α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途的制作方法

专利名称：：α-毒素在治疗和预防葡萄球菌感染上的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细菌感染的治疗和预防。具体而言，本发明提供治疗和预防金黄色葡萄球菌(&a/^yZococcw做re^，S.aureus)和其它细菌感染的组合物和方法，所述感染包括与耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌菌株(例如那些产生a-毒素者)相关的感染
背景技术：
：金黄色葡萄球菌细菌通常称为"staph"、"Staph,aureus"或"S.aureus"，其一般寄生在健康人的鼻子和皮肤中。约20%至30%的人口在任何给定时间都寄生有金黄色葡萄球菌。这些细菌经常在健康个体中引发轻微感染，例如丘疹和疖，但也会引发全身性感染。可将其视为条件致病菌。通常，粘膜和表皮屏障(皮肤)可抵抗金黄色葡萄球菌感染。由于损伤-例如烧伤、创伤或外科手术-所导致的这些天然屏障的中断可显著增大感染风险。危害免疫系统的疾病(例如糖尿病、肾病后期、癌症)也会增大感染风险。机会性金黄色葡萄球菌感染可变得极为严重从而引发心内膜炎、菌血症和骨髓炎，其通常导致极高的发病率或死亡率。金黄色葡萄球菌表达多种毒力因子，包括荚膜多糖和蛋白毒素。一种重要的毒力因子是a_毒素(a-溶血素)，其是由大多数金黄色葡萄球菌致病菌株产生的成孔和溶血性胞外蛋白。研究已表明，人类白血细胞、红细胞、血小板和内皮细胞特别容易受a-毒素溶血效应的影响。所述研究确立了a-毒素与人类病理生理状况的相关性。已证明抗a-毒素免疫力可抵抗毒素的有害影响，但抗a-毒素疫苗的设计仍然是重大挑战。这是因为诱导保护性免疫应答的需要必须与避免引发与毒素的生物活性相关的疾病的需要相平衡。虽然据报导对a-毒素进行化学和分子修饰可降低其毒性，但没有一例报告称修饰可完全消除a-毒素的毒性。另外，在现实中经修饰a毒素存在可能回复其毒性较强的较早期状态的风险。此使得任何经单一修饰a-毒素都不适用于人类疫苗中。6因此，业内需要可安全地赋予a-毒素和金黄色葡萄球菌细菌以免疫性的组合物和方法。本发明可满足此需要和其它需要。
发明内容本发明提供治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗、治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的方法、抗体组合物(包括静脉注射免疫球蛋白(IVIG)组合物)和制备抗体组合物的方法。在一实施例中，提供五价葡萄球菌(Staphylococcal)抗原组合物，其包括(i)金黄色葡萄球菌5型抗原、(ii)金黄色葡萄球菌8型抗原、(iii)金黄色葡萄球菌336抗原、(iv)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和(v)葡萄球菌杀白细胞素抗原。在一实施例中，至少一种葡萄球菌抗原是保护性抗原。在一实施例中，金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与5型抗原、8型抗原、336抗原、或杀白细胞素抗原中的至少一者结合。在一实施例中，相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，a-毒素抗原含有至少两处可降低其毒性的改变。在一实施例中，葡萄球菌杀白细胞素抗原选自由帕顿-瓦伦丁(Panton-Valentine)杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和Y-溶血素亚单位抗原组成的群组。在一实施例中，葡萄球菌杀白细胞素抗原是选自由下列组成的群组(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位、(iii)HlgA金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位、(iv)HlgB金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位；(v)HlgC金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位、(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD、(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE、(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM、(ix)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(x)来自中间型葡萄球菌(S.intermedius)的LukF-I亚单位、和(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。在一实施例中，组合物另外包含一或多种其它细菌抗原，例如选自由下列组成的群组的葡萄球菌抗原.，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白、和其组合。在另一实施例中，提供包含金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和医药上可接受的载剂的组合物，其中相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，所述a-毒素抗原含有至少两处可降低其毒性的改变。在一实施例中，至少一处改变是化学改变。在另一实施例中，至少一处改变是分子改变。在再一实施例中，至少一处改变是化学改变并且至少一处是分子改变。在一实施例中，分子改变是在野生型金黄色葡萄球菌a-毒素氨基酸序列中的取代、插入或缺失。在一实施例中，分子改变是在野生型金黄色葡萄球菌a-毒素氨基酸序列中的取代。在一实施例中，取代发生在野生型金黄色葡萄球菌oc-毒素中对应于His-35的位置。在一实施例中，取代是用Arg、Lys、Ala、Leu或Glu取代His。在一实施例中，分子改变是在野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基阀结构域(latchdomain)中的取代、插入或缺失。在一实施例中，分子改变是在野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基阀结构域中的缺失。在一实施例中，分子改变是在野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的干结构域(stemdomain)中的缺失。