专利名称：用于治疗骨关节炎和骨关节病的哌啶衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有药物活性的哌啶衍生物，所述哌啶衍生物作为趋化因子受体(例如CCR3)活性调节剂和H1拮抗剂活性调节剂，用于治疗骨关节炎(osteoarthritis)或骨关节病(osteoarthrosis)。本发明还涉及具体哌啶衍生物的特定盐。
背景技术：
组胺为一种碱性胺即2-(4-咪唑基)-乙胺，其是利用组氨酸脱羧酶由组氨酸形成。组胺存在于身体的绝大多数组织中，但以高浓度存在于肺、皮肤和胃肠道中。在细胞水平，炎症细胞如肥大细胞和嗜碱性粒细胞中存储大量的组胺。目前已经认识到肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱粒以及随后的组胺释放是产生变态反应过程(allergic process)临床表现的基本机理。组胺通过作用于特异性组胺G-蛋白偶联受体来发挥其作用，所述受体有4种主要类型，即H1、H2、H3和H4。组胺H1拮抗剂包括的、用于治疗患变应性疾病(例如鼻炎和荨麻疹)病人的药物种类最多。H1拮抗剂可用于控制变应性反应，通过例如阻断组胺对后毛细管小静脉平滑肌的作用，导致脉管渗透性降低、渗出和水肿。该拮抗剂也阻断组胺对H1受体对c型痛觉神经纤维的作用，使发痒和打喷嚏减轻。
趋化因子是趋化细胞因子，其由多种细胞释放，以将巨噬细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及嗜中性粒细胞引至炎症部位，并且还在免疫系统细胞的成熟中发挥作用。
趋化因子在多种疾病和病症的免疫和炎性反应中发挥中重要作用，这些疾病和病症包括哮喘和变应性疾病，以及自身免疫性病变如类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。这些被分泌出的小分子属于不断增加的8-14kDa蛋白超家族，该家族特征为保守的4个半胱氨酸基序。趋化因子超家族可分成显示出特征性结构基序的两类主要家族即Cys-X-Cys(C-X-C，或α)和Cys-Cys(C-C，或β)。根据NH-附近的半胱氨酸残基对之间插入的单个氨基酸和序列相似性来区分这两个家族。
所述C-X-C趋化因子包括嗜中性粒细胞的几种强效的化学引诱物和活化剂，如白介素-8(IL-8)和嗜中性粒细胞活化肽2(NAP-2)。
所述C-C趋化因子包括单核细胞和淋巴细胞(但不包括嗜中性粒细胞)的强效化学引诱物，如人单核细胞趋化蛋白1-3(MCP-1、MCP-2和MCP-3)，RANTES(调节活化、正常T表达和分泌)、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)以及巨噬细胞炎性蛋白1α和1β(MIP-1α和MIP-1β)。
研究表明趋化因子的作用由G蛋白偶合受体的亚家族调节，所述亚家族中的受体命名为CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3和CXCR4。
WO2005/073192公开了具有趋化因子受体调节活性和H1拮抗剂活性的N-(2-羟基丙-1-基)哌啶衍生物的药理学活性。
骨关节炎(OA)是一类慢性、疼痛的、使人丧失能力的病症，其感染滑膜关节，并以关节软骨的基质组成退化伴随促炎性细胞因子的生成为特征(Pelletier等人，Rheum Dis Clin North Am 19(1993)，545-568页)。已普遍认为，白介素-1(IL-1)β是在OA的病理生理学中发挥重要作用的促炎性细胞因子之一(Dinarello，Interleukin-1，Ann N Y Acad Sci 546(1988)，122-132页)。软骨细胞中发生的异化(catabolic event)包括下述酶的基因的上调基质金属蛋白酶(MMPs)、可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)(Stadler等人，J Immunol147(1991)，3915-3920页)、环氧化酶2(COX-2)(Morisse等人，J Rheumatol25(1998)，pp.1146-1153)和微粒体前列腺素E合成酶-1(mPGEs1)，以及包括一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的释放(Stichtenoth等人，J Immunol167(2001)，469-474页)。软骨细胞组织代谢活性的同步延迟导致蛋白多糖合成和胶原合成的降低(Benton and Tyler，Biochem Biophys Res Commun154(1988)，421-428页，和Coll Relat Res 8(1988)，393-405页)。
最近的研究表明许多G蛋白偶合受体(GPCRs)及其配体在OA软骨或从该组织分离的初级软骨细胞中显示出具有改变的表达模式(Alaaeddine等人2001，Arthritis Rheum.2001，44(7)1633-1642，Tetlow and Woolley，Inflamm.Res 54，suppl1(2005)S74-S75)。
本发明基于下述发现结果H1R和趋化因子CCR3受体在OA软骨中的表达水平都增加并且H1R和趋化因子CCR3受体的配体在OA滑膜液中以较高水平存在。
已发现，组胺通过H1R调节初级软骨细胞中PGE2、IL-6和IL-8的表达。组胺剂量依赖性地诱导PGE2从人软骨细胞的初级培养物中释放，并且发现其能提高COX-2mRNA，组胺和IL-1在初级软骨细胞和OA移植软骨中协同调节PGE2表达。主流学说认为OA是非炎性关节病。然而，最新的临床研究表明，放射照相OA和炎症高度相关(D’Agostino等人，Ann Rheum Dis64(2005)，1703-1709页)，并且将炎性变化和滑膜炎与OA中结构性变化的进展有关(Ayral等人，Osteoarthritis Cart 13(2005)，361-367页)。因此，组胺促使炎性介质即IL6、IL8和PGE2的表达增加，因此其可能在OA病症发展过程中起关键作用。PGE2除了被认为是炎症关键介质，还认为其与骨关节炎疼痛有关，因为已清楚证明PGE2具有外周伤害性感应器终端的敏化剂的作用，而且组胺对关节初级感觉传入的刺激作用也与OA中观察到的机械痛觉增敏有关。
发明内容
本发明已发现CCR3配体即嗜酸性细胞活化趋化因子-2增加多个来自人关节软骨移植物的软骨降解基质金属蛋白酶和ADAMTS4的表达。
因此，已经认识到，将抑制CCR3和抑制H1R介导的效果组合可提供一种治疗OA患者的病征、症状和疾病发展的有效手段。
因此，本发明提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗骨关节病或骨关节炎的药物中的用途
其中 R1是任选被卤素、氰基、C1-4烷基或C1-4卤烷基取代的苯基； R2是氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；以及 R3是含有NH或OH的基团，其中NH或OH的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0。
应当理解的是，除非另有说明，否则治疗既指治疗也指预防。
