由母体妊娠高血压导致胎儿/新生儿海马中损伤的预防的制作方法

专利名称：：由母体妊娠高血压导致胎儿/新生儿海马中损伤的预防的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于预防或改善由于母体妊娠高血压(GH)而导致哺乳动物胎儿或新生儿中神经损伤的方法。所述方法包括对患有GH的怀孕哺乳动物口服给药萌发活化破壁灵芝孢子("GLS")。所述神经元损伤包括海马细胞增殖和神经元数量的减少。本发明进一步涉及一种用于预防或改善由于母体GH而导致哺乳动物胚胎中海马缺氧诱导因子(HIF-la)和血管内皮生长因子(VEGF)增加表达的方法。
背景技术：
：妊娠高血压(GH)是指先前血压正常的妇女在怀孕二十周之后显现并在分娩后恢复正常的高血压。一种较严重的状况，被称为先兆子痫，是指在尿中伴随蛋白的GH。先兆子痫可发展为子痫，导致母体的发作。这些怀孕相关的高血压障碍可对孕妇及胎儿的各种器官引起损伤。母体并发症可包括肺水肿、血栓性并发症、肾衰竭以及死亡。在美国，妊娠高血压障碍占母体死亡率的近百分之十五。长期的后遗症也可产生。虽然患有慢性高血压的妇女存在源自顽固性高血压的显然性长期风险，但是，患有先兆子痫的妇女，尽管产后障碍解除，与不患有先兆子痫的孕妇相比在以后的生命中仍具有增加心血管疾病的风险。由于GH而致的胎儿并发症包括生长受限、早产和死产。GH也可引起子宫内胎儿器官发育迟緩、产后智力下降以及许多神经心理障碍。也有证据表明，高血压妊娠中子宫内环境，以涉及胎儿没能训练完全生长潜能的机理，给予在成年期增加心血管事件的风险。灵芝属于真菌类的多孔菌科。灵芝被广泛地用于传统中药，作为多种.医学病况如肝炎、AIDS、癌症以及自身免疫疾病的辅助治疗。GLS是灵芝的精华，并且含有活性成分，诸如多糖类、甾醇类、油酸、亚油酸、三萜类、神经酰胺类以及某些有机离子，它们都拥有强的生物活性。GLS也已被用于治疗神经学上的障碍。但是，目前尚未有关于GLS对GH相关胎儿损伤影响的报道。发明概述本发明提供了一种用于预防或改善由于母体妊娠高血压(GH)而导致哺乳动物胎儿或新生儿中神经损伤的方法。所述方法包括对患有GH的怀孕雌性给药有效量的萌发活化破壁灵芝(G朋o&rma/腦V/Mm)孢子(GLS)。以如下方法制备GLS:(l)将灵芝孢子浸入水、盐水、营养液或其组合的溶液中，使孢子萌发；(2)放置经萌发处理的灵芝孢子于相对湿度65-98%和温度18-48°C的培养箱中，以使萌发的灵芝孢子被活化；和(3)破坏萌发活化灵芝孢子的孢壁，以产生破壁GLS。所述的怀孕雌性患有妊娠高血压。所述的怀孕雌性优选是人类。可选择地，所述怀孕雌性是啮齿动物。所述GH优选为先兆子痫。在动物模型中，所述先兆子痫可能是由N-w-硝基-L-精氨酸曱酯诱导的。所述被诱导的先兆子痫表明与人类中相似的先兆子痫症习犬。一种形式的所述神经损伤是海马细胞增殖的减少。另一种形式的所述神经损伤是神经元数量的减少。所述神经损伤发生于大脑的海马区内。GLS优选被口服给药。有效量的GLS优选为0.01至20g/kg体重/日之间，并且更优选0.1至20g/kg体重/日之间。本发明进一步提供了一种用于预防或改善由母体GH而导致哺乳动物胚胎中海马缺氧诱导因子(HIF-la)和血管内皮生长因子(VEGF)增加.表达的方法。所述的方法包括对患有GH的怀孕雌性给药有效量的萌发活化破壁灵芝孢子(GLS)。附图简要说明图1是复合图，其表示的是以50x放大(在每板右上角的插入物为200x)、自实验怀孕大鼠生育的30-龄(P-30)大鼠中海马颗粒下区(SGZ)的BrdU阳性细胞核(个)的免疫组织化学染色。板1A:正常对照组；板1B:L-NAME+蒸馏水组；板1C:L-NAME+精氨酸组；板1D:L-NAME+GLS组。图2是复合图，其表示的是应用vWF免疫组织化学染色、100x放大、21-天龄(E21)胚胎中海马的微血管(卞)。板2A:正常对照组；板2B:L-NAME+蒸馏水组；板2C:L-NAME+精氨酸组；板2D:L-NAME+GLS组。图3是复合图，表示的是P30大鼠中海马CA1区的毛细血管的超微结构(卞表示外周血管结构而l表示血管的基底膜)。EC是血管内皮细胞；内腔表示血管中内腔。透射电子显微镜12000x。板3A:正常对照组；板3B:L-NAME+蒸馏水组；板3C:L-NAME+灵芝孢子组。毛细血管基底膜变厚(板3B,|),外周结构出现空泡(板3B,^)而且在L-NAME+蒸馏水组中出现的内皮细胞也是空泡的(板3B，个)。