专利名称：：制备用于治疗皮肤病症和促进伤口愈合的植物提取物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备中草药(Chineseherbalmedicine)提取物的方法。具体来说，本发明涉及使用与特定处理组合使用固液分离法来大量生产用于治疗皮肤病症，包括促进尤其是糖尿病患者的伤口愈合的植物提取物。
背景技术：
：生长于马来西亚和印度的左手香(P/e"m"^u^a附Zw'm'CM(Lour.)Spreng)为一种常由普通家庭栽培的观赏药草。左手香的药用部分为其生长在地面上的部分。左手香也称为古巴牛至(Cubanoregano)、印度琉璃苣(Indianborage)、印度薄荷(Indianmint)、墨西哥薄荷(Mexicanmint)、墨西哥牛至(Mexicanoregano)或西班牙百里香(Spanishthyme)。东印度人使用左手香作为织物芳香剂，且英国人在19世纪20年代从印度进口披肩织物时发现其迷人香味。当将左手香叶直接与衣服放在一起时，其不仅具有芳香作用，而且也防止衣服被虫蛀噬的效果。左手香也被认为可适用于消毒、增强性兴奋和预防虫咬。此外，左手香可用于治疗毒蛇咬伤和减轻诸如头痛、胃肠胀气、呕吐、腹泻和发烧的症状。此外，左手香油在亚洲为一种受欢迎的香水，且其在芳香疗法中用于促进上皮再生、治疗痤疮和减轻湿疹、脚癣(Athlete'sfoot)和干裂皮肤的症状。此外，左手香为一种可减轻焦虑和增强性欲的良好镇静剂和催欲剂。虽然左手香的各种用途已报导于普通杂志中，但有关左手香的科学研究却很少见于文献中。US2006/0099283Al揭露用于治疗癌症和/或肿瘤的左手香的叶汁。USSN11/605,178(与本发明有关的专利申请案)提供一种包含治疗有效量的左手香粗提取物/提取物和治疗有效量的积雪草(CeWe//aaw'a"c"Urban)提取物的医药组合物。积雪草为一种天然生长于马达加斯加和印度洋的沿海地区的植物。伞形科(Apiaceaefamily)的积雪草的药用部分为其经干燥的整个植物。积雪草也称为欧洲水奇物(Europeanwater-marvel)、雷公根(Gotukola)、可乐树(Kola)、印度石莲花(Indianpennywort)、印度人参(Indianginseng)、马蹄草(Horse-hoofgrass)、崩大碗(Pegaga)、Mandookaparni、虎本草(Tigerherbal)、Spadeleaf或Tono。数百年来，在亚洲的传统医学中认为积雪草适用于促进伤口的愈合。积雪草的提取物包含两种主要化合物积雪草皂苷(asiaticoside)和羟基积雪草酸(madecassicacid)。积雪草提取物已知可用以治疗烧伤和外伤且预防手术后粘连，且积雪草提取物的制备方法已描述于一些专利申请案中。举例来说，US4,318,906和CN1353972A揭露积雪草作为单一活性成分的医学用途；US6,475,536、US6,267,996、CN1313124A、CN93110425.4和CN1089497A揭露积雪草与其它物质的结合物，和其用于化妆品调配、治疗烧伤或制备用于外伤的软膏的用途；且US5,834,437、US6,417,349和CN1194154A揭露制备积雪草提取物的方法。将组分从混合物分离的常规分离方法包括使混合物与非离子吸附树脂(诸如DIAIONHP20、DIAIONHP20SS、SepabeadsSP207(MitsubishiChemicalCorporation),AmberliteXAD-2(RohmandHasscompany)、AmberliteXAD陽4和其类似物)接触。所述的步骤包含将非离子吸附树脂装填至分离管柱中，将混合物添加至管柱中，和用溶剂洗提管柱。当用所述方法处理大量混合物时，此为耗时的且洗提条件不易控制。US2006/0099283Al的叶汁是通过研磨且移除组织碎片和/或残余物，且用离心过滤装置分离叶汁的不同部份来获得的。USSN11/605,178的左手香提取物是通过利用一系列具有不同极性的溶剂从色谱管柱洗提提取物来制备。这一方法复杂且耗时。仍然需要提供一种大量获得左手香的活性成分的方法。本发明意外发现一种搅拌方法可代替传统管柱分离方法且可大量生产左手香提取物。所述搅拌方法快速且洗提条件易于控制。此外，通过搅拌分离获得的左手香提取物比通过管柱色谱分离制备的提取物更有效。