式(I)化合物在WO2005/073192(
公开日为2005年8月11日)中已公开。式(I)化合物的pKa值按照WO2005/073192中描述的方法进行计算或测量。
式(I)化合物中的某些化合物可以不同的异构体形式存在(例如对映异构体、非对映异构体、几何异构体或互变异构体)。本发明的范围涵盖所有这些异构体的用途及它们以各种比例形成的混合物的用途。
合适的盐包括酸加成盐，例如盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、二醋酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、甲烷磺酸盐或对甲苯磺酸盐。酸加成盐的例子还有重硫酸盐、苯磺酸盐(besylate)、丙酮酸盐、琥珀酸盐、乙烷磺酸盐(ethanesulphonate)、丙二酸盐、羟萘甲酸盐(xinafoate)、抗坏血酸盐、油酸盐、烟酸盐、糖精酸盐(saccharinate)、己二酸盐、甲酸盐、乙醇酸盐、L-乳酸盐、D-乳酸盐、天冬氨酸盐、苹果酸盐、L-酒石酸盐、D-酒石酸盐、硬脂酸盐、2-糠酸盐、3-糠酸盐、萘二磺酸盐(萘-1，5-二磺酸盐或萘-1-(磺酸)-5-磺酸盐)、乙二磺酸盐(乙烷-1，2-二磺酸盐或乙烷-1-(磺酸)-2-磺酸盐)、羟乙基磺酸盐(2-羟基乙基磺酸盐)、2-均三甲苯磺酸盐和2-萘磺酸盐。盐还包括金属盐，例如碱金属盐(例如钠盐或钾盐)或碱土金属盐(例如镁盐或钙盐)。
式(I)化合物可以溶剂化物(例如水合物)的形式存在，本发明的范围也包含所有这些溶剂化物的用途。
卤素是例如氟或氯。
烷基基团和烷基部分是直链或支链的，并且为例如甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。
环烷基是单环基，并且为例如环丙基、环戊基或环己基。
卤代烷基是含有一个或多个(例如1至6个)卤素原子(例如氯原子或氟原子)的烷基，并且为例如CF3、CH2CF3或C2F5。
氟代烷基是含有一个或多个(例如1至6个)氟原子的烷基，并且为例如CH2F、CF3、CH2CF3或C2F5。
本发明一方面提供式(I)化合物的用途，其中R1是任选地被卤素、氰基或C1-4烷基取代的苯基。
本发明另一方面提供式(I)化合物的用途，其中R1是被一个、两个或三个如下基团取代的苯基卤素(例如氟或氯)、氰基或C1-4烷基(例如甲基)；例如R1是被一个、两个或三个如下基团取代的苯基氟、氯、甲基或氰基。在另一方面，R1是被一个、两个或三个(例如两个或三个)如下基团取代的苯基氟、氯、氰基或甲基(例如氯、氰基或甲基)。R1是例如，3，4-二氯苯基、2-甲基-3-氯-4-氰基苯基、2-甲基-4-氯苯基、3-甲基-2，4-二氯苯基、2-甲基-3，4-二氯苯基、3-氯-4-氰基苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基或4-氯苯基(例如2-甲基-4-氯苯基、3-甲基-2，4-二氯苯基、2-甲基-3，4-二氯苯基、3-氯-4-氰基苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基或4-氯苯基)。在另一方面，R1是3，4-二氯苯基或3-氯-4-氰基苯基。
在本发明的另一方面，R1是被一个或多个氯或一个或多个甲基取代的苯基，并任选地所述苯基进一步被氟取代。例如R1是2-甲基-4-氯苯基、3-甲基-2，4-二氯苯基、2-甲基-3，4-二氯苯基、3-氟-4-氯苯基、4-氯苯基或3，4-二氯苯基。
在本发明的另一方面，R1是3，4-二氯苯基、2-甲基-4-氯苯基、3-甲基-2，4-二氯苯基、2-甲基-3，4-二氯苯基或2-甲基-3-氯-4-氰基苯基。
在另一方面，本发明还提供式(I)化合物的用途，其中R2是氢或C1-4烷基(例如甲基)。
在本发明的另一方面，R2是氢。
R3中酸性的NH(即该NH具有的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0)可以是环的一部分，或可以是芳环或杂环上的取代基的一部分。R3中酸性的OH(即该OH具有的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0)可以是芳环或杂环上的取代基或芳环或杂环上的取代基的一部分(例如羧酸基团中的OH)。因此，例如，R3中酸性的OH可以是酸性苯酚的一部分，所述OH在羧酸中，或在羟基芳族杂环(例如可互变成吡啶酮的羟基吡啶)中。
芳基包括任选被取代的苯基或萘基。
杂环是任选被取代的芳族或非芳族的5-或6-元环，根据需要其包括至少一个选自氮、氧和硫的杂原子；或其氮氧化物、硫氧化物或硫二氧化物。所述杂环是，例如，呋喃基、噻吩基(也称为硫代苯基)、吡咯基、2，5-二氢吡咯基、噻唑基(例如2-氧代-2，3-二氢-1，3-噻唑基)、异噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、三唑基(例如在1H-1，2，3-三唑基中)、吡啶基(例如6-氧代-1，6-二氢-吡啶基中)或嘧啶基。
在本发明的一个方面，R3中酸性的NH是环的一部分，该环被适当取代，所述环为例如吡咯基环、2，5-二氢吡咯基环、噻唑基环、异噻唑基环、吡唑基环、噁唑基环、异噁唑基环、咪唑基环、三唑基环、吡啶基环或嘧啶基环，或者是被适当取代的芳基(例如苯基或萘基)的取代基的一部分，或是被适当取代的杂环的一部分，所述杂环为例如呋喃基环、噻吩基环、吡咯基环、2，5-二氢吡咯基环、噻唑基环、异噻唑基环、吡唑基环、噁唑基环、异噁唑基环、咪唑基环、三唑基环、吡啶基环或嘧啶基环。
在本发明的另一方面，R3中的酸性OH是被适当取代的芳基上的取代基或被适当取代的杂环上的取代基，或是被适当取代的芳基上的取代基的一部分或被适当取代的杂环上的取代基的一部分(例如羧基中的OH)，所述芳基为例如苯基或萘基，所述杂环基为例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、2，5-二氢吡咯基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、三唑基、吡啶基或嘧啶基。因此，例如，R3中的酸性OH可以是酸性苯酚(取代的或未取代的)的一部分，所述OH在羧酸中或在被适当取代的羟基芳族杂环(例如可互变成吡啶酮的羟基吡啶)中。所述被适当取代的羟基芳族杂环的例子有羟基喹啉、羟基异喹啉和羟基苯并咪唑。
在本发明的一方面，当R3中的酸性NH是被适当取代的环的一部分时，它是例如下述环的一部分2-氧代-噻唑-5-基、2-氧代-噁唑-5-基、2-氧代-咪唑-5-基、1H-1，2，3-三唑-4-基、4-氧代-1H-1，4-二氢吡啶-3-基、2，6-二氧代-1H-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-基、6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基或2H-四唑-5-基。
在本发明的另一方面，当R3中的酸性NH是被适当取代的环的一部分时，它是例如下述环的一部分2-氧代-噻唑-5-基、1H-1，2，3-三唑-4-基或6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基。
