专利名称：：一种用于治疗肿瘤疾病的中药复方的制作方法一种用于治疗肿瘤疾病的中药复方本发明属于中药复方领域，具体涉及一种由黄芪、虎杖和番蕃枝组成的中药复方制剂，本复方制剂具有抗肿瘤及辅助治疗肿瘤疾病的作用。
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：黄芪为扶正固本的常用中药，中国药典规定，药用黄芪为豆科植物蒙古黄贫Afraga/MS附e附6rawacews(F/seW5ge.歸"gfe/,cwj(Segv)/fo'ao或膜荚黄贫爿Wraga/"swe附6ra""ce^(F&cA.」5ge.的干燥冲艮。其化学成分众多，主要含有皂苷、黄酮、多糖以及氨基酸等几类成分。如黄芪甲苷、槲皮素、异鼠李素、亚油酸、亚麻酸等，此外还含有硒、锌、铜、铁等14种微量元素。传统中医学认为，黄芪具有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿、敛疮生肌的功效。现代药理研究表明，黄芪具有增强机体免疫功能，强心降压、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗病毒、镇静、镇痛等作用。虎杖为廖科植物虎杖po/ygo""wcw/^toww"Zwcc.的干燥根茎及根，主要含有蒽醌类化合物、黄酮、白藜芦醇苷、水溶性多糖和鞣质等成分。虎杖性寒微苦，归肝、胆、肺经，有祛风湿、止咳化痰之功效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、经闭痛经、水火烫伤、趺打损伤等。现代药理学表明，虎杖具有扩张血管、抗血栓、抗休克、降血脂、抗菌抗病毒、抗氧化和保肝的作用。文献(洪照友，高毅，等.中药虎杖对大鼠肝脏缺血性损伤保护形态学观察[J].世界华人消化杂志，2000,8(2):162-164)表明，虎杖煎剂具有改善损伤肝组织的微循环,抑制白细胞、血小板与肝脏内皮细胞的黏附，达到促进肝细胞再生、修复损伤的能力。文献(刘红山，齐咏，等.虎杖提取物白藜芦醇对鼠肝癌细胞H22生长及扩增的影响[J].新乡医学院学报，2001,18(6)，)测定了虎杖的有效成分白藜芦醇对体外培养的小鼠肝癌细胞H22的抗癌活性，白藜芦醇终浓度为2.5、5.0、10.0、20.(Vg/mL，8、12、24、48h的抑制率较对照组有显著差异，显微镜下观察经药物处理48h的肝癌细胞，可见细胞膜不规则、肿胀和染色质断裂，电镜下可见细胞电子密度增加及出现凋亡小体，因而认为白藜声醇对体外培养的小鼠肝癌细胞H22的生长具有抑制作用，机制可能是诱导H22细胞凋亡。中国专利CN1679796A公开了一种抗肿瘤复方虎杖根、藤梨根、水杨梅根制剂及其制备方法。番荔枝为番荔枝科植物，属双子叶植物纲木兰亚纲，具有比较原始的性状，被达尔文成为"活化石"，原产于美洲热带，全世界有120属2100种。我国共有24属103种及6个变种，主要分布于西南至台湾，大部分产于华南及云南南部。华南引种的热带品种有圆滑番荔枝、刺果番荔枝、牛心番蕃技、毛叶番蕃技等。番荔技科植物中有7属12种可供药用，一般用来清热解毒、驱虫、止痢、抗肿瘤、抗疟等，今年来从番荔枝科植物中分离得到的一类新颖的植物成分-番蟲技内酯(J朋o"aceoMsacetogemVw)显示了很强的抗肿瘤活性，由于其结构独特，作用机理不同于现有的抗癌药物，是作用于线粒体干扰能量代谢，而且无致突变性，引起人们极大兴趣。中国专利已公幵多篇对番蒸枝内酯分离提取、番蕃枝内酯类化合物结构修饰及其在抗肿瘤方面的应用文献，如CN1171850C公开了一种番翥技二雜化合物及其制法和用途专利；CN1209355C公开了一种新型番蕃枝内酯衍生物及其制备方法和用途专利；CN1141093C公开了一种番蕃枝内酯抗癌有效部位药及其制备方法，其部位有效即为番蕃枝总内酯。
