专利名称：：能敲除hpve7蛋白的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：宫颈癌是目前影响女性健康的重要恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，位于女性恶性肿瘤的第二位，并且近年来宫颈癌的发病呈年轻化趋势。现阶段宫颈癌的治疗主要采用手术、放疗和化疗的综合治疗，但手术仅适用于早期的宫颈癌患者，晚期患者只能依靠放疗、化疗，而对于肿瘤复发患者的治疗效果就更差。同时，以上提及的治疗手段对患者造成的创伤大，副反应严重，而且对于年轻的患者还可能剥夺其生育功能。因此，微创、副反应小的治疗方法是医药研究者一直以来努力的方向。研究证实人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的持续感染是宫颈癌发病的主要原因。HPV病毒有多种亚型，不同亚型对宫颈上皮的致病力不同，HPV主要分为高危型和低危型，高危型HPV的持续感染是宫颈癌的主要原因，高危型HPV的转化特性主要存在于两个基因E6和E7，其中E6可与p53结合导致p53失活，并促进其在细胞内的降解，从而使细胞周期失控，抑制细胞凋亡；E7则与非磷酸化pRb(视网膜母细胞瘤蛋白)结合，导致Rb蛋白功能失活，改变了细胞生长周期的调控机制，使细胞永生化和恶变(ZtoorZar/ifo7ec〃JarWoJog/力咖朋iW^r^W.'5^5-W)。非磷酸化Rb蛋白(pRb)具有调节细胞生长功能，pRb可以通过同转录因子E2F的结合抑制细胞增殖，磷酸化pRb失去对细胞生长的控制。HPV病毒的E7蛋白能与pRb结合，使pRb与E2F不能形成复合体，游离的E2F便促进进入S期所需蛋白的转录。因此，细胞生长不受限制，促进了感染细胞恶性化的进展。E7的这种作用对于细胞的增生过程是非常重要的(5e/^"eZ/a/^C力叫^m7o迈朋.foz^r《"/朋/扁'7y腦6erp，/ora^r油"肌尸愿，asAe_rtargetsoft力es鹏W"朋f/it/s0/2co;i"-ofei/s.。/co《e"e.,iVM05入5^77-《5！)。研究表明，HPVE7是通过一条含有9个氨基酸残基的LxCxE肽与RB蛋白的A-Bbox结构中的BBox结合的，RBA-Bbox是一个含有405个氨基酸残基的蛋白，分子量约为45KDOz'e-Zee,^h'c/aA化^so&Ho7a尸.泛素蛋白复合体目标性降解蛋白途径在真核细胞的蛋白质代谢过程中起重要作用。泛素介导的蛋白降解过程主要由3种酶组成泛素活化酶E1、泛素耦联酶E2、E3泛素连接酶。SCF类E3连接酶是目前研究比较深入的一类连接酶，SCF复合体的名称来源于其中的3个亚基Skpl、Cdc53(cullin)、F-box蛋白，另外一个亚基是RBX1。除F-box蛋白以外的3个亚基组成一个一般骨架，通过与不同的F-box蛋白结合识别不同的底物，即F-box蛋白决定了底物识别的特异性。F-box蛋白是一类含有F-box基序(motif)，在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族，这类蛋白质在细胞时相转换、信号传导、发育等多种生理过程中都具有重要功育g(尸e/2^"力oZZo〃.7krgefec^/i"ofeY/G^egracfefio",C〃rreytQw'/2io/C力,.ca7A'。7。^j，<5Y^.'57-幼。近年来，随着生物技术的发展，基因工程疫苗的研究成为治疗和预防因HPV病毒感染而引发的疾病的重要方法，虽然治疗型疫苗的研究已取得了一定的进展，但是存在着制备成本高，免疫源性不强等弱点，因此，寻找廉价与高效的疫苗是研究工作者努力的方向。
发明内容本发明的目的是提供一种能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白。本发明所提供的融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白质(1)包括人F-box蛋白的结构域和人RB蛋白的A-Bbox结构域；所述人F-box蛋白的结构域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumber:AAF04464的氨基末端第1位至254位氨基酸残基；所述人RB蛋白的A-Bbox结构域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumber:NP—000312的氨基末端第379位至787位氨基酸残基；(2)将(1)的融合蛋白的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白质。所述融合蛋白，具体可为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由691个氨基酸残基组成。自序列表中序列2的氨基末端的第12位至265位为人F-box蛋白的结构域；自序列表中序列2的氨基末端的第283位至691位为人RB蛋白的A-Bbox结构域；自序列表中序列2的氨基末端的第266位至282位为连接肽。为了使(1)和(a)中的融合蛋白便于纯化，可在(1)和(a)中的融合蛋白的氨基酸残基序列的N端或C端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(2)和(b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。