图4是复合图，表示的是P30大鼠中海马CA1、CA2和DG区的细胞层和神经元体。中性红染色，200x。板1A:正常对照组；板IB:L-NAME+蒸馏水组；板1C:L-NAME+精氨酸组；板ID:L-NAME+GLS组；a:CA1区；b:CA3区；c:DG区。DG:齿状脑回。CA1-CA3:阿门氏角(Cwm/v4ww7w^)区域。尽管涉及描述海马和相邻皮质的术语缺乏一致性，但是术语"海马结构"通常应用于齿状脑回，阿门氏角区域CA1-CA3(以及CA4，常常称为门并被认为是齿状脑回的部分)，和下托。CA1、CA2和CA3区域组成了海马本体。图5A是WesternBlot图，表示的是在E21和P30海马组织中HIF-la和VEGF的表达。N-正常对照组；M隱L画NAME+蒸馏水组；A-L-NAME+精氨酸组；G-L-NAME+GLS。图5B是复合图，表示的是在E21和P30海马组织中HIF-la和VEGF表达的RT-PCR结果。N-正常对照组；M-L-NAME+蒸馏水组；A-L-NAME+精氨酸组；G-L-NAME+GLS。发明的详细描述本发明致力于研究由于母体妊娠高血压(GH)而导致的神经损伤和在哺乳动物胎儿和/或新生儿海马中缺氧诱导因子(HIP-la)与血管内皮生长因子(VEGF)的增加表达，以及萌发活化破壁灵芝孢子粉(GLS)对于这种损伤的预防或改善作用。为了便利于母体GH而导致哺乳动物胎儿/新生儿中神经损伤的研究，根据YallampalliC.等，AmJ.ObstetGynecol.，169(5):1316-1320(1993)和HelmbrechtGD等，Am.J.Obstet.Gynecol"175(4):800-805(1996)应用先兆子痫的动物模型。所述的动物模型包括了应用一氧化氮合成酶(NOS)非选择性抑制剂，N-o硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)，以在怀孕大鼠中诱导先兆子痫样综合症一高血压、蛋白尿、子宫内生长受限以及肾小球毛细管内皮损害。这种模型在产科领域是公认的，以在怀孕的人类中产生类似于先兆子痫的那些症状。应用L-NAME以诱导先兆子痫样综合症的理论是基于这样的观察结果在患有GH的孕妇中，血液中一氧化氮(NO)的水平显著性低于正常孕妇中的水平(WangY，等，AmJObstetGynecol.,190(3):817-824(2004))。NO是由内皮细胞产生的并且涉及到血管张力、血小板聚集、神经传递以及免疫活化的调节。NO，原来认作EDRF(内皮素衍生的松弛因子)，然而，是由含核黄素的酶，一氧化氮合成酶(NOS),对L-精氨酸的胍基氮进行氧化脱氨而合成的。换言之，L-精氨酸是NOS的底物以产生NO。因此，用L-精氨酸类似物一L-NAME代替L-精氨酸阻滞了NO的合成，并且依次较少了怀孕啮齿动物中的NO产生，这模拟了怀孕人类中的NO较少。如下文中下列的实验设计和结果中所示的，本发明的发明人发现，母体GH引起胎儿和新生儿中大脑海马区的细胞增殖以及神经元数量的减少。也发现在哺乳动物胚胎中海马缺氧诱导性因子(HIP-la)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的增加。海马位于大脑的颞叶中间叶(medialtemporallobe)。它形成边缘系统的一部分并且参与记忆和空间导航。名称"海马"源自它在大脑冠状部分中弯曲的外形，类似海马(希腊语/2^;ocgw;ws)。在阿尔茨海默病中，海马成为遭受损伤的、大脑首要区域之一。海马中的损伤包括，但不限于，记忆问题和定向障碍。因此，在胎儿和新生儿大脑海马上的损伤可导致胎儿和新生儿记忆丧失以及长期学习能力的损伤。在所述的本发明优选的实施方式中，为了清晰而采用了特定的术语。但是本发明并非限于所选的特定术语。应当理解的是，每一个特定元素都包括以相似方式来实现相似目的而实施的全部技术等同。本发明的一方面涉及一种用于预防或改善由于母体GH而导致胎儿/新生儿神经损伤的方法。所述方法包括对患有GH的怀孕雌性给药有效量GLS的步骤。所述怀孕雌性可以是任意的哺乳动物，包括但不限于，人类，宠物如狗和猫，饲养动物如绵羊、山羊、牛和猪，以及实验室动物如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴子和狒狒。GLS为微溶于水的棕色粉末。生物活性的GLS可通过包括如下步骤的工艺而生产/.劳发'谬,仔细挑选成熟且完整的灵芝孢子以经受浸泡工艺来诱导萌发。