专利名称：：用于制备预防和治疗抑郁症药物的丹参素及其钠盐的制作方法用于制备预防和治疗抑郁症药物的丹参素及其钠盐
背景技术：
：丹参素(danshensu)，化学名D-(+)P-(3，4-二羟苯基)乳酸，D-(+)卩-(3，4-dihydoxyphenyl)lacticacid，是从传统中药丹参(SalviamiltiorrhizaBge)中提取的活性成分。由于丹参素是一种不稳定的游离酸，故常用其钠盐丹参素钠(Sodiundanshensu，sodiump-3，4~dihydroxyphenyllactate)。丹参素及其钠盐的结构式如图1。丹参素苯环上的羟基是功能基，可清除自由基，抑制氧化反应和自由基反应。抑郁症(depression)的特征性症状是悲观心境，自身感觉很坏；睡眠障碍，失眠或早醒；食欲很差，动力不足；缺乏活力，兴趣和愉快感消失；自责自罪，消极想死；体重下降；性欲降低。抑郁症常有便秘和各种疼痛申诉，焦虑、恐怖、疑惑或强迫症状很普遍，抑郁性的先占观念尤为常见。抑郁症可分为原发性抑郁症(双相或单相抑郁症)和继发性抑郁症(继发于其他精神疾病或躯体疾病)。目前三类经典抗抑郁剂，包括三环抗抑郁剂地昔帕明、5-羟色胺重摄取抑制剂氟西汀(Prozac)和单胺氧化酶A抑制剂马氯贝胺，对皮质酮损伤的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞具有显著的保护作用，而抗精神病药氯丙嗪和抗焦虑药地西泮则无此作用。地昔帕明或氟西汀显著减弱皮质酮处理PC12细胞诱导的胞内(^2+超载，显著提高神经生长因子(NGF)信息RNA的表达水平。因此，尽管各类抗抑郁剂结构迥异，但细胞保护作用可能是其作用共同通路，而减弱胞内Ca^超载和提高NGF等神经营养因子的表达则可能是抗抑郁药的细胞保护作用机制之一。抑郁症正成为全球第五大疾病，预计到2020年，将跃升为第二大疾病，并将成为致命疾病。世界卫生组织已将抑郁症、癌症及艾滋病并列为21世纪的三大疾病及卫生教育预防重点工作。镇静剂或安眠药，副作用大，容易造成药物依赖，治疗效果也不好，不适用于抑郁症。目前流行的抗抑郁症药物，包括有名的氟西汀、西普兰(Cdexa)和怡诺思(Effexor)，都在服用几周后才开始见效，而且有降低性功能等副作用。此外，这些药对大约三分之一的病人还无效。血清素调节剂属新一代抗抑郁药，效果较好且副作用小，但国内尚未生产。从祖国医药中独辟蹊径，或许能找到防治抑郁症的新药。发明概要本发明涉及丹参素及其钠盐作为用于制备预防和治疗抑郁症的药物组合物，该药物组合物包括丹参素及其钠盐和可药用的载体。本发明涉及如权利1要求所定义的药物组合物的制备方法，该方法是指丹参素及其钠盐与可药用的载体混合或溶解。丹参素及其钠盐可与任何可药用的载体混合或溶解，如经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可药用载体。该药物以常规药用制剂的形式使用，如固体形式的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂及扁囊剂等，或结晶性粉末状针剂和液体形式的针剂、悬浮剂、糖浆剂及乳剂等。该药物中使用可药用的赋形剂和添加剂，这些可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、稳定剂等，如乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、琼脂、果胶、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因及抗坏血酸等。该药物可按各种制剂的常规工艺制备。本发明涉及丹参素及其钠盐作为预防抑郁症的药物，可作为食品添加剂加入到食品中。本发明涉及丹参素及其钠盐作为治疗抑郁症的药物。所制成的各种口服药物中丹参素钠的剂量为每日每kg体重大约0.1—100mg，优选约0.05—50mg，更优约0.1—20mg，最佳约1—5mg。每日分2—4次服用，10—30天为一疗程，一般用药3—IO个疗程，每个疗程间隔5—30天。