发明内容本发明的一个目的为提供一种制备左手香粗提取物和/或提取物的方法。本发明的另一目的为提供一种用于治疗皮肤病症(包括促进糖尿病患者的伤口愈合)的医药组合物，其包含治疗有效量的左手香粗提取物和/或提取物。所述的医药组合物可进一步包含治疗有效量的积雪草提取物。本发明的又一目的为提供一种包含本发明的医药组合物的伤口敷料。本发明的另一目的为提供一种治疗皮肤病症的方法，其包含投与本发明的医药组合物。本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的和优点可易见于本发明的具体实施方式和权利要求书中。图l展示通过搅拌分离制备的左手香提取物(PA-W4)的色谱分析谱图。所述谱图是通过逆相HPLC在UV270nm下测定。图2展示通过管柱色谱分离制备的左手香提取物(PA-C4)的色谱分析谱图。所述谱图是通过逆相HPLC在UV270nm下测定。图3展示STZ诱发的糖尿病大鼠中的伤口闭合。第1组经安慰剂(无药物的软膏)涂覆的伤口；第2组经含有1%积雪草提取物(Sl)的软膏涂覆的伤口；第3组经CGS-21680(10ixg/ml)涂覆的伤口；第4组经Regranex涂覆的伤口；第5组经DCB-WH1-C(包含1%Sl和0.25%PA-C4的软膏)涂覆的伤口；第6组经DCB-WH1-W(包含1%S1和0.25%PA-W4的软膏)涂覆的伤口。图4展示STZ诱发的糖尿病大鼠中的伤口闭合。第1组经安慰剂(无药物的软膏)涂覆的伤口；第2组经含有1%积雪草提取物(Sl)的软膏涂覆的伤口；第3组经含有0.25%PA-W4的软膏涂覆的伤口；第4组经DCB-WH1-W(包含1%Sl和0.25%PA-W4的软膏)涂覆的伤口；第5组经含有1%PA-W4的软膏涂覆的伤口。具体实施例方式除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有所属领域的一般技术人员通常理解的含义。术语的含义和范畴应为明确的；然而，如果存在任何潜在含糊性，那幺本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。除非另外指示，否则应了解如本揭露案所用的以下术语具有以下含义如本文所用的术语"皮肤病症"包括伤口或疮。在一实施例中，伤口包括切伤、裂伤、擦伤、刺伤或其它类似皮肤损伤，优选为糖尿病患者的伤口；疮包括褥疮。如本文所用的术语"治疗"或"促进"表示改善症状。如本文所用的术语"患者"表示动物，尤其为哺乳动物。在一优选实施例中，术语"患者"表示"人类"。如本文所用的术语"治疗有效量"指的是单独使用或与其它用于治疗病症的药物组合使用的医药组合物可展现治疗功效的量。术语"载剂"或"医药学上可接受的载剂"指的是稀释剂、赋形剂、受剂或类似物，其为制造医药组合物技术中所属领域的一般技术人员所熟知。术语"积雪草提取物"表示干燥积雪草整个植物的提取物，其中主要活性组分包含积雪草皂苷和羟基积雪草酸。优选地，其为主要包含积雪草皂苷和羟基积雪草酸的可在市面上购得的药用部分，且其纯度大于70%。术语"左手香粗提取物"表示从左手香的地面上生长部分获得的提取物，且粗提取物可经进一步浓缩。术语"左手香提取物"表示通过进一步分离粗提取物获得的提取物。术语"高极性溶剂"表示在制备方法中所用的溶剂中具有最高极性的溶剂。高极性溶剂包括(但不限于)水、甲醇、乙醇或两种或两种以上前述溶剂的混合物。术语"低极性溶剂"表示在制备方法中所用的溶剂中具有最低极性的溶剂。低极性溶剂包括(但不限于)氯仿、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、两种或两种以上前述溶剂的混合物或一种或一种以上前述溶剂与一种或一种以上具有较高极性的溶剂的混合物。术语"次高极性溶剂"表示极性比制备方法中所用的高极性溶剂的极性低但比制备方法中所用的中等极性溶剂的极性高的溶剂。次高极性溶剂可通过以约30:70至约70:30，优选约60:40至约40:60的比率(v:v)混合高极性溶剂与具有较低极性的溶剂来获得。术语"中等极性溶剂"表示极性比制备方法中所用的次高极性溶剂的极性低但比制备方法中所用的低极性溶剂的极性高的溶剂。中等极性溶剂可通过以约30:70至约5:95，优选约15:85至约5:95的比率(v:v)混合高极性溶剂与具有较低极性的溶剂来获得。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。制备方法
