专利名称：：摩尔比为1:100至1:350的阿洛夫定和齐多夫定的组合的制作方法
技术领域：
：本发明涉及HIV的治疗方法和药物组合物，其中以指定比例给药以已知的HIV抗病毒剂阿洛夫定(alovudine)和齐多夫定(zidovudine),所述给药任选地与其他的抗病毒剂联合进行。
背景技术：
：齐多夫定，又名AZT或2，3，-双脱氧-3，-叠氮-胸苷，是注册用于治疗HIV的第一个核普类似物。齐多夫定抑制了病毒编码逆转录酶，因此阻断了病毒的复制循环并且有效地减慢了AIDS的发展。当首先作为长效单剂治疗引入并用于处方中时，齐多夫定会引起多种组织病变，其特征为线粒体机能障碍，包括骨骼肌肌病、扩张性心肌炎和肝中毒。虽然仍然与其他HIV抗病毒剂一起广泛地使用，但是其毒性问题，尤其是血液毒性问题，以及产生耐受性问题限制了齐多夫定的临床应用。目前的给药状态是每日两剂，一般为300mgBID(即，每日成人的剂量为600mg，早晚以单独的300mg片剂服用)。即寸吏是耳关合的单位剂型例如Combivir(齐多夫定加4立米夫定)或Trizivir(齐多夫定加拉米夫定加阿巴卡韦)也必须采用BID。从患者适应性的角度考虑，这不是一种在最恰当时间的方便的剂量方案。但是由于许多需要服用齐多夫定的患者还被要求服用其他HIV抗病毒药物，例如蛋白酶抑制剂和/或非核苷抑制剂或者症状性药物例如抗真菌剂、抗CMV抗病毒剂、抗精神病剂或免疫刺激剂，因此情况对于HIV患者来说更加糟糕。这些另外的药物的服用周期通常与齐多夫定的不同(QD、TID等)，导致服药方式非常复杂，难以适应。例如，严重的HIV患者服药负担每天超过15-20片的情况并不罕见，他们需要在一天中的多个时间点服药，一些在餐前一些在餐后，在每个时间点服药的数目也有变化。对于容易出现耐药突变株的HIV来说，缺乏对剂量方案的适应性是非常重要的，其中所述突变株的出现是由于对HIV复制机制能力的错误校对而产生的。如果HIV药物的血清内水平和三磷酸核苷的胞内4水平降低到某一限度以下时，耐药突变林的选择和繁殖会剧烈加速。如果没有严格地执行规定的剂量方案，这种情况下会在HIV患者中迅速发生。阿洛夫定(又名FLT或2，,3，-双脱氧-3，-氟胸苷)是一种在二十世纪九十年代早期进行临床开发的潜在HIV抗病毒剂。它的开发在在病毒感染患者中观察到剂量依赖性血液毒性之后终止。基于细胞培养实验，Su油eth等人，J齒^ra"gC/2譜o/7er199640(2):331-335发现该血液毒性是DNA断裂和细胞程序死亡所导致的。然而，近来的研究显示阿洛夫定的毒性是由于对线粒体DNA合成的抑制而产生的。在阿洛夫定原始开发终止之前登记的国际专利申请WO91/01137,描述了联合使用3，-氟化抗病毒剂例如FLT(现在称为INN阿洛夫定)和某些2',3，-双脱氧核苷酸包括AZT(现在称为INN齐多夫定)的协同抗病毒效果。该专利申请在体外和动物实-验中例举了AZT:FLT的比例为1:1和8:1的组合。该专利申请清楚地表明优选FLT和AZT以基本上相等的量进行给药。例如专利申请的第5页第16行显示，给出协同效果的FLT与AZT优选范围是10:1到1:20,其最佳范围是1:1到1:10的FLT:AZT。WO91/01137中的表1表明，1:1比例的FLT:AZT相对于1:8比例的FLT:AZT具有更优越的通过免疫荧光实验测量的治疗指数，IC5。/IC5()，并且具有相当的通过ELISA测量的治疗指数。国际专利申请WO2004/002433描述了阿洛夫定和另一种名称为阿巴卡韦的NRTI组成的替代组合物。其在减少病毒方面的协同作用活性在HIV感染患者的临床实验中得到了确认，其中的患者除了原来的反转病毒疗法治疗以外还需要另外服用7.5mgQD的阿洛夫定。该研究设计以及全部的结果在Katlama等人，爿/AS200418(9):1299-1304中有所描述。尤其应当注意的是其中排除了已经采用齐多夫定进行了治疗的患者，因为感觉阿洛夫定和齐多夫定非常类似的结构能够产生另外的血液毒性。阿巴卡韦一般是通过300mgBID或600mgQD进行给药的。这相当于阿洛夫定比阿巴卡韦的摩尔比为1:70。在专利说明书中协同抗病毒作用在摩尔比为1:200的细胞培养中得到了证实。