将孢子保持于清澈或蒸馏水、生物盐水溶液、或者能使灵芝孢子迅速萌发的其它营养溶液。营养溶液的实例包括椰汁或1-5%麦芽提取物溶液、0.5-25%的灵芝孢子果或灵芝孢丝的提取物、0.1-5%含生物素的培养溶液、0.1-3%含有磷酸二氲钾和硫酸镁的培养溶液。溶液的选择将取决于所需的浸泡时间、待处理的孢子数量以及其它诸如材料可获得性等因素。可使用一种以上的上述萌发溶液，添加的量是灵芝孢子重量的0.1-5倍。浸泡的时间可根据水温而确定，并且通常30分钟至8小时完成浸泡，水温为20-43。C。优选地，浸泡时间为2-4小时，且水温为25-35。C。//.;gy么潜^;将灵芝孢子从浸泡溶液中取出，通过使其滴流而消除过量的溶液。然后将该孢子置于恒定温度和湿度的、通风良好的培养箱，以便于完成孢子培养活化。培养的相对湿度通常设为65-98%,培养温度设为18-48。C，并且活化时间持续从30分钟至24小时。优选地，湿度为85-97%并且温度为25-35。C。在活化过程中，灵芝孢子的细胞壁被明显地软化，这样更易于渗透孢子的细胞壁。灵芝孢子的活化一般达到95%以上的比率。///^子^變付义^^.'经萌发/活化工序之后，用酶解处理孢子。本工序是在低温下实现的，并且在此条件下酶的活性得以维持，应用工业上常用的壳多糖酶、纤维素酶或其它酶。当孢子外壁丧失弹性并且变脆时，本工序完成。可替代地，实现物理处理以渗透细胞壁，例如微粉化、碾压、研磨、超高压微流处理，以及可实现产业中常用的其它机械方法，渗透率99%以上。"f媒成'炎承；在低温下应用工业中常用的标准方法包括冻干或真空干燥等实现干燥。所获得产物具有水分含量低于4%。经干燥后，用水或醇，或者通过薄膜浓缩，提取生物活性物质。通过渗析可进一步纯化所提取的生物活性物质，以确保最终产品中无污染物。最终的产品可制成纯化的粉末、提取膏、注射或口服的溶液。关于生产GLS的更详细描述可见于美国专利号6,316,002,在此通过引用全文并入作为参考。GLS是从KindwayInternationalLtd./HolistolInternationalLtd.,瑞典和香港，商业上可以获得的。有效量的GLS是指在胎儿/新生儿中用于预防或改善GH相关神经损伤的有用剂量。GLS的毒性和治疗功效可通过在细胞培养或实验动物模型中标准的药学方法来确定，例如确定LD5。(50%种群致死的剂量)和ED50(在50%种群中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率是治疗系数，并且它可表示为LD5Q/ED5()。从细胞培养检验以及动物实验获得的数据可用于配制一定范围的人用剂量。通常，适当的给药GLS剂量可为，例如，从O.Olg/kg体重/天至20g/kg体重/天的范围。在一种实施方案中，GLS的有效量为0.1至20g/kg体重/天之间。在另一种实施方式中，GLS的有效量为1至10g/kg体重/天之间。在另一种实施方式中，GLS的有效量为8g/kg体重/天。优选GLS为口服给药。所述的给药可以是一次用药，或者间隔的，如每日三次，每日两次，每日一次，隔日一次，和每周一次。给药GLS的用药方案可基于个体的状况和目标需要而调整。在推注用药后，也可应用连续输注。通过适宜的生物检验可检测任何特定剂量的作用。可将GLS与药学上可接受的载体一起制成药学组合物。这里所用的术语"药学上可接受的载体"是指包括了任意和所有的溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、緩沖剂、控释载体、稀释剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、M介质、包衣剂、抗菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等，与药学上给药可相容的。在本领域中，用于药学活性物质的这种介质和试剂是熟知的。除了与活性化合物不相容的任意常规介质或试剂之外，考虑都可用在组合物中。也可将补充试剂用于组合物中。本发明的药学组合物可配制成与其给药途径，例如口服或非胃肠给药，相容的制剂。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可被封闭在明胶胶嚢中或压缩成片剂。为了口服治疗给药，活性化合物可与固体载体结合并且以片剂、锭剂或胶嚢剂的形式而应用。口服组合物也可应用液体载体来制备。作为组合物的一部分，药学上相容的粘合剂，和/或辅助材料可包括。