技术领域：
：本发明的特征在于使用固液分离(搅拌分离)与特定处理的组合，以较快方式和较高产率大量生产左手香提取物。所述的搅拌分离包含将吸附树脂(诸如DIAION)于左手香提取物中搅拌，且利用不同溶剂通过微分分离步骤从左手香提取物中分离出不同部分。通过本发明的方法获得的左手香提取物除通量较高外，还比通过管柱色谱分离方法制备的左手香提取物更有效。用于制备左手香提取物的本发明方法包含以下步骤使经干燥的左手香叶与叶提取溶剂接触以获得左手香粗提取物；浓縮所述的左手香粗提取物；和使用搅'拌分离方法处理经浓缩的左手香粗提取物以获得左手香提取物。根据本发明，搅拌分离方法包含以下步骤(a)用高极性溶剂稀释经浓縮的左手香粗提取物，将经稀释的左手香粗提取物与吸附树脂混合，且搅拌吸附树脂与经稀释的左手香粗提取物；(b)移除液体部分，用蒸馏水提取树脂且收集第一提取物；(c)用次高极性溶剂提取树脂且收集第二提取物，-(d)用中等极性溶剂提取树脂且收集第三提取物；和(e)用低极性溶剂提取树脂且收集第四提取物。在一优选实施例中，用于制备左手香提取物的方法包含以下步骤-1.使经干燥的左手香叶与叶提取溶剂接触约30至约100小时以获得左手香粗提取物；2.浓縮所述的左手香粗提取物；3.用高极性溶剂稀释经浓縮的左手香粗提取物，且通过搅拌约10至约30小时使经稀释的左手香粗提取物与吸附树脂混合；4.移除液体部分；5.将树脂浸渍于蒸馏水中约1至约7小时以获得第一提取物(PA-W1);6.将树脂与次高极性溶剂混合且搅拌约1至约7小时以获得第二提取物(PA-W2);7.将树脂与中等极性溶剂混合且搅拌约1至约7小时以获得第三提取物(PA-W3);8.将树脂与低极性溶剂混合且搅拌约l至约7小时以获得第四提取物(PA-W4)。根据本发明的方法，叶提取溶剂是选自(但不限于)水和醇类。在一优选实施例中，所述的醇为乙醇。叶提取溶剂体积与经干燥的左手香叶重量的比率为约6:1至约15-.1，优选为约10:1。根据本发明的方法，步骤1中获得的叶提取物可通过任何针对溶液的常规浓縮方法，诸如使用减压旋转蒸发器来浓縮。根据本发明的方法，吸附树脂是选自(但不限于)DIAIONHP20、DIAIONHP20SS、SepabeadsSP207、AmberliteXAD-2、AmberliteXAD-4和其类似物，优选为DIAION恋系列。在一优选实施例中，吸附树脂为DIAIONHP20。此外，DIAIONHP20树脂可经甲醇预处理。根据本发明的方法，高极性溶剂体积与经干燥的左手香叶重量的比率为约8:1至约4:1，优选为约5:1;次高极性溶剂体积与经干燥的左手香叶重量的比率为约8:1至约4:1，优选为约5:1;中等极性溶剂体积与经干燥的左手香叶重量的比率为约8:1至约4:1，优选为约5:1;且低极性溶剂体积与经干燥的左手香叶重量的比率为约8:1至约4:1，优选为约5:1。根据本发明的方法，步骤1的提取时间为约30至约100小时，优选为约50至约80小时，且最优选为约72小时至约80小时。步骤3的吸附时间为约10至约30小时，优选为约17至约25小时，且最优选为约20小时至约25小时。步骤5的提取时间为约1至约7小时，优选为约1至约4小时，且最优选为约l小时。步骤6的提取时间为约1至约7小时，优选为约1至约4小时，且最优选为约1小时。步骤7的提取时间为约1至约7小时，优选为约1至约4小时，且最优选为约1小时。步骤8的提取时间为约1至约7小时，优选为约1至约4小时，且最优选为约l小时。此外，根据本发明的方法，搅拌为以约3至约15rpm，优选为约5至约10rpm，且最优选为约7rpm的速度进行。本发明的方法为大量生产左手香提取物的高通量方法。所述方法从左手香提取活性部分比管柱色谱分离方法快约5倍。医药组合物本发明提供一种包含治疗有效量的通过本发明的分离方法制备的左手香粗提取物和/或提取物的医药组合物。本发明的另一实施例提供一种包含治疗有效量的通过本发明分离方法制备的左手香粗提取物和/或提取物与治疗有效量的积雪草提取物组合的医药组合物。本发明的医药组合物可局部涂覆于伤口，且其可调配成喷雾形式或非喷雾形式。喷雾形式包括喷雾或溶液；非喷雾形式可为半固体或固体，优选为具有大于水的运动粘度的固体形式。合适的调配物包括(但不限于)悬浮液、乳液、乳膏、软膏、擦剂和其类似物。