在另一实施例中提供组合物，其包含(i)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多种不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原。在一实施例中，一或多种其它细菌抗原中的至少一者是选自由下列组成的群组的其它葡萄球菌抗原金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、葡萄球菌杀白细胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白、和其组合。在一实施例中，其它葡萄球菌抗原是保护性抗原。在一实施例中，金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与一或多种其它细菌抗原中的至少一者结合。在一实施例中，相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，a-毒素抗原含有至少两处可降低其毒性的改变。在另一实施例中，提供治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包含对有需要的个体投与任一种上述抗原组合物。在一实施例中，方法另外包含投与选自由下列组成的群组的药剂抗感染剂、抗生素和抗微生物剂，例如万古霉素(vancomycin)、溶葡萄球菌素(lysostaphin)或氯林肯霉素(clindamycin)。在一实施例中，金黄色葡萄球菌感染与耐氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌相关。在一实施例中，耐氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌产生d-毒素。在另一实施例中，提供制备超免疫特异性静脉注射免疫球蛋白(IVIG)制剂的方法，其包含(i)对个体投与任一上述组合物，(ii)自所述个体采集血浆，和(iii)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。在另一实施例中，提供五价葡萄球菌抗体组合物，其包含(i)特异性结合金黄色葡萄球菌5型抗原的第一抗体、(ii)特异性结合金黄色葡萄球菌8型抗原的第二抗体、(iii)特异性结合金黄色葡萄球菌336抗原的第三抗体、(iv)特异性结合金黄色葡萄球菌ci-毒素抗原的第四抗体、和(v)特异性结合葡萄球菌杀白细胞素抗原的第五抗体。在一实施例中，第一至第五抗体中的至少一者是单克隆抗体。在一实施例中，第一至第五抗体中的至少一者是中和抗体。在一实施例中，第五抗体特异性结合选自由帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和Y-溶血素亚单位抗原组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原。在一实施例中，第五抗体特异性结合选自由下列组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位、(iii)HlgA金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位、(iv)HlgB金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位、(v)HlgC金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位、(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD、(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE、(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM、(ix)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(x)来自中间型葡萄球菌的LukF-I亚单位；禾Q(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。在另一实施例中提供保护性抗体组合物，其包含(i)特异性结合金黄色葡萄球菌8a-毒素抗原的第一抗体和(ii)至少一种特异性结合不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的细菌抗原的第二抗体。在一实施例中，第一和第二抗体中的至少一者是单克隆抗体。在一实施例中，第一和第二抗体中的至少一者是中和抗体。在一实施例中，至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由下列组成的群组的其它葡萄球菌抗原金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、葡萄球菌杀白细胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁斷LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。在一实施例中，至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和y-溶血素亚单位抗原组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原。在一实施例中，至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由下列组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位、(iii)fflgA金黄色葡萄球菌y-溶血素亚单位、(W)HlgB金黄色葡萄球菌y-溶血素亚单位、(v)fflgC金黄色葡萄球菌y-溶血素亚单位、(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD、(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE、(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM、(ix)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位、(x)来自中间型葡萄球菌的LukF-I亚单位、和(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。在一实施例中，组合物包含次优量的所述第一抗体和次优量的所述第二抗体。在一实施例中，组合物是通过包含下列步骤的方法来制备(a)对人类个体投与(i)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多种不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原，(b)自所述个体采集血浆，和(c)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。