专利名称：多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓缩工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种多联灭活疫苗病毒 (抗原)液浓縮工艺。
背景技术：
灭活疫苗是目前预防控制动物病毒性传染病(如禽流感等)的必 要手段。每羽份灭活疫苗中抗原量的多少决定疫苗免疫效果的好或
差,提高灭活疫苗中抗原的量是生产优质灭活疫苗的关键；另一方面， 在生产多联灭活病毒疫苗时，需要加入多种抗原(3或4种)，与油 项按固定比例混合乳化制成疫苗，在相同的免疫剂量下，每羽份疫苗 中每种抗原的含量要减少，这样会降低疫苗的免疫效果，因此，在保 证不减少抗原量的条件下，必须降低每种抗原的体积，才能使多联疫 苗达到单联疫苗的免疫效果。
抗原浓縮是解决该问题的唯一途径。抗原浓縮有许多方法，如化 学法(PEG沉淀法)、超速离心法和超滤法等。其中，超滤法是近年 出现的一种浓縮技术。目前，超滤法用于病毒的浓縮还不多见，尤其 是适用工厂化的工艺技术还不成熟，绝大多数仅限于实验研究阶段。 限制工厂化应用的主要原因是1.病毒颗粒小，从几百到几十个纳 米之间，最小的只有20纳米，需要根据病毒颗粒的大小选择合适孔 径的超滤膜，才能达到能完全截留病毒的目的；2.疫苗抗原液成分 复杂，含有大量的不溶性和可溶性杂蛋白，比较粘稠，容易污染超滤 膜，降低浓縮效率，减少设备的使用寿命。用细胞培养获得的抗原液
含有大量的细胞碎片，通过离心，相对比较容易去除；但用鸡胚繁殖 病毒所获得的抗原液含有大量的杂蛋白和颗粒，抗原液中可溶性蛋白 多，相对粘稠，更容易堵塞超滤膜，造成膜污染；3.疫苗抗原液容 易受到杂菌污染， 一方面是在病毒液收获的过程中容易受到大肠杆菌 的污染；另一方面，鸡胚可能带有一些隐性感染的细菌，如沙门氏菌。 如果不除去其中污染的细菌和杂蛋白，在病毒液被浓縮的过程中，细 菌和杂蛋白也被浓縮。用这样抗原液生产出来的疫苗免疫动物后，会 给动物带来严重的负反应，甚至引起免疫动物的死亡。正是由于以上 3个主要的原因，目前的兽用多联灭活疫苗的抗原液的浓縮工艺还不 成熟，尤其不能用于工厂化，多数停留在实验室阶段，而且主要是停 留在浓縮效果方面的研究，很少涉及到浓縮前的样品处理和浓縮后的 设备清洗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有抗原浓縮工艺所存在的缺陷，提供一 种浓縮效率高，浓缩后病毒液品质好，适用于工业化生产的多联灭活 疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺。
本发明的技术方案如下 一种多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮 工艺，包括如下工艺过程
(1) 采用分离因数在8000g 10000g的液一固连续离心机对液 体进行离心分离，液体在离心机内驻留的时间大于15秒，出料口接 密闭的物料罐I，经过离心的液体流进物料罐I内；
(2) 采用微滤装置去除病毒液中的细菌，微滤装置的出口通过 管道与物料罐II连接；
(3) 将过滤后残留的溶液用高速离心机进行离心分离，将分离
后的上清液加入到物料罐II中；
(4) 使用超滤浓縮装置对病毒液进行浓縮，超滤浓縮装置中选 用中空纤维或板框式膜包做为超滤柱，将多个相同的中空纤维柱或膜 包并联在一起，增加浓縮的效率，并对物料罐II进行冷却，温度为 4°C 10°C;
(5) 病毒浓縮结束后，对整个系统进行清洗。 如上所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其中，在步