片剂、丸剂、胶嚢剂、锭剂等可含有任意下列的成份，或相似性质的化合物粘合剂如微晶纤维素、黄耆胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogd或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸^:或Stertes;助流剂如胶状二氧化珪；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸曱酯或橘子调味剂。适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水可溶时)或者用于临时配制无菌可注射溶液或分散剂的分散剂和无菌粉末。对于静脉给药，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓沖盐水(PBS)。在任何情况下，可注射组合物应当是无菌的并且应当是达到易于注射程度的流动性。在制造和储存条件下，它应当是稳定的并且必须抗微生物如细菌和真菌污染作用而保存。所述的载体可以是溶剂和分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等等)，以及它们的适宜混合物。例如，通过应用包衣剂如卵磷脂，在分散情况下通过维持所需粒径，以及通过应用表面活性剂，可保持适当的流动性。以各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯曱酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，可实现预防微生物的作用。在许多情况下，它可优选在组合物中包括等渗剂，诸如氯化钠、糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇等)。通过在组合物中包括延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可取得延长吸收的可注射组合物。通过将在适当的溶剂中所需量的GLS与必要时一种或上面列举的成份的组合相结合，然后过滤灭菌，可制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物结合至含有碱性分散介质以及所需的、来自上面所列举那些的其它成份的无菌载体，制备分散剂。在用于配制无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，它从先前无菌过滤溶液得到活性成份以及任意添加所要成份的粉末。将口服或非胃肠组合物制成易于给药和剂量一致性的剂量单元形式是有利的。如这里所用的剂量单元形式包括物理上离散单元，其作为单元剂量适于治疗的个体；每个单元含有预定量的、计算与所需药学载体一起产生想要治疗作用的活性化合物。本发明剂量单元形式的规定受治于且直接取决于活性化合物的独特性质以及要实现的特定治疗效果，以及用于个体治疗在复合这种活性化合物领域中的自身限制。药物组合物可包括在与用药说明在一起的容器、包装或分配器中。下面的实例是示例性的，并非限制本发明的范围。这里可以进行合理的变化，例如对于适当技术人员而发生的那些，没有脱离本发明的范围。另外，在描述本发明中，为了清楚应用了特定的术语。但是本发明并非想要限制于所选的特定术语。应当理解的是，每一个特定元素都包括以相似方式来实现相似目的而运行的全部技术等同。实^i殳计动參遂一秀參/#秀。在大鼠中，应用Yallampalli等[Yallampallietal.,AmJObstetGynecol"1993,169:1316画1320]的L-NAME(—类NOS抑制剂)方法产生妊娠高血压(GH)。40只成熟(11-12周龄)SD雌性大鼠，体重200-230g;10只成熟(13-15周龄)SD雄性大鼠，体重250-300g;以雌性雄性为1:2的比率，将大鼠在笼中成对，在第二天，观察(涂片技术)雌性大鼠阴道分泌物以及那些含有精子的被认为怀孕0天(E0)。将怀孕大鼠分成(1)正常对照组一每日腹腔注射生理盐水+每日胃喂詞蒸馏水，从怀孕14日至20日(E14-20);(2)L-NAME+蒸馏水组(腹腔注射L-NAME+胃喂饲蒸馏水)；(3)L-NAME+精氨酸组(腹腔注射L-NAME+胃喂饲L-精氨酸32mg/kg/天)和(4))L-NAME+GLS组(腹腔注射L-NAME+胃喂饲GLS8g/kg/天)。两次注射给予L-NAME,总用药量为60mg/kg/天。