在一实施例中，方法使用与所述一或多种其它细菌抗原中的至少一者结合的金黄色葡萄球菌a-毒素抗原。在一实施例中，方法使用金黄色葡萄球菌a-毒素抗原，相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，所述抗原含有至少两处可降低其毒性的改变。在一实施例中，组合物使通过包含下列步骤的方法来制备(a)筛选尚未投与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原的人类个体，(b)自所述个体采集血浆，和(c)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。在另一实施例中，提供治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包含对有需要的个体投与任一上述抗体组合物。在一实施例中，方法另外包含投与选自由下列组成的群组的药剂抗感染剂、抗生素和抗微生物剂，例如万古霉素、溶葡萄球菌素或氯林肯霉素。在一实施例中，金黄色葡萄球菌感染与耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌相关。在一实施例中，金黄色葡萄球菌感染产生a-毒素。在另一实施例中提供中和金黄色葡萄球菌PVL感染的方法，其包含对有需要的患者投与包含以下的组合物(i)葡萄球菌杀白细胞素抗原或(ii)特异性结合葡萄球菌杀白细胞素抗原的抗体。在另一实施例中提供中和葡萄球菌杀白细胞素感染的方法，其包含对有需要的患者投与包含以下的组合物(i)金黄色葡萄球菌PVL抗原亚单位或(ii)特异性结合金黄色葡萄球菌PVL抗原亚单位的抗体。图l:用兔多克隆抗ALD/H35K免疫扩散a-毒素蛋白。具体实施例方式本发明提供治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗、治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的方法、抗体组合物(包括IVIG组合物)、和制备抗体组合物的方法。在本发明这些方面的论述中，除非另外说明，否则使用"一"和"所述"来意指"一或多"。通常认为，细菌多糖(PS)是T细胞非依赖性抗原，因此当单独投与时在初次试验人群组和幼儿中不引发显著量的抗体，即不触发回忆性免疫应答。与绝大多数细菌多糖类似，表皮葡萄球菌PS1(未与蛋白质结合)不能单独引发特异性抗体免疫应答。然而，通过以化学方式使多糖与蛋白质(PR)结合，多糖可获得T细胞依赖性抗原的性质，例如免疫记忆和长效IgG应答。蛋白质在PS-PR结合疫苗中用作蛋白载体的适宜性通常是通过测量PS特异性抗体应答来评估。在本文所述PSl-rALD/H35K结合物的情况下，蛋白载体rALD/H35K在临床上是重要的抗原并且rALD/H35K特异性抗体可中和天然a-毒素。因此，由PSl-rALD/H35K诱导的抗a-毒素抗体应答的量值在临床上很重要。疫苗组合物本发明提供包含金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的疫苗。本文所用"金黄色葡萄球菌a-毒素抗原"或"a-毒素抗原"是指任何包含金黄色葡萄球菌a-毒素抗原性部分的分子，包括全长金黄色葡萄球菌a-毒素和其片段。适用于本发明的金黄色葡萄球菌a-毒素的片段具有类似于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的抗原性质。例如，所述抗原可诱导与野生型金黄色葡萄球菌a-毒素特异性结合的抗体。金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的长度可为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个氨基酸。金黄色葡萄球菌a-毒素抗原可包含野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、或290个相邻氨基酸。在其整个长度上，金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的氨基酸序列可约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%地等同于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列(SEQIDNO:l)或金黄色葡萄球菌a-毒素的对应部分。金黄色葡萄球菌ct-毒素抗原可为重组抗原，意指抗原是通过重组DNA方法来制备。所述重组DNA方法在业内众所周知。重组金黄色葡萄球菌a-毒素抗原通常不含10在天然状态下与野生型金黄色葡萄球菌a-毒素相关的其它蛋白质和细胞组份(即存于金黄色葡萄球菌细胞中的蛋白质和细胞组份)。用于制备金黄色葡萄球菌ci-毒素抗原的例示性重组宿主是大肠杆菌(E.COli)。可首先在大肠杆菌细胞中表达抗原，随后使用(例如)亲和柱色谱自大肠杆菌纯化。相对于野生型金黄色葡萄球菌o-毒素，可用于本发明中的金黄色葡萄球菌a-毒素抗原可包含一个或一个以上氨基酸插入、取代或缺失。例如，金黄色葡萄球菌a-毒素序列内的一个或一个以上氨基酸残基可被另一用作功能等效物的具有类似极性的氨基酸取代，产生沉默改变。抗原内的取代可选自所述氨基酸所属类别中的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氮基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。或者，可实施非保守性氨基酸改变，包括以下在对金黄色葡萄球菌a-毒素抗原实施去毒的上下文中更详细论述的改变。因此，在某些实施例中，对金黄色葡萄球菌a-毒素抗原实施非保守性氨基酸改变以将其去毒。根据本发明，相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素抗原来改变金黄色葡萄球菌a-毒素抗原以降低其毒性。在一实施例中，相对于野生型抗原，所述抗原含有至少两处改变。此实施例将毒性降至最低并且同样降低了抗原回复较强毒性状态的风险。例如，抗原可含有2、3、4、5-10、10-15、15-20或更多处改变。所述改变可为"化学改变"，可为"分子改变"，或可为化学改变与分子改变的组合。出于计数改变数量的目的，将单一氨基酸或氨基酸连续序列的化学或分子改变视为单一改变。因此，本文所用两个或更多个连续氨基酸的缺失、取代或插入是"单一改变"。"化学改变"是指通过对金黄色葡萄球菌a-毒素抗原进行化学处理或将金黄色葡萄球菌a-毒素抗原结合到另一部分来达成的修饰。例如，已知用焦碳酸二乙酯对金黄色葡萄球菌a-毒素中的组氨酸实施化学修饰可降低a-毒素的溶血活性。