骤(5)中清洗液一固连续离心机时，首先清除转鼓或碟片中的残渣， 然后开动机器，用大量的自来水清洗，然后通入蒸汽消毒，封闭连续 离心。
如上所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其中，在步 骤(5)中清洗高速离心机时，先用清水清洗离心管，然后用双蒸水 冲洗，之后倒置干燥。
如上所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其中，在步 骤(5)中清洗过滤和浓縮装置时，启动装置，把进料和出料口的阀 门全部打开，关闭滤液阀门，先冲洗膜表面残留的蛋白，然后打开滤 液阀门，关闭部分出料阀门，保证膜的内外压力差为0.25 0.30Pa， 正向冲洗；然后，用无菌水配置0.025%的胰蛋白液，通过真空泵将 胰酶液抽到装置中，关闭进、出料阀门，使胰酶浸泡整个浓縮柱，静 置一段时间后，用胰酶消化残留的蛋白；随后启动反向冲洗系统冲洗; 关闭反向冲洗系统，启动正向浓縮系统，用无菌水冲洗；最后向过滤 和浓縮装置通入蒸汽消毒，然后分别用质量浓度为0.1%和0.2%的氢 氧化钠溶液浸泡浓縮装置和过滤装置。如上所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其中，步骤
(2)中微滤装置的微滤柱膜的孔径为0.22微米。
如上所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其中，步骤 (4)中浓縮后使病毒液的体积降为原来的.1/2 1/4。
本发明具有如下特点
1. 浓縮效率高，在样前处理阶段，采用连续离心；浓縮阶段采 用多个并联浓縮柱和大功率真空泵；整个体系，从样前处理到病毒浓 縮都采用密闭管道连接。
2. 浓縮后病毒液品质好，浓縮前对病毒液进行了除杂蛋白和细 菌处理；经过样前处理的病毒液不含有不溶性颗粒蛋白和细菌，使浓 縮后的病毒液品质好，同时浓縮装置中不含有细菌。
3. 装置使用寿命长，首次在系统清洗阶段使用胰酶消化残留蛋 白，改进了清洗方法，提高清洗的效率，延长装置使用寿命。
4. 发明工艺适用工厂化，本发明的整个系统都采用管道密闭连 接；生产工艺适合工厂化生产，能直接进行大规模的生产。
具体实施例方式
本发明所提供的工艺主要包括以下三个阶段-(一)样前处理阶段
样前处理是病毒液浓縮的第一个环节。样品前处理的好坏直接影 响病毒浓縮的效果、浓縮病毒液的品质和浓縮设备的使用寿命，所以 样前处理非常重要。在样前处理阶段，需要达到以下目的1)除去 病毒液中不溶性杂蛋白；2)去处病毒液中可能含有的细菌；3)能够
工厂化生产。目前我国对病毒浓縮样前处理工艺的研究还不多，而且
多数处于实验室阶段；在实际生产中，多数采用多层纱布过滤的方法， 效果不好；特别是在除菌环节，有的除菌方法不适合工厂化生产，有 的除菌方法截留病毒，丢失抗原， 一直没有很好地解决。
本发明采用不同方法组合，成功地解决了这些问题，特别是除菌 问题。
1. 液一固连续离心机法(立式管状离心机或碟片离心机)去除 病毒液中杂蛋白
采用分离因数在8000g 10000g的液一固连续离心机。控制进料 的速度，保证液体在离心机内驻留的时间大于15秒，出料口接一密 闭的不锈钢罐(物料罐1)。经过离心的液体源源不断地流进罐内。 如果使用立式管状离心机，根据病毒液含杂蛋白的量，需要定期停机， 取出转鼓，去除内部的滤饼，否则影响离心效果；
2. 微滤法去除病毒液中的细菌
采用微滤装置。微滤柱膜的孔径为0.22微米。开启微滤装置， 不断过滤病毒液，细菌被截留，病毒在滤液中。出口通过管道与物料 罐2连接(可选带有制冷夹层罐)。经过一段时间的过滤，病毒液的 体积不断縮小，达到微滤装置的死体积(即微滤装置固有体积，一般 为3 5升)时，停止过滤，用真空泵从进料口抽出病毒的浓縮液。此 时残留的病毒浓縮液含有大量的杂蛋白、细菌和病毒；