在本发明的另一方面，当R3中的酸性NH是取代基的一部分时，它是例如-NHS(O)2(C1-4烷基)的一部分。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物的用途，其中R3具有NH或OH的基团，所述NH或OH的pKa计算值或pKa测量值为3至6.5。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物的用途，其中R3具有NH或OH基团，所述NH或OH的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0(例如3至6.5)，R3基团为例如下述基团，或任选地为这些基团的互变异构形式 ·在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噻唑-5-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、芳基基团(例如4-氟苯基)、杂环基团(例如吡啶基)或者CH2S(O)2(C1-4烷基)基团； ·在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噁唑-5-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)或CH2S(O)2(C1-4烷基)； ·在5位上具有合适的取代基的1H-1，2，3-三唑-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3或CH(CH3)2)、C3-6环烷基(例如环丙基)、C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、S-R4(其中R4是C1-4烷基[例如CH3]、C1-4氟代烷基[例如CF3、CH2CF3或C2F5]或C3-6环烷基[例如环丙基])、NHS(O)2(C1-4烷基)、N(C1-4烷基)S(O)2(C1-4烷基)、芳基(例如4-氟苯基)、杂环基(例如吡啶基)或CH2S(O)2(C1-4烷基)基团。
·在2位上具有合适的吸电子取代基的4-氧代-1H-1，4-二氢吡啶-3-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3或C2F5)； ·在3位上具有合适的取代基、并环上的一个或多个其它位置任选被取代的2，6-二氧代-1H-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3)、C3-6环烷基(例如环丙基)或CH2(C1-3氟代烷基)(例如CH2CF3)； ·在2位和/或5位上具有合适的吸电子取代基、并且在环上的一个或多个其它位置任选被取代的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、氰基或苯基； ·在环的氮上具有CH2CO2H基团的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基，并且在环上的一个或多个其它位置任选被取代； ·2H-四唑-5-基； ·在下述环上的CO2H、CH2CO2H或OCH2CO2H任选被取代的苯基、任选被取代的-CH2O苯基、任选被取代的萘环或任选被取代的酰化二氢异喹啉环(例如用C(O)(C1-4烷基)酰化)，或者， ·在任选被取代的芳族杂环(例如吡啶基、嘧啶基或噻唑基)上的NHS(O)2(C1-4烷基)(例如NHS(O)2CH3)。
在本发明的一方面，酰化的(例如用C(O)(C1-4烷基酰化))二氢异喹啉在7位连接CO2H、CH2CO2H或OCH2CO2H基团。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物的用途，其中R3是具有NH或OH的基团，所述NH或OH的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0(例如3至6.5)，R3为例如下述基团，或如果可能为这些基团的互变异构体 ·在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噻唑-5-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、芳基(例如4-氟苯基)、杂环基(例如吡啶基)或CH2S(O)2(C1-4烷基)基团； ·在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噁唑-5-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)或CH2S(O)2(C1-4烷基)； ·在5位上具有合适的取代基的1H-1，2，3-三唑-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3)、C3-6环烷基(例如环丙基)、C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、S-R4(其中R4是C1-4烷基[例如CH3]、C1-4氟代烷基[例如CF3、CH2CF3或C2F5]或C3-6环烷基[例如环丙基])、NHS(O)2(C1-4烷基)、芳基(例如4-氟苯基)、杂环基(例如吡啶基)或CH2S(O)2(C1-4烷基)基团； ·在2位上具有合适的吸电子取代基的4-氧代-1H-1，4-二氢吡啶-3-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3或C2F5)； ·在3位上具有合适的取代基的2，6-二氧代-1H-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3)、C3-6环烷基(例如环丙基)或CH2(C1-3氟代烷基)(例如CH2CF3)； ·在2位或5位上具有合适的吸电子取代基、并且在其它位置任选被取代的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基，所述取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)或氰基； ·2H-四唑-5-基； ·在任选被取代的苯基或萘环上的CO2H基团；或， ·在任选被取代的芳族杂环(例如吡啶基、嘧啶基或噻唑基)上的NHS(O)2(C1-4烷基)(例如NHS(O)2CH3)。
如上所述，R3中的杂环可任选被取代，其可任选被例如下述取代基取代氟、氯、溴、C1-4烷基(例如甲基)、C3-6环烷基(例如环丙基)、C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、S-R4(其中R4是C1-4烷基[例如CH3]、C1-4氟代烷基[例如CF3、CH2CF3或C2F5]或C3-6环烷基[例如环丙基])、氰基、S(O)2(C1-4烷基)(例如S(O)2CH3)或S(O)2NH(C1-4烷基)(例如S(O)2NHCH3)。
