Ala pHe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser50 55 60Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys65 70 75 80Asp Glu Leu Leu pHe Pro Ser Trp Glu Ala Leu pHe Ser Gly Ser Glu85 90 95Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile pHe Ser pHe Asp Gly Lys Asp100 105 110Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser115 120 125Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg130 135 140Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly145 150 155 160Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val165 170 175Leu Cys Ile Glu Asn Ser pHe Met Thr Ala Ser Lys Gly Gly Gly Gly180 185 190Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser195 200 205Glu Val Ala His Arg pHe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn pHe Lys Ala210 215 220Leu Val Leu Ile Ala pHe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro pHe Glu225 230 235 240Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu pHe Ala Lys Thr Cys245 250 255Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu
260 265 270pHe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly275 280 285Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys290 295 300pHe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg305 310 315 320Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala pHe His Asp Asn Glu Glu Thr325 330 335pHe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr pHe340 345 350Tyr Ala Pro Glu Leu Leu pHe pHe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala pHe355 360 365Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys370 375 380Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg385 390 395 400Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys pHe Gly Glu Arg Ala pHe Lys Ala405 410 415Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg pHe Pro Lys Ala Glu pHe Ala420 425 430Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys435 440 445Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala450 455 460Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu465 470 475 480Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val485 490 495Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp pHe500 505 510Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val515 520 525pHe Leu Gly Met pHe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr530 535 540Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu545 550 555 560Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val565 570 575pHe Asp Glu pHe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys580 585 590Gln Asn Cys Glu Leu pHe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys pHe Gln Asn595 600 605Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro610 615 620Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys625 630 635 640
Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu645 650 655Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val660 665 670Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg675 680 685Pro Cys pHe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu690 695 700pHe Asn Ala Glu Thr pHe Thr pHe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser705 710 715 720Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val725 730 735Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp740 745 750Asp pHe Ala Ala pHe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu755 760 765Thr Cys pHe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala770 775 780Ala Leu Gly Leu Glu pHe785 790<210>2<211>785<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Pro Leu Glu Lys Arg His Ser His Arg Asp pHe Gln Pro Val Leu His1 5 10 15Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg20 25 30Gly Ala Asp pHe Gln Cys pHe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala35 40 45Gly Thr pHe Arg Ala pHe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser50 55 60Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys65 70 75 80Asp Glu Leu Leu pHe Pro Ser Trp Glu Ala Leu pHe Ser Gly Ser Glu85 90 95Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile pHe Ser pHe Asp Gly Lys Asp100 105 110Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser115 120 125Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg
130 135 140Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly145 150 155 160Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val165 170 175Leu Cys Ile Glu Asn Ser pHe Met Thr Ala Ser Lys Gly Gly Gly Gly180 185 190Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg195 200 205pHe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn pHe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala210 215 220pHe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro pHe Glu Asp His Val Lys Leu225 230 235 240Val Asn Glu Val Thr Glu pHe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser245 250 255Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu pHe Gly Asp Lys Leu260 265 270Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys275 280 285Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys pHe Leu Gln His Lys290 295 300Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val305 310 315 320Met Cys Thr Ala pHe His Asp Asn Glu Glu Thr pHe Leu Lys Lys Tyr325 330 335Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr pHe Tyr Ala Pro Glu Leu340 345 350Leu pHe pHe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala pHe Thr Glu Cys Cys Gln355 360 365Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg370 375 380Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser385 390 395 400Leu Gln Lys pHe Gly Glu Arg Ala pHe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg405 410 415Leu Ser Gln Arg pHe Pro Lys Ala Glu pHe Ala Glu Val Ser Lys Leu420 425 430Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu435 440 445Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys TyrIle Cys Glu450 455 460Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro465 470 475 480Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met485 490 495Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp pHe Val Glu Ser Lys Asp500 505 510
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1.具有抗血管生成作用的融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)将序列表中SEQ ID NO1-3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗血管生成作用的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1所述的具有抗血管生成作用的融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO5的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)编码序列表中SEQ ID NO1-3的DNA序列；5)与序列表中SEQ ID NO4-6限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有抗血管生成作用的核苷酸序列；6)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO4-6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的DNA序列。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
6.一种表达权利要求1所述的具有抗血管生成作用的融合蛋白的方法，是将含有权利要求3所述的具有抗血管生成作用的融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抗血管生成作用的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组表达载体中具有抗血管生成作用融合蛋白编码基因的5’端连接有酵母分泌信号序列；所述酵母分泌信号序列具有序列表中SEQ ID NO7的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体为pPIC9、pPIC6α、pPIC3、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K或pPIC9K；所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌；所述酵母菌为巴氏毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168；所述大肠杆菌为E.coli JM109、E.coliHB101或E.coli Top10。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述重组酵母表达载体为Endo-Albu/pPIC9或Endo-Albu/pPIC9/9K。
10.权利要求1所述的融合蛋白在制备抑制血管生成和/或肿瘤治疗性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与该融合蛋白的表达方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。该融合蛋白具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO2；3)序列表中的SEQ ID NO3；4)将序列表中SEQ ID NO1－3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗血管生成作用的蛋白质。本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是抑制血管生成和/或肿瘤治疗性药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61K38/16GK101062954SQ20071010372
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者章金刚, 吕茂民, 杨梅 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所