所述融合蛋白的编码基因，具体可为如下c)或d)的基因c)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脱氧核糖核苷酸；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。所述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS，5XDenhardt,0.1mg/mL鲑精DNA的溶液中，在65。C下杂交，并用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液洗膜。序列表中的序列1由2100个脱氧核糖核苷酸组成。序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脱氧核糖核苷酸为编码序列。含有上述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因重组细胞系和转基因重组菌均属于本发明的保护范围。本发明根据HPVE7在宿主细胞内的作用特点及真核细胞内蛋白质代谢的特点，构建了本发明的融合蛋白，该融合蛋白包含决定底物识别的特异性的结构域一F-box蛋白的结构域和与HPVE7蛋白特异结合的人RB蛋白的A-Bbox结构域，研究表明在泛素蛋白降解系统中泛素连接酶E3是选择性降解蛋白质的关键因素，它可以识别被降解的蛋白质并将泛素连接到底物上，从而最终形成蛋白酶体对底物的降解，其中F-box蛋白是E3连接酶中识别底物的关键所在，因此在本发明中对F-box蛋白进行了相应改造，使其融合了人RB蛋白的A-Bbox结构域，该结构可以特异性的与HPVE7蛋白结合，这样HPVE7蛋白可以被本发明所表达的融合蛋白识别，从而进入泛素介导的蛋白降解过程，达到最终敲除HPVE7蛋白目的。因此该融合蛋白能敲除HPVE7蛋白，降低人乳头瘤病毒对宿主细胞的转化能力，并最终能够消除其危害。实验证明，转染含有本发明融合蛋白编码基因的重组表达载体pcDNA3.一F-box-RBABbox的Hela细胞中的HPV18型E7蛋白被敲除。本发明的融合蛋白的编码基因克隆于人源细胞，且在真核表达系统中表达了带myc标签的融合蛋白，不但易于分离纯化，还克服了异源蛋白的免疫源性。本发明的融合蛋白，和/或含有本发明融合蛋白编码基因的重组表达载体，和/或本发明融合蛋白编码基因可用于敲除HPVE7蛋白，可用于制备预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物。本发明还提供了预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物。本发明所提供的预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物，它的活性成分可为上述融合蛋白，还可为含有该融合蛋白编码基因的重组表达载体。所述HPV感染所致疾病可为宫颈癌。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。该药物可以按照药学领域的常规方法制备。所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。图1为PC財广增F-box、RBABbox基因和F-box—RBABbox融合基因片段的l。/o琼脂糖电泳结果其中l:DNAMarker,2:F-box，3:RBABbox,4:F—box—RBABbox。图2为PCR鉴定pcDNA3.F-box-RBABbox阳性克隆其中l:DNAMarker,2:F-box—RBABbox。图3为EcoRV和XbaI双酶切鉴定pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox阳性克隆其中l:DNAMarker,2:重组质粒pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox的酶切片段，5000bp左右处为pcDNA3.l(+)、2000bp左右处为F-box—RBABbox融合基因，3:pcDNA3.l")空质粒。图4为Westernblot检测融合蛋白F-box-RBABbox的表达其中l:蛋白质Marker，2:重组蛋白F-box-RBABbox,大小约为70KD左右。图5为Westernblot检测融合蛋白F-box-RBABbox在Hela细胞中敲除HPVE7蛋白的效果其中，A中l:蛋白质Marker，2:转染了重组质粒pcDNA3.1(+)_F-box-RBABbox的Hela细胞中HPV18E7蛋白的表达，3:转染了空质粒pcDNA3.l("的Hela细胞中HPV18E7蛋白的表达。B图是使用Gel-ProAnalyzer软件对Westernblot结果进行灰度分析的结果，其中l:转染重组质粒pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox后Hela细胞中HPV18E7蛋白表达的灰度值，2:转染空质粒pcDNA3.1(+)后Hela细胞中HPV18E7蛋白表达的灰度值。具体实施例方式本发明的融合蛋白F-box-RBABbox通过下述步骤获得①目的基因的获得从Hela细胞中分别扩增人F-box蛋白结构域编码序列和人RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段，根据已知的上述两条基因的mRNA序列，设计引物，并加上myc标签，用RT-PCR方法扩增出这两条基因的cDNA序列。②构建融合蛋白基因两段PCR产物分别酶切后连接，以连接产物为模板，用PCR方法得到融合蛋白基因。