专利名称：：用于刺激免疫系统的牛奶低聚糖的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于刺激免疫系统的方法和营养组合物，所述免疫系统尤其指诸如婴儿之类的对象所具有的弱免疫系统。
背景技术：
：有效的免疫系统对健康具有重要意义。由于例如疾病而具有弱免疫系统的对象、或其免疫系统正处于发育之中的对象(例如婴儿)可极大得益于能够刺激免疫系统的组合物。在专利WO2005039597中描述了增强哺乳动物体内免疫系统的方法、以及对哺乳动物体内与免疫系统有关疾病的治疗和/或预防，所述哺乳动物尤其指婴儿，且该方法包括服用酸性低聚糖和中性低聚糖。在专利EP1242436中描述了基于由一种或几种动物奶得到的低聚糖的低聚糖混合物，且该低聚糖混合物由两个或更多个单糖单位组成，其中中性低聚糖与酸性低聚糖的比例为90-60。就其阳性特性、尤其是其抗感染活性而言，所述低聚糖混合物接近人乳。发明概述人们惊奇地发现，从羊奶中分离出来的低聚糖可强烈地剌激免疫系统，因此可有利地用于治疗和/或预防与免疫系统有关的疾病。刺激免疫系统对于免疫系统弱或发育不全的对象尤其有用，特别是婴儿、老人和医患人员。因此，本发明对于剌激这些对象的免疫系统和保证其健康、以及治疗和/或预防与免疫系统有关的疾病尤其有用。人们更进一步认识到，可使用具有有限链长的多种低聚糖(即DP2、3、4和/或5)适当剌激免疫系统。本发明也提供了具有特定含量小链低聚糖的营养组合物。本发明另一方面发现，由羊奶低聚糖刺激免疫系统可推动营养组合物制剂的研制，且可使具有弱的和/或发育不全的免疫系统的对象有利地服用该制剂。本组合物有利地包含免疫刺激性羊奶低聚糖，且可通过包含长链多不饱和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacid,LCPUFA)得到进一步改良，并可选择性地与核苷组合、以及/或使用附加低聚糖增强。成分组合具有重要的免疫刺激和免疫平衡效应，由此尤其希望将其用于例如营养品中。与羊奶低聚糖组合的LCPUFA更有效，可协同剌激肠上皮屏障的成熟，且/或互补改善服用这类混合物的病人的细胞因子概况。特别地，服用与诸如二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)之类的omega-3脂肪酸组合的本羊奶低聚糖会造成前列腺素E2代谢物(PGE2)产量的下降。PGE2可调节免疫反应的强度和持续时间。低聚糖与LCPUFA的本组合可获得改良的免疫反应。在另一优选实施例中，本组合物还包含核苷，该核苷除上述作用外、还能刺激白血球。特别优选的是，本羊奶低聚糖包含不同低聚糖的混合物。本发明人认为，不同低聚糖对免疫刺激效应作出重要贡献。然而，羊奶低聚糖是相对较贵的成分；在一优选实施例中，通过添加可由植物材料化学合成和/或分离得到的低聚糖、且优选为低聚半乳糖，可增加低聚糖的量和种类。另一方面，本发明也提供了用于通过免疫剌激作用分离低聚糖的方法，所述方法包括使用膜超滤法，其截留分子量在1至30kDa之间。具体实施例方式本发明使用羊奶低聚糖制造一种组合物，该组合物可用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关的疾病。在另一实施例中，本发明提供了用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关疾病的方法，所述方法包括服用羊奶低聚糖。另一方面，本发明提供了一种营养组合物，该营养组合物包含i)选自大豆蛋白质、豌豆蛋白质和牛奶蛋白质的蛋白质源；ii)长链多不饱和脂肪酸；以及iii)羊奶低聚糖。