必要时，其可经杀菌或与任何医药学上可接受的载剂，诸如稳定剂、湿润剂和其类似物混合。本发明的医药组合物优选为调配成软膏，其中优选的医药学上可接受的载剂包括(但不限于)高级脂肪酸、蜡、脂质、甘油、高级醇或合成脂质。无论本发明的医药组合物调配为何种形式，其均可进一步包含润肤剂、芳香剂或着色剂以增强各种用途的可接受性。治疗有效量的左手香粗提取物和/或提取物和积雪草提取物揭露于USSN11/605,178、US4，318，906、CN1353972A、US6,475,536、US6,267,996、CN1313124A、CN93110425.4和CN1089497A中，其中所述申请案的揭露内容是以全文引用的方式并入本文中。本发明的医药组合物可由所属领域的一般技术人员使用常规方法来制备。本发明的一个实施例包括一种制备软膏的方法，其包含以下步骤-在约5(TC的水浴中加热软膏基质直至软化；将软化的软膏基质添加至含有经冷冻干燥的左手香粗提取物和/或提取物的烧杯中；将软膏基质与左手香粗提取物和/或提取物的量调节以制备左手香粗提取物和/或提取物软膏；和将软膏在4.C下于冰箱中储存。左手香粗提取物的含量为软膏的约1wt。/。至15wt%。左手香提取物的含量为软膏的约0.1wt。/。至5wt%。本发明的另一实施例包括一种制备软膏的方法，其包含以下步骤在约50'C的水浴中加热软膏基质直至软化；将软化的软膏基质添加至含有经冷冻干燥的左手香粗提取物和/或提取物的烧杯中以制备左手香粗提取物和/或提取物软膏；将左手香粗提取物和/或提取物软膏与积雪草提取物均匀混合以制备积雪草提取物+左手香粗提取物和/或提取物软膏；和将软膏在4x:下于冰箱中储存。左手香粗提取物的含量为软膏的约0.5wt。/。至约5wt。/。且积雪草提取物的含量为软膏的约0.1wt。/。至约20wt%。左手香提取物的含量为软膏的约0.05wt。/。至约2wt。/。且积雪草提取物的含量为软膏的约0.1Wtn/。至约20wtn/。。左手香粗提取物与积雪草提取物之间的重量比为约1:40至约1:4。左手香提取物与积雪草提取物之间的重量比为约1:60至约1:4。根据本发明，含有通过本发明的搅拌分离方法制备的第四左手香提取物(PA-W4)的软膏和含有PA-W4与积雪草提取物组合的软膏展示比仅包含积雪草提取物的软膏、包含通过传统管柱色谱分离方法制备的左手香提取物与积雪草提取物组合的软膏或其它常规增强伤口愈合的药物(在以下实例中展示)高的促进伤口愈合的功效。软膏中第四左手香提取物与积雪草提取物的量分别为约至少O.Olwt。/。和约至少0.1wt%。第四左手香提取物的量优选为软膏的约0.01wt。/。至约5wt%，更优选为软膏的约0.1wt。/。至约1wt%，最优选为软膏的约0.25wt。/。至约1wt%。积雪草提取物的量为软膏的约0.1wt%至约20wt%，更优选为软膏的约0.5wt。/。至约9wt%，最优选为软膏的约1wt。/。至约3wt%。第四左手香提取物与积雪草提取物之间的重量比优选为约1:60至约1:4。效用本发明的医药组合物可用于治疗包括(但不限于)伤口和疮的病症。在一优选实施例中，所述病症为一般外伤和褥疮，更优选为糖尿病患者的伤口。所属领域的技术人员应不难选择治疗的合适途径和剂量。根据本发明，优选途径为局部投药。剂量将根据病症的性质和状况、患者的年龄和健康状况、投药途径和任何先前治疗而定。所属领域的技术人员应知道剂量可根据个体的年龄、体形、健康状况和其它相关因素而改变。本发明的医药组合物可便利地用于制造包含治疗有效量的左手香粗提取物和/或提取物和视情况治疗有效量的积雪草提取物的伤口敷料，其中所述伤口敷料包括(但不限于)具有粘着剂的绷带、软膏贴片和其类似物。提供以下实例以帮助所属领域的技术人员实施本发明。虽然如此，但不应认为所述实例可不当限制本发明，因为所属领域的一般技术人员在不悖离本发明发现的精神或范畴的情况下可对本文所讨论的实施例进行改进和修改。实例材料A.软膏基质实例中使用的软膏基质(倍他米松(BETAMETHASONE)软膏基质)是购自台湾杏辉制药(Sinphar)。使用所述软膏基质来制备于生物检定中包含积雪草提取物和/或左手香提取物以及安慰剂的软膏。B.CGS-21680CGS-21680(Sigma，批号093K4615)为在临床试验下用于愈合伤口的药物。