专利名称：益生菌在制备治疗与预防手足口病组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌等益生菌的药物新用途， 具体涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌等益生菌作为活性成份在制备治 疗与预防手足口病组合物中的应用，属于生物药领域。
背景技术：
益生菌(Probiotics)是一类通过改善宿主肠道微生物菌群平衡而发挥作用的 活性微生物，是人体肠道重要的生理菌，能够促进肠内微生物菌群的生态平衡， 有改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌的增殖、抑制有害菌的生长等重要生 理功效，目前利用益生菌制成的药品、保健品或饮品等益生菌制剂主要用于治 疗肠道菌群失调引起的腹泻、便秘和腹胀等肠道症状，到目前为止，尚未见益 生菌治疗手足口病的研究报道。常用的益生菌菌种有酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、 双歧杆菌、乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、肠球菌和 某些链球菌等。
手足口病(Hand-Food and Mouth Disease， HFMD)是一种主要发生于儿童的 病毒性皮肤病，多发生于婴幼儿，成人也偶见发生，又名发疹性水泡性口腔炎， 具有很强的传染性，常暴发流行，已有数十个国家和地区报告发生和流行。该 病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃成溃疡为主要临床特征，由数种肠道病毒感 染所致，常见病毒是柯萨奇病毒。手足口病的症状较重，并可发生严重的并发 症，如并发无菌性脑膜炎、脑炎及瘫痪。亚太地区HFMD流行均伴较高的死亡 率，有报道HFMD感染部分患儿有不同程度心肌损害。台湾1998 2000年两次 暴发HFMD流行，死亡78例。目前HFMD极强的传染性越来越被临床医师所 重视，且HFMD发生于夏季，易继发皮肤感染，故积极治疗HFMD，防止继发 感染，切断传播途径、防止暴发流行显得尤为重要。目前，治疗HFMD尚无特 效药物，临床用药主要有抗病毒药、中药和抗菌药等，治疗效果不理想，并有 副作用，影响儿童健康，治疗和预防传染成为医学上的难题，本发明的药物新 用途解决了这一医学难题，不但能有效治疗手足口病，在HFMD流行时可以预 防传染，而且没有副作用，不会损害儿童身体健康，社会意义巨大，特申请此 发明专利。
发明内容
到目前为止，尚未见益生菌治疗手足口病的研究报道，本发明的E1的是提 供益生菌的一种新的制药用途，即益生菌在制备治疗与预防手足口病组合物中 的应用，该组合物包含药品、保健品和饮品等。
本发明人首次选用酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌 和枯草芽孢杆菌等益生菌治疗于足口病，疗效显著。
手足口病的发病机理是病毒通过肠道屏障，进入肠壁，首先在肠壁细胞内 增殖，以游离的形式进入血液，到达手足部皮肤和口腔粘膜部继续增殖，导致 手足部皮肤玫瑰色斑、斑丘疹、疱疹、口腔溃疡的发生，未及时有效治疗继发 皮肤感染、心肌炎、脑膜脑炎等。
酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等
益生菌对手足口病是从多方面发挥治疗作用，主要包括以下几个方面
1、 益生菌直接补充肠道有益菌，并抑制肠道有害菌，促进肠道有益菌生长， 快速恢复肠道菌群平衡，使肠道有益菌与肠粘膜上皮紧密结合而产生占位性保 护和生物拮抗作用，阻止病毒进入肠壁细胞及进入血液，从而消除病源，切断 传播途径，防止手足口病病情的进一步发展，使手足口病痊愈。手足口病流行 时，应用益生菌，阻止病毒进入肠壁和血液，可以预防感染手足口病。
2、 益生菌能提高机体体液免疫和细胞免疫，提高机体的抗病毒能力， 一方 面可以促进手足口病痊愈；另一方面可以预防感染手足口病。
3、 益生菌能提高机体的粘膜免疫，尤其肠道粘膜免疫，促进粘膜大量分泌 具有重要抗感染作用的IgA，杀死进入肠粘膜细胞中的病毒，阻止病毒入血，损 害手足部皮肤和口腔粘膜。
4、 益生菌能直接抑制病毒，研究发现益生菌能产生干扰素，抑制病毒的复制。
5、 病毒在肠粘膜细胞中增殖必然会导致粘膜损伤，使粘膜屏障造到破坏， 病毒大量通过肠壁进入血液，部分手足口病患者有腹泻、腹痛症状。益生菌进 入肠道能分泌大量丁酸、乙酸、乳酸等短链脂肪酸，短链脂肪酸(尤其丁酸) 是肠粘膜的重要营养物质和能量来源，能促进受损肠粘膜的修复，改变肠粘膜 通透性，增强肠粘膜屏障功能。短链脂肪酸还能促进肠道蠕动，加速病毒排除 体外。
益生菌从多个方面发挥作用治疗和预防手足口病，本发明人通过临床观察 发现酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等 益生菌治疗与预防手足口病的疗效显著，有效率均达90%以上，并随剂量的增