发明内容本发明的目的在于提供一种由黄芪、虎杖和番蕃枝组成的复方，本复方在抗肿瘤方面有较强的作用。本发明复方中，三味药的重量份为黄芪1~3重量份、虎杖37重量份、番荔枝37重量份。其中优选为番荔枝2重量份，虎杖4重量分，番荔枝5重量份。本发明的出发点是基于三药在抑制肿瘤生长的不同机理而进行处方组合的。黄芪的抗癌作用并不是药物直接杀死癌细胞，而是通过对机体的免疫调节，主要成分为黄芪多糖，通过诱导淋巴细胞产生IL-2和IFN,直接或间接参与细胞因子网络和免疫系统的调控，从而杀灭癌细胞或诱导某些肿瘤细胞凋亡。-虎杖则主要是通过其中的白藜芦醇和大黄素起作用，在抑制癌细胞增殖过程中，对致癌的3个主要阶段均具有化学防癌活性，它具有抗氧化性和抗突变作用，并且可以诱导第二期药代酶(抗起始活性)；它可以传递抗炎作用并有抑制环氧合酶(COX)和过氧化氢酶的功能(抗促进作用);它还可以诱导人类早幼粒细胞白血病细胞的分化(抗发展作用)及抑制核糖核酸还原酶作用，而核糖核酸还原酶是细胞增生中DNA合成所必需的物质，作用靶点为癌细胞的DNA。番荔技中，其起抗癌作用的成分主要为番荔枝内酯。番荔枝内酯的Ames试验显阴性，表明这种化合物可能不是致癌源，也进一步说明其作用靶点不是染色体或DNA,其对线粒体复合物I具有强烈抑制作用，作用机理是通过抑制线粒体NADH氧化还原酶，从而阻止呼吸链电子的传递，使ATP产生迅速减少，由于能量的减少引起P-gp(可滲透性蛋白)功能的减弱及随后的细胞凋亡。同时，番荔枝内酯能引起细胞内活性氧的增加和线粒体膜点位的降低，活性氧的大量释放和线粒体膜电位的降低均能引起半胱氨酸蛋白酶caspase-9的释放，从而激活了半胱氨酸蛋白酶caspase-3，活化的caspase-3使其它底物PARK降解，从而诱导了肿瘤细胞的凋亡。本发明在研究中发现，将上述三味药的组合在一起使用，在抗癌方面起到了意想不到的效果，其对癌细胞的抑制作用强于任何一种药单独使用。本发明中，可以将三味药合在一起通过传统的煎煮工艺提取其有效成分，也可以通过将各自的有效部位提纯后组合在一起使用，优选将各自的有效部位提纯后组合在一起使用。本发明中，黄芪的有效部位主要为多糖类物质；虎杖的主要有效成分为大黄素类化合物和白藜芦醇或白藜芦醇苷及其衍生物类化合物；番蕃枝有效成分为番荔枝内酯类化合物。本发明中，主要通过将各自有效部位提取后再组合在一起使用。本发明中，番荔技内酯除可从番荔枝科番蕃枝属植物一如光叶番蕃技(又称圆滑番荔技)中分离得到外，还可从番荔枝科的其它属中分离得到，如紫玉盘属(C/v"r/a)，哥钠香属(Go"/of/^/am^)，泡泡树属(y4w7w'wa),卷团属(Ao〃fm'a),木瓣树属(Z;;/op/a)或暗罗属(Po/j^Z^)中分离得到，其属中的植物如海南哥纳香(Go"z'oA(3/amus/zow")、长叶哥钠香((7ow/of/M;/"m"sgani"en〕、田方骨(GoraV^/w/a附iw<io""an'era!'s)、大花哥纳香(Ggn^^力、景洪哥钠香(Gc/^"e"^)、大叶紫玉盘((/van'amacra_p/z_y〃a)、弟!j果紫玉盘(f/.ca/"w/j/rato)、越南紫玉盘(t/.towto2esis)、弟!j果番蕃枝(」""o""、囊辦木OSacco/gto/w附/ro/zycww)。本发明有效成分的提取工艺可以通过如下步骤实现(1)黄芪活性成分的制备取黄芪，粉碎成粗粉，用水煎煮提取，过滤，取滤液，滤液浓缩至相对密度约为1.10,在不断搅拌的情况下加乙醇使含醇量为70%，放置冷处静置，离心或过滤，取沉淀，加适量水溶解，使相对密度约为1.20,继续在不断搅拌的情况下加入乙醇使含醇量为50%，放置冷处静置，离心或过滤，沉淀干燥即得活性成分I;(2)虎杖活性成分的制备取虎杖，粉碎成粗粉，50%80%的乙醇于50口-70口下浸泡提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色变淡，改用75%的乙醇洗脱48个柱体积，收集75%的乙醇洗脱液，合并，浓缩，干燥，即得虎杖活性成分II;(3)番荔枝活性成分的制备取番荔枝种子，粉碎，以石油醚浸泡提取2次，过滤，弃石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以去离子水浸泡提取两次，过滤，弃水提液，滤渣再用75%~95%的乙醇浸泡提取23次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓縮，加蒸馏水分散浓缩浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC下减压浓缩，干燥，即得番蕃枝活性成分III;将活性成分I、II、III合并，混句，即得总活性部位。本发明活性部位中，加入制药上可接受的辅料，可制成各种所需的剂型。本发明所制得的剂型可以是口服制剂，注射制剂，优选口服制剂。如口服素片、口服糖衣片、口服肠溶片、口服泡腾片、口服缓控释片、口服硬胶囊、口服软胶囊、口服滴丸等。