在每次注射两小时后，怀孕大鼠接受胃喂祠蒸馏水、L-精氨酉臾或GLS。GLS是由KindwayInternationalLtd./HolistolInternationalLtd.提供，许可号GANSPSP04040104。L-精氨酸购自Ameresco公司。组织材料的制备。在E21天，对一些怀孕大鼠进行麻醉，腹腔注射1%戊巴比妥(35mg/kg)。从子宫中取出胚胎。一些被置于冷冻机盘并且从胚胎大脑中取出海马组织，置于Eppendorf试管并于-80。C保存待检。将胚胎大脑的其余部分固定于4%多聚曱醛溶液。另一组怀孕大鼠进行正常生产，并喂饲幼鼠且伺养至怀孕30天(P30)。一些幼鼠接受先前的戊巴比妥麻醉并且将它们的海马组织置于冷冻机盘并保存待检。在P30组中，其余的大鼠接受如上的戊巴比妥麻醉，将它们的胸腔打开，穿过左心室插入主动脉插管。首先用生理盐水快速灌注一组幼鼠，然后是4%聚曱醛0.1mol/L磷酸盐緩冲液(PB)(pH7.4)。然后，将固定的脑冠进行连续地冷冻并且以15ium厚度切片。从海马槽开始切片，每个切片300(am,自每个大脑获取六个切片，从而收集六套切片。用预冷的生理盐水快速灌注另一组的动物，随后用含有2%戊二醛+2。/。多聚曱醛的0.1mol/LPB(pH7.4)。萃取大脑，固定并置于4。C过夜。在振荡式切片机中对大脑样品进行切片，厚度100pm，以1%锇酸固定，脱水，植入树脂并进行半薄切片。证实它是CA1区后，进行超薄切片，然后醋酸铀酰和柠檬酸铅双电子染色，透射电子显微镜进行观测和摄像。将自E21天大鼠胚胎分离到的海马组织置于培养皿并剪成碎片，加入0.01mol/L磷酸盐緩沖盐水(PBS)并反复研磨，过滤通过100目筛，将得到的单细胞悬浮液固定于75%酒精、4。C,待检。检验前，将萃取的细胞悬浮液离心，除去上清液，加入100jnLRNase(O.lmg/L),置于37。C、30分钟，在用生理盐水冲洗之后，加入碘化丙咬(PI)染色(0.05mg/L，0.03%TritonX-1000.5mL),置于4°C避光反应30分钟，然后#:测。在流式细胞术中，分析488nm激光应用CellFit软件收集的10,000细胞/样品细胞周期数据，并且为了统计学处理而进行单向ANOVA检验(one-wayANOVAtesting)。///.i瘦jg欢化爭籴逸用11202和正常山羊血清固定海马组织切片。滴加一抗培养溶液并置于4。C过夜。一抗的类型和浓度包括家兔抗体缺氧诱导性因子-la(HIF-la)(Boshide,1:200),大鼠抗体血管内皮生长因子(VEGF)(SantaCruz,1:200),大鼠抗体因子八种相关抗原(vWF[vonWillebrand's因子])(BeijingZhongshan,工作溶液)。滴力卩PBS沖洗之后，然后加入二抗并进行特定抗原结合能力(SABC)培养，用DAB进行现影，然后进行苏木精对染，脱水，澄清并密封。5Wt/赤记.从各个P30组的大鼠中随机选出五只动物，接受腹腔注射，而且应用胸腺嘧，定类似物，5-溴脱氧尿苷(BrdU)(Sigma)标记以定位增殖细胞。将BrdU溶于含有0.007NNaOH的生理盐水中，并且在使用前新配制。将50mg/kg注射至腹腔，并且在灌注前两小时，大鼠接受一次注射。参考Kuhn等的方法[Kuhnetal.，J.Neurosci,1996,16:2027-2033],进行BrdU免疫组织化学染色。简而言之，将组织切片用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次沖洗5分钟)；在3%11202中室温培养30分钟；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次冲洗5分钟)；用50。/。曱醛/2XSSC、65。C孵化箱培养2小时；用2XSSC沖洗三次(每次沖洗5分钟)；用2NHC1、37°C培养30min;用0.1mol/L硼酸盐(boricate)緩沖液(pH8.0)冲洗三次(每次冲洗5分钟)；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次冲洗5分钟)；用1:50正常山羊血清阻滞30分钟；用小鼠抗体BrdU单克隆抗体(Sigma,1:400)于4。