然而，既没有测量到组合物的细胞毒性，也没有测量到线粒体毒性。在其中的对比实施例中，摩尔比介于这些值之间的阿洛夫定阿巴卡韦不能够逆转阿洛夫定的线粒体毒性。核苷逆转录酶抑制剂的相互作用，尤其是线粒体毒性，是一种复杂并且缺乏了解的现象。在Vidal等人，爿w",cra6jgC/zemoAer200650(11):3824-3832报告的非常全面的系列研究中，NRTI替诺福韦显示出明显提高的2',3，-双脱氧肌苷(ddl)线粒体毒性(通过mtDNA贫化测定)。在3uM2，，3，-双脱氧肌苷:30uM替诺福韦的剂量下(即，1:10的摩尔基数)，mtDNA的减少大约为80%,在较高摩尔比下的为>90%。相反，当在3、40和200uM齐多夫定比30um替诺福韦下(即1:10、1:1左右和6.5:1左右)测试时，替诺福韦没有影响齐多夫定的线粒体毒性。发明概述现在我们发现，以完全超出现有技术的特定比例范围对阿洛夫定和齐多夫定进行联合给药，产生了出乎意料的降低线粒体毒性的相互作用，同时保持了阿洛夫定和齐多夫定的协同抗病毒效力。根据本发明的第一方面，提供了一种治疗或预防HIV的方法，其包括以1:100到l:350的摩尔比范围对阿洛夫定和齐多夫定进行同时或顺续的给药。适宜地，所述方法包括向有需要的对象给予安全且有效量的阿洛夫定和齐多夫定，从而治疗或预防HIV。本发明的一个相关方面提供了阿洛夫定和齐多夫定在制造同时或顺续给药的药物中的用途，借此所述药物适于以阿洛夫定与齐多夫定的比例为1:100到1:350的剂量进行定量给药。一个相关的方面，提供了同时或顺续给药的阿洛夫定和齐多夫定在治疗或预防HIV中的用途。本发明的第二方面提供了适于在所述方法中使用的药物组合物，该组合物以1:100到1:350的摩尔比范围包含阿洛夫定和齐多夫定。相应地，本发明还提供了药盒组件，其包括含有阿洛夫定的药物组合物和含有齐多夫定的药物组合物，其特征在于阿洛夫定和齐多夫定以1:100到1:350的摩尔比范围存在于药盒中。适宜地，所述药盒组件还另外包括指导同时或顺续地给药以用于治疗或预防HIV的包含阿洛夫定药物组合物和包含齐多夫定药物组合物的说明书。本发明的组合物缓解了现有技术中采用齐多夫定和阿洛夫定治疗的缺点，齐多夫定/阿洛夫定的组合明显地降低了线粒体毒性并且因此6改善了安全性，提高了患者的适应性，改善了日常浓度水平的一致性并且减少了耐药突变林的产生。虽然不希望受到理论的束縳，但是我们的原始数据提出了在阿洛夫定和齐多夫定之间采用特征比例能够使齐多夫定干扰线粒体转运机制，从而防止了活性代谢物阿洛夫定三磷酸酯受到特别敏感的线粒体DNA聚合酶的不利影响。以前，该有益效果在现有技术中的AZT/FLT组合物中并没有发现，因为现有技术的组合物是以由基本上等摩尔量的两种核苷所引起的细胞毒性和线粒体DNA的减少为特征的。与现有技术中WO91/01137中的组合物相反，其中该专利是在0.1到1mg/kg/天的阿洛夫定剂量结合1-10mg/kg/天的齐多夫定剂量的基础上进行判断的，本发明提出了使0.005到0.05mg/kg/天左右的阿洛夫定剂量结合l-10mg/kg/天相应的阿洛夫定剂量。最近的临床研究提出。WO91/01137中优选的1:10的比例，所述比例是以齐多夫定的有效剂量为基础计的，产生了毒性水平的阿洛夫定和/或齐多夫定。方便地，本发明的组合物和方法使用1:150到l:250比例范围内的，例如1:150到1:200范围内的阿洛夫定和齐多夫定。对于70kg的成人来说，阿洛夫定的一般最大日常剂量为4mg/天左右。因此，根据本发明方法的剂量方案通常包括每天2-4mg的阿洛夫定剂量和每天300-900mg的齐多夫定剂量。特别优选的成人剂量方案包括2-3mg/天，例如2mg和2.5mg每天的日常阿洛夫定剂量。目前优选的成人剂量方案具有450-600mg范围内的，尤其是600mg的每日齐多夫定剂量。2.5mg阿洛夫定和600mg齐多夫定的每日剂量相当于1:218的摩尔比，其中使用244作为阿洛夫定的分子量，使用269作为齐多夫定的分子量。在定义比例范围内的阿洛夫定和齐多夫定的联合给药可以顺序或基本上顺序地发生，例如当阿洛夫定和齐多夫定是在单独的剂量单元中各自给药的时，其一般为胶嚢和片剂或者它们中的一种。