将5mg的CGS-21680添加至500ml蒸馏水中以制备10ug/mlCGS-21680溶液。将CGS-21680溶液用作实例中的比较药物。C.RegranexRegranexO.01%胶含有100yg/g(0.01%)浓度的贝卡普勒明(becaplermin)(—种重组人类血小板衍生生长因子(fh-PDGF-BB))。其为FDA批准用于治疗深度神经病性糖尿病足溃疡的处方药物。将Regranex用作实例中的比较药物。D.积雪草提取物和包含其的软膏制备本发明的医药组合物中积雪草提取物和活性组分的方法为草药提取技术中所属领域的一般技术人员所熟知。优选方法包含通过乙醇回流提取法提取积雪草2小时，且将其重复2至3次；浓縮乙醇提取流体以获得提取物；回收乙醇提取物，将提取物混合再溶解于水中；分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取，且接着用水饱和正丁醇提取；在减压下回收正丁醇提取物以获得乳膏状物质，且将所述物质溶解于少量甲醇中；添加数倍的无水丙酮至溶液中以沉淀微黄色粗总糖苷，干燥且称重沉降物；添加少量甲醇以溶解粗总糖苷，与硅胶适当混合且干燥混合物；将色谱用硅胶填充至湿润管柱且装载样品硅胶；用氯仿、甲醇和水(16:6:1均质混合物)洗提且继而收集18个组分；各组分为50ml且将所述组分以层点样以与已知的对照组相比较；组合组分9至15，浓縮，且接着用使用氯仿、甲醇和水(14:6:1均质混合物)进行洗提的管柱纯化；和浓縮相同组分且用甲醇反复结晶以获得白色针状结晶积雪草皂苷。此外，含有积雪草皂苷和羟基积雪草酸的纯度大于70%的积雪草提取物(Sl)的药物物质可在市面上购得。商业产品CENTELLAASIATICAPURIFIEDEXTRACT可购自台湾仲华公司。如下制备1%积雪草提取物(Sl)软膏在约5(TC的水浴中加热软膏基质直至软化；将99g软化的软膏基质与lg积雪草提取物(Sl)混合；将软膏在4'C下于冰箱中储存。在实例中将1%S1软膏用作比较药物。E.左手香提取物生物检定中使用的左手香提取物是由本发明的制备方法(搅拌分离方法)和管柱色谱分离方法制备。制备的详情描述于以下制备实例中。实例1.通过搅拌分离方法制备左手香提取物将800g经干燥的左手香叶浸入体积为干燥叶总重量10倍的95%乙醇中72小时，且接着过滤叶提取物。重复提取程序。将两种叶提取物混合以获得左手香粗提取物，且通过减压旋转蒸发器(HeidolphLABOROTA4000,EleyaN-N系列)浓縮粗提取物以使粗提取物体积减至原始体积约的5%(即，减至干燥叶原始重量的约一半)。用高极性溶剂将左手香粗提取物的体积稀释至原始体积的10倍。将经稀释的左手香粗提取物添加至含有通过甲醇预处理的DIAIONHP20树脂的桶状容器中。以3至10rpm的速度搅拌容器中的树脂和提取物过夜。接着将流体从容器中倒出。将体积为干燥叶总重量5倍的重蒸水添加至容器中。将树脂浸入水中不时搅拌1小时且收集流体。浓縮所收集的流体(PA-W1)且干燥以获得2.4g干制品，产率为0.3%。将体积为干燥叶总重量5倍的次高极性溶剂进一步添加至含有树脂的容器中。将树脂浸入溶剂中不时搅拌1小时且收集流体。重复所述过程两次。混合所提取的流体(PA-W2)且接着浓缩且干燥以获得4g干制品，产率为0.5%。将体积为干燥叶总重量5倍的中等极性溶剂进一步添加至含有树脂的容器中。将树脂浸入溶剂中不时搅拌1小时且收集流体。重复所述过程两次。混合所提取的流体(PA-W3)且接着浓縮且千燥以获得6g干制品，产率为0.75%。将体积为干燥叶总重量5倍的低极性溶剂进一步添加至含有树脂的容器中。将树脂浸入溶剂中不时搅拌1小时且收集流体。重复所述过程三次。混合所提取的流体(PA-W4)且接着浓縮且干燥以获得7.52g干制品，产率为0.94%。实例2.通过管柱色谱分离方法制备左手香提取物将重量与干燥左手香叶的重量相同的DIAION树脂浸入甲醇中且装填至色谱管柱中。接着将所装填的DIAION树脂用体积为DIAION树脂总重量1倍至2倍的甲醇洗涤，且接着用体积为DIAION树脂总重量5倍至6倍的重蒸水洗漆。将800g干燥左手香叶浸入体积为干燥叶总重量10倍的95%乙醇中24小时。过滤后，将叶进一步浸入体积为干燥叶总重量IO倍的95%乙醇中24小时。将左手香提取物流体混合且通过减压旋转蒸发器浓缩以将体积减至原始体积的约2-3%。将由先前步骤获得的提取物用蒸馏水稀释且装载入DIAION树脂管柱中。