又一方面，本发明提供一种营养组合物，该营养组合物包含i)选自大豆蛋白质、豌豆蛋白质和牛奶蛋白质的蛋白质源；ii)长链多不饱和脂肪酸；以及iii)至少一种选自3-唾液酰-乳糖和6-唾液酰-乳糖的低聚糖，且其中至少75%(重量百分比)的总低聚糖的聚合度为2、3、4或5。在另一实施例中，本发明涉及使用上述营养组合物之一制造一种药品，该药品可用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关的疾病。在另一实施例中，本发明提供了用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关疾病的方法，所述方法包括服用上述营养组合物之一。又一方面，本发明提供了用于制造包含动物奶低聚糖的营养组合物的工艺，该工艺包括以下步骤a.在超滤步骤中对羊奶或一定分数的羊奶进行处理，其中超滤膜的截留分子量在1至30kDa之间；b.使用渗透法制造营养组合物，该营养组合物包括大豆蛋白质、豌豆蛋白质或牛奶蛋白质。靡本发明涉及适用于刺激和/或支持免疫系统的组合物。该组合物对于具有弱免疫系统的对象尤其有利，例如婴儿、老人、病人和/或医患人员。年龄高至约4岁的婴儿可有利地使用本组合物。本组合物及其用途尤其适用于年龄高至约2岁的婴儿，这是因为可与LC-PUFA和核苷选择性组合的低聚糖可被改良得接近人乳。丰細覆薪在本发明中使用的"羊奶低聚糖"是从羊奶中分离出来的低聚糖。该低聚糖典型地包含2-50个单糖单位，优选为2-10个单糖单位。可采用Lara-Villoslada等人在期刊ClinNutrition中描述的方法、分离出一定分数的低聚糖；该文章可在2006年1月10日的在线期刊中查询到。羊低聚糖不能被人类的上消化道吸收，且优选可在下肠道内起到益生成分的作用。半乳糖、葡萄糖和乳糖是可消化的。用于本组合物和方法的羊低聚糖优选为相对纯，且其他羊奶成分的含量低，尤其是羊奶蛋白质的含量低。本组合物优选包含i)牛奶蛋白质/羊奶蛋白质的重量比高于1，优选高于2，更优选高于5。羊奶蛋白质:羊奶低聚糖的重量比优选低于2，更优选低于1，最优选低于0.5。本羊奶低聚糖优选为由不同低聚糖构成的混合物，更优选为由至少3种不同低聚糖构成的混合物，又更优选为由至少5种不同低聚糖构成的混合物，最优选为由至少6种不同低聚糖构成的混合物。低聚糖种类的不同被认为对免疫刺激效应作出主要贡献。包含羊奶低聚糖的本组合物优选包含至少三种低聚糖，这三种低聚糖选自N-乙酰-葡糖-乳糖、半乳糖-乳糖、N-乙酰基神经酰氨基-乳糖、3-唾液酰-乳糖和6-唾液酰-乳糖。具有相对低分子量的羊奶低聚糖被认为是最有效的。因此，本组合物优选基于低聚糖的总重包含至少50%(重量百分比)、聚合度为2至6(即2、3、4、5和/或6)的低聚糖，更优选至少75%(重量百分比)，最优选至少80%(重量百分比)。本组合物优选基于低聚糖的总重包含至少10%(重量百分比)的、选自3-唾液酰-乳糖和6-唾液酰-乳糖的低聚糖，更优选至少75%(重量百分比)，最优选至少80%(重量百分比)。可适当使用羊低聚糖，这一发现使人们认识到短链低聚糖的混合物尤其适用于刺激免疫系统，尤其当与LCPUFA组合后。因此，一方面，本发明提供了具有低聚糖的组合物，其中低聚糖包含至少一种选自3-唾液酰-乳糖和6-唾液酰-乳糖的低聚糖，且其中至少75%(重量百分比)的总低聚糖的聚合度为2、3、4、5或6。这一组合物也可适用于本方法，用于剌激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫系统有关的疾病。