如上所述，R3中的苯环或萘环可任选被取代，其可任选被例如下述取代基取代卤素、氰基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、OCF3、SCF3、硝基、S(C1-4烷基)、S(O)(C1-4烷基)、S(O)2(C1-4烷基)、S(O)2NH(C1-4烷基)、S(O)2N(C1-4烷基)2、NHC(O)(C1-4烷基)、NHS(O)2(C1-4烷基)。
在本发明的一个方面，R3为下述基团，或如果可能为这些基团的互变异构体 ·在4位上具有C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)的2-氧代-噻唑-5-基； ·在5位上具有合适的取代基的1H-1，2，3-三唑-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3)或S-R4(其中R4是C1-4氟代烷基[例如CF3、CH2CF3或C2F5])； ·在3位上具有合适的取代基的2，6-二氧代-1H-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-基，所述取代基为例如C1-4烷基(例如CH3)或C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)； ·在2位或5位上具有合适的吸电子取代基、并且在其它位置任选被取代的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)或氰基； ·在任选被取代的萘环上的CO2H基团；或， ·在任选被取代的芳族杂环(例如吡啶基、嘧啶基或噻唑基)上的NHS(O)2(C1-4烷基)(例如NHS(O)2CH3)； 所述任选的取代基如上文所述。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物的用途，其中R3是 ·在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噻唑-5-基，所述吸电子取代基为例如C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、苯基(例如4-氟苯基)或杂环基(例如吡啶基)； ·在5位上具有合适的取代基的1H-1，2，3-三唑-4-基，所述吸电子取代基为例如C1-4烷基(例如CH3或CH(CH3)2)、C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)、S-R4(其中R4是C1-4烷基[例如CH3]或C1-4氟代烷基[例如CF3、CH2CF3或C2F5])、N(C1-4烷基)S(O)2(C1-4烷基)或苯基(例如4-氟苯基)；或， ·在2位或5位上具有C1-4氟代烷基(例如CF3、CH2CF3或C2F5)或氰基的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物，其中R3是 ·在4位上具有CF3或C2F5的2-氧代-噻唑-5-基； ·在5位上具有CF3、C2F5、SCF3、SCH2CF3或SC2F5(例如CF3或SCH2CF3)的1H-1，2，3-三唑-4-基；或者， ·在2位具有CF3或C2F5的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基。
在另一方面，本发明提供式(I)化合物的用途，其中2-羟基基团的立体化学如下所示
在另一方面，本发明提供N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐(其是式(I)化合物的药学上可接受的盐的示例)。在另一方面，本发明提供N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐。
在另一方面，本发明提供制备N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐的方法，包括将N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺在合适的溶剂(例如脂肪醇如甲醇)中在环境温度(例如0-35℃)与苯磺酸反应。
式(I)化合物可以按照WO 2005/073192中描述的方法或与之类似的方法进行制备。这些制备方法中用到的中间产物可按照WO 2005/073192中描述的方法或与之类似的方法制备。
在另一方面，本发明提供用于本发明用途的化合物或其药学上可接受的盐，这些化合物是 N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； 5-溴-N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺； N-{(2S)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-N-甲基-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2S)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-N-甲基-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(五氟乙基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； 5-氰基-N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； 5-氰基-N-{(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； 5-氰基-N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-苯基-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； 5-氰基-N-{(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-苯基-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； 5-氰基-N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(三氟甲基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，6-二氧-3-(2，2，2-三氟乙基)-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-甲酰胺； 5-氰基-2-环丙基-N-[(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)-1-哌啶基]-2-羟基丙基]-1，6-二氢-6-氧代-3-吡啶甲酰胺； 5-氰基-2-环丙基-N-[(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)-1-哌啶基]-2-羟基丙基]-1，6-二氢-6-氧代-3-吡啶甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-[(甲基磺酰基)氨基]-4-(三氟甲基)烟酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-[(2，2，2-三氟乙基)硫基]-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； 