专利名称：一种香豆素衍生物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种香豆素衍生物及其制备方法以及作为血管生成抑制剂在治疗肿瘤及血管性视网膜病变中的应用。
背景技术：
肿瘤的生长、转移、复发、预后与血管生成密切相关，以肿瘤的血管生成为靶点，可能使实体瘤的治疗效果得到较大提高。血管生成抑制作用对象是不同肿瘤组织中几乎相同的血管内皮细胞，这种肿瘤血管内皮细胞除分裂增殖速度较快之外与正常内皮细胞相比并无明显差别。正常内皮细胞寿命较长，基因型稳定。除了神经细胞以外，内皮细胞是体内寿命最长的细胞之一。存在于成年血管壁上的内皮细胞，同一时间内只有0.01％左右处于分裂状态，肿瘤血管内皮细胞增殖速度较正常组织中的内皮细胞增殖速度大约高50倍以上。因此使用血管抑制因子对肿瘤血管有相对特异性作用，而对正常组织内的血管不会造成明显影响。endostatin和angiostatin虽是目前已知的较强的内源性血管生成抑制剂，但生产这类高纯度安全制剂工艺需较高的技术门槛，以及这些活性蛋白在体内较短的半衰期等因素的影响，从而限制了这些活性蛋白的临床应用。因此在小分子化合物中寻求血管生成抑制剂已成为研究重点。
combretastatin A-4(CA4)为南非Combretum caffrum树干中提取分离的具有抗肿瘤活性的二苯乙烯类化合物(美国专利4996237，Feb，22，1988)。由于该化合物溶解性差，经磷酸化生产前药combretastatin A-4磷酸钠(CA4P)(美国专利5561122，Dec，22，1994)，其体内抗肿瘤活性大大提高，CA4P在体内迅速去磷酸化生成CA4，血浆半衰期为30min。CA4直接作用于内皮细胞，诱导增殖的内皮细胞凋亡，从而抑制血管生成。
CA4P不仅在实体瘤上的研究取得进展，在治疗各种眼科疾病状况下异常血管形成方面亦取得突破性进展，特别是在治疗糖尿病晚期患者因血管性视网膜病变引起视觉模糊和失明，有可能成为治疗血管增生性视网膜病变的新型药物。
combretastatin A-4蛇床子素 蛇床子素(osthol)是从中药蛇床子中提取一种香豆素类化合物。近年来有研究表明，蛇床子素能不同程度地抑制肺腺癌和肺鳞癌的生长，蛇床子水提液能较明显地抑制昆明种小鼠S180肉瘤的生长。
血管内皮细胞抑制作用研究表明，蛇床子素具有明显的EVC-304抑制作用，但与CA4相比作用较弱。在蛇床子素的结构基础上进行结构修饰，保持香豆素基本结构，引入二苯乙烯官能团得到一系列衍生物。香豆素衍生物EVC-304抑制作用是CA4的1.5～10倍。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有药用价值的香豆素衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种香豆素衍生物的制备方法。
本发明进一步的目的在于提供上述化合物或其药学上可接受的盐作为血管生成抑制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步的目的还在于提供上述化合物或其药学上可接受的盐作为血管生成抑制剂在制备治疗血管性视网膜病变药物中的应用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到 本发明香豆素衍生物用下述通式(I)表示，该类化合物是在蛇床子素的结构基础上进行修饰得到。
式I 其中，R1、R2、R3、R4或R5分别代表氢、氨基或者取代氨基、烷基或取代烷基或OM，其中M为氢、烷基或者取代烷基或磷酸基及其盐。
本发明可以通过下述方法制得
本发明还可以通过下述方法制得
其中，R1、R2、R3、R4或R5分别代表氢、氨基或者取代氨基、烷基或取代烷基或OM，其中M为氢、烷基或者取代烷基或磷酸基及其盐。
表1给出了本发明实施例的香豆素衍生物。
表1 制备化合物15～24所需反应原料可以通过下述方法制得。
香豆素衍生物血管内皮细胞抑制作用测定 细胞培养EVC-304细胞以1×107个/mL密度接种于含10％小牛血清、100U/mL青、链霉素RPMI-1640培养液中(pH7.4)，5％二氧化碳恒温培养箱37℃培养，每隔48h换液1次，待细胞长满后用0.25％胰蛋白酶消化，收集并传代。试验选用换液24h后对数生长期细胞。
MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)试验对数生长期EVC-304细胞，用0.25％胰蛋白酶消化3～5min，用培养基终止消化，调整细胞浓度5×104个/mL，按150μL/孔接种于96孔板，再加入150μL试药。试药最大浓度为200μg/mL，以50％变量梯度递减，分别为200.00μg/mL、100.00μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL和1.06μg/mL8个浓度。每试药浓度设10孔。培养24h加入5mg/mL无菌MTT每孔20μL。继续培养4h后去培养基，每孔各加DMSO(二甲亚砜)150μL，放入二氧化碳培养箱10min，96孔酶标仪，490nm波长测定吸收度。