3. 高速离心法去除残留病毒浓縮液中的细菌和杂蛋白 将未过滤含菌的残留病毒浓縮液用高速离心机离心，8000gxl5
分钟，去处杂蛋白和细菌。将上清液加入到物料罐2中。至此，样前 处理结束。经过处理的病毒液为不含细菌和不溶性杂蛋白，而且此工 艺完全可以工厂化
(二) 病毒液浓縮阶段 本步骤是病毒浓縮的中间环节，目的是为了去除病毒液中的部分
水份，使病毒液的体积降为原来的1/2~1/4。此步骤中需要超滤浓縮 装置。尽管超滤技术已经很成熟，但将该技术用于病毒浓縮规模化生 产却很少。本发明根据病毒种类不同，选用一定孔径大小的中空纤维 或板框式膜包做为超滤柱(中空纤维造价低)。将几个相同的中空纤 维柱或膜包并联在一起，增加浓縮的效率。根据实际生产需求，可向 生产厂家订制。本发明采用大功率的真空泵，加快液体在浓縮系统中 的循环速度，达到0.25 0.35米/秒。这样一方面可以提高浓縮的效 率，另一方面可以减少膜污染，增加超滤柱的使用寿命。本发明采用 的病毒液罐(物料罐2)装有冷却装置，在浓縮期间保证病毒的抗原 性不会因为温度升高而被破坏。在浓縮期间会产生一定的热量，使病 毒液温度升高(有时可达40'C)，严重破坏病毒的抗原性，即免疫效 果，因此，必须使用冷却装置，降低病毒液的温度，保证不破坏病毒 的抗原性。病毒液在密闭浓縮系统内不断循环和浓縮，滤液通过滤液 排放口排出，弃掉。经过此步骤，无菌病毒液被浓縮，达到了浓縮的 目的。
(三) 浓縮装置的清洗阶段 本步骤是病毒浓縮的最后环节。病毒浓縮结束后，整个系统的清
洗非常重要。如果清洗不干净，其影响主要的体现在以下2方面1) 容易造成细菌的大量繁殖，会污染疫苗的半成品。病毒液含有大量的 不溶性和可溶性蛋白，营养非常丰富；如果混有细菌，极易造成细菌 的大量繁殖；2)残留的蛋白会固定浓縮柱的内表面，堵塞膜的过滤孔， 降低浓縮装置的使用寿命。因此，浓縮结束后，需要对所用过的设备，
特别是对离心机和浓縮设备需要进行全面地彻底地清洗。现有清洗工 艺只是采用清水正向和反向冲洗，不能有效清洗干净，尤其是当浓縮
柱被蛋白污染严重的时候，效果就更不好；如果延长反向冲洗的时间， 会破坏浓縮柱的表面结构，减少浓縮柱使用寿命。本发明增加胰酶消 化蛋白和蒸汽消毒步骤，縮短反向冲洗时间，提高了清洗的效果，延 长浓縮柱的使用寿命，而且能达到灭菌的效果。在设备停用期间，为 防止细菌生长，本发明使用一定浓度的氢氧化钠代替一定浓度的甲醛 充满整个微滤和浓縮系统，抑菌效果更好。 本发明中装置清洗的具体步骤如下-
1. 离心机的清洗连续离心结束后，首先清除转鼓或碟片中的 残渣，然后开动机器，用大量的自来水清洗，大约10分钟，然后通 入蒸汽消毒，封闭连续离心机；高速离心机的离心管用清水洗干净后， 用双蒸水冲洗，然后倒置干燥。注意下次使用前一定进行高压灭菌 后再使用。
2. 过滤和浓縮装置的清洗采用相同的步骤清洗过滤和浓縮装 置。启动装置，把进料和出料口的阀门全部打开，关闭滤液阀门，先 冲洗膜表面残留的蛋白，冲洗10分钟，然后打开滤液阀门，关闭部 分出料阀门，保证膜的内外压力差为0.25 0.30Pa，正向冲洗10分 钟。用温度为37"的无菌水配置0.025%的胰蛋白液，通过真空泵将 胰酶液抽到装置中，关闭进、出料阀门，使胰酶浸泡整个浓縮柱，静 置10分钟，用胰酶消化残留的蛋白。然后启动反向冲洗系统冲洗约 IO分钟；关闭反向冲洗系统，启动正向浓縮系统，用无菌水冲洗10 分钟。用流通量变化检测冲洗效果。如果流通量降低10%以上，说 明没有冲洗干净，浓縮装置中还留有蛋白，需要重复上述过程，特别
是随着使用次数的增多，应该延长胰酶消化的时间。最后过滤和浓縮