③构建pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox载体融合蛋白基因双酶切后连接入pcDNA3.1(+)载体中，经酶切、PCR鉴定后，对插入序列进行测序，证实插入片段含有F-box蛋白结构域编码序列和人RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列。④pcDNA3.1")—F-box-RBABbox在Hela细胞中的表达重组质粒使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染进入Hela细胞，用westernblot检测转染48小时后样品，证明有融合蛋白F-box-RBABbox的表达。再用westernblot的实验方法证实重组蛋白有结合HPV18型E7蛋白的功能，即可敲除E7蛋白。下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。本发明所涉及的各种实验材料，除了已在文中注明了来源的，其他的材料均为常规实验用品，本发明中所提及的引物和测序服务均由上海英骏生物技术有限公司广州分公司提供。实施例l、融合蛋白F-box-RBABbox的表达1.融合蛋白F-box-RBABbox基因的获得采用TRIzol(Gibco)提取Hela(ATCC)细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，实验具体方法是lugRNA+lug01igo(dT)18(Promega)，70。C反应5分钟后，立即置于冰上2分钟，再加M-MLV5XReactionBuffer(Promega)1，2.5raMdNTP(Promega)5pl，RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega)25units,M-MLVRT(Promega)200units,力口DEPCH20至25ul，混匀，42。C反应l小时。然后采用巢式PCR的方法得至ljF-box蛋白结构域编码序列和人RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段。其中巢式PCR的第一次PCR引物分别是F-box蛋白结构域编码序列的上游引物(pffl):5，-TGGCCTCGGCGATTATGGAC-3，，下游引物(pfrl):5，-AAACTATGTCTTCCACATCTCCAATTAG-3，，RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段的上游引物(pafl):5，-TCCACACACTCCAGTTAGGACTG-3，，下游引物(pari):5，—AGGGCTTCGAGGAATGTGAG-3，。反应体系均为ddH2019ul，DMS05ul，2.5mMdNTP(Takara)4u1，5Xprimestarbuffer(Takara)10u1，4umol/L上幼,弓l物5y1，4umol/L下游引物5u1，cDNA(HeLa)2u1，PrimeSTARDNApolymerase(2.5U/u1)(Takara)0.5ul，反应体积为50u1。F-box蛋白结构域编码序列的反应条件为98变性2分钟50秒;98。C10秒，60。C10秒，72。C40秒，20个循环，72。C延伸6分钟。RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段的反应条件为98变性2分钟50秒；98。C10秒，58°。10秒，72X:i分30秒，20个循环，72。C延伸6分钟。接下来分别用上述PCR产物为模板，进行第二次PCR，以获得最终的目的片段，其中第二次PCR的引物分别是F-box蛋白结构域编码序列的上游引物(pff2):5'-GTCGATATCGCCACCATGGAACAAAAACTTATTTCTGMGAAGATCTGATGGACCCGGCCGAGG-3'，下游引物(pfr2):5，-GTCGGATCCTCTTCCACATCTCCAATTAGATTC-3，，上述两条引物分别含有EcoRV和BamHI的酶切位点；RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段的上游引物(paf2):5，-CTGGGATCCGGCTCAGGCTCAGGATCAGGCTCACACACTCCAGTTAGGACTGTTATGA-3'，下游引物(par2):5，-GTCTCTAGATTATCGAGGAATGTGAGGTATTGGTG-3，，上述两条引物分别含有BamHI和XbaI的酶切位点。反应体系均为ddH2031u1,DMSOlOix1，2.5raMdNTP8u1，5Xprimestarbuffer(Takara)20u1，4umol/L上游弓I物IOu1，4ymol/L下游引物10ul，第一次PCR产物10u1，PrimeSTARDNApolymerase(Takara)(2.5U/ul)lul，反应体积为100ul。F-box蛋白结构域编码序列的第二次PCR反应条件为98变性2分钟50秒;98。C10秒，57。C10秒，72。C40秒，20个循环，72。C延伸6分钟。RB蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段的反应条件为98'C变性2分钟50秒；98。C10秒，57。C10秒，72。Cl分30秒，20个循环，72。C延伸6分钟。PCR产物用l。/。琼脂糖电泳鉴定，结果如图l所示，分别得到了大小为819bp的F-box蛋白结构域编码序列和1293bp的B蛋白的A-Bbox结构域编码序列片段。