本发明中，所用的药用辅料，可以选自于粘合剂(可以是聚维酮、淀粉浆、纤维素等)、崩解剂(可以是干燥淀粉、羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等)、润滑剂(可以是滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙镁、硬脂酸钙等)、矫味剂(可以是蔗糖、阿司巴甜、甜菊素、果糖等)、稳定剂(可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、稀释剂(可以是淀粉、糊精、糖粉、乳糖等)、润湿剂(可以是水或乙醇)、助流剂(可以是微粉硅胶)、赋形剂(可以是糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇；淀粉类衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精或羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维、羟丙基纤维、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙；硅酸盐衍生物如硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钩；硫酸盐衍生物如硫酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钩；阿拉伯胶；右旋糖苷)。具体实施例活性成分提取实施例以下实施例仅仅是对本发明的进一步说明，而不是在于限制本发明。在同样的条件下，黄芪、虎杖、番荔枝可做量的改变。实施例1黄芪活性成分的制备取黄芪100g，粉碎成粗粉，用8倍量水煎煮提取3次，过滤，取滤液,滤液浓缩至相对密度约为1.10,在不断搅拌的情况下加95%的乙醇使含醇量为70%,放置冷处静置，离心，取沉淀，加适量水溶解，调整相对密度约为1.20,继续在不断搅拌的情况下加入乙醇使含醇量为50%,放置冷处静置，离心或过滤，沉淀干燥即得活性成分黄芪多糖I;虎杖活性成分的制备取虎杖300g，粉碎成粗粉，8倍量50。/。的乙醇于5(TC下浸泡提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色变淡，改用75。/。的乙醇洗脱4个柱体积，收集75%的乙醇洗脱液，合并，浓缩，干燥，即得虎杖活性成分II;番荔枝活性成分的制备取番荔技种子700g,粉碎，以8倍量石油醚浸泡提取2次，过滤，弃石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取两次，过滤，弃水提液，滤渣再用95%的乙醇浸泡提取3次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩，加蒸馏水分散浓縮浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC下减压浓缩，干燥，即得番荔枝活性成分III;合并活性成分I、II、III，混匀，即得本发明活性成分。实施例2黄芪活性成分的制备取黄芪300g，粉碎成粗粉，用10倍量水煎煮提取3次，过滤，取滤液，滤液浓缩至相对密度约为1.10,在不断搅拌的情况下加95%的乙醇使含醇量为70%,放置冷处静置，离心，取沉淀，加适量水溶解，调整相对密度约为1.20，继续在不断搅拌的情况下加入乙醇使含醇量为50°/。，放置冷处静置，离心或过滤，沉淀干燥即得活性成分黄芪多糖I;虎杖活性成分的制备取虎杖700g，粉碎成粗粉，8倍量80n/。的乙醇于7(TC下浸泡提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色变淡，改用80%的乙醇洗脱8个柱体积，收集80%的乙醇洗脱液，合并，浓缩，干燥，即得虎杖活性成分II;番蒸枝活性成分的制备取番荔枝种子300g,粉碎，以8倍量石油醚浸泡提取2次，过滤，弃石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取两次，过滤，弃水提液，滤渣再用80%的乙醇浸泡提取3次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩，加蒸馏水分散浓缩浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC下减压浓缩，干燥，即得番荔枝活性成分m;合并活性成分I、II、III,混匀，即得本发明活性成分。