专利名称：一种肝靶向型智能纳米胶束前药系统及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于聚乙烯亚胺的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，并提供制备该纳米尺度自组装大分子前药的方法，属生物医药技术领域。
背景技术：
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。早期肝癌由于缺乏特征性征象，多表现为肝区隐痛、食欲差、腹胀、乏力等，与多数消化道疾病症状相似，目前的检测方法难以早期准确诊断，临床发现的肝癌多属中晚期肝癌，肝脏已经受到严重损害，故使临床治疗方案的选择和疗效受到很大的制约。目前，手术切除是治疗肝癌的首选，但术后容易复发，其主要原因是癌灶残留。若术后辅助化疗，可明显降低复发率，提高存活率,但是，化疗药物大都存在明显的疗效-剂量依赖关系，即增大药物的用量可明显的提高疗效。但药物剂量的增加必加重全身的毒副作用。为了提高肝癌治疗效果，除了需从"早发现，早诊断，早治疗"着手外，新的肝癌治疗药物的发现或现有肝癌治疗药物疗效、选择性和生物利用度的提高成为改善肝癌临床治疗效果的关键。
生物医药与纳米技术的融合集成而诞生的纳米生物医药技术，在肝癌等人类重大疾病的临床诊疗方面显示了诱人潜力。其中，耙向性的纳米药物载体技术由于特异性强，效果显著，避免损伤正常组织，为人类提高现有肝癌治疗药物的临床疗效和生物利用度，降低其毒副作用提供了理想的解决方案。如日本Matsumure研究小组以聚乙二醇和天冬氨酸的两嵌段共聚物胶束载带阿霉素(代号NK911 )和紫衫醇(代号NK105)治疗实体瘤已分别进入临床II期和临床I期研究(Y. Matsumure, Proceedings of the 2004 international Conference on MEMS, NANO andSmart Systems (ICMENS，04))，显示出较好的临床应用前景。Kataoka研究小组以聚乙二醇单甲醚与天冬氨酸的两嵌段共聚物为载体载带阿霉素而获得粒径分布均
匀的核~~^壳结构纳米胶束，研究发现纳米胶束药物能富集于实体瘤中，在血液中的稳定性良好(Y. Bae, S. Harada， K. kataoka, Angew Chem. Int. Ed. 42(2003) 4640.)。以聚乙二醇和天冬氨酸的共聚物胶束为抗癌药物载体虽然取得了不少成功(Yip YL etal. Application of phage display technology to cancer research. Curr Pharm Biotechnol. 2002，3 (1): 29-43.)，但也存在几方面的不足。首先，药物与药物载体间以降解非常缓慢的酰胺键连接，药物释放缓慢，指定时间内药物难以达到治疗剂量；其次，亲水的聚合物壳层(PEG)降低了细胞对纳米微粒的吞噬作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毒副作用小、临床疗效和生物利用度高、对肝
3癌细胞具有耙向性的肝耙向型智能纳米胶束前药系统。
本发明的另一目的在于提供上述肝靶向型智能纳米胶束前药系统的制备方法。
为了克服已有技术存在的缺陷，本发明利用聚乙烯亚胺(PEI)的"质子海绵"效应，肝癌耙向因子的耙向性，阿霉素良好的治疗效果，提供一种基于聚乙烯亚胺的肝靶向型智能纳米胶束前药系统。聚乙烯亚胺由于分子中含有多级胺
(如1级、2级、3级胺)，有"质子海绵"的功能，当其进入溶酶体后在质子泵作用下吸收质子(H+)的同时带入反离子，使溶酶体中离子浓度加大，渗透压加大，水份进入，从而使溶酶体膜破裂，使药物逃逸溶酶体。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统由三个功能部分组成(1)远端连肝癌靶向因子的聚乙二醇亲水链段为胶束的壳层；(2)化疗药物(如阿霉素)共价连接在促使溶酶体膜破裂的水溶性高分子链段上组成疏水部分作为胶束的核层；(3)化疗药物与载体间的溶酶体可降解(酸可降解)的连接键，其结构通式为-
[T-PEG〗n—PEI—(ADR)m
其中T为肝靶向基团；PEG为聚乙二醇；PEI为聚乙烯亚胺；ADR为阿霉