C培养过夜；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次冲洗5分钟)；与1:200生物素标记的绵羊抗-小鼠IgG室温反应30分钟；用0.01mol/LPBS沖洗三次(每次冲洗5分钟)；用1:100SABC室温培养30分钟；用DAB显色；用苏木精对染，然后进行常规的固定和脱水。多,悉都量夢^^f.检测源自海马各个区域的各种细胞层厚度并获得神经元体计数。借助低倍显微镜，从CA1、CA3和DG区随机选择两个可见区域。借助高倍显微镜(200x)，测定细胞层厚度并计数有核的神经元体数目。细胞层厚度或体数目是两个可见区域的平均数。雄马,j&^密乂f;应用Weidner计数法以确定微血管标准[Weidneretal.，AmJPathol.1995,147:9-19],其应用细胞质的阳性vWF染色作为血管内皮细胞的指示。检验的区域为在锥体层和分子层上的微血管。借助光显微镜(200x),在五个可见区域内计数微血管数目。微血管密度为五个区域的平均数。漆^份^7/W4勿應^"炎.对于每一个动物，在源自齿状脑回粒细胞层的六个大脑切片中对BrdU阳性细胞数目进行计数。才艮据Kuhn等的方法[Kuhnetal.,JN函sci.1996，16:2027-2033],将颗粒下区(SGZ)定义为每个颗粒层内两个颗粒细胞宽度的区域。应用自六个大脑切片中每个的一面的海马SGZ以获得总的BrdU阳性细胞计数。/K逆#求-炎合躇链^^^对于每一组，收集分离海马组织的三个样品，并且根据Trizol试剂说明书萃取总组织RNA。5|ugRNA在下列条件下经受室温反应合成cDNA:70。C5分钟，42。C60分钟，94°C5分钟。HIF-la引物序列为上游引物5'GGCTGGGCAACTACGTCATC3'(SEQIDNO:l)下游引物5'CCATGCACCTTAACATCCCA3'(SEQIDNO:2);VEGF引物序列为上游引物5'AATTGAGACCCTGGTGGACATC3'(SEQIDNO:3);下游引物5'TCTTTCTTTGGTCTGCATTCAC3'(SEQIDNO:4);内标GAPDH引物序列为上游引物5'GTGCTGAGTATGTCGTGGAGT3'(SEQIDNO:5);下游引物5'GATGGCATGGACTGTGGTCA3'(SEQIDNO:6)。才艮据下列顺序进行PCR反应94。C预变性45秒，60°C复性1分钟；72。C延伸1.5分钟秒；当周期完成时，72。C延伸5分钟然后停止反应。然后用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。Pf，飾/从每组中收集三个样品的被分离海马组织用于均化。用10%SDS-PAGE分离20吗蛋白质并且电子方法地转移至PVDF膜。用无脂奶粉室温阻滞该膜2小时，然后用小鼠抗-VEGF单克隆抗体(SantaCruz1:200)或者家兔抗-HIF-la多克隆抗体(武汉Boshide,l:200)于4。C培养过夜。用磷酸盐緩沖盐水和吐温(PBST)沖洗该膜，并且用轭合山羊抗-小鼠IgG(SantaCruz，1:5000，用于小鼠抗-VEGF抗体)或者山羊抗-家兔IgG(SantaCmz,1:5000，用于家兔抗-HIF-la抗体)的辣根过氧化物酶室温培养2小时。将小鼠抗-GAPDH单克隆抗体(ShanghaiKangcheng,1:10000)标记的辣根过氧化物酶与轭合山羊抗-小鼠IgG或者山羊抗-家兔IgG.的辣才艮过氧化物酶一起滴加。然后以PBST冲洗该膜并且用ECL[增强化学发光]化学发光技术显影。W.^#浙借助SPSS10.0统计软件、应用单因素方差分析，对所有的实验数据进行了统计学处理，而且计算结果表示为平均值士标准偏差。^:M;勿應^:錄果表1为四组E21天的大鼠胚胎大脑海马细胞周期的比较。结果表明，应用L-NAME显著性降低DNA合成期(S期)海马细胞的百分数，并且增加G0/G1期细胞的百分数。然而，在L-NAME+GS组中S期细胞的数目是统计学上不同于L-NAME+DW组的，并且与正常对照组的没有统计学上的不同。尽管L-NAME+Arg组中动物与L-NAME+DW组相比也表现为S期细胞增加，但是这种增加不是统计学上显著的。然而，L-NAME+Arg组具有最大百分数的G1/G0期细胞，与正常对照组和L-NAME+灵芝孢子组的那些相比，其为统计学上显著的。结果表明，在E21天大鼠胚胎中应用GLS将S期海马细胞数目恢复至接近正常的水平。