表2香豆素衍生物和CA4对EVC-304细胞生长抑制MTT试验结果 本发明的有益效果 在蛇床子素的结构基础上进行结构修饰，保持香豆素基本结构，引入二苯乙烯官能团得到一系列衍生物，血管内皮细胞抑制作用试验表明，该衍生物具有明显的EVC-304细胞增殖抑制作用。与combretastatin A-4(CA4)相比，香豆素衍生物EVC-304抑制作用是CA4的1.5～10倍。
图1.24个香豆素衍生物和CA4对EVC-304细胞生长抑制率比较图
具体实施例方式 实施例1 制备7-甲氧基-8-(2-苯基)乙烯基香豆素(化合物1) 7-甲氧基香豆素-8-乙酸的制备
15℃以下，加入冰醋酸350ml，蛇床子素30g，搅拌下分数批加入三氧化铬40g，加毕，20～25℃继续搅拌反应4h，反应完毕，加入冰水1000ml，过滤，水洗涤得7-甲氧基香豆素-8-乙酸12.6g。
7-甲氧基-8-(2-氧代-2-苯基)乙基香豆素的制备
二氯甲烷300ml，7-甲氧基香豆素-8-乙酸20g，搅拌下加入氯化亚砜20ml，室温搅拌反应过夜，减压回收溶剂至干，加入二硫化碳100ml溶解备用。
二硫化碳500ml，苯100ml，冰盐浴冷却-5℃以下，搅拌下加入无水三氯化铝50g，保持温度-5℃以下，搅拌下滴加上述备用液，加毕，室温反应过夜，将反应液下加入到1000ml冰水混合物中，分出有机层，回收溶剂得到7-甲氧基-8-(2-氧代-2-苯基)乙基香豆素28.9g。
7-甲氧基-8-(2-羟基-2-苯基)乙基香豆素的制备
无水乙醇450ml，7-甲氧基-8-(2-氧代-2-苯基)乙基香豆素30g，冰浴冷却下，分数批加入硼氢化钠1.8g，加毕，继续0℃左右反应4h，反应完毕，搅拌下将反应液加入到5％氯化铵水溶液1000ml中，用二氯甲烷提取，得到7-甲氧基-8-(2-羟基-2-苯基)乙基香豆素30g。
7-甲氧基-8-(2-苯基)乙烯基香豆素(化合物1)的制备
7-甲氧基-8-(2-羟基-2-苯基)乙基香豆素2g，冰醋酸150ml，无水乙酸钠5g，90～100℃搅拌反应2h，反应完毕，减压回收溶剂至干，用冰水洗涤得到7-甲氧基-8-(2-苯基)乙烯基香豆素(化合物1)1.6g。质谱M/Z[M+1]+，279。
实施例2 制备7-甲氧基-8-[2-(4-甲基苯基)]乙烯基香豆素(化合物2) 按照实施例1方法，以甲苯代替苯制备化合物2。质谱M/Z[M+1]+，293。
实施例3 制备7-甲氧基-8-[2-(3，4-二甲基苯基)]乙烯基香豆素(化合物4) 按照实施例1方法，以邻二甲苯代替苯制备化合物4。质谱M/Z[M+1]+，307。
实施例4 制备7-甲氧基-8-[2-[(苯并[1，2，a]环戊烷)-4-基]乙烯基香豆素(化合物5) 按照实施例1方法，以苯并[1，2，a]环戊烷代替苯制备化合物5。质谱M/Z[M+1]+，319。
实施例5 制备7-甲氧基-8-[2-[(苯并[1，2，a]环己烷)-4-基]乙烯基香豆素(化合物6) 按照实施例1方法，以苯并[1，2，a]环己烷代替苯制备化合物6。质谱M/Z[M+1]+，333。
实施例6 制备7-甲氧基-8-[2-(4-甲氧基苯基)]乙烯基香豆素(化合物7) 按照实施例1方法，以苯甲醚代替苯制备化合物7。质谱M/Z[M+1]+，309。
实施例7 制备7-甲氧基-8-[2-(4-羟基苯基)]乙烯基香豆素(化合物8) 按照实施例1方法，以苯酚代替苯制备化合物8。质谱M/Z[M+1]+，295。
实施例8 制备7-甲氧基-8-[2-(3，4-二甲氧基苯基)]乙烯基香豆素(化合物9) 按照实施例1方法，以邻二甲氧苯代替苯制备化合物9。质谱M/Z[M+1]+，339。
实施例9 制备7-甲氧基-8-[2-(3，4-二羟基苯基)]乙烯基香豆素(化合物10) 按照实施例1方法，以邻苯二酚代替苯制备化合物10。质谱M/Z[M+1]+，311。
实施例10 制备7-甲氧基-8-[2-(2，3，4-三甲氧基苯基)]乙烯基香豆素(化合物11) 按照实施例1方法，以1，2，3-三甲氧基苯代替苯制备化合物11。质谱M/Z[M+1]+，369。
实施例11 制备7-甲氧基-8-[2-(2，3，4-三羟基苯基)]乙烯基香豆素(化合物12) 按照实施例1方法，以1，2，3-苯三酚代替苯制备化合物12。质谱M/Z[M+1]+，328。
实施例12 制备7-甲氧基-8-[2-[(苯并[1，2，d](1，3-二氧杂)环戊烷)-4-基]乙烯基香豆素(化合物13) 按照实施例1方法，以苯并[1，2，d](1，3-二氧杂)环戊烷代替苯制备化合物13。
质谱M/Z[M+1]+，323。
实施例13 制备7-甲氧基-8-[2-[(苯并[1，2，b](1，4-二氧杂)环己烷)-4-基]乙烯基香豆素(化合物14) 按照实施例1方法，以苯并[1，2，b](1，4-二氧杂)环己烷代替苯制备化合物14。
质谱M/Z[M+1]+，351。
实施例14 制备7-甲氧基-8-[2-(4-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物15) 按照实施例1方法，以乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(4-乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。