使金黄色葡萄球菌a-毒素与其它分子结合也可降低a-毒素的溶血活性。在一实施例中，另一分子是另一细菌抗原，例如细菌多糖或细菌糖蛋白。细菌抗原可为金黄色葡萄球菌抗原或可得自其它细菌种类。例示性细菌抗原包括金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、杀白细胞素(例如PVL(包括各个PVL亚单位，LukS-PV和LukF-PV)和Y-溶血素亚单位(HlgA、HlgB禾卩HlgC)、来自金黄色葡萄球菌的LukD、来自金黄色葡萄球菌的LukE、来自金黄色葡萄球菌的LukM、来自金黄色葡萄球菌的LukF-PV、来自中间型葡萄球菌的LukF-I亚单位、或来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位)、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。因此，本发明的疫苗可包含a-毒素抗原5型结合物、a-毒素抗原8型结合物、a-毒素抗原336型结合物、a-毒素-PVL结合物、a-毒素抗原-PS1结合物、a-毒素抗原-GP1结合物、a-毒素-LTA结合物、或a-毒素-MSCRAMM结合物。类似地，本发明疫苗可包含通过结合另一分子而经改变和去毒的a-毒素抗原，所述另一分子例如另一细菌多糖、另一革兰氏(Gram)阳性细菌抗原或革兰氏阴性细菌抗原。"分子改变"是指金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的修饰。修饰可为插入、缺失或取代一个或一个以上氨基酸。分子改变可在金黄色葡萄球菌ct-毒素的任一部分中发生。在一实施例中，氨基阔结构域发生分子修饰。例如，氨基阀结构域的部分或整个氨基阀结构域(Ala'-Va严)可缺失，由此使a-毒素抗原去毒。在另一实施例中，干结构敏Lys，-Ty,8)发生分子修饰。例如，干结构域的部分或整个干结构域可缺失。在另一实施例中，形成三角区域的氨基酸残基(Pro,-Thr朋和Val149-Asp152)发生分子修饰。在再一实施例中，帽结构域发生分子修饰。在另一实施例中，边缘结构域发生分子修饰。在又一实施例中，一个或一个以上组氨酸残基经修饰，例如His35、His48、HinHis259。对His"的修饰是例示性的。例如，修饰可为His35Lys、His35Arg、His"Ala、His"Leu或His"Glu取代。His"Lys取代是一个具体实施例。其它可经修饰的例示性残基包括Asp24、Lys37、Lys58、Aspl(K)、He107、Glum、Met113、Asp127、Asp128、Gly130、Gly134、Lys147、Gln150、Asp152、Phe'153、Lys154、Val169、Asn173、Arg200、Asn214和Leu219。分子改变可通过业内熟知的方法来达成，包括基于质粒模板通过原始孔克尔(Kunkel)方法(孔克尔，TA,科学院学报(Proc.Acad.Sci.)，美国，82:488-492(1985))使用单链模板或双链DNA模板(帕普沃斯(Papworth)等人，战略OS加"g!'")，9(3):34(1996))实施引物延伸，和PCR克隆(布拉曼(Braman),J.(编辑)，体外诱变方案(INVITROMUTAGENESISPROTOCOLS),第2版，希尔曼那出版社(HumanaPress),脱托瓦(Totowa)，新泽西(2002);伊什(Ishii)等人，酶学方法(Me仇&iz;ymo/)，293，，53-71(1998);卡曼(Kammann)等人，核酸研究(7V"ddcAcWs尺".)，17:5404(1989);赫姆斯禾U(Hemsley)等人，核酸研究，17:6545-6551(1989);杰贝尔(Giebel)等人，核酸研究，18:4947(1990);兰德特(Landt)等人，基因(Gme)，96:125-128(1990);斯徳默(Stemmer)等人，生物技术(所oredim々MM)，13:214-220(1992);马里尼(Marini)等人，核酸研究，21:2277-2278(1993);和韦纟内(Weiner)等人，基因，151:119-123(1994))。业内熟知确定改变是否可降低金黄色葡萄球菌a-毒素抗原毒性的方法。a-毒素能透化细胞膜，造成细胞组份迅速外流。因此，通过习用染料排斥试验、通过测量萤光染料(例如碘化丙啶或溴化乙啶)的吸收、或通过测量ATP渗漏可方便地记录有核细胞的孔形成和死亡。可用于测量a-毒素毒性的技术包括光或萤光显微术、流式细胞术和萤光测定术。伯恩海默(Bernheimer)阐述使用红细胞来测量毒性的溶血分析。(伯恩海默，A.W.，酶学方法，165:213-217(1988))。测定溶血效价的标准程序是将红细胞悬浮液添加至经连续稀释的毒素中。在1小时内于室温下引发50%溶胞的稀释度的倒数给出溶血单位(HU)数，其可以每毫克蛋白质来表示。在通过添加1体积的2.5%红细胞悬浮液(2.5X108细胞/ml)来评价时，经纯化a-毒素的比活性在40,000HU/mg蛋白质范围内。当培养时间延长时溶血效价升高并在室温下保持4小时后达到50,000至100,000HU/mg。金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与其它分子的结合不仅降低a-毒素抗原的溶血活性，也使得可诱导对其它分子的免疫应答。实际上，分子与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的结合可改良分子的抗原特征，或提高对所述分子的免疫应答的强度。对诸如肽和寡糖等低分子量分子来说尤其如此，其自身不能诱导长期有效的免疫应答。因此，金黄色葡萄球菌ci-毒素抗原可用作有效载体蛋白。其是尤其有用的细菌抗原载体。因此，在本发明某些实施例中，使金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与另一分子结合。在一实施例中，另一分子是另一细菌抗原，例如细菌多糖或细菌糖蛋白。细菌抗原可为金黄色葡萄球菌抗原或可得自另一种细菌种类。例示性细菌抗原包括金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、杀白细胞素(例如，诸如LukS-PV和LukF-PV等帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原、诸如HlgA、HlgB和HigC等Y-溶血素亚单位抗原，和其它杀白细胞素，例如来自金黄色葡萄球菌的LukM和LukF-PV、来自金黄色葡萄球菌的LukE和LukD、来自中间型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I)、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、LTA和MSCRAMM。