表1.E21天大鼠胚胎海马细胞在细胞周期各时期的百分数(x士sx，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>DW:蒸馏水；L-arg:L-精氨酸；GS:灵芝孢子单因素方差分析(单向ANOVA):S期arSd，aWj,drajP〈0.05;arag，dMg尸>0.05G1/G0期bFSe,erakPO,05;bF5h,bF5k,hF5Tc户>0.05G2/M期craf,crai，crai,fFSi,fFSl,iraii5>0.055^/"#尹记如图1所示，BrdU阳性细胞主要分布于P30幼鼠的海马齿状脑回中。表2表明，与正常对照组相比，L-NAME+DW组和L-NAME+Arg组具有较少的BrdU阳性细胞(也可参见图1A-1C)。与L-NAME+DW组相比较，L-NAME+GLS组具有增加数目的BrdU阳性细胞(图1D),这与正常对照组没有显著性不同。这种结果表明，GLS能够将BrdU阳性细胞计数恢复至正常水平。净马凝Af^^和超凝潜^^f必.表3中结果表明，在L-NAME+DW组中，E21天海马微血管密度明显地增加(图2B)。在应用GLS之后，微血管密度(图2D,表4)被降低至正常对照组的水平(图2A)。尽管微血管密度随着精氨酸的给予而降低(图2C,表4),但是减少的数量没有应用GLS的大。在四组幼鼠中，P30天海马微血管密度没有统计学上不同。但是，与正常对照组相比，随着L-NAME的给予，在海马CAl区毛细管壁超孩i结构上的血管内皮细胞中出现空泡(图3A)(图3B),所述脉管的管周结构是云状的且不清楚，而且还有空泡，并且所述脉管的基底膜更厚。然而，在应用GLS之后，CA1区血管内皮细胞和血管壁结构更加完整(图3C)。表3.在P30大鼠中海马齿状脑回的BrdU阳性细胞计数(x土sd).<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>DW:蒸馏水；L-arg:L-精氨酸；GS:灵芝孢子单因素方差分析(单向ANOVA):E21:aFSt,cragP<0.01;aFSe，cFSe，eFSg_P<0.05;aragP>0.05P30:b5f，brai，dKST，drai,歸P>ftft5漆4勿應^岸,^都定和#经^傳#炎/.在中性红染色之后，观察L-NAME+DW组(图4，板Ba，Bb，和Be)和L-NAME+L-arg组(图4,板Ca,Cb和Cc)P30大鼠在海马CAl区，CA3区和DG细胞层厚度，并与正常对照组对比(图4，板Aa,Ab,和Ac)。神经元体计数明显地减少(表5)。在应用GLS之后，CA1区、CA3区和DG细胞层厚度和神经元体计数都达到恢复性增加(图4，板Da,Db,和Dc，表5)。结果表明，在应用GLS之后，在海马神经元体计数方面实现恢复性增加是可能的，随着给予精氨酸未观察到这种作用。表5.P30大鼠中海马细胞层厚度(x±sd,pm)和神经元体计数(x±sd,num).组别CAl(nm)CA1(誦)CA3(iara)CA3(n—DG(,)正常对照130.01±8.03a41.20±1.35b104.42士7.2ie38.00±3.01d84.06±1.37eL-NAME+DW100.78±3.65s27.60±1.36h79.30i6.69126.60±1.36*59.4l±5.31kL-NAME+L-arg115.23±9.49m31.80±1.15n90.64±6.18°23.00±0.83p64.87±4.42qL-NAME+GS125.60±7.30s38.00±1.58'93.70±9.78u35.20±1.28v75.12±3.81w单因素方差分析(单向ANOVA):CAl(nm):arag，gFSs户O.05;aram，aFSs，gMni,mFSsP>0.05CA1(num):bF5h，bKSn,b(^h，nrat,hKSnP<0.05;bF汰nFSt尸>0.05CA3(nm):cFSi尸<0.05;cFSo,cFSu,iFSo，iKSu,oFSu,尸>0.05CA3(num):dFSj,dKSp，pFSv/><0.01;dr5V;jKSpP>0.05DG(nm):e離，eSw，e^5Sv，qF5\v尸<0.05;kraqP>0.05举马*FEGFW4逸在E21和P30海马组织中，对HIF-la和VEGFmRNA以及蛋白质表达水平进行RT-PCR和Western-Blot检验。才t险结果示于图5A和5B。对于各组E21海马内HIF-lamRNA及其蛋白质表达，在L-NAME+蒸馏水组和L-NAME+精氨酸组中HIF-lamRNA及其蛋白质表达水平应当高于正常对照组中(图5A和5B)。