用体积为干燥叶总重量10倍的高极性溶剂洗提管柱。收集所洗提的洗提份(PA-C1)，其产率为0.38%。接着用体积为干燥叶总重量5-10倍的次高极性溶剂洗提管柱。收集所洗提的洗提份(PA-C2),其产率为0.5%。用体积为干燥叶总重量5-10倍的中等极性溶剂再次洗提管柱。收集所洗提的洗提份(PA-C3)，其产率为0.78%。最终，用体积为干燥叶总重量5-10倍的低极性溶剂洗提管柱。收集所洗提的洗提份(PA-C4)，其产率为0.67%。实例3.左手香提取物的组成分析仪器与设备高效液相色谱(HPLC)谱系统，Thermo泵Spectra-PhysicsP4000检测仪UV/VISSpectra-Physics谱系统UV600OLP自动取样机ThermoSeparationProductsAS3500软件ThermoSeparationProductsChromQuest系统控制器ThermoSeparationProductsSN4000液相HPLC的条件色谱管柱Phenomenex，4.6X250nm，Luna5y二氧化硅(2)流速1.0ml/min压力极限250kgf/cm2样品量10piPDA条件取样时间0.64sec波长范围190-370nm信道270、320nm洗提特征时间(min)移动相0154550正己烷95%85%30%95%乙酸乙酯5%15%70%5%通过搅拌分离获得的PA-W4提取物的色谱分析谱图和通过管柱色谱分离获得的PA-C4提取物的色谱分析谱图分别展示于图1和2中。PA-W4在以下滞留时间具有HPLC峰峰滞留时间(min)15.529.6320.0422.5523.5624.8727.7827.8928.61028.91129.71231.01331.91436.61537.8实例4.包含左手香提取物的软膏和包含积雪草提取物(Sl)和左手香提取物的软膏的制备测量软膏基质、PA-W4提取物和PA-C4提取物的合适量。将软膏基质在约50'C的水浴中预热直至软化，再分别添加至含有PA-W4提取物和PA-C4提取物的烧杯中以获得0.25%PA-W4软膏和0.25%PA-C4软膏。软膏基质与左手香提取物的重量比为99.75:0.25。接着将所得的软膏分别与积雪草提取物(Sl)以99:1的重量比混合以获得DCR-WH1-W软膏(r/。Sl+0.25%八-\^4)和001-\\^[1-(:软膏(1%Sl+0.25%PA-C4)。生物检定实例5.糖尿病大鼠中伤口闭合的动物实验在动物中诱发高血糖将链脲佐菌素(STZ，65mg/kg，腹膜内)投与体重超过300g的大鼠以诱发高血糖。选择成功诱发高血糖(超过300mg/DL)的大鼠，且在高血糖综合症出现2个月后进行伤口闭合测试。糖尿病动物的外伤外科手术i.淘汰体重低于300g的高血糖动物且将其余动物随机分为6组。ii.用戊巴比妥(pentobarbital)麻醉动物且移除外科手术区域(背部区域)上的毛发。接着在手术前用75%乙醇将外科手术区域和仪器消毒。iii.使用直径为1cm的圆形切刀切除背部中间区域(距离两块肩胛骨中点4、6和8cm)上的皮肤。测量伤口，涂覆测试物质和防止抓挠伤口i.将一个标准尺置放于伤口旁边且拍摄照片。ii.将调配为软膏的测试物质和0.05mlCGS21680溶液以一层涂覆于各伤口。iii.用纱布覆盖伤口且在大鼠颈上戴上防护罩。每天两次(早晨和晚上)将测试物质涂覆于大鼠且在每一时间点测量伤口。在实验完成后，取下再生皮肤以进行生物化学和组织学分析。[伤口面积分析]拍摄照片时在伤口旁边置放一个标准尺。在用影像处理软件Image-Pro(MediaCybernetics,Inc.)分析伤口前根据照片中标准尺的刻度将伤口长度标准化，以避免因不同拍照距离引起的误差。通过Image-Pro分析大鼠背上三个伤口的面积。第0天伤口面积为原始伤口面积。将原始伤口面积减去不同时间点的伤口面积的值后再除以原始伤口面积，得到伤口闭合百分比。每只大鼠的三个伤口闭合百分比的平均值代表每只大鼠的伤口闭合。各测试物质使用每组4至7只大鼠进行实验。数据以平均值土标准误差(SEM)的方式表示。通过t检验以统计软件sigmastatis(SystatsoftwareInc.)计算测试结果的P值。PO.05意谓存在显著差异，且其在统计图或表上用*标记。PO.01意谓存在非常显著的差异，且其在统计图或表上用**标记。