4-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)-羰基]-1-萘甲酸； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-[(甲基磺酰基)氨基]-4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(4-氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； [5-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)-羰基]-2-氧代-4-(三氟甲基)吡啶-1(2H)-基]醋酸； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-4-(4-氟苯基)-2-氧代-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-(4-氟苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3-氯-4-氰基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2S)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2S)-3-[4-(3-氯-4-氰基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-N-甲基-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3-氯-4-氰基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-异丙基-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2S)-3-[4-(3-氯-4-氰基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-异丙基-N-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(2，2，2-三氟乙基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-吡啶-2-基-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(五氟乙基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-(甲基硫)-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3噁唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-(三氟甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-[甲基(甲基磺酰基)氨基]-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3-氯-4-氰基-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2-氧代-4-(三氟甲基)-2，3-二氢-1，3-噻唑-5-甲酰胺； N-{(2R)-3-[4-(3-氯-4-氰基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-5-(三氟甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-甲酰胺； 2-氯-5-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)羰基]苯甲酸； 4-氯-3-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)羰基]苯甲酸； 4-氯-3-[2-({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸； {2-氯-5-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)羰基]苯氧基}醋酸； 3-[2-({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)-2-氧代乙氧基]苯甲酸；或 {3-[({(2R)-3-[4-(3，4-二氯-2-甲基苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}氨基)羰基]苯氧基}醋酸。
另一方面，本发明提供N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺或其药学上可接受的盐(例如苯磺酸盐)在制备治疗骨关节病或骨关节炎的药物中的用途。
本发明还提供N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐在治疗或预防中的用途。
本发明进一步提供N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐在制备用于治疗CCR3介导的疾病的药物中的用途，所述疾病为例如温血动物如人所患有的如下疾病 (1)(呼吸道)气道阻塞性疾病慢性阻塞性肺病(COPD)(例如不可逆COPD)；哮喘{例如支气管性、过敏性、内源性、外源性或粉尘性哮喘，特别是慢性或长期哮喘(例如迟发性哮喘(late asthma)或气道高反应性)}；支气管炎{例如嗜酸性支气管炎}；急性、过敏性、萎缩性鼻炎或慢性鼻炎包括干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、鼻粘膜炎、干燥性鼻炎或药物性鼻炎；膜性鼻炎包括克鲁布性的、纤维性或假膜性鼻炎或腺病性鼻炎；季节性鼻炎包括神经性鼻炎(花粉症)或血管舒缩性鼻炎；肉样瘤病；霉尘肺(农民肺，farmer’slung)和相关疾病；鼻息肉；纤维化肺、特发性间质性肺炎、止咳作用、气道炎症的慢性咳嗽或者医源性诱导的咳嗽的治疗； (2)(骨和关节)风湿性、传染性关节炎或自身免疫性关节炎；血清反应阴性的脊椎关节病(例如强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎或赖特尔病(Reiter’s disease))；白塞病(
病)；舍格伦综合症(Sjogren’s syndrome)；或全身性硬化症；或者， (3)(皮肤和眼睛)牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎或其它湿疹性皮炎，脂溢性皮炎、扁平苔藓、类天疱疮、大疱性类天疱疮、大疱性表皮松懈、荨麻疹、皮肤血管炎、血管炎红斑、表皮嗜曙红性细胞增多、眼色素层炎、局限性脱发或春季结膜炎。