与棘系一统絲游疾谅人们已发现，服用羊奶低聚糖可刺激免疫系统。术语"刺激免疫系统"也可表述为"支持免疫系统"、"平衡免疫系统"或相似用辞。因此，本发明提供了用于治疗和/或预防与免疫系统有关疾病的方法，所述方法包括给哺乳动物(优选为人类)服用包含有效治疗量羊奶低聚糖的组合物。可被有利地治疗和/或预防的与免疫系统有关的疾病包括自身免疫性疾病、遗传或条件诱导性免疫缺陷和过敏症。可被适当治疗的自身免疫性疾病包括胰岛素抗性糖尿病、IDDM(insulindependentdiabetesmellitus，胰岛素依赖性糖尿病)、风湿性关节炎、多发性硬化症、牛皮癣、硬皮病、克罗恩病、IBD(inflammatoryboweldisease,炎性肠道疾病)、神经病，优选为胰岛素抗性糖尿病(2型糖尿病)。可被适当治疗和/或预防的遗传或条件诱导性免疫缺陷包括免疫衰老、自闭症、由慢性病引起的营养不良，例如癌、COPD(chronicobstructivepulmonarydisease,慢性阻塞性月巿病)、AIDS(acquiredimmunodeficiencysyndrome，获得性免疫缺陷综合症，爱滋病)、关节炎、糖尿病、食欲减退、恶疾、dysphagea、肾衰竭、辐射。病人在受到社会压力、呼吸道感染、慢性感染或香烟污染、空气污染、辐射、化学疗法之后，会身患慢性溃疡，应接受更细致的应激。可采用本方法最有利地治疗和/或预防的与免疫系统有关的疾病包括过敏症、湿疹和/或哮喘。由于多种低聚糖对本组合物的免疫剌激效应起作用，本组合物优选包含附加低聚糖，这些低聚糖不是从羊奶中分离出来的。附加低聚糖优选在人类的上肠道内不被消化。这些附加低聚糖的聚合度(degreeofpolymerisation,DP)优选低于100，再优选低于40，更优选低于20，又更优选低于10，最优选低于5。这些低聚糖的DP至少为2。附加低聚糖在人类的上消化道内也不被消化。附加低聚糖优选选自FOS寡果糖、低聚半乳糖(包括transgalactooligo糖类)、多果糖(包括菊粉)、岩藻糖化寡糖、以及半乳糖醛酸基低聚糖(即低聚糖基于总糖单位包含至少50%的半乳糖醛酸)。每天服用的低聚糖总量优选在10mg至100g之间，再优选在100mg至50g之间，更优选在500mg至20g之间。多稀/〃微麼本低聚糖优选与长链多不饱和脂肪酸(longchainpolyunsaturatedfattyacid,LCPUFA)组合。LCPUFA通过调节类十二垸酸的合成和/或降低前列腺素E2代谢物(PGE2)，增强了本低聚糖的免疫刺激效应。本组合物也优选旨在提供营养，因此也优选包含饱和脂肪和单不饱和脂肪。优选以甘油三酸酯和/或磷脂形式提供LCPUFA。本组合物中具有20至22个碳原子的LC-PUFA的含量优选不超过总脂肪含量的20%(重量百分比)，再优选不超过15%(重量百分比)，更优选不超过5%(重量百分比)。本组合物中具有20至22个碳原子的LC-PUPA的含量优选至少为总脂肪含量的0.1°/。(重量百分比)，再优选至少为0.25%(重量百分比)，更优选至少为0.5%(重量百分比)，又更优选至少为0.75%(重量百分比)。二十碳五烯酸(EPA,n-3)、二十二碳六烯酸(DHA，n-3)、花生四烯酸(ARA，n-6)和/或n-3二十二碳五烯酸(DPA)可被有利地包括在本组合物中，且优选为EPA和DHA。EPA的含量优选不超过总脂肪的15%(重量百分比)，更优选不超过1%(重量百分比)，但优选至少为总脂肪的0.05%(重量百分比)，更优选至少为0.1%(重量百分比)。DHA的含量优选不超过15%(重量百分比)，更优选不超过1%(重量百分比)，但至少为总脂肪的0.1%(重量百分比)。