齐多夫定一4殳的给药方式是BID,例如300mgBID。然而，通常优选的阿洛夫定给药方式是QD,所以本发明的一种方便的顺续给药方式包括早晨给予300mg齐多夫定片剂和2、3或4mg阿洛夫定片剂，并且晚上给予300mg齐多夫定(反之亦然)。为了简化服药方案，一种代替性的但是目前较少采用的方案包括给药以300mg齐多夫定片剂或胶囊和l、1.5或2mg含有阿洛夫定的片剂或胶嚢，早晚一起或紧接着连续吞服。顺序给药剂型例如前段所描述的那些剂型可以以单独的包装存在，例如各自包含泡罩包装的齐多夫定片剂或泡罩包装的阿洛夫定片剂的单独的纸盒。其他的例子可以包括装有齐多夫定和阿洛夫定的胶嚢或片剂的单独药瓶。通常至少一个药瓶或纸盒会包括包装说明书或其他的印刷说明书，其建议阿洛夫定应当以1:100到1:350的特征比例与齐多夫定共同给药。然而，方便地，通常的纸盒同时包括含有阿洛夫定的泡罩板和含有齐多夫定的泡罩板。在优选的顺序给药剂型中，独立的阿洛夫定和齐多夫定片剂或胶嚢是以下述的空间排布存在于同一泡罩板上的，所述空间排布能够提供各组分正确剂量的视觉刺激。例如，如果阿洛夫定的计划剂量为2、3或4mgQD,齐多夫定的剂量为300mgBID,则泡罩板可以设置成一行阿洛夫定片剂平行于两行各自具有相同数目齐多夫定的片剂。因此，患者能够很容易地确定在给定的给药时机是应当同时服用阿洛夫定和齐多夫定还是仅服用齐多夫定。泡罩板上单独的泡罩可以标记有标记，例如一周中的笫几天，从而获得进一步的支持顺从性。然而，优选地，阿洛夫定和齐多夫定存在于一个常用的单位剂型，例如胶嚢或糖衣丸或者更优选的片剂中。所述单位剂型可以是适于BID给药的，即每个剂量单元中含有计划每日剂量一半的阿洛夫定和齐多夫定组分，假设在任一定量给药时机处仅给予单个的片剂或胶嚢。根据该实施方式的一般单位剂型包括含有300mg齐多夫定和1或1.25mg阿洛夫定的胶嚢或片剂。如果剂量方式需要同时摄入多个相同的剂量单元(如在洛匹那韦/利托那韦组合物KaletraTM的情况下，其一般以两个软片剂的形式每天给药三次，每个片剂含有133mg洛匹那韦和33mg利托那韦)，可以相应地调节每个单位剂型中阿洛夫定和齐多夫定的量。一种代替性的单位剂型适于QD给药。QD给药能够促进顺从性，同时使毒性最小化，并且提供了协同的抗病毒效果。因此，为成人设计的片剂或月交嚢可以含有2-4mg阿洛夫定和300-600mg齐多夫定。优选的单位剂型包括82mg阿洛夫定和300mg、400mg、500mg或者尤其是600mg齐多夫定；2.5mg阿洛夫定和300mg、400mg、500mg或者尤其是600mg齐多夫定；3mg阿洛夫定和300mg、400mg、500mg或者尤其是600mg齐多夫定；或者4mg阿洛夫定和300mg、400mg、500mg或者尤其是600mg齐多夫定。由于在HIV治疗中联合治疗已经是普遍采用的规则而不是例外情况，因此本发明的方法和药物组合物可以进一步包括一种或两种另外的药物活性剂，尤其是另外的HIV抗病毒剂。所述另外的HIV抗病毒剂或抗病毒集可以采用机理分类类别中的任何一种，例如核苷逆转录酶抑制剂(NRTI),非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI),蛋白酶抑制剂(PI)，整合酶抑制剂，融合抑制剂，成熟抑制剂等。另外的HIV抗病毒剂一般以它们的常规剂量进行联合给药或联合制剂。代表性的NRTI包括双脱氧胸苷(d4T,Zerit)，2，,3，-双脱氧胞苷(ddC)，2，,3，-双脱氧肌普(ddl,Videx),阿巴卡韦(ABC,Ziagen)，拉米夫定(3TC,Epivir)恩曲他滨(FTC,Emtriva),racevir(夕卜消旋的FTC)阿德福韦(ADV),恩他卡韦(BMS200475),阿洛夫定(FLT),替诺福韦地索普西富马酸盐(TNF,Viread),amdoxavir(DAPD),D-d4FC(DPC-817),dOTC(ShireSPD754),艾夫他滨(elvucitabine)(AchillionACH-126443),BCH10681(Shire)SPD-756,racivir,D画FDOC,GS7340,INK-20(硫醚磷酯AZT,Kucera),2'3'-双脱氧-3'-氟代鸟普(FLG)以及它的前药例如MIV-210，reverset(RVT,D-D4FC,PharmassetDPC-817)。