实施例3黄芪活性成分的制备取黄芪200g，粉碎成粗粉，用8倍量水煎煮提取3次，过滤，取滤液，滤液浓缩至相对密度约为1.10,在不断搅拌的情况下加95%的乙醇使含醇量为70%,放置冷处静置，离心，取沉淀，加适量水溶解，调整相对密度约为1.20,继续在不断搅拌的情况下加入乙醇使含醇量为50%,放置冷处静置，离心或过滤，沉淀干燥即得活性成分黄芪多糖I;虎杖活性成分的制备取虎杖400g,粉碎成粗粉，8倍量60%的乙醇于60卩下浸泡提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色变淡，改用60%的乙醇洗脱4个柱体积，收集60%的乙醇洗脱液，合并，浓缩，干燥，即得虎杖活性成分n;番荔枝活性成分的制备取番荔枝种子500g，粉碎，以8倍量石油醚浸泡提取2次，过滤，弃石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取两次，过滤，弃水提液，滤渣再用95%的乙醇浸泡提取3次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩，加蒸馏水分散浓缩浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC下减压浓缩，干燥，即得番荔技活性成分III;合并活性成分I、II、III,混匀，即得本发明活性成分。药理实施例以下药理实验中，以实施例3所得到的提取物为例，但这并不是限制本发明(1)体外药理实施例细胞株白血病细胞株K562、乳腺癌细胞株MDA-MB-436、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞SW480。将处于对数生长期的白血病细胞珠、乳腺癌、肝癌细胞、结肠癌细胞和LAK细胞(对照组)用RPMI-1640培养基配成2xl05/ml细胞悬液，加入96孔圆底细胞培养板内，每孔0.2ml,再分别加入同工艺条件下的黄芪多糖提取物、虎杖提取物、番荔枝内酯提取物、本发明提取物，使其浓度均为2.0、5.0、10.0吗/ml，每一测试浓度5孔，置37。C、5。/。C02饱和湿度条件下培养72小时，用MTT法在酶联检测仪570nm波长测得吸光(A)值。计算出本发明提取物对各细胞株的抑制率。抑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>结果见表l表1不同浓度本发明提取物对肿瘤细胞和LAK细胞的增值抑制率(0/。)细胞株黄芪活性部位虎杖活性部位番荔枝活性部位本发明活性提取物2.05.010.02.05.010.02.05.010.02.05.010.0K562123549215572215678196989MDA-MB-43693453175169154563185781HepG2194665326381326477297492SW480154056275974194968236786LAK-137031417490318从上表结果可知，各提取物在2.0-10pg/ml时，对三种癌细胞均具有一定的抑制作用。对LAK细胞毒性实验表明，黄茛提取物在210pg/ml范围内，对LAK细胞基本无毒性，虎杖活性部位在10.0pg/ml时，显示一定的细胞毒性作用，但较对癌细胞的抑制，作用不明显，番荔枝活性部位在10.0pg/ml时，对LAK细胞显示较强的毒性作用，而当三药和在一起使用时，当其浓度为lO.Opg/ml,对LAK的细胞毒性明显降低，说明黄芪和虎杖可降低番蕃技对LAK的细胞毒性。对癌细胞的抑制作用，单独用药与联合用药相比，在5.010^ig/ml时，即显示出协同增强效果，尤其是对白血病细胞、肝癌细胞和结肠癌细胞，与单独用药相比，差异有显著性(P0.05)。2、体内药理实施例(1)对小鼠S180肉瘤的抑制作用取接种7天后的S180腹水，用生理盐水稀释成1:3的悬液备用，将制备的S180瘤细胞悬液，以0.211117只的量接种与昆明小鼠右前肢腋部皮下，24小时后将已接种的小鼠随机分为对照组、黄芪提取物组、虎杖提取物组、番荔技内酯组、本发明组合物提取物组，每组10只，各给药组每天给小鼠灌胃给药50mg/kg.cT1，每天给药一次，对照组每天灌胃给予等量的生理盐水，各组连续给药7天。停药后拉颈处死，剥取瘤块称重，按"抑瘤率=(1-Hl^llllg)xKKm"公式计算抑瘤率。