本组合物中基于总脂肪的ARA的含量优选至少为0.1%(重量百分比)，更优选至少为0.25%(重量百分比)，最优选至少为0.5%(重量百分比)。ARA的含量优选不超过总脂肪的5%(重量百分比)，更优选不超过1%(重量百分比)。在含有ARA的肠道组合物中，有利地添加EPA和DHA，以平衡ARA的作用，例如降低ARA代谢物的潜在催炎作用。来自ARA的过量代谢物可引起炎症。因此，本组合物优选包含ARA、EPA和DHA，其中重量比ARA/DHA优选高于0.25，再优选高于0.5，更优选高于1。该比例优选低于25。重量比ARA/EPA优选在1至100之间，更优选在5至20之间。本组合物基于总脂肪的多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUPA)的含量优选在5%至75%(重量百分比)之间，更优选在10%至50%(重量百分比)之间。如果本组合物被用作婴儿配方(例如一种婴儿喂养方法，所述方法包括使婴儿服用本组合物)，由于人们希望本组合物尽可能接近人乳，因此LC-PUFA的含量、尤其是具有20至22个碳原子的LC-PUFA的含量、优选不超过总脂肪含量的3%(重量百分比)。基于相同原因，omega-3LC-PUFA的含量优选不超过总脂肪含量的1%(重量百分比)，omega-6LC-PUFA的含量优选不超过总脂肪含量的2%(重量百分比)，ARA(omega-6)的含量优选低于总脂肪含量的1%(重量百分比)、和/或重量比EPA/DHA优选为1或低于l，更优选低于0.5。具有20至22个碳原子的LC-PUFA可以以游离脂肪酸、甘油三酸酯、磷脂、或由其中两种或多种物质构成的混合物形式被提供。本组合物优选以磷脂形式包含至少ARA和DHA之一。本营养组合物也优选提供omega-9(n-9)脂肪酸(优选为油酸，18:1)，以提供充足的营养。本组合物基于总脂肪酸的重量、优选提供至少15%(重量百分比)的n-9脂肪酸，更优选至少为25%(重量百分比)。n-9脂肪酸的含量优选低于80%(重量百分比)。滞本组合物优选包含选自以下物质的核苷成分核酸、核酸衍生物、核苷、聚磷酸核苷、多核苷酸、苷酸、核糖、脱羟核糖和双核苷聚磷酸盐(NpxN)。核苷成分与本低聚糖可协同作用，进一歩刺激免疫系统。核酸典型地包括杂环嘧啶基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿苷及其衍生物，例如假尿苷、dihyderouridine、胸腺嘧啶核糖核苷、4-硫代尿苷、3-甲基胞苷、N-乙酰胞嘧啶核苷、赖西丁、以及嘌呤基腺嘌呤和鸟苷及其衍生物，例如1-甲基腺苷、N6-异戊烯腺苷、肌苷、N7-甲基鸟苷、N2-二甲基鸟苷和Y核苷。诸如N-糖苷之类的核苷包括嘧啶或嘌呤基复合糖。优选的核苷为苷酸磷酸酯，是以寡核苷酸或多核苷酸的形式存在的单体或聚合物。对于这一应用，适当的原料尤其包括由动物奶、动物和植物组织、酵母、双歧杆菌和乳酸菌、以及合成分子衍生的去氧核糖酸和核糖核酸的水解产物、t-核糖核酸、以及核糖体。(S/oc/ze/w'W/^Z)。waWKe/1Jw(i她GJo/w优选地，本组合物包含至少一种、优选至少两种、更优选至少三种核苷，这些核苷选自胞苷酸(CMP)、一磷酸鸟苷(GMP)、一磷酸腺苷(AMP)、尿苷酸(UMP)、以及次黄嘌呤核苷酸(IMP)。在另一优选实施例中，本组合物包含作为核苷成分的核糖，该核糖优选为D-核糖。D(-)核糖是戊糖，可购买到其结晶产品。核糖是核酸的主要成分。本组合物基于产品干重的核糖含量优选在0.01%至50%(重量百分比)之间，更优选在0.05%至10%(重量百分比)之间，又更优选在0.5%至10%(重量百分比)之间。