代表性的NNRTI包括地拉夫定(Rescriptor),衣非韦仑(DMP-266，Sustiva),奈韦拉平(BIRG-587，Viramune),(+)胡桐素A和B(AdvancedLifeSciences),卡泊韦林(AG1549fS-1153;Pfizer),GW-695634(GW-8248;GSK),MIV-150(Medivir),MV026048(MIV-160MedivirAB),MIV-170(Medivir)NV-0522(IdenixPharm.),R-278474(Johnson&Johnson),RS-1588(IdenixPharm.),TMC-120/125(Johnson&Johnson),nlpivi腦(TMC-278,165335;Johnson&Johnson),UC-781(BiosynInc.)和YM215389(Yama醒shi)。代表性的HIV蛋白酶抑制剂包括BEA-403(Medivir),PA-457(Panacos)，KPC-2(KuceraPharm.),5HGTV-43(EnzoBiochem),安泼那韦(VX-478,Agenerase),阿扎那韦(Reyataz)，印地那韦硫酸盐(MK-639,Crixivan),Lexiva(fosamprenavircalcium,GW—433908或908,VX-175),利托那韦(Norvir),洛匹那韦+利托那韦(ABT-378,Kaletra),替普拉那维，那非那韦曱磺酸盐(Viracept),沙奎那韦(Invirase，Fortovase),AG1776(JE-2147,KNI-764;NipponMiningHoldings),AG-1859(Pfizer),DPC-681/684(BMS),GS224338;GileadSciences),KNI-272(NipponMiningHoldings),Nar-DG-35(Narhex)，P(PL)-IOO(P-1946;ProcyonBiopharma),P-1946(ProcyonBiopharma),R-944(Hoffmann-LaRoche),RO曙0334649(Hoffmann-LaRoche),TMC-114(Johnson&Johnson),VX-385(GW640385;GSK/Vertex),VX-478(Vertex/GSK)。其他HIV抗病毒剂包括引入抑制剂，包括融合抑制剂，CD4受体抑制剂，CCR5共受体抑制剂和CXCR4共受体抑制剂，或者它们的药学上可接受的盐或前药。引入抑制剂的例子是AMD-070(AMD]1070;A證Med)，BlockAide/CR(ADVENTRXPharm.),BMS806(BMS-378806;BMS),Enfurvirtide(T-20,R698,Fuzeon),KRH1636(KurehaPharmaceuticals),ONO-4128(GW-873140,AK-602,E-913;ONOPharmaceuticals)，Pro-140(ProgeniesPharm)，PR0542(ProgeniesPharm.),SCH-D(SCH-417690;Schering-Plough),T画1249(R724;Roche/Trimeris),TAK-220(TakedaChem.Ind.)，TNX-355(Tanox)和UK-427,857(Pfizer)。整合酶抑制剂的例子L-870810(Merck&Co.),c-2507(Merck&Co.)和S(RSC)-1838(Shionogi/GSK)。目前，希望用于本发明的方法和药物组合物中的另外抗病毒剂是MIV-160,又名顺-l-(5-氰基吡啶-2-基)-3-(4,7-二氟-l,la,2,7b)-四氬环丙烯并[c]色烯-l-基)脲。MIV-160的合成描述于WO02/070516中。适宜的成人剂量包括250-1500mg,例如400或800mg,—般为QD或BID。