所制成的注射用药物，可供肌肉、静脉注射及静脉点滴，其中丹参素钠的剂量为每日每kg体重0.01—50mg，优选约0.05—25mg/kg，更优约O.l—10mg，最佳约0.5—5mg。每日分l一3次使用，10—30天为一疗程，一般用药3—30个疗程，每个疗程间隔5_30天。然而，精确的剂量及持续时间应由医生确定，取决于病人的年龄、体重、病情及反应等。下面列举实验内容及其结果，作为丹参素及其钠盐可用于制备预防和治疗抑郁症药物的证据。材料动物NIH小鼠，8周龄，SPF级；SD大鼠，200-230g，SPF级。丹参素钠，纯度>98%;谷氨酸单钠，购自Sigma公司。一、大鼠强迫游泳实验方法:大鼠随机分组，每纟i'10只，雌雄各半，分别为对照、阳性对照和丹参素钠组。实验前一天每只大鼠游泳训练15min。实验前阳性对照组盐酸氟西汀(20mg/kg)灌胃两次(实验前17、7h)，丹参素钠组腹腔注射丹参素钠(5、10、20mg/kg)2次(实验前17h、7min)，对照组同步给生理盐水。末次给药7min后，置大鼠于水温25°C、水深23cm的塑料桶(高40cm，直径30cm)中，观察并同时测定5min内给药组和对照组大鼠累计不动时间(即四肢完全不动或仅有足部轻拍划水动作)。数据统计处理采用Student'st检验，结果用(3fis)表示。结果大鼠强迫游泳模型中出现的不动状态反映动物的绝望行为。丹参素钠(10、20mg/kgx2)非常显著縮短大鼠游泳不动时间(表l)(p〈0.01)，且作用稍优于盐酸氟西汀(表l)。表l丹参素钠对大鼠强迫游泳模型不动时间的影响(3f士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>与对照组相比，*p<0.05;**p<0.01。二、小鼠强迫游泳实验方法小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半，分别为对照组、阳性对照组和丹参素钠组。实验前一天每只小鼠游泳训练15min。实验前阳性组盐酸氟西汀(20mg/kg)灌胃两次(实验前17、7h)，丹参素钠组腹腔注射丹参素钠(IO、20、40mg/kg)2次(实验前17h、7min)，对照与实验组同步给生理盐水。小鼠末次给药7min后，置于水温25°C、水深10cm的量筒(高20cm，直径14cm)中，量筒之间放一不透明隔板，.以防小鼠彼此看到。观察6min，同时测定给药组和对照组小鼠在后4min内的累计不动时间。判断不动的标准停止挣扎，垂直体位，不动漂浮，仅做一些必要的活动使其头露出水面。数据统计处理采用Student'st检验，结果用(3f士s)表示。结果:小鼠在强迫游泳模型中出现的不动状态反映动物的绝望行为。丹参素钠组显著縮短小鼠游泳不动时间(表2)。表2丹参素钠对小鼠强迫游泳模型不动时间的影响(±s)组别_动物数(只)剂量(mg'kg—4不动时间(s)对照组io——151.2±19.2盐酸氟西汀1020x2121.4±34.4*丹参素钠1010x2134.8±33.6丹参素钠1020x2118.2±28.5*丹参素钠1040x2112.7±17.1*与对照组相比，*p<0.05。三、小鼠悬尾实验方法分组及给药方法同游泳实验，小鼠末次给药7min后，将其尾端2cm的部位贴在一根水平木棍上，使动物成倒挂状态，头部离台面约5cm。用板隔开相临动物的视线，观察6min，同时测定给药组和对照组小鼠在后4min内的累计不动时间。数据统计处理采用Student'st检验，结果用(3F士s)表示。结果:在悬尾模型中小鼠出现的不动状态反映动物的绝望行为。丹参素钠三个剂量组均能减少小鼠悬尾不动时间，20、40mg/kg组作用非常显著。表3丹参素钠对小鼠悬尾不动时间的影响(3f±s)组别动物数(只)剂量(rng'kg—1)不动时间(s)对照组10—170.2±20.4盐酸氟西汀1020x2113.6±31.6**丹参素钠1010x2137.4±28.2*丹参素钠1020x2118.9±21.7**丹参素钠1040x2106.3±24.5**与对照组相比*<0.05,**p<0.01。四、利血平致体温下降实验方法:小鼠随机分组，每组10只，分别为模型、阳性对照和丹参素钠组。实验前先测定每只小鼠肛温，共测3次，求其平均值作为基础体温。