在另一方面，本发明提供治疗CCR3介导的疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐。
在另一方面，所述N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐可有效治疗哮喘{例如慢性哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、外源性哮喘或粉尘性哮喘，特别是慢性或长期哮喘(例如迟发性哮喘或气道高反应性)}；或鼻炎{包括急性鼻炎、过敏性鼻炎、萎缩性鼻炎或慢性鼻炎，例如干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、鼻粘膜炎、干燥性鼻炎或药物性鼻炎；膜性鼻炎包括克鲁布性鼻炎、纤维性鼻炎或假膜性鼻炎或腺病性鼻炎；季节性鼻炎包括神经性鼻炎(花粉症)或血管舒缩性鼻炎}。
在另一方面，N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐可用于治疗哮喘。
本发明还提供N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐在制备治疗哮喘或鼻炎的药物中的用途。
式(I)化合物及其药学上可接受的盐具有调节趋化因子受体(例如CCR3)活性的作用，并且同时是H1拮抗剂，可用于治疗与骨关节病或骨关节炎有关的原发性关节炎和继发性关节炎，例如，可用于治疗先天性髋关节发育不良。
本发明还提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐，用在治疗温血动物(例如人)患有的骨关节炎或骨关节病的方法中。
本发明的另一方面，提供了一种在需要治疗骨关节炎或骨关节病的温血动物例如人中治疗所述疾病的方法，包括给予所述动物有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
为了使用式(I)化合物或其药学上可接受的盐(活性成分)用于治疗温血动物，例如人，通常将所述成分按照标准制药规范制备成药物组合物。
本发明还提供一种药物组合物，其包括N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐和载体、稀释剂或助剂混合。
根据给药形式，所述药物组合物包括，例如，0.05至99w％(重量百分比)活性成分，例如0.05至80w％活性成分，例如0.10至70w％活性成分，例如0.10至50w％活性成分，所有重量百分比是以组合物的总重量计。
可采用针对需要治疗的疾病的标准方式给药药物组合物，例如通过局部给药(例如给药至肺和/或气道或给药至皮肤)、口服、直肠给药或非肠胃道给药(例如，关节内)。为满足上述目的，式(I)化合物可由本领域公知技术配制成如下制剂，例如，气溶胶、干粉制剂、片剂、胶囊、糖浆、粉剂、颗粒剂、水或油的溶液或混悬液、(脂质)乳液剂、分散粉剂、栓剂、软膏剂、乳剂、滴剂和无菌可注射水溶液或油溶液或悬浮液。
合适的药物组合物是适合口服给药的、单位剂量形式的一种组合物，例如，是包含0.1mg至1g活性成分的片剂或胶囊。
可选地，药物组合物是适合静脉注射、皮下注射或肌肉注射的组合物。可选地，药物组合物为适合关节内注射的组合物。
当采用例如关节内、静脉内、皮下或肌肉内给药时，每个患者可接受的剂量为0.01mgkg-1至100mgkg-1化合物，例如0.1mgkg-1至20mgkg-1本发明化合物，组合物可每天给药1至4次。关节内、静脉内、皮下或肌肉内剂量可通过单次快速注射给药。可选地，关节内或静脉内剂量可通过在一段时间内连续输注给药。可选地，每个患者可接受的每日口服剂量近似等于每日肠胃道外给药剂量，组合物每天给药1至4次。
本发明还涉及疗法的联合或组合物的联合，其中式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或含有式(I)化合物或其药学上可接受的盐的组合物，与治疗骨关节病或骨关节炎的药物同时(可能在同一个组合物中)或相继给药。
特别地，式(I)化合物可与组胺1型受体拮抗剂联合给药，所述组胺1型受体拮抗剂为例如西替利嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿司咪唑、阿伐斯丁、特非那定、异丙嗪、赛克利嗪、咪唑斯汀、氮卓斯汀或氯苯那敏联合使用；采用口服、局部或非肠胃道(例如关节内)给药方式。
本发明将通过下列非限制性实施例做进一步阐述，其中，除非另有说明，使用下列缩写 DMEM是组织培养基杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagles Medium) PSG是青霉素、链霉素和L-谷酰胺的组合 FCS是胎牛血清 NEAA是非必需氨基酸
具体实施例方式 实施例1 N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐
步骤1N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺 将2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑羧酸乙酯(85.252g)溶液溶解在亚硫酰氯(500mL)中，将得到的溶液加热回流过夜。然后将所得溶液冷却到环境温度，真空浓缩，将残余的亚硫酰氯与甲苯(2 x 100mL)共沸。将残余物溶解于无水四氢呋喃(250mL)中，将所得的溶液历时3h滴加到(2R)-1-氨基-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]丙-2-醇(127.7g)和三乙胺(111.5mL)的四氢呋喃(1250mL)混悬液中。在环境温度搅动所得黄色混合物过夜，真空中浓缩溶液，得到黄色胶状物(313g)。将所述胶状物溶解于水(pH7-8)中，并用稀盐酸酸化至pH1-2。用乙酸乙酯(2L+500mL)萃取固体，在水层中加入氯化钠使剩余的有机物盐析。合并有机萃取物，干燥(Na2SO4)，真空浓缩，真空干燥42小时得到黄色泡沫状物(217g)。
MS(APCI-ve)512/514[M-H]- 1H NMR δ(CD3OD)2.00-2.40(4H，m)，3.19(2H，m)，3.40(2H，m)，3.20-3.60(4H，m)，4.16-4.24(1H，m)，4.65-4.85(1H，m)，6.98(1H，dd)，7.23(1H，s)，7.43(1H，d)。
步骤2N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐 将步骤1(上文)得到的黄色泡沫状物溶解于甲醇(400mL)中，用苯磺酸(63.27g)处理，然后在环境温度搅动2小时，将所得物过滤并在真空中浓缩，得到黄色泡沫状物(297g)。将所述黄色泡沫状物溶解于热乙酸乙酯(约800mL)中，然后使得到的溶液冷却至环境温度。将得到的混悬液在环境温度搅动72小时，过滤，用乙酸乙酯(500mL)洗涤，风干，将所得物置于烘箱中40℃温度真空干燥得到白色粉末(177.5g)。