素作为治疗药物。n， m为1-350的整数。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统中肝靶向基团可为D-半乳糖，乳糖或靶向肽，以实现其主动靶向。PEG分子量可为35000Da， 25000Da，10000Da， 3500Da， 1800Da。优选为3500-25000Da，更好实现其在血液中的长效循环。本发明采用的是分子量分别为60000Da， 10000Da， 1800Da， 1200Da，600Da， 423Da的支化或直链PEI。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统中载体与阿霉素之间通过共价键连接；这里的共价键优选通过溶酶体可降解的共价键连接，使其只在溶酶体中降解释药以降低毒性。具体可为肼键、腙键、縮醛键或原酸酯键。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统纳米颗粒粒径为10 500nm。优选为100 150nm,对肿瘤组织可实现被动耙向的效果。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统的制备方法步骤如下第一步以远端带肝靶向基团(T)的聚乙二醇修饰聚乙烯亚胺得到(T-PEG-PEI);其方法为 一定量的聚乙烯亚胺(PEI)与半乳糖聚乙二醇NHS酯先在冰盐浴中反应12小时，然后在室温下反应72小时，透析得产物。
第二步T-PEG-PEI与琥珀-4-(氮maleimidomethyl)环己烷-l-磺酸钠SMCC反应得T-PEG-PEI-SMCC;其方法为 一定量的T-PEG-PEI与琥珀-4-(氮maleimidomethyl)环己烷-l-磺酸钠SMCC溶解于三蒸水中，室温下搅拌72小时，透析得产物。第三步阿霉素巯基衍生物(ADR-SH)的制备；其方法为先将3-(2-吡啶
二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)肼解，肼解产物与阿霉素盐酸盐(ADM-HC1)反应72小时，然后透析得产物。
第四步ADR-SH与T-PEG-PEI-SMCC反应得T-PEG-PEI-ADR;其方法为一定量的ADR-SH与T-PEG-PEI-SMCC在室温下搅拌反应72小时，然后将反应液经葡聚糖G-50凝胶柱处理，得产物
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统用葡聚糖凝胶G-50进行纯化。
本发明提供的肝靶向型智能纳米胶束前药系统的制备方法可表示如下:
本发明与己有技术相比较显著效果在于其一，两亲性的大分子阿霉素前药在水介质中自组装成纳米尺度的胶束结构；其二，聚乙二醇为聚合物纳米胶束的壳层，保证了纳米胶束微粒在血液中能够长效循环；其三，聚乙二醇远端的肝癌细胞靶向因子，一方面可通过受体介导的内吞途径增强肝癌细胞对聚合物纳米胶束的吞噬作用，另一方面可将治疗药物选择性地运送到肝肿瘤部位，定向杀伤肝肿瘤细胞，实现对肝部肿瘤细胞水平的主动靶向；其四，纳米胶束通过细胞吞噬作用克服细胞膜屏障后，首先进入内涵体、溶酶体等细胞器，由于内涵体、溶酶体等细胞器的pH值显酸性(5.(XpIK6.5),治疗药物与载体间的连接键发生酸催化降解，释放出治疗药物和促使溶酶体膜破裂的高分子链段(PEI的"质子海绵"效应)，随着溶酶体膜的破裂，化疗药物阿霉素逃逸溶酶体，进入发挥治疗作用的场所——细胞核，从而能最大限度地降低阿霉素等细胞毒类药物治疗肝癌的毒副作用，提高现有肝癌治疗药物的临床疗效和生物利用度，降低其毒副作用。对肝癌细胞具有靶向性的智能纳米胶束药物载体系统的设计思想具有原创性，是一种新型的抗肿瘤大分子药物，可望克服目前肝癌临床治疗效果不理想的瓶颈。
图1、 PEI的结构示意图。从图中我们可以看出，PEI含有大量的l'，2',3'氨基基团，质子海绵效应明显。
图2、 PEI接上靶向基团D-半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)后得到的Gal-PEG-PEI 'HNMR谱图。
图3、 Gal-PEG-PEI接上阿霉素后得到的Gal-PEG-PEI-ADR紫外谱图。
图4、肝靶向型智能纳米胶束前药的粒径、粒径分布图(Size Distribution byIntensity)(横轴代表粒径，单位nm，纵轴代表强度，曲线代表粒径分布)。
图5、肝靶向型智能纳米胶束的透射电镜图。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不仅限于此。
其中，聚乙烯亚胺PEI (Polyethyleneimine)购于Aldrich公司，半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)购买于北京键凯科技有限公司，葡聚糖凝胶G-50购买于上海摩速科学器材有限公司；水为三次蒸馏水；其余试剂均为市售AR试剂。
用英国MARLVEN公司Zetasizer3000HS型激光粒度散射仪，对本发明基于聚乙烯亚胺的肝耙向型智能纳米胶束前药的粒径及粒径分布进行表征，测试时的温度为25°C，入射激光的波长为633nm，其偏振方向与散射检测光平面垂直。并使用透射电镜(TEM)对纯化后的纳米粒子的形貌进行表征。用BRUKERAVANCE 500核磁共振仪(NMR)对Gal-PEG-PEI的结构进行了表征。用亚研电子有限公司的紫外-可见分光光度计UV1900PC对Gal-PEG-PEI-ADR进行了表征。