本组合物优选包含5至100mg的核苷，以及/或本组合物每100克干重优选包含5至100mg的核苷，更优选在5至50mg之间。會y^人们发现，本低聚糖可被有利地应用在食品中，例如婴幼儿食品和临床食品。本发现尤其适用于婴儿营养，这是因为可与LCPUFA和核苷选择性组合的低聚糖可被最优化为接近人乳的配方。这类食品优选包含脂质、蛋白质和碳水化合物，且优选以流质形式服用。本组合物优选包含5-25en%的蛋白质、30-60en%的碳水化合物、以及30-60en%的脂肪(en%是能量百分比的縮写，表示每种成分对制剂总热值的相对贡献)。如果本组合物以流质形式存在，且粘度足够低，它即可被用作婴幼儿食品和流质临床食品，且可通过使用管子或吸管被食用。在一优选实施例中，本组合物的粘度低于600mPa，优选低于250mPa，更优选低于50mPa，最优选低于25mPa，且在20°C时的剪切速率为100s—1。每当在本文件中使用术语"粘度"，这即是指依照下列方法确定的物理参数可使用Carri-MedCSL流变仪确定粘度；所用几何体呈锥形(6cm、2度丙烯酸酯材质的圆锥体)，且平板与几何体之间的间隙被设定为55)am;采用在20秒内0至150s"的线性连续斜坡剪切速率。大便不规律(例如大便硬、大便量不够、腹泻)是许多婴幼儿以及接受流质食品的生病对象的主要问题。人们发现，可通过在流质食品中添加本低聚糖减少大便问题，且该流质食品的同渗重摩在50至500mOsm/kg之间，更优选在100至400mOsm/kg之间。鉴于上文所述，同样重要的是，流质食品虽不具有过量的热量密度，然而仍能为对象提供充足的卡路里。因此，流质食品的热量密度优选在0.1至2.5kcal/ml之间，更优选在0.5至1.5kcal/ml之间。使用优选与最优热量密度组合的最优同渗重摩、可增强本低聚糖的免疫刺激效应，且可选择性地与LCPUFA组合。使用良好的热量密度和同渗重摩可确保肠道健康，而不会出现腹泻和其他机能障碍，从而使低聚糖起到免疫刺激剂的作用。举例例1:羊低聚糖的免疫刺激效应实麥絲包含羊奶低聚糖饮食的效应测试是对迟发型超敏(delayed-typehypersensitivity,DTH)反应进行测试，迟发型超敏反应是Thl免疫反应参数，可通过测量动物模型在受到局部抗原攻击之后耳肿胀的增加确定。羊低聚糖可通过以下方法获得将Ewe乳清粉(Lactalis，法国)以20%干物质的比例溶解在自来水中。使用截留分子量(molecularweightcutoff,MWCO)为20000D(例如DSSFF-UF-GR20PP缠绕式膜)的膜对Ewe乳清溶液超滤，以除去乳清蛋白质。超滤法渗透是指采用纳滤法(例如DSS至FF-NF-GR缠绕式膜)除去盐。采用纳滤浓缩工艺将干重含量为35-40%的低聚糖蒸发，直到出现乳糖结晶。过滤除去该乳糖结晶。该滤液包含低聚糖(总固体的10-20%)。对6周大的老C57B1/6老鼠(HarlanNederlandBV，Horst，荷兰)的饮食进行测试，该饮食基于饮食总重量、包含1%(重量百分比)的羊低聚糖。控制饮食，并测试包含等量乳糖的饮食。给鼠接种疫苗是在该鼠改变新居和饮食两至四周之后开始的。在第0天，在接种疫苗之前采集血样。在第1天，在皮下首次接种疫苗。在三周之后，采集血样(第21天)，并进行加强接种(第22天)。在进行加强注射后的第九天(第31天)，采用Digimatic外径千分尺(Mitutoyo，Veenendaal，荷兰)测量基本耳厚，并通过在老鼠耳廓内注射抗原溶液i.e.(皮内)诱发迟发型超敏(DTH)反应。