装置通入蒸汽消毒20分钟，然后分别用质量浓度为0.1 %和0.2%的 氢氧化钠溶液浸泡浓縮装置和过滤装置。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
例一鸡胚尿囊病毒液浓縮
1. 收获病毒将繁殖病毒的鸡胚从37"C培养箱中取出，放到4'C
过夜。取出鸡胚，用真空泵吸出鸡胚尿囊液(注意不要吸出卵黄液)
到IO升的玻璃瓶中。然后将装满病毒液的玻璃瓶放到一2(TC条件过 夜，取出放到4-C条件下融化和静置(不超过24小时)。
2. 样前处理
2.1连续离心启动连续离心机(立式柱状离心机或碟片离心 机)，通过蠕动泵将已经融化的病毒液不断地泵入离心机中，控制病 毒液进入的速度。出液口与不锈钢罐(物料罐l)相连接，经过离心 的病毒液不断进入物料罐I中。如果使用立式柱状离心机，当滤饼达 到一定厚度后会影响离心的效果，因此，经过一段时间离心，要停机， 清除滤饼后再离心。经过离心的病毒液去除了绝大部分不溶性杂蛋 白。
2.2过滤除菌启动过滤除菌装置，通过真空泵，物料罐I中的
病毒液不断地通过过滤除菌装置进入到物料罐II中。随着过滤时间 的延长，病毒原液中含蛋白的浓度升高，过滤的效率降低，此时可以
向病毒原液中加入一定比例的PBS,稀释病毒液，提高过滤效率。经 过过滤除菌，病毒液中不含有杂菌。
2.3高速离心过滤到最后，过滤系统中会残留有一定的病毒原
液。从进料口排除剩余的病毒液。将病毒液装入离心瓶中，高速离心去除杂菌(有时需多次重复)。将离心的病毒液加入到物料罐II中。
经过样前处理，病毒液中的绝大多数杂蛋白被去除，并且不含有 杂菌。
3. 病毒浓縮
开启浓縮装置，通过真空泵将物料罐II中的病毒液带入浓縮体 系中，控制进、出阀门，保持浓縮柱内外具有一定的压力差，采用大 功率的真空泵，使循环系统内的液体循环速度达到0.25 0.35米/秒。 去除病毒液中的部分水分，使浓縮后病毒液的体积为原来的1/2~1/4， 达到浓縮病毒(抗原)的目的。经过此步骤，无菌病毒液得到浓縮。
4. 病毒液收获
将病毒液从出料口排除，分装到一定体积的容器中(一般为500 毫升的玻璃瓶)，放到fC备检验，测定病毒的效价及检验是否含有 杂菌。
5. 连续离心机、过滤装置及浓縮装置的清洗
浓縮结束后，尽快清洗离心机、过滤装置和浓縮装置，以延长仪 器设备的使用寿命。
5.1连续离心机的清洗离心结束后，首先人工清除转鼓中的滤 饼，尽量去除干净；启动离心机，用蠕动泵加入大量的清水冲洗10 分钟，然后改用3(TC的温水冲洗10分钟；通蒸汽进行消毒10分钟。 5.2浓縮装置和过滤装置的清洗
用温水配置0.025%的胰酶液，分别通过各自的真空泵将胰酶液带 入到过滤柱和浓縮柱中，要保证胰酶液充满过滤柱和浓縮柱，关闭进、 出阀门，保持10分钟后排出胰酶；用温水正向冲洗10分钟，然后方 向冲洗10分钟，再正向冲洗10分钟。 6.浓縮装置和过滤装置的保存
过滤装置中可能会残留有一定数量的杂菌，为了杀灭或抑止细
菌，过滤装置用0.2%的氢氧化钠溶液浸泡；而浓縮装置中不含有细
菌，但为了防止残留的蛋白腐败，用0.1%的氢氧化钠溶液浸泡。下 次使用前，放出氢氧化钠溶液，用无菌水冲洗，直到流出的水的PH 值达到7.0左右。
例二细胞培养病毒液浓縮
1. 收获病毒收获细胞培养的病毒，反复冻融3次。
2. 样前处理启动连续离心机(立式柱状离心机或碟片离心 机)，通过蠕动泵将已经融化的病毒液不断地打入离心机中，控制病 毒液进入的速度。出液口与不锈钢罐(物料罐l)相连接，经过离心 的病毒液不断进入物料罐2中。经过样前处理，去除病毒液中细胞碎 片。(因为细胞培养的病毒液中不含有细菌，所以可以省略除菌步骤， 如果不能确定是否混有细菌，可以使用除菌步骤) 以下步骤同例一的相应步骤。