因此，本发明疫苗可包含a-毒素抗原5型结合物、a-毒素抗原8型结合物、a-毒素抗原336型结合物、a-毒素抗原-PSl结合物、a-毒素-杀白细胞素结合物(例如a-毒素-PVL结合物)、a-毒素抗原-GPl结合物、a-毒素-LTA结合物、或a-毒素-MSCRAMM结合物。在一实施例中，另一抗原是保护性抗原，例如所述抗原可诱导中和抗体。业内存在使金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与诸如细菌抗原等另一分子结合的方法。例如，可用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)活化PSl、5型或8型抗原来形成半胱胺衍生物。用N-琥珀酸亚胺-3-(-2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)修饰a-毒素，然后通过硫醇替换使其与PS1的半胱胺衍生物结合。可通过尺寸排除色谱法将所得结合物与未结合抗原分离。在另一实施例中，通过(例如)以下方法使金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与336抗原结合使用溴化氰或四氟硼酸l-氰基-4-二甲基氨基吡啶鐺活化336抗原上的羟基，并且通过含亲核基团的连接子或不使用连接子与a-毒素抗原结合。然后可使所产生结合物与未结合抗原分离。在另一实施例中，通过(例如)以下方法使金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与PS1抗原结合用己二酸二酰肼(ADH)通过EDC易化反应修饰PS1以制备PS1的乙二酸二酰肼衍生物(PS"h)。然后使金黄色葡萄球菌a-毒素抗原琥珀酰化并使a-毒素抗原的琥珀酸衍生物結合PSUh，此步骤是由EDC介导。其它可用的结合方法也为所属领域中所知，例如在高碘酸盐氧化后实施还原性胺化、碳化二亚胺处理、和所述方法的组合。所述方法可提供分子与a-毒素载体的直接13或间接(通过连接子》共价结合。不论使用何种方法来使分子与(X-毒素载体结合，分子与载体的共价结合都可将分子从T细胞非依赖性抗原转换为T细胞依赖性抗原。因此，结合物将在经免疫动物中引发分子特异性抗体应答，与单独投与所述分子时无此应答形成对比。本发明疫苗也可包含医药上可接受的载剂。医药上可接受的载剂是可用作抗原媒剂的材料，因为在疫苗投与的情况下所述材料是惰性的或是医学上可接受的，并且与活性剂相容。除适宜赋形剂外，医药上可接受的载剂也可含有习用疫苗添加剂，例如稀释剂、佐剂和其它免疫刺激剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂。例如，可添加聚山梨醇酯80以使聚集最小化并可将其用作稳定剂，并且可添加缓冲液来控制pH值。制备疫苗的方法通常为所属领域中所知。例如，参见迪托马索(DiTommaso)等人，疫苗(Vaccine),15:1218-24(1997)和费托姆(Fattom)等人，感染和免疫(Infect,andImmun.),58:2367-2374(1990)和64:1659-1665(1996)。本文所述的疫苗允许相对容易地添加佐剂，而不损害组合物的性质。另外，本发明疫苗也可经调配以包括"贮存"组份，从而延长抗原材料在投与位点的保持。例如，除佐剂(如果使用)夕卜，也可添加明矾(氢氧化铝或磷酸铝)、QS-21、硫酸葡聚糖或矿物油来提供此贮存效应。如上所述，本发明疫苗可包含一或多种不同于金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的细菌抗原。其它细菌抗原可与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原结合，可作为同一组合物的分开组份与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原共同投与，或可作为完全分开的组合物的一部分在投与a-毒素抗原之前、期间或之后投与。在任一情况下，其它细菌抗原都可为先前所述的抗原之一，例如细菌多糖或细菌糖蛋白，包括金黄色葡萄球菌抗原和自其它细菌种类获得的抗原。在一实施例中，其它细菌抗原为诱导中和抗体的保护性抗原。因此，其它细菌抗原可为5型和8型抗原如费托姆等人，感染和免疫，58:2367-2374(1990)和费托姆等人，感染和免疫，64:1659-1665(1996)中所述。其它细菌抗原也可为美国专利第5,770,208号、第6,194,161号、第6,537,559号中所述的金黄色葡萄球菌336抗原，或美国专利第5,770,208号和第6,194,161号中所述的葡萄球菌336抗原，或其抗体。其它金黄色葡萄球菌抗原在业内为人习知并涵盖于本发明中。例如，参见亚当斯(Adams)等人，临床微生物学杂志(/.C"".M^o&W.)，26:1175-1180(1988);瑞奈克(Rieneck)等人，生物化学生物物理学学报(5Zoc/u'm.A'o;^，A"a.)，1350:128-132(1977);和奥赖尔登(O'Riordan)等人，临床微生物学研究(CW打./^v.)，17:218-34(2004)。例如，本发明涵盖帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原，包括其各个亚单位LukF-PV和LukS-PV。类似地，本发明涵盖表皮葡萄球菌抗原。例如，也称为PS1的表皮葡萄球菌II型抗原揭示于美国专利第5,961,975号和第5，866，140号中。所述抗原是酸性多糖抗原，其可通过包含生长可凝集ATCC55254抗血清的表皮葡萄球菌分离菌(II型分离菌)的细胞的方法来获得。表皮葡萄球菌GP1抗原阐述于公开的美国专利申请案第2005/0118190号中。许多凝固酶阴性葡萄球菌菌株都具有GP1，所述菌株包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)和人葡萄球菌(Staphylococcushominis)。抗原可自以ATCC202176储存的表皮葡萄球菌菌株获得。本发明涵盖的另一葡萄球菌抗原阐述于WO00/56357中。此抗原构型中包含氨基酸和N-乙酰基化己糖胺，不含O-乙酰基并且不含己糖。其特异性结合以ATCC202176储存的葡萄球菌菌株的抗体。抗原的氨基酸分析显示丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、缬氨酸和苏氨酸以约39:25:16:10:7的莫耳比存在。氨基酸构成抗原分子的约32重量％。可用于本发明的其它抗原包括杀白细胞素。杀白细胞素(也称为(例如)双组份白细胞毒素)的种类包括(但不限于)S组份，例如LukS-PV、来自金黄色葡萄球菌的LukM、HlgA(Y-溶血素)、HlgC(Y-溶血素)、来自金黄色葡萄球菌的LukE、LukS-I(来自中间型葡萄球菌)；和F组份，例如LukF-PV、LukF-PV、HlgB(y-溶血素)、来自金黄色葡萄球菌的LukD、和LukF-I(来自中间型葡萄球菌)。本发明涵盖使用各种杀白细胞素中的任一种，包括一或多种本文所述S和F组份。