包括MIV-160的本发明的实施方式能够方便地与细胞色素拮抗剂共给药，尤其是与Cyp4503A4抑制剂例如葡萄果汁或更优选利托那韦。利托那韦是一种已经注册用于治疗HIV的蛋白酶抑制剂，其推荐成人剂量为600mgBID,但是当用作加强剂(booster)时，可以采用低得多的剂量，一般为100或200mgBID。使用加强剂一般可以使MIV-160的剂量降低。本发明该方面的一般的单元剂量实施方式包括如下片剂，其含有<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>其他的本发明中所采用的NNRTI是MIV-170,又名N-[(lS,laR,7bR)-4,7画二氟-l,la,2，7b-四氢环丙烯并[c]色烯曙l画基卜N，-[5-(4-(磺酰氨基)苯氧基)-2-吡啶基]脲。MIV-170的合成在WO05/066131中给出。一般的成人剂量为100-900mg/天左右，尤其是300-600mgQD。MIV-170与特;f正比例的阿洛夫定和齐多夫定的组合通常不需要利托那韦加强，因为其已经明显地改善了口服生物利用度。该实施方式的一般给药方案包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>现在回到对本发明的一般性描述，阿洛夫定和齐多夫定通常并不被认为是难以制剂的，常规的医学方法、赋形剂和载体都是可以广泛地获得的。阿洛夫定和齐多夫定与任意上述另外抗病毒剂进行联合制剂时，可能需要采用本领域技术人员显而易见的适于另外抗病毒剂的制剂。优选的另外抗病毒剂MIV-160、MIV-170和利托那韦都不能对制剂构成难以克服的挑战。这样的公知医学方法包括将制定特征比例范围内的阿洛夫定和齐多夫定以及任意的另外抗病毒剂与常规的药物载体混合的步骤。通常，制剂是通过将活性试剂与液体载体或精细粉碎的固体载体或者二者进行均匀且紧密地混合，然后如果需要，将产品成型而制备的。本发明提供了用于制备药物组合物的方法，其包括将指定特征比例范围的阿洛夫定和齐多夫定以及任选的一种或两种另外的抗病毒剂与药物可接受的载体或介质结合或混合。如果药物制剂的制造涉及紧密混合药物赋性剂并且活性成分是盐的形式，则通常优选使用性质为非碱性的赋性剂，即酸性或中性的赋形剂。本发明的口服给药制剂可以以不连续的单元的形式存在，例如胶嚢、扁形胶嚢剂或片剂，其各自含有预定量的活性试剂。代替地它们可以以粉末或颗粒的形式存在；以活性试剂在水溶液或非水溶液中的溶液或悬浮液的形式存在，或者以水包油液体乳化液或油包水液体乳化液的形式存在，以丸剂等形式存在。对于口服给药的组合物(例如片剂和胶嚢)来说，术语"适宜的载体"包括介质例如常用的赋性剂，比如粘合剂例如糖浆，阿拉伯胶，明胶，山梨糖醇，黄芪胶，聚乙烯吡咯烷酮(Povidone),曱基纤维素，乙基纤维素，羧曱基纤维素钠，羟丙基-甲基纤维，蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉，明胶，乳糖，蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露糖醇，磷酸二钙，氯化钠和海藻酸；以及润滑剂例如硬脂酸4美，硬脂酸钠以及其他金属硬脂酸盐，硬脂酸甘油酯，硬脂酸，硅酮油，滑石蜡，油剂和胶体氧化硅。还可以使用调味剂例如胡椒薄荷，冬青油，櫻桃香精等。加入着色剂可能也是合意的，从而使得剂型容易被识别。片剂还可以用本领域中公知的方法进行包衣。片剂可以通过压制或模制的形式制备，其任选地含有一种或多种辅助组分。压制片剂可以通过在适宜的机器中压制流动形式例如粉末或颗粒形式的活性试剂而制备，所述活性试剂任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在适宜的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物压模而制备。所述片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以配制成能够提供缓释或控释的活性试剂的形式。