7-甲氧基-8-[2-(4-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物15)的制备 7-甲氧基-8-[2-(4-乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素5g，乙醇100ml，浓盐酸50ml，55℃搅拌反应4h，反应完毕，减压回收溶剂至于，用冰水洗涤得到7-甲氧基-8-[2-(4-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物15)4.1g。质谱M/Z[M+1]+，294。
实施例15 制备7-甲氧基-8-[2-(4-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物16) 按照实施例1方法，以N-甲基乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(4-(N-甲基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(4-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物16)。质谱M/Z[M+1]+，308。
实施例16 制备7-甲氧基-8-[2-(4-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物17) 按照实施例1方法，以N-乙基乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(4-(N-乙基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(4-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物17)。质谱M/Z[M+1]+，322。
实施例17 制备7-甲氧基-8-[2-(4-(N，N，二甲基氨基)苯基)]乙烯基香豆素(化合物18) 按照实施例1方法，以N，N-二甲基苯胺代替苯制备化合物18。质谱M/Z[M+1]+，322。
实施例18 制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物19) 按照实施例1方法，以4-甲氧基乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2甲氧基-5-乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2甲氧基-5-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物19)。质谱M/Z[M+1]+，324。
实施例19 制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物20) 按照实施例1方法，以4-甲氧基-(N-甲基)乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-甲基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物20)。质谱M/Z[M+1]+，338。
实施例20 制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物21) 按照实施例1方法，以4-甲氧基-(N-乙基)乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-乙基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲氧基-5-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物21)。质谱M/Z[M+1]+，322。
实施例21 制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物22) 按照实施例1方法，以4-羟基乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物22)。质谱M/Z[M+1]+，310。
实施例22 制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物23) 按照实施例1方法，以4-羟基-(N-甲基)乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-甲基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-甲基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物23)。质谱M/Z[M+1]+，324。
实施例23 制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物24) 按照实施例1方法，以4-羟基-(N-乙基)乙酰苯胺代替苯制备化合物7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-乙基)乙酰氨基苯基)]乙烯基香豆素。再按照实施例14方法水解制备7-甲氧基-8-[2-(2-羟基-5-(N-乙基)氨基苯基)]乙烯基香豆素(化合物24)。质谱M/Z[M+1]+，338。