阳性对照组盐酸氟西汀(40mg/kg)灌胃2次(给利血平前17、7h)，丹参素钠组腹腔注射丹参素钠(IO、20、40mg/kg)2次(给利血平前后30min)。各组小鼠在腹腔注射利血平(5mg/kg)2h后，测量小鼠肛温。结果:与基础体温比较，利血平可显著降低小鼠体温(p〈0.01)，盐酸氟西汀可逆转利血平所致小鼠体温下降OxO.Ol)，而丹参素钠对利血平所致动物体温下降无明显作用，即丹参素钠不能逆转利血平所致小鼠体温下降。五、增强5-羟色胺作用实验按常规方法实验，分组及给药方法同前。结果表明，丹参素钠不抑制5-羟色胺的重摄取。六、增强去甲肾上腺素毒性实验按常规方法实验，分组及给药方法同前。结果表明，丹参素钠不增强去甲肾上腺素的毒性。七、丹参素钠对小鼠自主活动的影响方法雄性NIH小鼠，随机分成4组，每组10只。对照组给予生理盐水，实验组给予谷氨酸单钠(2.0g/kg/d，灌胃)或邻丹参素钠(20mg/kg/d，腹腔注射)，每天一次，连续5天。末次给药后30min，将小鼠置于自主活动仪中，适应3min后记录小鼠5min内活动次数。结果丹参素钠对正常小鼠自主活动次数无明显影响，但逆转谷氨酸单钠诱导的小鼠自主活动次数增加(表4)。_表4丹参素钠对小鼠自主活动的影响_组别动物数(只)剂量(mg'kg—1)活动次数(次)对照组丹参素钠谷氨酸单钠谷氨酸单钠+丹参素钠1010101020x52000x52000x5+20x132.8±7.4128.6±9.4167.2±10.0*112.4±6.2与对照组相比，*p<0.05。八、丹参素钠对阏剂量戊巴比妥钠诱导下小鼠睡眠的影响方法:NIH小鼠随机分为4组，每组10只，雌雄各半。对照组给予生理盐水，给药组分别腹腔注射丹参素钠IO、20、40mg/kg/d，每天一次，连续10天。末次给药后30min小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg/d)，以小鼠翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间。记录小鼠的入睡时间和睡眠持续时间。结果丹参素钠对戊巴比妥钠诱导下小鼠入睡时间无明显影响，但延长小鼠睡眠的持续时间。丹参素钠(20、40mg/kg/dxl0)组显著延长小鼠睡眠持续时间(P〈0.05)(表5)。表5丹参素钠对戊巴比妥钠诱导下小鼠睡眠的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与对照组相比，*P<0.05。九、丹参素钠对糖皮质激素诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的保护作用方法1、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC12细胞的培养PC12细胞接种于培养瓶中，培养液为含7.5%小牛血清、7.5%胎牛血清、lxl()Su/L青霉素、100mg/L链霉素、pH7.4的DMEM培养基，置于37°C、5%C02、湿度98X的C02培养箱中培养，34天传代一次。2、地塞米松对PC12细胞生长的抑制作用细胞长满瓶底后，用吸管轻轻吹打数次，使细胞完全分散。调节细胞密度为2xl()S细胞/mL,接种于0.01%多聚赖氨酸包被过的96孔板，每孔100nL。待细胞长满至70%80%，吸去培养液，D-hanks洗1次。对照组加无血清DMEM培养液100nL，损伤组加含不同浓度地塞米松(10、1、0.1、l(T2、l(T3、1(rVmol/L)的无血清DMEM培养液10(HiL，每组各设6复孔。继续培养24、48、72h，吸去培养液，用D-hanks洗2遍。每孔加入20nL5g/mL的MTT液，培养4h。每孔加入100pL三联液，待蓝色颗粒完全溶解(1216h)，用酶联免疫检测仪在波长570nm处读取吸光度(OD)值，采用Bliss方法计算半数致死浓度LD50。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值xlOOX3、丹参素钠对地塞米松诱导的PC12细胞损伤的影响将PC12细胞悬液接种在0.01%多聚赖氨酸包被过的96孔板内，每孔10(HiL。