其他适于口服给药的制剂包括糖锭，其包含的活性试剂处于调味基质中，所述调味基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；锭剂，其包含的活性试剂处于惰性基质中，所述惰性基质例如是明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口水，其包含的活性试剂处于适宜的液体载体中。阿洛夫定和/或齐多夫定可以以游离核苷或其常规的药学上可接受的盐或水合物的形式配制。常规的盐包括酸加成盐例如盐酸盐、氬溴酸盐、柠檬酸盐、曱苯磺酸盐和马来酸盐以及与磷酸或硫酸形成的盐。在另一方面，适宜的盐是石咸基盐例如碱金属盐如钠或钾盐，石咸土金属盐如钓或镁盐，或者有机胺盐如三乙胺盐。溶剂化物的例子包括水合物。或者，阿洛夫定和/或齐多夫定可以以前药的形式配制，所述前药在体内释放阿洛夫定/齐多夫定或阿洛夫定/齐多夫定单磷酸盐。能够在体内释放核普的常规核普前药包括5，-烷基酯例如乙酰基、特戊酰基或硬脂酰基酯或者5，-氨基酯例如L-缬氨酰、L-异亮氨酰或L-乳酰-L-缬氨酰酯。能够在体内是放齐多夫定单磷酸盐的前药包括fosivudine,例如fosivudinetidoxil。能够在体内释放阿洛夫定的前药包括EP350287、EP545966、EP741740和EP763049中描述的fosivudine类似物，例^口石舞夫定酉旨(fosalvudinetidoxil):R其中n是11,m是9并且R是F(fosalvudine)或N3(fosivudine)。在本说明书和权利要求书中所涉及的阿洛夫定和齐多夫定也指这样的盐、水合物以及前药，其中的重量(例如日常剂量)一般都被向上调节到与其相对于游离核苷增加的分子量相一致。药物级别的齐多夫定现在是通用的并且可以从世界范围内的许多厂家广泛地获得。阿洛夫定可以使用EP470355或WO94/26762中描述的铝或铁催化的脱水核普(anhydronucleoside)路线或类似路线方便地合成。Fosivudine和Fosalvudine是在以上所引用的专利中制备的。MIV-160和MIV-170的合成4安照以上所述进4亍。实施方式的详细描述下，描述本发明的各个方面。细胞株实验中测定的线粒体毒性以下描述的实验是用来说明在给药以阿洛夫定、齐多夫定或者二者后对线粒体DNA合成的抑制作用的。几种支持HIV生长的适宜的细胞抹是易得的，其中包括支持HIV生长的那些细胞抹，包括源自SwedishInstituteforInfectiousDiseaseControl(SMI)Sweden的CEMxl74细胞林，MT-4(可商购获得的)以及HepG2(可商购获得的)。简而言之，将100ul细胞以1x104细胞/ml的浓度接种在96孔板上，在RPMI1640培养基(来自Gibco)中进行指数生长培养，所述培养基掺有10%的加热灭活胎牛血清(来自Gibco)和青霉素-链霉素(来自Gibco)。培养基每3或4天更换一次，并且将细胞每周稀释1:10进行再次培养。所有的培养物都要进行支原体感染的例行检查并且在37。C下在湿润的5%。02的气氛下生长。所有的测试药物在用培养基进一步稀释到适宜浓度之前首先要被溶于10mM的二甲基亚砜(DMSO)中。按照之前的报道(Zhang,H等人，A/o/.尸/wm^co/199446:1063-1069),使用改进的Taqman技术进行线粒体DNA分析，其分析过程概要如下。将细胞用测试药物处理一系列的时间段，所述药物例如是阿洛夫定、fosalvudine、齐多夫定、阿巴卡韦等或者阿洛夫定/fosalvudine和齐多夫定/阿巴卡韦的多种组合物。各种比例描述在各自的表格中。在暴露于药物中14天以后，收集细胞。使用QiAampDNA血液迷你药盒(QIAGEN，Chatsworth,CA),按照供应商对QiageneBlood&BodyFluidSpinProtocol的指示制备总细胞DNA,并且进行DNA扩增。由AppliedBiosystems制备线粒体DNATaqman和人类核DNA的振能量转移(FRET)产生了光谱响应J这要归因于在DNA扩增期i;TaqDNA聚合酶的5，—〉3'核酸外切酶活性。