实施例24 制备7-甲氧基-8-[2-(2-甲基苯基)]乙烯基香豆素(化合物3) 7-甲氧基香豆素-8-乙醛的制备
二氯甲烷600ml，蛇床子素15g，搅拌下加入NaIO4 20g，室温搅拌2h后，搅拌下加入饱和碳酸氢钠水溶液100ml，继续室温剧烈搅拌反应18h，分出有机层，回收溶剂至干得到7-甲氧基香豆素-8-乙醛8.1g。
7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(2-甲基苯基)]乙基香豆素的制备
冰水冷却，加入无水THF 200mL，镁屑3g，2-溴甲苯20g，剧烈搅拌下，催化量碘，反应开始后，慢慢加热回流反应至镁屑几乎消失为止，约需2h，冷至室温，慢速滴加7-甲氧基香豆素-8-乙醛25g溶于无水THF 100mL的溶液，加毕，继续搅拌回流反应3h。蒸除THF，冰水冷却下，向残余物中加入水1000mL，以3％硫酸调pH6～7，二氯甲烷200mL提取3次。合并有机层，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，得7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(2-甲基苯基)]乙基香豆素23g。
7-甲氧基-8-[2-(2-甲基苯基)]乙烯基香豆素的制备
7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(2-甲基苯基)]乙基香豆素2g，冰醋酸150ml，无水乙酸钠5g，90～100℃搅拌反应2h，反应完毕，减压回收溶剂至干，用冰水洗涤得到7-甲氧基-8-[2-(2-甲基苯基)]乙烯基香豆素(化合物3)1.5g。质谱M/Z[M+1]+，293。
实施例25 制备7-甲氧基-8-[2-(4-甲氧基苯基)]乙烯基香豆素(化合物7) 按照实施例24方法，以4-溴苯甲醚代替2-溴甲苯制备化合物7。质谱M/Z[M+1]+，309。
实施例26 制备7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)]乙基香豆素磷酸(化合物25)
无水吡啶100ml，加入双-(O-三氯乙基)磷酰氯12g，搅拌下加入7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)]乙基香豆素8g，60～70℃反应4h，真空浓缩至干，用二氯甲烷200ml溶解，有机层分别用浠盐酸，水和浠碳酸氢钠溶液洗涤，回收溶剂至干得油状物，用吡啶100ml溶解，搅拌下慢慢滴加乙酸10ml，滴加完毕，加入锌粉3g，50～60℃搅拌反应20h，冷却室温，用硅藻土100g过滤，滤饼用甲醇洗涤，回收溶剂至干，加二氯甲烷200ml溶解，分别用水、浠盐酸和浠碳酸氢钠洗涤，回收溶剂得到化合物25。质谱M/Z[M+1]+，375；[M+Na]+，397。
实施例27 制备7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)]乙基香豆素磷酸钠(化合物26)
7-甲氧基-8-[2-羟基-2-(4-羟基苯基)]乙基香豆素磷酸(化合物25)5g，甲醇50ml，蒸馏水50ml，搅拌下滴加2N氢氧化钠调节溶液pH7～7.5，溶液真空浓缩至干，加70％甲醇水溶液20ml，冷却结晶，过滤得到化合物26。质谱M/Z[M+1]+，375；[M+Na]+，397。
权利要求
1.本发明公开了下述通式(I)化合物或其药学上可接受的盐
式I
其中，R1、R2、R3、R4或R5分别代表氢、氨基或者取代氨基、烷基或取代烷基或OM，其中M为氢、烷基或者取代烷基或磷酸基及其盐。
2.权利要求1所述的化合物制备方法，该方法通过下述方法制得
其中，R1、R2、R3、R4或R5分别代表氢、氨基或者取代氨基、烷基或取代烷基或OM，其中M为氢、烷基或者取代烷基或磷酸基及其盐。
3.权利要求1所述的化合物制备方法，该方法还通过下述方法制得
其中，R1、R2、R3、R4或R5分别代表氢、氨基或者取代氨基、烷基或取代烷基或OM，其中M为氢、烷基或者取代烷基或磷酸基及其盐。
4.权利要求1、2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1、2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗血管性视网膜病变药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的一种香豆素衍生物及其制备方法以及作为血管生成抑制剂在治疗肿瘤及血管性视网膜病变中的应用。该类化合物是在蛇床子素的结构基础上进行修饰得到，血管内皮细胞抑制作用试验表明，式(I)具有明显的EVC-304细胞增殖抑制作用。与combretastatin A-4(CA4)相比，式(I)的EVC-304抑制作用较强，是CA4的1.5～10倍。
文档编号A61P35/00GK101121706SQ20071013180
公开日2008年2月13日 申请日期2007年9月18日 优先权日2007年9月18日
发明者苏国强 申请人:南京中瑞药业有限公司