待细胞长满至70%80%后，吸去培养液，D-hanks洗1次。对照组加无血清DMEM培养液10(HiL，损伤组加含地塞米松lOpmol/L的无血清DMEM培养液100piL，保护组(丹参素钠+地塞米松)加含不同剂量的丹参素钠(25、50、100、200、400、800|amol/L)无血清DMEM培养液50pL预处理lh，再加含20pmol/L的地塞米松无血清DMEM培养液50pL，继续培养24h。吸去细胞培养液，用D-hanks洗2遍，每孔加入20iiL5g/mL的MTT液，培养4h。每孔加入100pL三联液，待蓝色颗粒完全溶解(1216h)，用酶联免疫检测仪在波长570nm处读取吸光度(OD)值，每组各设8复孔。4、丹参素钠对地塞米松诱导的PC12细胞乳酸脱氢酶漏出率的影响将PC12细胞接种在0.01%多聚赖氨酸包被过的96孔板内，每孔10(HiL。待细胞长满至70%80%,吸去原培养液，D-hanks洗1次。对照组加无血清DMEM培养液lOOpL，损伤组加含地塞米松lOpmol/L的无血清DMEM培养液10(HiL,保护组(丹参素钠+地塞米松)加含不同剂量的丹参素钠'(25、50、100、200、400、800nmol/L)无血清DMEM培养液50pL预处理lh,再加含20pmo1/L的地塞米松无血清DMEM培养液5(HiL，继续培养24h。吸取细胞培养液，按照乳酸脱氢酶试剂盒说明测定PC12细胞培养上清夜中乳酸脱氢酶活力，每组设5复孔。加入各试剂的次序及量按试剂盒说明进行。乳酸脱氢酶活力(U/L)=(测定管OD值一测定对照管OD值)/(标准管OD值一标准对照管OD值)x标准管浓度(2nmol/ml)xl000mlx样品稀释倍数结果1、地塞米松对PC12细胞生长的影响结果显示，在10'tl(^mol/L剂量范围内地塞米松抑制PC12细胞的生长，并与剂量成正相关。当地塞米松浓度为1(Himol/L时对PC12细胞生长的抑制最明显，作用24h存活率为59.6X。2448h时段，PC12细胞的存活率下降比较慢。4872h时段存活率大大下降，已经不属于延迟性损害过程。Bliss方法计算得24h时地塞米松的ICso约为916.3pmol/L。选择1Opmol/L地塞米松做以下实验。2、丹参素钠对地塞米松诱导的PC12细胞损伤的保护作用丹参素钠对PC12细胞生长无明显影响，但可对抗地塞米松对PC12细胞生长的抑制作用，并与剂量成正相关。当丹参素钠浓度为40(Himol/L时，PC12细胞的存活率为98.6%，几乎完全抵消了地塞米松对PC12细胞生长的抑制作用。3、丹参素钠对地塞米松诱导的PC12细胞乳酸脱氢酶漏出的保护作用结果显示，地塞米松损伤组乳酸脱氢酶的漏出率急剧升高，高达对照组的2倍；丹参素钠可减少地塞米松诱导PC12细胞释放乳酸脱氢酶，其效果与剂量成正相关。当丹参素钠浓度为40(Himol/L时，其效果最明显，抑制率达到60.4%(P<0.01)。十、丹参素钠对谷氨酸盐诱导的成年小鼠脑损伤的保护作用方法8周龄小鼠，雌雄兼有，随机分组。除对照组外，小鼠接受谷氨酸单钠(1.0、2.0、4.0g/kg/d，灌胃)和/或丹参素钠(10、20、40mg/kg/d,腹腔注射)，连续10天。然后进行行为学实验和病理组织学检查。1、Y-迷宫分辨学习记忆能力实验成年小鼠在谷氨酸单钠和/或丹参素钠处理后的第1天开始Y-迷宫分辨学习记忆实验，连续6天，第30天再重复一次。2、开野实验开野实验是用来检测动物对新环境的反应。在谷氨酸单钠和/或丹参素钠处理后的第7天开始实验，记录小鼠3min内的活动次数，每5天测一次，直到第27天结束。3、组织病理学检查接受谷氨酸单钠和/或丹参素钠处理后第四天，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉，用10%福尔马林溶液作心脏灌流牺牲动物，取脑，置10%福尔马林溶液中固定一周。通过海马区进行10pm厚度切片，常规HE染色。光镜下检查脑海马区组织病理学变化。4、统计学分析Y迷宫和开野实验数据采用重复测量资料分析法分析。