该方法^^用了具有激光扫描技术的PCR基实验，从而激发了存在于特别设计的TaqMan探针中的荧光染料线粒体DNA探针相当于D-环，5'氟标记，6-FAM-ACGCTGGAGCCGGAG-MGBNFQ;核DNA探针相当于18S核糖RNA,5,氟标记，6，FAM-TCGAACGTCTGCCC-MGBNFQ以及一对DNA扩增引物(正向线粒体DNA引物5，-CACGCGATAGCATTGCGA-3，和反相线粒体DNA引物5，-AGGAATCAAAGACAGATACTGCGA-3，。正向核DNA引物5，-GCGGCGACGACCCA-3，和反相细胞核DNA引物5，-GGCGACTACCATCGAAAGTTG-3，)。它是一套用于实时检测pCR的完全整合的系统，在荧光5，核酸酶实验中使用的试剂为ABIPRISM7700和TaqMan试剂。细胞的生长受到细胞核DNA的控制(16S核蛋白体DNA)。线粒体实-睑的结果以线粒体DNA和细胞核DNA相对于对照组(没有暴露于药物中)的抑制百分率表示。实施例1在源自T淋巴细胞的MT4细胞株中进行上述实验。在以下表1中所报告的摩尔浓度下使用阿洛夫定或齐多夫定进行单剂治疗或者使用阿洛夫定加齐多夫定的组合物进行联合治疗表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从表1中明显可以看出，采用阿洛夫定的单剂治疗，即使是O.luM的低浓度都可以在该实验中导致线粒体DNA复制数降低70%。该抑制-故以1:100摩尔比存在的齐多夫定所消除。现在来看1uM阿洛夫定10uM齐多夫定的组合，其比例在以上所提到的WO91/01137特别优选的范围内，可以注意到存在显著的细胞毒性(通过核DNA复制数降低60%所反映)并且线粒体DNA复制数明显降低。在临床期，该细胞毒性是以与单独使用阿洛夫定相比降低的线粒体毒性为标志的。然而，问题在于在现有技术中阿洛夫定/齐多夫定的组合存在非常明显的线粒体毒性水平。相反，在本发明范围内的摩尔比为1:100(以wt:wt为基础则相当于1:110)的阿洛夫定和齐多夫定完全消除了线粒体DNA复制数降低的问题。实施例2在MT4细胞林中使用其他浓度的阿洛夫定和/或齐多夫定重复上述实验。原始数据和统计数据在表2A中给出。所述数据总结在以下表2B中表2A处理相对复制数降低％mtDNASDnDNASDmtDNAnDNA齐多夫定60uM7487301160138906638卯57440齐多夫定30uM993321133615836935257217043齐多夫定10uM856782100863891446242554040阿洛夫定0.6uM96998139141740000889132880阿洛夫定0.3uM2474813641711600001587606822阿洛夫定0.1uM4347091752895633119938744350.6uM阿洛夫定十60uM齐多夫定5209371178993030073212233800.3uM阿洛夫定+3uM齐多夫定985449790051380000307833070.1uM阿洛夫定十10uM齐多夫定7581916501517卯00077259820未治疗的细胞77749228760814800009790600表2B<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>因此，该实验证实了实施例1中阿洛夫定的线粒体毒性可以通过使用明显较大摩尔浓度的齐多夫定进行联合给药而逆转。实施例3在MT-4细胞中使用阿洛夫定单磷酸盐前药磷夫定酯和/或齐多夫定进行进一步的线粒体贫化实验，所述磷夫定酯是按照EP741740中的实施例19合成的。结果在表3中给出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>通过mtDNA贫化测定，单剂治疗中的阿洛夫定(在以单磷酸盐前药的形式给药的情况下)再次显示出明显的线粒体毒性。该毒性通过使用100倍大浓度的齐多夫定进行联合给药而逆转。对比实施例1在MT-4细胞中测定阿洛夫定与阿洛夫定加阿巴卡韦相比的线粒体毒性。摩尔比为70:1的阿巴卡韦和阿洛夫定在II期临床实-睑中显示出协同增效活性，参见WO2004/002433。该专利申请还描述了在细胞培养实验中在200:1的摩尔比下的协同增效抗病毒活性。