实施例1:
第 一 步分别将0.1834g(0.0054mmo1)半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)(分子量为35000Da)， 0.3773g507。的PEI水溶液(分子量为1800Da^0.1048mmo1)溶于10mlDMF中。在冰盐浴条件下，将Gal-PEG-NHS溶液滴加到PEI溶液中，并在冰盐浴条件下反应12小时，然后在室温下反应72小时。所得产物用7000Da的透析袋在三蒸水中透析96小时，所得透析液冷冻干燥72小时，得到白色絮状产物(Gal-PEG-PEI)，取少量该产物，溶于重水中，其NMR表征结果见附图3。
第二步取Gal-PEG-PEI 0.2733g，用20ml三蒸水溶解于100ml圆底烧瓶中，并加入50倍过量的琥珀4-(氮maleimidomethyl)环己烷-1一磺酸钠SMCC,室
6温下搅拌反应72小时，反应液用7000Da的透析袋在三蒸水中透析72小时，所得透析液冻干72小时，得白色固体Gal-PEG-PEI-SMCC 。
第三步阿霉素巯基衍生物ADR-SH的合成取70mg (0.22mmo1) 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)用3ml四氢呋喃(THF)溶解于圆底烧瓶中，在冰水浴的条件下，向此溶液加入0.3ml 1M肼的异丙醇溶液，在0"C下反应20分钟。将上述反应液用二氯甲烷萃取，然后用无水碳酸钾干燥。21mg上述产物，48mg阿霉素盐酸盐(ADM-HC1)(0.083mol)用5ml甲醇溶解于圆底烧瓶中，室温下避光搅拌反应6天，然后将反应液用反向薄层色谱柱进行分离，浓縮。将浓縮后的产物溶解于水中，加过量的二硫苏糖醇(DTT)，室温下搅拌2小时，硅胶柱分离，得到产物ADR-SH。
第四步
取Gal-PEG-PEI-SMCC0.2554g，用20ml三蒸水溶解于100ml圆底烧瓶中，并加入过量的ADR-SH，在室温下搅拌反应72小时，将所得产物用葡聚糖凝胶G-50柱进行，然后在冷冻干燥72小时后，得Gal-PEG-PEI-ADR。
实施例2
同实施例1法，固定PEI的分子量为1800Da，采用分子量为25000Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)进行实验实施例3
同实施例1法，固定PEI的分子量为1800Da，采用分子量为10000Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)进行实验实施例4
同实施例1法，固定PEI的分子量为1800Da，分别采用分子量为3500Da，的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)进行实验实施例5
同实施例1法，固定PEI的分子量为1800Da，分别釆用分子量为1800Da的半乳糖聚乙二醇活性酯(Gal-PEG-NHS)进行实验实施例6
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为60000Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例7
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为10000Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例8
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为1800Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例9
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为1200Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例10
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为600Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例11
同实施例1法，固定半乳糖聚乙二醇活性酯的(Gal-PEG-NHS)分子量为3500Da,采用分子量为423Da的聚乙烯亚胺进行实验实施例12
同实施例1法，把D-半乳糖聚乙二醇NHS酯，改换成乳糖聚乙二醇NHS酯,进行同样的实验实施例13
同实施例1法，把D-半乳糖聚乙二醇NHS酉旨，改换成多肽聚乙二醇NHS酯,进行同样的实验实施例14
同实施例1法，改变D-半乳糖聚乙二醇NHS酉旨、阿霉素巯基衍生物(ADR-SH)的用量比，进行同样的实验