元素分析C44.32％(44.65)；H3.86％(3.90)；N6.38％(6.25)； S9.66％(9.53) MS(APCI-ve)512/514[M-H]- 1H NMR δ(d6-DMSO)1.88-2.26(4H，m)，3.11(2H，m)，3.24-3.32(2H，m)，2.86-3.46(4H，m)，4.02-4.10(1H，m)，4.64-4.72(1H，m)，7.02(1H，dd)，7.24-7.30(4H，m)，7.50(1H，d)，7.60-7.64(2H，m)，8.37(1H，s)。
实施例2 N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-6-氧代-2-(五氟乙基)-1，6-二氢吡啶-3-甲酰胺(WO 2005/073192中的实施例35)的活性鉴定 方法 (i)从OA软骨分离人关节软骨细胞(HAC)用于组胺刺激 HAC是从骨关节炎组织的软骨中分离出来的，所述骨关节炎组织是在关节置换术中取出的。37℃，将软骨在含有2mg/ml胶原蛋白酶的(DMEM+10％ FCS+PSG)中振荡培养过夜。将得到的细胞悬液过滤，除去未消化的软骨，并将所述细胞在1200rpm离心10分钟。将细胞重新悬浮于DMEM加10％FCS PSG/NEAA/两性霉素B/庆大霉素中，以约5 x 10-6的浓度平板接种在T-75中，使其生长至融合。然后将细胞以每孔约10,000个细胞平板接种在96孔板上，用组胺刺激。三份载有第一代HAC细胞的孔用仅含有DMEM(10％或0％ FCS)(对照组)处理，或用DMEM(10％或0％FCS)加组胺(剂量范围10nM至最多1mM)处理。细胞在37℃温度培养24小时，收集所述受调节的培养基，用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定PGE2、MMP或细胞因子的生成。此外，收集细胞，在含有1％β-巯基乙醇的Qiagen RLT缓冲液中分析RNA。
在一些实验中，在用组胺刺激之前将细胞与特异性拮抗剂培养20分钟，并与组胺刺激联合。
(ii)人软骨移植物的趋化因子刺激 移植物的制备 在全膝关节置换术中获得人骨关节炎软骨。在股骨髁部和胫骨平台上(tibial plateau)获取全深度软骨切片，用直径5mm的KAI无菌皮肤活检穿孔器得到移植物片。解剖分解后，将移植物全部收集在Petri培养皿中。针对每种条件，从Petri培养皿中随机选取16个移植物，在聚丙烯96孔板中培养，所述板中带有不含酚磺酞的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；Gibco，Grand Island，NY)、150μg/ml庆大霉素、1.5μg/ml两性霉素B和100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和L-谷酰胺。
在初期48小时预刺激并经休眠期之后，在24、48或96小时加入实验药剂。在加入趋化因子之前将移植物与下述物质培养20分钟只含有合适浓度的化合物的物质或与DMSO培养作为对照组。然后将软骨用下述物质处理载体对照(加DMSO)；趋化因子(30-300ng/ml)加DMSO；或趋化因子(30ng/ml)加实施例1化合物。在刺激后24，48或96小时收集条件培养基(conditioned media)，并在分析前在-20℃温度储存。也收集软骨移植物并在RNA提取前将其快速冷冻到液氮中。
从软骨移植物中提取RNA 每种情况需要16个软骨移植物片，将它们收集起来然后快速冷冻到液氮中。将这些收集的样品在液氮中粉碎成精细粉末，然后悬浮在装于聚丙烯Oakridge试管中的10ml三唑仑中，根据制造商提供的方案提取RNA。将所述RNA颗粒物重新悬浮在约500μl不含RNAse和不含DNAse的水中，然后与1.75ml Qiagen RLT合并。用Qiagen RNEasy微型柱(Qiagen Cat# 74104)，按照制造商提供的方案对RNA进一步纯化，包括柱上DNA消化(on columnDNA digestion)。利用灵敏生物分析技术(Agilent bioanalyser technology)对经过上述步骤得到的RNA进行分析，按照制造商的指示测定质量和数量。
基因表达分析用低密度芯片(Q-PCR)得到96和48基因指纹图谱 低密度基因芯片[定量聚合链式反应(Q-PCR)法]和与OA相关的96或48基因(通过OA关节软骨Affymetrix基因芯片测定法进行鉴定)，用于评估用嗜酸细胞活化趋化因子-2或RANTES(单独或联合实施例1化合物)对患病的人软骨移植物的治疗效果。以相对标准的未感染的基因即GAPDH归一化得到的倍数变化(fold change)来表示基因表达的变化。
(iii)在鼠膝关节中对组胺诱导反应的体内功能验证 据推测，由转运肥大细胞释放的或由关节软骨细胞从头合成的组胺能诱导COX-2mRNA表达的H1依赖性增加，以及能提高滑囊液成纤维细胞和关节软骨细胞中的PGE2合成。为了评估组胺在关节病理学过程中所起的作用，建立一个药效学小鼠模型，进而使用测径器来研究组胺关节内注射(IAI)对关节肿胀的作用，并测量膝关节滑囊冲洗液中PGE2和/或Il-6的水平。
在关节内注射组胺(5μmol)之前1小时给C57Bl6成年小鼠服用载体或测试化合物。使小鼠吸入异氟烷麻醉后，向膝关节腔内注射6μl组胺/生理盐水混悬液来诱导肿胀。在1、6、12、24、36和48小时用测径器测量关节来量化肿胀。从最终的膝盖滑膜冲洗液中取样，并在膝关节滑膜冲洗液中测量炎症介质Il-6的水平。
结果 组胺诱导的关节水肿 在鼠类膝关节研究中，被关节内注射组胺的动物发生的关节水肿是被关节内注射载体的对照组动物关节水肿的5倍。该肿胀可通过氯雷他定(5.1mg/kg)治疗而得到几乎完全的消除。
关节冲洗液中的经组胺诱导的IL-6 在许多病理学病症中都观察到IL-6水平的升高，所述病症包括炎症。通过注射组胺诱导的关节肿胀导致向滑膜液中释放的IL6增加了>60％。与对照样品中测得的基线水平相比，所有剂量的地氯雷他定都显著地抑制IL-6的释放(
图1)。
总而言之，这些结果显示，组胺诱导的关节肿胀的改善与滑膜液中IL-6蛋白降低至接近基线水平有关。基于此，在这样理论的指导下，如果化合物具有限制IL-6表达的能力则预示所述化合物具有潜在的、控制膝盖肿胀的活性。
(iii)在分离的人关节软骨细胞中对组胺诱导的反应的体外功能验证 先前已有报道，组胺诱导初级软骨细胞，使之增加释放PGE2(Tetlow& Woolley 2004)。在研究中，我们观察到在分离的人软骨细胞中，组胺诱导的剂量依赖性PGE2(n＝6)的释放增加(图2)，以及观察到Cox2 mRNA表达水平的增加。这些对组胺的反应被H1R选择性拮抗剂地氯雷他定(10nM)和西替利嗪(100nM)抑制(图2)，这说明组胺刺激疼痛介质即PGE2从人软骨细胞中的释放，并且这种作用可被H1R拮抗剂消除。