加，疔效加强，且未发现任何毒副作用，是首次揭示了益生菌治疗手足1J病的 新医药用途。
木发明所述酪酸梭菌选g但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum )、 CGMCC、保存编号0313.1。
本发明所述凝结芽孢杆菌选自但不限于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、 CGMCC 、保存编兮1207。
本发明所述双歧杆菌选自但不限于婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、 CGMCC、保存编号0313.2，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、 CGMCC、 保存编号0313.5，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、CGMCC、保存编号0313.6， 两歧双歧杆菌，又称双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、 CGMCC、保存 编号0313.7。
本发明所述乳杆菌选g但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、 CGMCC、保存编号0313.4。
本发明所述链球菌选自但不限于嗜热,连球菌(Streptococcus thermophilus)、 CGMCC、 {呆存编号0313.3。
本发明所述枯草芽孢杆瞎选向似不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 CGMCC 、保存编号1887。
本发明所述益牛菌包含酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链 球菌、枯草芽孢杆菌等，以它们中的任何一种菌或几种菌组合作为L要药物活 性成份制成药物组合物，治疗与预防手足口病。
本发明所述的酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆歯、链球齒、枯 草芽孢杆菌等益生菌指活生物个体。
本发明足以有效剂量的酪酸梭齒、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链 球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌根据h而所述单独或组合作为药物活性成份，按 照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、
湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合r临
床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、灌肠剂等剂,。 本发明所述益牛.菌组合物可以是益生菌单独作为活性成份制成活菌制剂，
也口J以是i^生菌与其他非益生菌活性成份组合制成活菌制剂，以起到协同治疗
作用，提高对手足U病治疗效果。
木发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆齒、
链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌根据上面所述单独或组合作为药物活性成份制
成的同体活菌制剂包含的总活齒数不能低丁- lX106CFU/g，.般在lXl07CFU/g
以上，最高可达到1 X 1012CFU/g或1 X 1012CFU/g以上。
木发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、 链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌根据上面所述单独或组合作为药物活性成份制 成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/mL， 一般在IX 107CFU/mL以上，最高可达到1 X 1012CFU/mL或1 X 1012CFU/mL以上。
本发明优选的制剂工艺为，先在液体培养基中接种菌种，进行培养或多级 扩增培养，然后将液态培养物离心，收集湿菌泥，并将所述菌泥干燥、过筛， 得到干燥菌粉。将所得干燥菌粉与药用载体混合，制成最终剂型。制剂工艺并 不局限于本发明所述，其它公知的制剂工艺均可以。