用核磁共振对实施例l产物进行表征，结果见附图3，谱图中出现了聚乙烯亚胺、聚乙二醇的化学位移峰，说明半乳糖的聚乙二醇衍生物已经接到支化的聚乙烯亚胺上；用上述紫外-可见分光光度计进行产物进行表征，结果见附图4，产物在495nm处有吸收峰，此处正是阿霉素的特征吸收峰，说明阿霉素接到聚乙烯亚胺上;用激光粒度仪PCS测量产物的粒径，结果见图5，其粒径为小于100nm，粒径分布均匀。由于其他实施例的表征与实施例1的表征相似，故不再罗列。
通过上述实施例，发现采用3500Da的聚乙二醇NHS酯制得的智能肝靶向纳米聚乙烯亚胺药物载体系统粒径小，粒径分布均匀，适合作为肝靶向载药系统。通过上述实施例，发现采用分子量1800Da的支化聚乙烯亚胺制得的智能肝耙向纳米聚乙烯亚胺药物载体系统粒径小，粒径分布均匀，适合作为肝耙向载药系统。
通过实施例14，发现n:Fl:4时，肝靶向纳米聚乙烯亚胺药物载体系统粒径小，粒径分布均匀，适合作为肝靶向载药系统。
在上述实施例中，制得了粒径为10 500nm的基于聚乙烯亚胺的肝耙向型智能纳米胶束前药。上述实施例仅用以说明本发明但并不局限于此，应该理解在不脱离本发明的精神范围内还可有多种变通或替换方案。
权利要求
1、一种肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于结构通式为[T-PEG]n-PEI-(ADR)m其中T为D-半乳糖，乳糖或靶向肽；PEG为分子量为35000Da，25000Da，10000Da，3500Da或者1800Da的聚乙二醇；PEI为分子量为60000Da，10000Da，1800Da，1200Da，600Da或者423Da的支化或直链PEI聚乙烯亚胺；ADR为阿霉素；n，m为1-350的整数；纳米颗粒粒径为10～500nm。
2、 如权利要求l所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于PEG分子量为3500-25000Da。
3、 如权利要求1所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于PEI为支化的PEI。
4、 如权利要求l所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于载体与阿霉素之间通过共价键连接。
5、 如权利要求1所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于载体与阿霉素之间通过溶酶体可降解的共价键连接。
6、 如权利要求l、 4或者5所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，载体与阿霉素之间的连接键可为肼键、腙键、缩醛键或原酸酯键。
7、 如权利要求l所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，其特征在于纳米颗粒粒径为100 150nm。
8、 如权利要求1所述的肝靶向型智能纳米胶束前药系统的制备方法，其特征在于步骤如下第一步聚乙烯亚胺(PEI)与半乳糖聚乙二醇NHS酯先在冰盐浴中反应12小时，然后在室温下反应72小时，透析得(T-PEG-PEI);第二步T-PEG-PEI与琥珀-4-(氮maleimidomethyl)环己烷-l-磺酸钠SMCC溶解于三蒸水中，室温下搅拌72小时，透析得T-PEG-PEI-SMCC;第三步先将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)肼解，肼解产物与阿霉素盐酸盐(ADM-HC1)室温下搅拌反应72小时，然后透析得阿霉素巯基衍生物(ADR-SH);第四步ADR-SH与T-PEG-PEI-SMCC在室温下搅拌反应72小时，然后将反应液经葡聚糖G-50凝胶柱处理，得T-PEG-PEI-ADR。
全文摘要
本发明涉及基于聚乙烯亚胺的肝靶向型智能纳米胶束前药系统，提供了制备该大分子前药的方法。本发明是以远端带肝靶向基团(T)的聚乙二醇修饰毒性较低的聚乙烯亚胺为载体(T-PEG-PEI)，以阿霉素(ADR)作为治疗药物，载体与阿霉素之间通过溶酶体可降解的共价键连接而得前药(T-PEG-PEI-ADR)。T-PEG-PEI-ADR前药在水溶液中自组装成粒径10～500nm的胶束。该胶束前药系统在血液中能够长效循环，并能增强肝癌细胞对聚合物纳米胶束的吞噬作用，并能将治疗药物选择性地运送到肝肿瘤部位，定向杀伤肝肿瘤细胞，降低阿霉素治疗肝癌的毒副作用，提高了现有肝癌治疗药物的临床疗效和生物利用度。
文档编号A61K47/34GK101574527SQ20071017211
公开日2009年11月11日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者余家会, 公彦宝, 刘顺英, 罗淑芳 申请人:华东师范大学