P<0.001意谓存在极端显著的差异，且其在统计图或表上用***标记。实例6.1%Sl、CGS-21680、Regranex、DCB-WH1-C和DCB-WH1-W对STZ诱发的糖尿病大鼠伤口闭合的功效的比较此实例的目的在于比较本发明的组合物对伤口闭合的功效和市售产品对伤口闭合的功效。伤口闭合动物实验是根据实例5进行。在安慰剂(第l组)、1。/。Sl软膏(第2组)、CGS-21680(第3组)、Regranex(第4组)、DCB-WH1-C(第5组)和DCB-WH1-W(第6组)治疗后的第0天、第4天、第6天、第8天、第IO天和第12天，测量所有实验组的伤口面积且计算伤口闭合百分比和CT5Q(50%伤口闭合所需的时间)值。结果展示于图3和表1中。实验组的伤口闭合百分比的成对比较的P值展示于表2中。表1经安慰剂、1%Sl软膏、CGS21680、Regranex、DCB-WH1-C和DCB-WH1-W治疗的实验组的伤口闭合百分比和CTso<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在第4天，第3、第4、第5或第6组的伤口闭合百分比显著高于第1和第2组的伤口闭合百分比(PO.Ol)，且第6组的伤口闭合百分比更显著高于第3、第4和第5组的伤口闭合百分比(P<0.05)。在第6天，第3、第4、第5和第6组的伤口闭合百分比显著高于第1和第2组的伤口闭合百分比(分别为P<0.01和p<0.001)，且第6组的伤口愈合百分比更显著高于第3、第4或第5组的伤口闭合百分比(PW.05或PO.001)。在第8天，第5和第6组的伤口闭合百分比显著高于第2组的伤口闭合百分比(p0.05)，且第6组的伤口闭合百分比更显著高于第3、第4和第5组的伤口闭合百分比(PO.OOl)。在第10天，第6组的伤口闭合百分比显著高于其它组的伤口闭合百分比(PO.OOl)。第l至第6组的CT5o分别为U.4天、10.3天、10.36天、9.4天、9.5天禾卩7.65天。总的来说，本发明的DCB-WH1-W软膏具有优于其它测试物质(即，软膏基质、1%Sl软膏、CGS21680、Regranex和DCB陽WH1-C)的功效。实例7.1%Sl、0.25%PA-W4、DCB-WH1-W和1%PA-W4对STZ诱发的糖尿病大鼠伤口闭合的功效的比较此实例的目的在于比较DCB-WH1-W和其活性成分对伤口闭合的功效。测试物质为安慰剂(第l组)、1。/。Sl软膏(第2组)、0.25。/。PA-W4软膏(第3组)、DCB-WH1-W(第4组)和1。/。PA-W4软膏(第5组)。伤口闭合动物实验是根据实例5进行。在用测试物质治疗后的第0天、第4天、第9天、第11天和第13天，测量所有实验组的伤口面积且计算伤口闭合百分比和CT5Q。结果展示于图4和表3中。实验组的伤口闭合百分比的成对比较的P值展示于表4中。表3经安慰剂、1%Sl软膏、0.25%PA-W4软膏、DCB-WH1-W和1%PA-W4软膏治疗的实验组的伤口闭合百分比和CTS()<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4实验组的伤口闭合百分比的成对比较的P值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在第4天，第4和第5组的伤口闭合百分比显著高于第1和第2组的伤口闭合百分比(PO.Ol)。在第9天，第4和第5组的伤口闭合百分比显著高于第1组(P<0.001)、第2组(P<0.01)和第3组(PO.05)的伤口闭合百分比，且第3组的伤口闭合百分比也显著高于第1组的伤口闭合百分比(P<0.05)。在第11天，第3、第4和第5组的伤口闭合百分比显著高于第2组的伤口闭合百分比(P<0.01),且第4和第5组的伤口闭合百分比显著高于第3组的伤口闭合百分比(P<0.05)。在第13天，第4和第5组的伤口闭合百分比显著高于第1组(PO.Ol)和第2组(P<0.05)的伤口闭合百分比'且第5组的伤口闭合百分比显著高于第3组的伤口闭合百分比(P<0.05)。在第4天、第9天、第11天和第13天，第4与第5组之间无显著差异。第1至第5组的CTso分别为11.7天、10.6天、9.9天、8.25天禾B8.25天。总的来说，包含1%PA-W4的软膏(1%PA-W4软膏)对伤口闭合的功效与DCB-WH1-W(1%S1+0.25%PA-W4)软膏的功效相等。