因此，本发明包括组合物，其包含a-毒素抗原、一或多种其它细菌抗原和医药上可接受的载剂，其中a-毒素抗原和一或多种其它细菌抗原可分开提供，或其中a-毒素抗原与一或多种其它细菌抗原结合。一实施例涉及可用于(例如)诱导中和抗体的毒素制剂。例示性抗毒素制剂可包含(i)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原；(ii)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和杀白细胞素，例如帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原；(iii)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和一或多种PVL抗原亚单位，例如LukS-PV或LukF-PV;(i)、(ii)、和(iii)的任一组合、和其它包含a-毒素抗原的毒素制剂。在一具体实施例中，毒素制剂包含a-毒素和至少一种杀白细胞素抗原，例如至少一种PVL亚单位或至少一种Y-溶血素亚单位，例如HlgA、HlgB或HlgC。另一实施例涉及调理制剂，例如可诱导调理抗体。例示性调理制剂可包含a-毒素抗原和一或多种调理抗原，例如金黄色葡萄球菌5型、8型、或366。调理制剂也可包含杀白细胞素抗原，例如PVL抗原或一或多种PVL亚单位，例如LukS-PV或LukF-PV。一具体实施例提供五价制剂，其包含a-毒素抗原、杀白细胞素抗原(例如PVL抗原，例如PVL或一或多种PVL亚单位)、5型抗原、8型抗原、和336抗原。在另一实施例中提供包括rLukS-PV抗原的五价抗原组合物。另一实施例提供五价制剂，其包含a-毒素抗原、杀白细胞素抗原(例如一或多种Y-溶血素亚单位抗原，例如HlgA、HlgB或HlgC)、5型抗原、8型抗原和336抗原。在一实施例中，制剂同时包含表面抗原和毒素抗原，其可用于(例如)预防金黄色葡萄球菌感染。此一组合物可包含表面抗原(例如5型和/或8型荚膜抗原和/或表面多糖，例如336抗原)，以及毒素抗原(例如a-毒素抗原(例如rALD/H35K))和/或杀白细胞素抗原(例如PVL抗原或PVL亚单位(例如LukS-PV)或Y-溶血素亚单位抗原)。在一实施例中，组合物包含(i)5型-rEPA结合物，(ii)8型-rEPA结合物，(iii)336-rEPA结合物；和(iv)a-毒素抗原rALD/H35K。在另一实施例中，组合物包含(i)5型-rEPA结合物，(ii)8型-rEPA结合物，(iii)336-rEPA结合物;(iv)a-毒素抗原rALD/H35K禾P(v)rLukS-PV。在另一实施例中，组合物包含(i)5型-rEPA结合物，(ii)8型-rEPA结合物，(iii)336-rEPA结合物;(iv)a-毒素抗原rALD/H35K禾口(v)—或多种Y-溶血素亚单位抗原，例如HIgA、HIgB或HlgC。已发现某些抗原对与其它抗原相关的感染具有交叉反应性和交叉中和性。因此，例如，PVL亚单位抗原，例如LukS-PV或LukF-PV可诱导能中和与另一杀白细胞素(Y-溶血素)相关感染的抗体。反的，Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾n/或HlgC)可诱导能中和与PVL相关的感染的抗体。因此，本发明一方面包括包含一或多种PVL亚单位抗原的组合物，其可用于(例如)抵抗Y-溶血素感染。本发明另一方面包括包含一或多种Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB或HlgC)的组合物，其可用于(例如)抵抗PVL感染。因此，本发明包括包含一种类型抗原的组合物，其可用于抵抗与不同的交叉反应性抗原相关的感染。用疫苗组合物治疗和预防感染本发明也提供通过对有需要的个体投与任一上述疫苗来治疗或预防感染的方法。本文所述治疗和预防方法的目标个体群体包括经细菌病原(例如金黄色葡萄球菌)感染或有感染风险的哺乳动物，例如人类。在某些实施例中，欲治疗或预防的感染与耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌相关。在具体实施例中，耐甲氧苯青霉素的金黄色葡疫苗可与其它抗原联合投与，如上文所述。其它例示性抗原包括金黄色葡萄球菌荚膜多糖抗原(例如5型、8型、和336抗原)和其它所属领域中已知的金黄色葡萄球菌。其它例示性抗原也包括表皮葡萄球菌抗原(例如PS1抗原或GP1抗原)和其它葡萄球菌抗原，例如WO00/56357中所述抗原。其它例示性抗原包括杀白细胞素，例如帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原(例如LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亚单位抗原(例如HlgA、HlgB禾BHlgC)，和其它杀白细胞素，例如来自金黄色葡萄球菌的LukM和LukF-PV、来自金黄色葡萄球菌的LukE和LukD、和来自中间型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I。如上所述，一或多种其它抗原可与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原疫苗组合物分开投与，或可包括于金黄色葡萄球菌a-毒素抗原疫苗组合物中。鉴于上述某些抗原具有交叉反应性和交叉中和活性，本发明包括通过投与包含一种抗原的疫苗来中和与不同交叉反应性抗原相关的感染的方法。例如，本发明包括使用包含Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾卩/或HlgC)的疫苗来中和PVL感染的方法，以及使用包含PVL亚单位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)的疫苗来中和Y-溶血素感染的方法。本发明疫苗的治疗或预防有效量可通过业内常规方法来确定。熟习此项技术者可认识到，所述量可随疫苗组成、具体个体的特征、所选投与途径以及所治疗或预防的16细菌感染的性质而变化。一般性指导可见(例如)国际协调会议(theInternationalConferenceonHarmonization)的出版物以及雷明顿医药科学(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES)(马克印刷公司(MackPublishingCompany)1990)。典型疫苗剂量可在1昭至400昭抗原之间。疫苗可与或不与佐剂一起投与。若使用佐剂，则佐剂应经选择以便避免佐剂诱导毒性。例如，本发明疫苗可包含如美国专利第6,355,625号所述P-葡聚糖，或粒细胞集落刺激因子。疫苗可以任何期望剂型投与，包括可经静脉内、肌内或皮下投与人类的剂型。疫苗可以单次剂量或根据多次给药方案投与。可以任一数量的途径投与，包括皮下、皮内和静脉内。在一实施例中，使用肌内投与。