由丁本发明首次公开了以益生菌为药物活性成份在制备治疗与预防感染手 足口病药物中的应用，因此，以益生菌，包括酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢 杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等单独或组合作为药物活性成份与辅料 组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗与预防感染手足口病，均属于本发明的 保护范围。
本发明所述的益生菌在制成任何种剂型时，均具有治疗手足口病和预防 感染手足口病的作用。任何药剂，如果其组份屮含有酪酸梭菌、双歧杆菌、凝 结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌中的一种或几种成份制 备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示 具有治疗手足口病和预防感染手足口病的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明所述益生菌可以制成保健品或饮品。将酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结 芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌制成的保健品或饮品，如 果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治 疗手足口病和预防感染手足口病的作用，则落入本发明的保护范围之内。
具体实施例方式
药物制备例说明益生菌制剂的制备是首先制备菌粉，然后按照需要填加 相应辅料按常规方法制成最终剂型。菌粉制备过程中所用的培养基，本技术领 域人员公知的培养基均可以。本发明所述益生菌制剂的制备按照本领域技术人 员已知的制剂工艺均可以，并不局限于下面所述的方法，本发明以口服酪酸梭 菌活菌散剂和U服凝结芽孢杆菌活菌散剂的具体制备为例，说明益生菌的制备 方法，本领域技术人员根据本发明所述很容易掌握其它益生菌制剂的制剂工艺， 在此为说明简洁，其它益生菌制剂的制备方法省略，不冉一一叙述说明。
1、菌粉制备取益生菌菌种管一支，溶于已灭菌装有10mL生理盐水和适量玻璃珠的 100mL三角瓶中，75。C水浴活化IO分钟，用lmL无菌吸管吸取lmL菌悬液， 接种装有50mL扩增培养基的250mL三角瓶中，置摇摆床内37。C恒温振荡 (190rpm)培养24小时，转接装有450mL扩增培养基2500mL档板三角瓶中， 37"恒温振荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.5L扩增培养基的种子 罐中，厌氧(或好氧)培养(充气量3: 1) 24小时，镜检无杂菌后转接有45L 发酵培养基的发酵罐中，37"C厌氧(或好氧)培养(充气量3: 1) 24小时，镜 检芽孢率达80%以上(非芽孢菌不检查芽孢率)，停止培养。用连续离心机，12000 rpm离心。收集湿菌泥，称重，按l: 1 (w/v)添加冻干保护剂，冻干，研细， 过IOO目筛，常温保存备用。
2、成品制备
依据益生菌菌粉的活菌数，按比例和需要添加各种辅料，制成最终剂型， 使活菌数不低于1 X 106CFU/g或1 X 106CFU/mL。
药物制备实施例1口服酪酸梭菌活菌散剂的制备
1、 菌粉制备
取酪酸梭菌菌种管一支，溶于已灭菌装有10mL生理盐水和适量玻璃珠的 lOOmL三角瓶中，75。C水浴活化10分钟，用lmL无菌吸管吸取lmL菌悬液， 接种装有50mL扩增培养基的250mL三角瓶中，置摇摆床内37。C恒温振荡 (190rpm)培养24小时，转接装有450mL扩增培养基2500mL档板三角瓶中， 37"恒温振荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.5L扩增培养基的种子 罐中，厌氧培养(充气量3: 1)24小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养基 的发酵罐中，37。C厌氧培养(充气量3: 1) 24小时，镜检芽孢率达80%以上， 停止培养。用连续离心机，12000rpm离心。收集湿菌泥，称重，按l: 1 (w/v) 添加冻干保护剂，冻干，研细，过100目筛，常温保存备用。
2、 成品制备
据酪酸梭菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖，使活菌数不低 于lX106CFU/g，装袋。
药物制备实施例2 口服凝结芽孢杆菌活菌散剂的制备 1、菌粉制备
取凝结芽孢杆菌菌种管一支，溶于已灭菌装有10mL生理盐水和适量玻璃 珠的100mL三角瓶中，75。C水浴活化10分钟，用lmL无菌吸管吸取lmL菌悬 液，接种装有50mL扩增培养基的250mL三角瓶中，置摇摆床内37。C恒温振荡 (190rpm)培养24小时，转接装有450mL扩增培养基2500mL档板三角瓶中，