扩增产物进行琼脂糖电泳分离后，回收并克隆到pMD18-TVector载体上，进行测序分析，测序结果表明，该819bp的PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中的序列3，包括F-box蛋白结构域的编码cDNA序列(自序歹U3的5'末端第16—810位脱氧核糖核苷酸)；该1293bp的PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中的序列4，包括人RB蛋白的A-Bbox结构域的编码cDNA序列(自序列4的5'末端第55—1284位脱氧核糖核苷酸)。2.构建融合蛋白F-box-RBABbox基因应用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)回收上述两条目的基因片段，用BamHI(Takara)分别酶切上述两条片段，切胶回收后，酶切产物l:l混合(总体积5itl)，再加入等体积(5ul)的LigationMix(Takara)，混匀后16。C反应3小时后，以此连接产物为模板，用F-box蛋白结构域第二次PCR的上游引物(pff2)和人RB蛋白的A-Bbox结构域第二次PCR的下游引物(par2)进行PCR扩增，得到大小约为2kb的F-box-RBABbox片段，反应体系为ddH2031ul，DMS010ul，2.5mMdNTP8u1，5Xprimestarbuffer(Takara)20u1，4umol/L上游弓I物IOu1，4nmol/L下游引物10u1，连接产物10u1，PrimeSTARDNApolymerase(Takara)(2.5U/u1)lul，反应体积为100ul。PCR反应条件为98变性2分钟50秒；98。C10秒，58°C10秒，72。C40秒，40个循环，72'C延伸6分钟。反应产物包含有EcoRV(Takara)和XbaI(Takara)的酶切位点，反应产物用1%琼脂糖电泳鉴定(图l)。3.构建pcDNA3.F-box-RBABbox载体用EcoRV和XbaI分别对胶回收纯化后的pcDNA3.(Invitrogen)和F-box-RBABbox片段进行双酶切，按载体酶切产物=1:4比例混合(总体积5ul)，再加入等体积(5ul)的LigationMix，混匀后16。C反应过夜；连接液全部加入100iUDH5a大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42"C90秒，再冰上放置2分钟，加入900u1LB培养基，37°C200rpm培养l小时，低速离心后取下层菌液300yl涂布含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基中，37。C过夜培养。挑取菌落，加入到2ml含有氨苄青霉素(100wg/ml)的LB液体培养基中，37°C200rpm培养过夜，用QIApr印SpinMinipr印Kit(Qiagen)提取质粒，用PCR和EcoRV和XbaI双酶切进行鉴定，结果如图2和3所示，鉴定出的阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司广州分公司进行测序鉴定。测序结果表明，阳性重组质粒含有核苷酸序列是序列表中的序列l的F-box-RBABbox基因，将该重组质粒命名为pcDNA3.1(+)_F-box-RBABbox。4.pcDNA3.1(+)—F-box-RBABbox在Hela细胞中的表达使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)转染pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox质粒进入Hela细胞，具体实验步骤参照试剂说明书，简单陈述如下①转染前一天，在不包含抗生素的含10%FBS的高糖DMEM培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度达到70-80%;②.在0pti-MEJ^I低血清培养基稀释质粒，轻轻混匀；③稀释适量的试剂到0pti-MEJ^I低血清培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟；④孵育5分钟后，混合稀释的质粒和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以允许复合物的形成；将质粒-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。⑥37"C，C02培养箱孵育48小时，收集样品，以c-MycAntibody为一抗(SantaCruz，sc-56634)，并按照文献"萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1992.第889—898页"中描述的方法进行Westernblot检测，结果如图4所示，证明有融合蛋白F-box-RBABbox的表达。实施例2、pcDNA3.l(+)_F-box-RBABbox在Hela细胞中降解HPV18型E7蛋白的效果使用LipofectamineTM2000转染pcDNA3.l(+)—F-box-RBABbox质粒进入Hela细胞，具体实验步骤如上所述，转染48小时后，以HPV18E7Antibody为一抗(SantaCruz，sc-51952)，并按照文献"萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1992.