3. 病毒浓縮同例一3。病毒(抗原)的目的。经过此步骤，无菌 病毒液得到浓縮。
4. 病毒液收获同例一4。
5. 连续离心机、过滤装置及浓縮装置的清洗同例一5。
6. 浓縮装置和过滤装置的保存同例一6。
权利要求
1. 一种多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓缩工艺，包括如下工艺过程(1)采用分离因数在8000g～10000g的液—固连续离心机对液体进行离心分离，液体在离心机内驻留的时间大于15秒，出料口接密闭的物料罐I，经过离心的液体流进物料罐I内；(2)采用微滤装置去除病毒液中的细菌，微滤装置的出口通过管道与物料罐II连接；(3)将过滤后残留的溶液用高速离心机进行离心分离，将分离后的上清液加入到物料罐II中；(4)使用超滤浓缩装置对病毒液进行浓缩，超滤浓缩装置中选用中空纤维或板框式膜包做为超滤柱，将多个相同的中空纤维柱或膜包并联在一起，增加浓缩的效率，并对物料罐II进行冷却，温度为4℃～10℃；(5)病毒浓缩结束后，对整个系统进行清洗。
2. 如权利要求1所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺， 其特征在于在步骤(5)中清洗液—固连续离心机时，首先清除转鼓或碟片中的残渣，然后开动机器，用大量的自来水清洗，然后通入 蒸汽消毒，封闭连续离心。
3. 如权利要求1所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其特征在于在步骤(5)中清洗高速离心机时，先用清水清洗离心管，然后用双蒸水冲洗，之后倒置干燥。
4. 如权利要求1或2或3所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其特征在于在步骤(5)中清洗过滤和浓縮装置时，启 动装置，把进料和出料口的阀门全部打开，关闭滤液阀门，先冲洗膜 表面残留的蛋白，然后打开滤液阀门，关闭部分出料阀门，保证膜的内外压力差为0.25 0.30Pa，正向冲洗；然后，用无菌水配置0.025% 的胰蛋白液，通过真空泵将胰酶液抽到装置中，关闭进、出料阀门， 使胰酶浸泡整个浓縮柱，静置一段时间后，用胰酶消化残留的蛋白； 随后启动反向冲洗系统冲洗；关闭反向冲洗系统，启动正向浓縮系统， 用无菌水冲洗；最后向过滤和浓縮装置通入蒸汽消毒，然后分别用质 量浓度为0.1%和0.2%的氢氧化钠溶液浸泡浓縮装置和过滤装置。
5. 如权利要求1所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺， 其特征在于步骤(2)中微滤装置的微滤柱膜的孔径为0.22微米。
6. 如权利要求1所述的多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓縮工艺，其特征在于步骤(4)中浓縮后使病毒液的体积降为原来的1/2 1/4。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种多联灭活疫苗病毒(抗原)液浓缩工艺。该工艺在样前处理阶段，采用连续离心，浓缩前对病毒液进行了除杂蛋白和细菌处理；浓缩阶段采用多个并联浓缩柱和大功率真空泵；并在系统清洗阶段使用胰酶消化残留蛋白，改进了清洗方法，提高清洗的效率，延长装置使用寿命。本发明的整个系统都采用管道密闭连接；生产工艺适合工厂化生产，能直接进行大规模的生产。
文档编号A61P31/12GK101380467SQ20071014630
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月4日 优先权日2007年9月4日
发明者邵卫星 申请人:邵卫星