本发明的1%PA-W4和DCB-WH1-W软膏具有优于软膏基质、1%S1软膏和0.25。/。PA-W4软膏的功效。权利要求1.一种制备左手香(Plectranthusamboinicus)提取物的方法，其包含以下步骤a)将经干燥的左手香叶与叶提取溶剂接触以获得左手香粗提取物；b)浓缩所述左手香粗提取物；和c)使用搅拌方法处理所述经浓缩的左手香粗提取物以分离获得左手香提取物。2.根据权利要求l所述的方法，其中所述的叶提取溶剂包含水或醇类。3.根据权利要求1所述的方法，其中使用一搅拌分离方法分离所述经浓縮的左手香粗提取物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述搅拌分离方法包含以下步骤-(a)用高极性溶剂稀释所述经浓縮的叶提取物；(b)将所述经稀释的叶提取物与吸附树脂混合；(c)将所述吸附树脂与经稀释的叶提取物搅拌；(d)移除液体部分后，用所述的高极性溶剂提取所述树脂且收集第一提取物；(e)用次高极性溶剂提取所述树脂且收集第二提取物；(f)用中等极性溶剂提取所述树脂且收集第三提取物；和(g)用低极性溶剂提取所述树脂且收集第四提取物。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的高极性溶剂包含水、甲醇、乙醇、或其混合物。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述的次高极性溶剂具有一比所述的高极性溶剂低的极性。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述的中等极性溶剂具有一比所述的次高极性溶剂低的极性。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述的低极性溶剂具有一比所述的中等极性溶剂低的极性。9.一种通过根据权利要求4所述的方法制备的左手香提取物，其含有一种或一种以上选自第一提取物、第二提取物、第三提取物和第四提取物的提取物。10.根据权利要求9所述的左手香提取物，其为所述第四提取物且具有以下滞留时间的HPLC峰<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>11.一种左手香粗提取物，其是通过根据权利要求1所述的方法的步骤a)和/或b)制备的。12.—种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求9或10所述的左手香提取物和视情况的医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。13.根据权利要求12所述的医药组合物，其进一步包含治疗有效量的积雪草(Ce"^/acm'a"caUrban)提取物。14.根据权利要求13所述的医药组合物，其中所述左手香提取物与所述积雪草提取物之间的重量比为约1:60至约1:4。15.—种医药组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求11所述的左手香粗提取物和视情况的医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。16.根据权利要求15所述的医药组合物，其进一步包含治疗有效量的积雪草提取物。17.—种伤口敷料，其包含根据权利要求12至16中任一权利要求所述的医药组合物。18.—种根据权利要求12至16中任一权利要求所述的医药组合物的用途，其是用于制造供治疗皮肤病症用的药物。19.根据权利要求18所述的用途，其中所述皮肤病症为一般外伤或褥疮。20.根据权利要求18所述的用途，其中所述皮肤病症为糖尿病患者的伤口。全文摘要本发明提供一种使用搅拌分离方法制备左手香(Plectranthusamboinicus)提取物的方法。本发明也涉及一种包含左手香粗提取物和/或提取物的医药组合物，其用于治疗皮肤病症，包括促进尤其是糖尿病患者的伤口愈合。文档编号A61K127/00GK101375933SQ200710188280公开日2009年3月4日申请日期2007年11月30日优先权日2007年8月29日发明者司玛莉,吴玉园,吴瑞钰,萧景文,锺玉山申请人:财团法人生物技术开发中心