第889—898页"中描述的方法进行Westernblot，检测HPV18型E7蛋白的水平，结果如图5中A;并使用Gel-ProAnalyzer软件对Westernblot结果进行灰度分析，结果如图5中B所示，结果证明本发明所表达的融合蛋白可以敲除HPV18型E7蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><row><column>〈210>2〈211〉691<212〉PRT<213〉人工序列〈220〉<223><400>2</column></row><row><column>ValAlaLysThrLysLeuAlaAsnGlyThrSerSerMetlieValPro859095LysGinArgLysLeuSerAlaSerTyrGluLysGluLysGluLeuCys100105110ValLysTyrPheGluGinTrpSerGluSerAspGinValGluPheVal115120125GluHisLeulieSerGinMetCysHisTyrGinHisGlyHislieAsn130135140SerTyrLeuLysProMetLeuGinArgAspPhelieThrAlaLeuPro145150155160AlaArgGlyLeuAspHislieAlaGluAsnlieLeuSerTyrLeuAsp165170175AlaLysSerLeuCysAlaAlaGluLeuValCysLysGluTrpTyrArg180185190ValThrSerAspGlyMetLeuTrpLysLysLeulieGluArgMetVal195200205ArgThrAspSerLeuTrpArgGlyLeuAlaGluArgArgGlyTrpGly210215220GinTyrLeuPheLysAsnLysProProAspGlyAsnAlaProProAsn225230235240SerPheTyrArgAlaLeuTyrProLyslielieGinAsplieGluThr245250255lieGluSerAsnTrpArgCysGlyArgGlySerGlySerGlySerGly260265270SerGlySerHisThrProValArgThrValMetAsnThrlieGinGin275280285LeuMetMetlieLeuAsnSerAlaSerAspGinProSerGluAsnLeu290295300lieSerTyrPheAsnAsnCysThrValAsnProLysGluSerlieLeu305310315320LysArgValLysAsplieGlyTyrliePheLysGluLysPheAlaLys325330335AlaValGlyGinGlyCysValGlulieGlySerGinArgTyrLysLeu340345350GlyValArgLeuTyrTyrArgValMetGluSerMetLeuLysSerGlu355360365GluGluArgLeuSerlieGinAsnPheSerLysLeuLeuAsnAspAsn370375380liePheHisMetSerLeuLeuAlaCysAlaLeuGluValValMetAla385390395400ThrTyrSerArgSerThrSerGinAsnLeuAspSerGlyThrAspLeu405410415SerPheProTrplieLeuAsnValLeuAsnLeuLysAlaPheAspPhe420425430TyrLysVallieGluSerPhelieLysAlaGluGlyAsnLeuThrArg435440445GluMetlieLysHisLeuGluArgCysGluHisArglieMetGluSer450455460LeuAlaTrpLeuSerAspSerProLeuPheAspLeulieLysGinSer465470475480LysAspArgGluGlyProThrAspHisLeuGluSerAlaCysProLeu485490495AsnLeuProLeuGinAsnAsnHisThrAlaAlaAspMetTyrLeuSer500505510ProValArgSerProLysLysLysGlySerThrThrArgValAsnSer515520525ThrAlaAsnAlaGluThrGinAlaThrSerAlaPheGinThrGinLys530535540ProLeuLysSerThrSerLeuSerLeuPheTyrLysLysValTyrArg545550555560LeuAlaTyrLeuArgLeuAsnThrLeuCysGluArgLeuLeuSerGlu565570575HisProGluLeuGluHislielieTrpThrLeuPheGinHisThrLeu580585590GinAsnGluTyrGluLeuMetArgAspArgHisLeuAspGinlieMet595600605MetCysSerMetTyrGlylieCysLysValLysAsnlieAspLeuLys610615620PheLyslielieValThrAlaTyrLysAspLeuProHisAlaValGin625630635640GluThrPheLysArgValLeulieLysGluGluGluTyrAspSerlie645650655lieValPheTyrAsnSerValPheMetGinArgLeuLysThrAsnlie660665670LeuGinTyrAlaSerThrArgProProThrLeuSerProlieProHis675680685lieProArg690<210>3〈211〉819<212〉腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉3<