熟习此项技术者可认识到，投与途径可根据待治疗或预防的细菌感染和疫苗的组成而变化。在组合疗法中，疫苗可与抗感染剂、抗生素和/或抗微生物剂一起投与。例示性抗感染剂包括(但不限于)万古霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗微生物剂包括(但不限于)耐青霉素酶的青霉素(penicimn)、头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯类(carbapenems)，包括万古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨苄西林(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacilUn)、双氯西林(dicloxacillin)、头孢菌素(cephalothin)、头孢唑林(cefazolin)、头孢力新(cephalexin)、头孢霉定(c印hradine)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、正大霉素(gentamycin)、替考拉宁(teicoplanin)、林可霉素(lincomycin)和氯林肯霉素。这些抗生素的剂量为所属—领域中所知。例如，参见默克诊断和治疗手册(MERCKMANUALOFDIAGNOSISANDTHERAPY),§13，第157章，第100版(比尔斯(Beers)和伯科(Berkow)编辑，2004)。抗感染剂、抗生素和/或抗微生物剂可于投与前组合，或可与疫苗组合物同时或依序投与。抗体本发明另外提供包含特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的抗体("a-毒素抗体")和特异性结合另一细菌抗原的抗体("细菌抗原抗体")的组合物。金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和另一细菌抗原可为任何天然存在的a-毒素或另一细菌抗原，或可为任一上述抗原。抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或其任一组合。抗体可与医药上可接受的载剂一起调配。本文所用术语"抗体"是指全长(即天然存在的或通过标准免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，包括抗体片段。本文所用"抗体"与"免疫球蛋白"同义。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。无论结构如何，抗体片段都与全长抗体可识别的同一抗原结合，并且在本发明上下文中特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原或另一细菌抗原。制备和筛选抗体片段的方法在业内为人所熟知。本发明的a-毒素抗体或细菌抗原抗体可通过多种不同方法来制备。例如，抗体可自经投与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和/或细菌抗原的个体获得。抗体也可自经针对a-毒素抗体和/或细菌抗原抗体筛选的血浆获得，其在下文中有更详细的论述。在某些实施例中，抗体可通过重组方法来制备。制备重组单克隆抗体的方法在业内为人习知。重组多克隆抗体可通过与美国专利申请案第2002/0009453号(赫若姆(Haurum)等人)中所阐述者类似的方法使用金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和/或细菌抗原作为免疫原来产生。本发明的(x-毒素抗体或细菌抗原抗体可为鼠类、人类或人化抗体。人化抗体是其中抗体CDR来自一个物种的重组蛋白；例如，将啮齿动物、兔、狗、山羊、马、或鸡抗体(或任何其它适宜动物抗体)自啮齿动物抗体的可变重链和轻链转移至人类重链和轻链可变结构域中。抗体分子的恒定结构域衍生自人类抗体的恒定结构域。制备人化抗体的方法已为所属领域中所熟知。可通过习用方法来获得上述抗体。例如，可将a-毒素抗原和/或其它细菌抗原投与个体并通过标准方法由自所述个体采集的血桨纯化所得IgG。用于获得抗体的抗原可为任何天然存在的抗原、任何上述抗原、或所属领域中已知的任何其它抗原。在一实施例中，根据上述教示使得用于获得a-毒素抗体的金黄色葡萄球菌a-毒素抗原为无毒的。抗体组合物本发明包括适合投与的抗体组合物，例如包含抗体和医药上可接受的载剂的组合物。抗体组合物可通过所属领域中已知的方法经调配用于任何投与途径，包括静脉内、肌内、皮下和经皮。在一实施例中，抗体组合物提供治疗或预防有效量的抗体，即足以达成治疗或预防有益作用的量。在另一实施例中，抗体是保护性抗体组合物，其中和感染和/或提供抗感染的保护作用。在一实施例中，抗体组合物是IVIG组合物。如本文所用，"IVIG"是指适于静脉内投与的免疫球蛋白组合物。除免疫球蛋白外，IVIG组合物也可含有医药上可接受的载剂。IVIG组合物可为"特异性IVIG"，意指IVIG含有特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和/或其它期望细菌抗原(如上所述)的免疫球蛋白。IVIG组合物也可为"超免疫特异性IVIG"。"超免疫特异性IVIG"是指包含高效价的a-毒素抗体的抗体制剂。超免疫特异性IVIG制剂可由已受目标金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和/或其它期望细菌抗原攻击的个体的血浆来制备，或可通过对尚未投与抗原的个体的血浆进行高抗体效价筛选来获得。在每一种情况下，个体都可为人类或动物。在一实施例中，特异性IVIG组合物既包含特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原(和视情况中和a-毒素抗原)的抗体也包含特异性结合其它细菌抗原(和视情况中和其它细菌抗原)的抗体。抗体和抗原可为先前所述抗体和抗原中的任一种。例如，其它细菌抗原可为多糖并且可为糖蛋白，包括金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、杀白细胞素组18份(例如PVL(包括各个PVL亚单位LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亚单位(HlgA、HlgB和HlgC)、来自金黄色葡萄球菌的LukE或LukD、来自金黄色葡萄球菌的LukM或LukF'-PV、来自中间型葡萄球菌的LukF-I或LukS-I亚单位)、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。一实施例涉及抗毒素制剂。