在人关节软骨细胞/软骨中对CCR3介导的反应的体外功能验证 CCR3配体由于其通过增加MMPs并刺激蛋白聚糖的丧失来影响软骨的完整性，因此其被认为与骨关节炎的发病机制有关(Alaaedine等人2001；Hsu等人2004)。通过下述方法测定CCR3在人软骨移植物培养中的功能作用分析在应答CCR3配体的刺激作用时该系统中观察到的基因表达变化。在应答人移植软骨(供体KM 014_04)嗜酸细胞活化趋化因子2的刺激作用时，观察到促炎症细胞因子IL-6(14倍)和IL-8(11倍)的表达增加。重要地，CCR3配体上调金属蛋白酶MMP1(8.8倍)、MMP2(4倍)和MMP13(x3.5倍)，而内源性MMP抑制剂、TIMP 1、2或3的表达没有随之变化。还观察到聚蛋白多糖酶(aggrecanase)、ADAMTS4(3.6倍)和ADAMTS 5(6倍)的表达增强。最后，骨膜蛋白(periostin，一种被认为在OA中参与基质矿化的蛋白)在一定程度上有所增加(2倍)。Q-PCR分析和ELISA证实了这些基因表达的变化。对来自多个供体的移植软骨中的ADAMTS4、MMP13、IL-6、IL-8和MMP2mRNA的表达进行检测，在大部分OA供体中观察到，在应答CCR3配体时，mRNA表达的增加多于2倍，而这种表达可被实施例1的化合物抑制，抑制浓度为3x pA2，n＝3(图3)。{图3中右侧图表(标题为IL6的图表)的Y轴表示IL6/GAPDH的比例。} 实施例3 在患有膝盖骨关节炎的患者中，针对(I)化合物或其药学上可接受的盐进行II期、随机、双盲、安慰剂对照、平行、多中心的探索性研究，测试所述化合物或其药学上可接受的盐对临床标记物(clinical marker)、胶原转换生物标记物(biomakrker of collagen turnover)的作用，及其安全性和耐受性，所述化合物或其药学上可接受的盐以口服片剂形式给予，每天一次，进行4周。
本研究的目的是评价式(I)化合物或其药学上可接受的盐与安慰剂相比的临床效果，通过评价其相对WOMACTM分数表(WOMACTM subscale，疼痛、僵直和躯体功能)中的基线的变化，以及通过大夫和患者综合的疾病评估。初级胶原转换生物标记物计划定为CTX-II，PIIANP和uGGP(Glc-Gal-PYD)。
式(I)化合物为例如，N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺(例如其(2R)对映异构体)的苯磺酸盐。
·WOMACTM指数(WOMACTM 3.1指数)是一种官方的评分系统，使用一组24个问题。更多信息参见www.womac.org/womac/index.htm。
·CTX-II是II类胶原新抗原表位，其由MMP断裂II类胶原产生。它是软骨降解的标志物。
·PIIANP是II类胶原前胶原α链。它是软骨合成的标志物。
·uGGP是来自胶原C或N端肽的2-羟基-赖氨酸残基与来自α螺旋胶原的糖基化的羟基赖氨酸的成熟产物。它是滑膜液发炎的标志物。
·片剂包括式(I)化合物或其药学上可接受的盐、微晶纤维素、甘露醇、羧甲基淀粉钠、羟丙基纤维素和富马酸硬脂醇酯·钠盐(sodium stearylfumarate)。
权利要求
1.式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗骨关节炎或骨关节病的药物中的用途，
其中
R1是任选被卤素、氰基、C1-4烷基或C1-4卤烷基取代的苯基；
R2是氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；和
R3是具有NH或OH的基团，所述NH或OH的pKa计算值或pKa测量值为1.0至8.0。
2.权利要求1所述的用途，其中，R1是被1、2或3个如下基团取代的苯基卤素、氰基或C1-4烷基。
3.权利要求1或2所述的用途，其中，R2是氢。
4.前述任一权利要求所述的用途，其中，R3定义的酸性NH是环的一部分或是芳环或杂环上的取代基的一部分。
5.前述任一权利要求所述的用途，其中R3为如下基团或如果可能为这些基团的互变异构形式
●在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噻唑-5-基；
●在4位上具有合适的吸电子取代基的2-氧代-噁唑-5-基；
●在5位上具有合适取代基的1H-1，2，3-三唑-4-基；
●在2位上具有合适的吸电子取代基的4-氧代-1H-1，4-二氢吡啶-3-基；
●在3位上具有合适取代基、并且环上的一个或多个其它位置任选被取代的2，6-二氧-1H-1，2，3，6-四氢嘧啶-4-基；
●在2位和/或5位上具有合适的吸电子取代基、并且环上的一个或多个其它位置任选被取代的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基；
●在环上的氮具有CH2CO2H、并且环上的一个或多个其它位置任选被取代的6-氧代-1H-1，6-二氢吡啶-3-基，；
●2H-四唑-5-基；
·在任选被取代的苯基、在任选被取代的CH2O苯基、在任选被取代的萘环上的CO2H、CH2CO2H或OCH2CO2H基团；或
·在任选被取代的芳族杂环上的NHS(O)2(C1-4烷基)基团。
6.前述任一权利要求所述的用途，其中所述2-羟基基团的立体化学如下
7.前述任一权利要求所述的式(I)化合物与组胺I型受体拮抗剂的组合在制备治疗骨关节炎或骨关节病的药物中的用途。
8.在需要治疗骨关节炎或骨关节病的温血动物例如人中治疗所述疾病的方法，其包括向所述动物给予有效量的如权利要求1所述的式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
9.权利要求8所述的方法，包括联合给予有效量的式(I)化合物和有效量的组胺I型受体拮抗剂。
10.N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐。
11.N-{(2R)-3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐。
12.制备权利要求10或11所述的化合物的方法，包括在环境温度将N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺、其外消旋体或其(2R)对映异构体在合适的溶剂中用苯磺酸处理。
13.一种组合物，包含权利要求10或11所述的化合物以及载体、稀释剂或助剂。
14.权利要求10或11所述的化合物，其用于治疗或预防。
15.权利要求10或11所述的化合物在制备治疗CCR3介导的疾病的药物中的用途。
16.一种治疗CCR3介导的疾病的方法，包括向患者给予治疗有效量的如权利要求10或11所述的化合物。
全文摘要
本发明涉及式(I)化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗骨关节炎或骨关节病的药物中的用途，其中R1是任选被卤素、氰基、C1-4烷基或C1-4卤烷基取代的苯基；R2是氢、C1-6烷基或C3-6环烷基；R3是含有NH或OH的基团，所述NH或OH基团的pKa计算值或测量值为1.0至8.0。本发明还涉及N-{3-[4-(3，4-二氯苯氧基)哌啶-1-基]-2-羟基丙基}-2，3-二氢-2-氧代-4-(三氟甲基)-5-噻唑甲酰胺的苯磺酸盐，制备所述盐的方法，以及其用于治疗的用途(例如治疗CCR3介导的疾病)。
文档编号A61K31/4465GK101466378SQ200780021178
公开日2009年6月24日 申请日期2007年4月4日 优先权日2006年4月6日
发明者彼得·凯奇, 马克·弗伯, 扎拉·卡恩, 莫里斯·尼达姆, 彼得·纽汉 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司