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>atttttcatatgtctttattggcgtgcgctcttgaggttgtaatggccacatatagcaga420agtacatctcttctggaacagatttgtctttcccatggattctgaatgtg480ctt3attta^aagcctttgattttt￡LCaa￡Lgtgatcgaaagttttatcaa540aacttgac^gagaaatg3tg認gatgtgaacatcgaatcatggaatcc600cttgcatggctctcagattcacctttatttgatcttattaggaxxgag^660gg3ccaax:1:gatcaccttgaatctgcttgtcctcttaatcttcctctccagaataatcac720actgcagcagatatgtatctttctcctgtaagatctccaaagaaaaaaggttcaactacg780cgtgtaaattctactgcaaatgcagagacacaagcaacctcagccttccagacccagaag840cc3ttgaa^tctacctctctttcactgttttgtatcggctagcctatctc900cactttgtgaacgccttctgtctgagcacccagaattagaacatatcatc960tggacccttttccagcacaccctgcagaMtcatgagagacaggcatttg1020tgatgtgttccatgtatggcatatgcaa^gtg犯g犯t^t1080ttcaaaatcattgtMcagcata<ca^gg8tcttcctcatgctgttcagga1140cgtgttttgatcaaaga^gaiggagt3tg3ttctattatagtattct3taactcggtcttc1200atgca^gactgaaaaca^atattttgcagtatgcttccaccaggccccctaccttgtca1260ccaatacctcacattcctcggac129权利要求1、一种能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白质(1)包括人F-box蛋白的结构域和人RB蛋白的A-Bbox结构域；所述人F-box蛋白的结构域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumberAAF04464的氨基末端第1位至254位氨基酸残基；所述人RB蛋白的A-Bbox结构域的氨基酸序列是自GenBankAccessionNumberNP_000312的氨基末端第379位至787位氨基酸残基；(2)将(1)的融合蛋白的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白质。2、根据权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(a)衍生的蛋白质。3、权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因。4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的编码基因，为如下c)或d)的基因c)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第16位至2091位脱氧核糖核苷酸；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。5、含有权利要求1或2所述融合蛋白编码基因的重组表达载体。6、根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pcDNA3.1(+)的EcoRV和XbaI位点间插入序列表中的序列1的DNA序列得到的重组表达载体。7、含有权利要求1或2所述融合蛋白编码基因的转基因重组细胞系和转基因重组菌。8、预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物，它的活性成分是权利要求1或2所述的融合蛋白，或权利要求5或6所述的重组表达载体。9、权利要求1或2所述的融合蛋白，和/或权利要求1或2所述的融合蛋白编码基因，和/或权利要求'5或6所述的重组表达载体在制备预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物中的应用。10、根据权利要求8所述的药物和权利要求9所述的应用，其特征在于所述HPV感染所致疾病为宫颈癌；所述HPV为HPV18型。11、权利要求1或2所述的融合蛋白，和/或权利要求5或6所述的重组表达载体，禾口/或权利要求1或2所述的融合蛋白编码基因在敲除HPVE7蛋白中的应用。全文摘要本发明公开了一种能敲除HPVE7蛋白的融合蛋白及其编码基因与应用。该融合蛋白，是如下(1)或(2)的蛋白质包括人F-box蛋白的结构域和人RB蛋白的A-Bbox结构域，(2)将(1)的融合蛋白的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能敲除HPVE7蛋白的由(1)衍生的蛋白质。该融合蛋白，和/或该融合蛋白编码基因，和/或含有该融合蛋白编码基因的重组表达载体可用于敲除HPVE7蛋白，用于制备预防和/或治疗HPV感染所致疾病的药物。文档编号A61P35/00GK101100487SQ20071011781公开日2008年1月9日申请日期2007年6月25日优先权日2007年6月25日发明者吉雁鸿,张雅鸥申请人:清华大学深圳研究生院