37t:恒温振荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.5L扩增培养基的种子 罐中，好氧培养(充气量3: 1) 24小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养基 的发酵罐中，37"C好氧培养(充气量3: 1) 24小时，镜检芽孢率达80%以上， 停止培养。用连续离心机，12000 rpm离心。收集湿菌泥，称重，按l: 1 (w/v) 添加冻干保护剂，冻干，研细，过100目筛，常温保存备用。 2、成品制备
依据凝结芽孢杆菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖，使活菌 数不低于lX106CFU/g，装袋。
临床疗效观察实施例说明虽然益生菌有许多菌种，但它们的作用(包括 治疗手足口病)机理大致相同，包括恢复肠道菌群平衡、提高机体和粘膜免疫、 抑制病毒复制、分泌短链脂肪酸等，所以可以明显的预见各种益生菌治疗手足 口病的疗效是一样的，因此在临床疗效观察实施例中观察酪酸梭菌、双歧杆菌、 凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌治疗手足口病的临床 疗效，所选择的益生菌包含了含芽孢的、不含芽孢的、需氧的、厌氧的等各个 方面的，并且都是临床上最普遍应用的益生菌，能充分代表和揭示所有益生菌 治疗手足口病的临床疗效。
试验例1酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽 孢杆菌治疗与预防手足口病疗效观察
1对象与方法
1.1病例资料按手足口病诊断标准明确诊断为手足口病的60例患者，男 38例，女22例，平均年龄1.5周岁，最大3周岁。病例均发热，37.5 40°C。 手足口均有米粒至绿豆大小的圆形、椭圆形的疱疹。随机分为酪酸梭菌组、双 歧杆菌组、凝结芽孢杆菌组、乳杆菌组、链球菌组、枯草芽孢杆菌组，每组10 例患者，观察益生菌对手足口病的治疗效果。
1.2给药方法
口服酪酸梭菌活菌散剂，每袋500mg (含酪酸梭菌活菌数不低于1.0X 106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一天3次。
口服双歧杆菌活菌散剂，每袋500mg (含双歧杆菌活菌数不低于1.0X 106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一天3次。
口服凝结芽孢杆菌活菌散剂，每袋500mg (含凝结芽孢杆菌活菌数不低于 1.0XlCfcfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一天3次。
口服嗜酸乳杆菌活菌散剂，每袋500mg (含嗜酸乳杆菌活菌数不低于1.0X 106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一天3次。
口服嗜热链球菌活菌散剂，每袋500mg (含嗜热链球菌活菌数不低于1.0X 106cfU/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一天3次。
口服枯草芽孢杆菌活菌散剂，每袋500mg (含枯草杆菌活菌数不低于1.0X 106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。2袋/次， 一大3次。
以上疗程均为4天。
1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后体温、皮疹和饮食情况。 1.4治疗手足口病疗效评定标准(刘素琴.更昔洛节治疗婴幼儿手足口病的 疗效.实用儿科临床杂志，2006， 21 (24): 1731-1732) 显效体温正常，皮疹基本消退，饮食正常； 好转休温下降，皮疹部分消失，能少量进食； 无效体温、皮疹或饮食无改善。 显效及好转为有效，同时观察不良反应。 2结果 2.1治疗效果
酪酸梭菌组，显效9例，好转1例，总有效率100%。 双歧杆菌组，显效6例，好转3例，无效1例，总有效率90%。 凝结芽孢杆菌组，显效8例，好转2例，总有效率100%。 乳杆菌组，显效7例，好转3例，总有效率100%。 链球菌组，显效6例，好转4例，总有效率100%。 枯草芽孢杆菌组，显效6例，好转3例，无效1例，总有效率90%。 各组间有效率无统计学差异(P〉0.05) 2.2不良反应
临床观察未见任何不良反应。 3讨论
酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌基 本代表了所有的益生菌，酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球 菌、枯草芽孢杆菌治疗手足口病疗效显著，说明益生菌治疗手足口病的疗效是 肯定的。由于手足口病多发生于婴幼儿，这与婴幼儿肠黏膜未发育成熟，通透 性高，肠道菌群屏障也不完善和免疫力低等有关，益生菌能产生短链脂肪酸修 复肠黏膜，促进肠黏膜发育成熟，同时建立完善的肠道菌群屏障和提高机体和 黏膜免疫，在治疗和预防感染手足口病方面疗效显著，本次选择病例都是婴幼 儿，但可以预见到治疗3周岁以上的儿童或成人手足口病同样有效，所需要的 剂量是临床医生根据病情和年龄能很容易掌握的。同时，根据益生菌的临床疗
效和作用机理，可以很容易预见到手足口病暴发流行时，口服益生齒可以预防 感染手足口病，降低手足口病的发病率。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年7月28日、2004 年8月23日和2006年12月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物物屮心(北京市海淀区屮关村北一条13号，中国科学院微生物研究所邮编 100080)保藏，共九个下述微生物菌种，但本发明所述的酪酸梭菌、双歧杆菌、 凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌并不局限于这九种微牛.物菌种。
(1) 分类命名酪酸梭菌Clostridium butyricum，保存编号0313.1。
(2) 分类命名婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis，保存编g 0313.2。
(3) 分类命名嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、保存编号0313.3 。
(4) 分类命名嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus )、保存编号0313.4。
(5) 分类命名长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保存编号0313.5。
(6) 分类命名短双歧杆菌Bifidobacterium breve，保存编号0313.6。
(7) 分类命名双歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，保存编兮0313.7。
(8) 分类命名凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans，保存编号1207。
(9) 分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、保存编号1887。
上述九个微生物菌种经该微生物屮心检测，检测结果均为存活。
权利要求
1、益生菌在制备治疗手足口病和预防感染手足口病组合物中的应用，所述组合物包括药品、保健品和饮品。
2、 按权利要求l所述应用，其特征在于益生菌包含酪酸梭菌、双歧杆菌、 凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌。
3、 按权利要求l所述应用，其特征在于益生菌指活的生物个体。
4、 按权利要求l所述应用，其特征在于益生菌组合物可以是益生菌单独作 为活性成份制成活菌制剂，也可以是益生菌与其他非益生菌活性成份组合制成 活菌制剂。
5、 按权利要求2所述应用，其特征在于酪酸梭菌包含但不限于酪酸梭菌 CGMCC0313. 1株。
6、 按权利要求2所述应用，其特征在于双歧杆菌包含但不限于婴儿双歧杆 菌CGMCC0313. 2株，长双歧杆菌CGMCC0313. 5株，短双歧杆菌CGMCC 0313. 6株， 两歧双歧杆菌CGMCC0313. 7株。
7、 按权利要求2所述应用，其特征在于凝结芽孢杆菌包含但不限于凝结芽 孢杆菌1207株。
8、 按权利要求2所述应用，其特征在于乳杆菌包含但不限于嗜酸乳杆菌 CGMCC0313.4株。
9、 按权利要求2所述应用，其特征在于链球菌包含但不限于嗜热链球菌 CGMCC0313. 3株。
10、 按权利要求2所述应用，其特征在于枯草芽孢杆菌包含但不限于枯草 芽孢杆菌CGMCC1887株。
全文摘要
本发明公开了益生菌在制备治疗与预防感染手足口病组合物中的应用，具体涉及益生菌治疗手足口病和预防感染手足口病的药物新用途，益生菌包含酪酸梭菌、双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等，组合物包含药品、保健品和饮品。
文档编号A61P31/12GK101336938SQ200710129319
公开日2009年1月7日 申请日期2007年7月2日 优先权日2007年7月2日
发明者崔云龙, 李洪福 申请人:青岛东海药业有限公司;北京东方百信生物技术有限公司;北京天施康医药科技发展有限公司