按照实施例1中的描述测试各个浓度下的阿巴卡韦、阿洛夫定和阿巴卡韦加阿洛夫定表4处理平均qtymtDNASD线粒体DNA抑制％0.1uM阿洛夫定549900214665401uM阿巴卡韦75654467855180.1uM阿洛夫定+1uM阿巴卡韦48932614426748未处理的细胞77179120672200.2uM阿洛夫定1875741243548220uM阿巴卡韦506181404843510.2uM阿洛夫定十20uM阿巴卡韦22620117327378未处理的细胞1030000■3330结果显示，阿洛夫定的线粒体毒性没有通过以低或高摩尔比(1:10阿洛夫定:阿巴卡韦和1:100阿洛夫定:阿巴卡韦)加入NRTI阿巴卡韦而得到逆转。这表示在抗病毒效力方面获得的协同作用与线粒体毒性的拮抗机理没有机理上的联系。所有的参考文献，包括本申请中涉及的专利和专利申请，都被全文引入本文中作为参考。在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语"包含，，及其变形例如将被理解为表示包括了所指出整体或步骤或整体群，但不排除任何其他的整体或步骤或者整体或步骤的群。权利要求1.一种药物组合物，其包含摩尔比在1:100到1:350范围内的阿洛夫定和齐多夫定。2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述比例范围在1:150到1:250的范围内,优选为1:150到1:200。3.根据权利要求1或2的药物组合物，其进一步包含一种或两种另外的药物活性剂。4.根据权利要求3的药物组合物，其中所述另外的药物活性剂是HIV抗病毒剂MIV-170;或者所述另外的药物活性剂是HIV抗病毒剂MIV-160,MIV-160是单独使用的或者是与加强剂量的利托那韦一起使用的。5.根据前述权利要求任意一项的药物组合物，其是以QD单位剂型的形式存在的。6.根据权利要求5的药物组合物，其包含2-4mg的阿洛夫定和300-900mg的齐多夫定。7.根据权利要求6的药物组合物，其包含600mg的齐多夫定。8.根据权利要求1到5任意一项的药物组合物，其中所述阿洛夫定是以阿洛夫定单磷酸盐前药磷夫定酯的形式给药的。9.一种治疗或预防HIV的方法，其包括用比例在1:100到1:350范围内的阿洛夫定和齐多夫定进行同时或顺序给药。10.根据权利要求9的方法，其中所述比例在1:150到1:250的范围内，优选为1:150到200。11.根据权利要求9的方法，其进一步包括同时或顺序给药以一种或两种另外的药物活性剂。12.根据权利要求11的方法，其中所述另外的药物活性剂包含HIV抗病毒剂MIV170;或者MIV-160,MIV-160是单独使用的或者是与加强剂量的利托那韦一起使用的。13.根据权利要求9-12任意一项的方法，其中所述阿洛夫定和齐多夫定是以QD单位剂型的形式存在的。14.根据权利要求13的方法，其中所述单位剂型包含2-4mg的阿洛夫定和300-900mg的齐多夫定。15.根据权利要求14的方法，其中所述单位剂型包含600mg的齐多夫定。16.根据权利要求9到12任意一项的方法，其中阿洛夫定的剂量是2-4mgQD,齐多夫定的剂量是300mgBID。17.根据权利要求9到16任意一项的方法，其中阿洛夫定是以阿洛夫定单磷酸盐前药磷夫定酯的形式给药的。18.—种药盒组件，其包含(i)含有阿洛夫定的药物组合物；和(ii)含有齐多夫定的药物組合物；其特征在于阿洛夫定和齐多夫定是以1:100到1:350的摩尔比范围存在于药盒中的。全文摘要以明显超出现有技术的比例对阿洛夫定和齐多夫定进行联合给药，以在线粒体DNA贫化实验中完全或基本上消除阿洛夫定的线粒体毒性。本发明因此提供了以1∶100到1∶350的摩尔比范围含有阿洛夫定和齐多夫定的药物组合物以及用于治疗或预防多重耐药HIV的方法，所述方法包括以特征摩尔比例对阿洛夫定和齐多夫定进行同时或顺序给药。文档编号A61P31/18GK101437525SQ200780016316公开日2009年5月20日申请日期2007年5月4日优先权日2006年5月5日发明者B·奥伯格,泓张申请人:美迪维尔公司