在其后的24小时(第32天)测量DTH反应。对于DTH反应，作为一种DTH激发手段，在老鼠的两耳中注射25pi渗析Influvac。丽厳丰雄覆麟碧菜从统计上看，羊奶低聚糖剂量为1%(重量百分比)的饮食促使DTH反应显著增加(见表1)。所观察到的效应显示出羊奶低聚糖在本方法和组合物中的有利用途。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*显示出与控制情形时的显著差异(P<0.01)例2:使用羊低聚糖的婴儿营养AptamilHAl(Milupa，德国)包含50mg羊奶/100kcal低聚糖(根据例1制备)。AptamilHAl固有地包含以下物质低聚半乳糖、FOS寡果糖(RaftilinHP,Orafti)、0.35g花生四烯酸/100g脂肪、以及0.20g二十二碳六烯酸/100g脂肪。权利要求1.羊奶低聚糖在制备用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关的疾病的组合物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于使具有弱免疫系统的对象服用所述组合物，该对象包括婴儿、老人和医患人员。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述组合物包含由至少三种不同的低聚糖构成的混合物。4.根据权利要求1-3中的任何一项所述的应用，其特征在于所述组合物可用于治疗和/或预防过敏症、哮喘、特应性湿疹和/或过敏性鼻炎。5.营养组合物，包含i)选自大豆蛋白质、豌豆蛋白质和牛奶蛋白质的蛋白质源；ii)长链多不饱和脂肪酸；以及iii)羊奶低聚糖。6.营养组合物，包含i)选自大豆蛋白质、豌豆蛋白质和牛奶蛋白质的蛋白质源；ii)长链多不饱和脂肪酸；以及iii)低聚糖混合物，且该低聚糖中至少有一种选自3-唾液酰-乳糖和6-唾液酰-乳糖；其中至少75%(重量百分比)的所述总低聚糖的聚合度为2、3、4或5。7.根据权利要求5或6所述的营养组合物，其特征在于所述牛奶蛋白质选自乳清、干酪素、水解乳清和水解干酪素。8.根据权利要求5-7所述的营养组合物，其特征在于每100kcal所述营养组合物包含5mg至10克羊低聚糖。9.根据权利要求5-8所述的营养组合物，其特征在于所述营养组合物进一步包含附加低聚糖，该附加低聚糖选自FOS寡果糖、低聚半乳糖、多果糖，岩藻糖化低聚糖、以及半乳糖醛酸基低聚糖。10.权利要求5-9中的任何一项所述的营养组合物在制备用于刺激免疫系统、以及/或治疗和/或预防与免疫有关的疾病的药物中的应用。11.一种用于制造包含动物奶低聚糖的营养组合物的工艺，该工艺包括以下步骤a.在超滤步骤中对羊奶或一定分数的羊奶进行处理，其中超滤膜的截留分子量在1至30kDa之间；b.使用渗透法制造营养组合物，该营养组合物包括大豆蛋白质、豌豆蛋白质或牛奶蛋白质。12.根据权利要求11所述的工艺，其特征在于所述营养组合物为婴儿配方。13.根据权利要求11或12所述的工艺，其特征在于所述营养组合物还包含长链多不饱和脂肪酸。全文摘要本发明涉及用于刺激免疫系统的方法和营养组合物，尤其涉及诸如婴儿之类具有弱免疫系统的对象的免疫系统。所述方法包括服用包含羊奶和/或短链低聚糖的组合物。文档编号A61K35/20GK101415408SQ200780011664公开日2009年4月22日申请日期2007年3月21日优先权日2006年3月30日发明者劳拉·马拉贝特,安东尼·范·巴伦,托马斯·休伯图斯·马蒂诺斯·斯诺伊仁,贝恩德·施塔尔,阿尔简·保罗·沃斯申请人:荷兰纽迪希亚公司