结果见表2表2对小鼠核S180瘤的抑制作用(S±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验结果表明，各治疗组均具有一定的治疗效果，其对小鼠移植性肉瘤S180的抑制率可达到32.69%-71.13%,在等同剂量下(均为10mg/kg.cT1)，联合用药组的抑瘤率要明显强于单独用药组，其中联合用药组在相对低剂量下(30mg/kg.cT1)，即可达到与黄芪提取物(50mg/kgi1)和虎杖提取物(50mg/kg.cT1)相当的效果。说明两药联合在一起使用，在体内对移植性小鼠S180肉瘤的抑制具有协同增强的效果。(2)对小鼠移植性肝癌HepG2的抑制作用取接种7天后的HepG2腹水，用生理盐水稀释，调整稀释,使其种浓度为2xl06个/mL,将制备的HepG2瘤细胞悬液，以0.2mL/只的量接种与小鼠右前肢腋部皮下，24小时后将已接种的昆明小鼠随机分为对照组、黄芪提取物组、虎杖提取物组、番蕃枝内酯组、本发明组合物提取物组，每组10只，各给药组每天给小鼠灌胃给药50mg/kg.d'1,每天给药一次，对照组每天灌胃给予等量的生理盐水，各组连续给药7天。停药后拉颈处死，剥取瘤块称重，按"抑瘤率-(1-Ifl^imfl)xlOO。/。"公式计算抑瘤率。结果见表3X寸照组肿瘤的平均重量表3对小鼠核HepG2肝癌细胞的抑制作用(S±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验结果表明，各药物组对HepG2均有一定的抑制作用，单用以虎杖提取物最强，但三药联合使用，对小鼠移植HepG2癌的抑制率可达到61.88%,其作用在等同剂量下明显强于黄芪、虎杖或番荔枝单独使用，在本发明低剂量使用时(30mg/kg.d")，其对小鼠抑制瘤的抑制作用与番荔枝相当，但强于黄芪单独使用。以上结果表明，联合用药在抑制小鼠移植HepG2瘤生长过程中，可起到协同增强的效果。权利要求1、一种用于抗肿瘤的中药复方，其特征是由下列重量份的原料药组成黄芪1～3份，虎杖3～7份，番荔枝3～7份。2、如权利要求l所述的中药复方，其特征是黄芪2份，虎杖4份，番荔技5份。3、一种制备如权力要求1或2所述的中药复方的方法，其特征在于包括如下(1)黄芪活性成分的制备取黄芪，粉碎成粗粉，用水煎煮提取，过滤，取滤液，滤液浓缩至相对密度约为U0，在不断搅拌的情况下加乙醇使含醇量为70%,放置冷处静置，离心或过滤，取沉淀，加适量水溶解，使相对密度约为1.20,继续在不断搅拌的情况下加入乙醇使含醇量为50%,放置冷处静置，离心或过滤，沉淀干燥即得活性成分I;(2)虎杖活性成分的制备取虎杖，粉碎成粗粉，50%80%的乙醇于50'C-7(TC下浸泡提取，过滤，取滤液，减压浓缩滤液至无醇味，浓缩液上已处理好的大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液颜色变淡，改用75%的乙醇洗脱4~8个柱体积，收集75%的乙醇洗脱液，合并，浓缩，干燥，即得虎杖活性成分II;(3)番荔枝活性成分的制备取番荔技种子，粉碎，以石油醚浸泡提取2次，过滤，弃石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以去离子水浸泡提取两次，过滤，弃水提液，滤渣再用75%95%的乙醇浸泡提取2~3次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩，加蒸馏水分散浓缩浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，50。C下减压浓缩，干燥，即得番荔技活性成分m;(4)将活性成分I、II、III合并，混匀，即得总活性部位。4、如权利要求1或2所述的中药复方在制备具有抗肿瘤作用和肿瘤辅助治疗作用的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种用于治疗肿瘤疾病的中药复方，该复方由活性药材黄芪、虎杖和番荔枝组成，经药理实验证明，该复方具有较强的抑制肿瘤生长增殖的作用，可用于制备抗肿瘤药物。文档编号A61P35/00GK101284052SQ20071012105公开日2008年10月15日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者熊国裕申请人:北京星昊医药股份有限公司