在应用GLS之后，HIF-lamRNA及其蛋白质表达未表现明显的增加。在正常对照组P30海马中，未检测到HIF-lamRNA及其蛋白质表达。L-NAME+蒸馏水组和L-NAME+精氨酸组都具有可检测到的HIF-lamRNA以及蛋白质表达水平。在应用GLS之后，未见HIF-lamRNA及其蛋白质表达。同时，在各组中E21和P30海马组织HIF-la蛋白质表达的免疫组织化学冲企验与Western-Blot检验的结果是一致的。对于正常对照组，可以检测到E21海马中的VEGFmRNA及其蛋白质表达；然而，在正常对照组的P30海马中未能检测到VEGFmRNA及其蛋白质表达(图5A和5B)。在P30海马中，在L-NAME+蒸馏水组中仍可以检测到VEGFmRNA及其蛋白质表达。应用灵芝孢子之后，在E21海马中，可以检测到VEGFmRNA及其蛋白质表达，然而在P30海马中未4全测到VEGFmRNA及其蛋白质表达。这种情况类似于正常对照组中VEGFmRNA及其蛋白质表达。在各组海马组织中E21和P30的免疫组织化学结果与上述Western-Blot4佥-睑的那些结果相类似。離^论本研究证明了，在怀孕雌性中，GH特别是先兆子痫导致胚胎中海马缺氧诱导因子(HIF-la)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加，并且这种表达在新生儿中延续。GLS治疗将海马HIF-la和VEGF表达恢复至正常水平，并且预防在海马细胞增殖和神经元数目方面的减少以及在在海马组织中异常的发展。在本说明书中示例及讨论的实施方案只是想要教导本领域技术人员本发明人所知的最佳方式，以制造和使用本发明。不应当将本说明书认为是对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据上述的教导，对于本发明的上述实施方案可进行修改或改变，增加或省略技术特征元素，且未背离本发明。因此，应当理解为，在权利要求及其等同的保护范围内，可实现本发明，除非特别说明。权利要求1.萌发活化破壁灵芝孢子(GLS)用于制备预防或改善由于怀孕雌性的母体妊娠高血压而导致的哺乳动物胎儿或新生儿疾病的药物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述疾病选自哺乳动物胎儿或新生儿中神经损伤、哺乳动物胚胎中海马缺氧诱导因子(HIF-la)表达增加、哺乳动物胚胎中海马血管内皮生长因子(VEGF)表达增加。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述GLS的制备方法包括以下步骤将灵芝孢子浸泡在溶液中以引起孢子萌发，所述的溶液选自水、盐水和营养溶液组成的组；将所萌发处理的灵芝孢子置于培养箱，以65-98%的相对湿度和18-48°C的温度来引起已萌发灵芝孢子活化；和破坏所萌发活化灵芝孢子的孢壁以产生所述的GLS。4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的怀孕雌性是人类。5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的怀孕雌性是啮齿动物。6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的妊娠高血压是先兆子痫。7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的先兆子痫是由N-co-硝基-L-精氨酸曱酯引起的。8.根据权利要求2所述的用途，其中所述的神经损伤是指细胞增殖的减少。9.根据权利要求2所述的用途，其中所述的神经损伤是指神经元数量的减少。10.根据权利要求2所述的用途，其中所述神经损伤是在大脑的海马区。全文摘要本发明提供了一种用于预防或改善哺乳动物胎儿或新生儿中神经损伤的方法，所述的损伤是由母体妊娠高血压(GH)而引起的。该方法包括对患有GH的怀孕哺乳动物口服给药萌发活化破壁灵芝孢子(“GLS”)。所述的神经损伤包括海马细胞增殖和神经元数量的减少。本发明进一步提供了一种用于预防或改善由于母体GH而导致哺乳动物胚胎中海马缺氧诱导因子(HIF-1a)和血管内皮生长因子(VEGF)增加表达的方法。文档编号A61K36/16GK101204406SQ20071012968公开日2008年6月25日申请日期2007年8月14日优先权日2006年8月14日发明者张志强,曾园山申请人:伟善国际有限公司