结果1、丹参素钠对谷氨酸单钠诱导的小鼠Y-迷宫分辨学习记忆能力损伤的影响结果显示，成年小鼠给予谷氨酸单钠(l.O、2.0、4.0g/kg/dxl0，灌胃)对Y-迷宫分辨学习记忆能力有明显的损伤。在谷氨酸单钠处理后第1-6日及第85日，谷氨酸单钠组小鼠的Y-迷宫分辨学习记忆能力明显低于对照组(PO.OOl)。然而，丹参素钠(20mg/kg/dxl0，腹腔注射)或谷氨酸单钠(2.0g/kg/dx10，灌胃)+丹参素钠(20mg/kg/dxl0，腹腔注射)组小鼠的Y-迷宫分辨学习记忆能力与对照组无明显差别(PX).05)。丹参素钠除能逆转谷氨酸单钠对小鼠Y-迷宫分辨学习记忆能力的损伤外，本身对成年小鼠的Y-迷宫分辨学习记忆能力并无明显影响。2、丹参素钠对谷氨酸单钠引起的自主活动增加的保护作用成年小鼠给予谷氨酸单钠(2.0、4.0g/kg/dxl0，灌胃)后，在一定程度上增加其自主活动，但无统计学意义(0.1〉PX).05)。丹参素钠(20mg/kg/dxl0，腹腔注射)及谷氨酸单钠(2.0g/kg/dxl0，灌胃)+丹参素钠(20mg/kg/dxl0，腹腔注射)组与对照组相比则非常相近。结果显示，丹参素钠除能逆转谷氨酸单钠对自主活动的影响外，本身对成年小鼠的自主活动并无明显影响。3、丹参素钠对谷氨酸单钠诱导的脑病理组织损伤的保护作用脑组织中对损伤最敏感的区域是海马，海马在学习记忆中起着重要的作用。结果显示，成年小鼠给予谷氨酸单钠(2.0g/kg/dxl0，灌胃)后，引起小鼠海马神经元变性和坏死(图2B)。然而，丹参素钠组和谷氨酸单钠+丹参素钠组小鼠海马区未发现明显的神经元损伤(图2C)。实施例实施例1:片剂NO组分1丹参素钠2乳糖USP3玉米淀粉，食品级呈10%的纯水桨状物)4玉米淀粉，食品级5硬脂酸镁NF合计用量(mg/粒)5010012212330409513037300400制造方法在适当的混合机中混合第1、2组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，通过一个初筛将干燥的颗粒过筛，并与第4组分混合10—15分钟。加入第5组分混合l一3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。实施例2:胶囊剂<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>制造方法将第1、2、3组分在适当的混合机中混合10—15分钟，加入第4组分混合l一3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。实施例3:注射液丹参素钠100g或500g，葡萄糖400g或250g，加注射用水至10000ml。图1、丹参酸(A)和丹参素钠(B)的化学结构图2、丹参素钠对谷氨酸盐诱导的成年小鼠脑损伤的保护作用除对照组外，小鼠接受谷氨酸单钠(2.0g/kg/d，灌胃)和域丹参素钠(40mg/kg/d，腹腔注射)，连续10天，其后检查小鼠海马区的病理组织学变化。A、对照，x200;B、谷氨酸单钠(2.0g/kg/dxl0，灌胃)，x200,a.神经元变性和坏死；C、谷氨酸单钠(2.0g/kg/dxl0，灌胃)+丹参素钠(40mg/kg/dxl0，腹腔注射)，x200。权利要求1.丹参素及其钠盐用于制备预防和治疗抑郁症的药物。全文摘要丹参素，化学名D-(+)β-(3，4-二羟苯基)乳酸，是一种不稳定的游离酸，常用其钠盐丹参素钠。丹参素钠能显著缩短大小鼠游泳不动时间和小鼠悬尾不动时间，其作用优于盐酸氟西汀。丹参素钠逆转谷氨酸单钠诱导的小鼠自主活动次数增加，延长小鼠睡眠的持续时间。丹参素钠不对抗利血平引起的体温降低、眼睑下垂及运动不能，不抑制5-羟色胺的重摄取，不增强去甲肾上腺素的毒性。丹参素钠对糖皮质激素诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤(包括乳酸脱氢酶漏出)，对谷氨酸盐诱导的成年小鼠脑损伤均有强保护作用。丹参素钠可能是通过保护神经细胞发挥抗抑郁作用的。文档编号A61K31/192GK101310715SQ20071010932公开日2008年11月26日申请日期2007年5月23日优先权日2007年5月23日发明者于廷曦申请人:于廷曦