例示性抗毒素制剂可包含(i)特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的抗体；(ii)特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的抗体和特异性结合杀白细胞素(例如帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL))抗原的抗体；(iii)特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的抗体和特异性结合杀白细胞素亚单位抗原(例如PVL抗原亚单位)的抗体，例如特异性结合LukS-PV或LukF-PV的抗体；(i)、(ii)和(iii)的任一组合，和其它包含特异性结合ci-毒素抗原的抗体的抗毒素制剂。在一具体实施例中，抗毒素制剂包含特异性结合a-毒素的抗体和特异性结合PVL、LukS-PV或LukF-PV或特异性结合另一杀白细胞素(例如Y-溶血素亚单位，例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗体。另一实施例涉及调理抗体制剂，其包含调理抗体。例示性调理抗体制剂可包含特异性结合a-毒素抗原的抗体和一或多种调理抗体，例如特异性结合金黄色葡萄球菌5型、8型或366的抗体。调理抗体制剂也可包含特异性结合杀白细胞素抗原(例如PVL抗原)的抗体，或特异性结合一或多种PVL亚单位(例如LukS-PV或LukF-PV)的抗体，或特异性结合Y-溶血素亚单位(例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗体。一具体实施例提供五价制剂，其包含特异性结合a-毒素抗原结合的抗体，特异性结合杀白细胞素抗原(例如PVL抗原(例如PVL或一或多种PVL亚单位)或y-溶血素亚单位(例如HlgA、HlgB或HlgC))的抗体，特异性结合5型抗原的抗体，特异性结合8型抗原的抗体，和特异性结合336抗原的抗体。因此，某些实施例提供包含具中和性(例如抗a-毒素抗体)和/或调理性(例如抗荚膜或表面抗原的抗体)的单克隆和/或多克隆抗体的组合物。一种组合物包含特异性结合5型抗原单克隆和/或多克隆抗体、特异性结合8型抗原的抗体、特异性结合336抗原的抗体和特异性结合a-毒素抗原rALD/H35K的抗体。另一组合物特异性结合5型抗原的包含单克隆和/或多克隆抗体、特异性结合8型抗原的抗体、特异性结合336抗原的抗体、特异性结合a-毒素抗原的抗体和特异性结合rLukS-PV的抗体。。另一组合物包含特异性结合5型抗原的单克隆和/或多克隆抗体、特异性结合8型抗原的抗体、特异性结合336抗原的抗体、特异性结合a-毒素抗原的抗体和特异性结合丫-溶血素亚单位(例如HlgA、HlgB或HlgC)的抗体。另一实施例涉及具交叉反应性，交叉中和性的抗体组合物。例如，本发明包括包含对一种抗原具特异性并且对另一抗原具有交叉反应性和交叉中和性的抗体的组合物。例如，本发明包括包含对Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB禾卩/或HlgC)具有特异性的抗体的组合物，其可用于(例如)抵抗PVL感染，并且包括包含对PVL亚单位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)具有特异性的抗体的组合物，其可用于抵抗Y-溶血素感染。如上所述，本发明提供抗体组合物，其提供抗体的治疗或预防有效量，即足以达成治疗或预防有益效应的量。在另一实施例中，抗体是保护性抗体组合物，其可中和感染和/或提供抵抗感染的保护作用。所述保护性组合物可包括保护量的a-毒素抗体和保护量的抵抗另一细菌抗原的抗体。或者，保护性抗体组合物可包含次优量的抗a-毒素抗体和次优量的抵抗另一细菌抗原的抗体。本文所用"次优"(sub-optimal)量意指自身不具有保护性的量，即自身不能有效中和感染或提供抗感染保护的量。虽然这些组合物所包含抗体量自身无效，却可通过各抗体组合的协同活性来中和感染和/或提供抵抗感染的保护作用。在一具体实施例中，组合物包含次优量的抗a-毒素抗体和次优量的金黄色葡萄球菌5型抗体。在另一具体实施例中，组合物包含次优量的抗a-毒素抗体和次优量的金黄色葡萄球菌8型抗体。制备IVIG组合物的方法
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：本发明也提供制备包括特异性IVIG组合物和超免疫IVIG组合物在内的IVIG组合物的方法。任一上述抗原组合物都可用于制备IVIG组合物。在一实施例中，通过以下方法制备IVIG组合物:对个体投与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和其它细菌抗原，然后自所述个体采集血浆并自血浆纯化免疫球蛋白d金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和其它细菌抗原可为任一上述抗原，包括野生型抗原，和可诱导中和抗体的保护性抗原，并且可将其调配于任一上述疫苗中。因此，其它细菌抗原可为多糖并且可为糖蛋白，并且在一实施例中选自下列抗原金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、杀白细胞素类(例如杀白细胞素组份，例如帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原(例如LukS-PV和LukF-PV)、Y-溶血素亚单位抗原(例如HlgA、HlgB和HlgC)、和其它杀白细胞素(例如来自金黄色葡萄球菌的LukM和LukF'-PV、来自金黄色葡萄球菌的LukE或LukD、来自中间型葡萄球菌的LukS-I和LukF-I))、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。细菌抗原可与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原结合。在一实施例中，相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，金黄色葡萄球菌a-毒素抗原含有至少两处可降低其毒性的改变，如上所述。受到抗原(例如金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和其它细菌抗原)攻击或投与的个体可为人类或可为另一动物，例如小鼠、兔、大鼠、鸡、马、狗、非人类灵长类动物或任一其它适宜动物。特异性结合抗原的抗体可通过习用血浆分级分离方法自动物血浆获得。在另一实施例中，IVIG组合物是通过以下方法来制备筛选尚未投与抗原的个体，例如尚未投与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和另一细菌抗原的个体(即未受到刺激的个体)，然后自所述个体采集血浆并自血浆采集免疫球蛋白。在此实施例中，对来自未经刺激个体的血浆进行高效价抗体筛选，所述抗体特异性结合抗原，例如金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和其它细菌抗原。抗原可为任一上述抗原。例如，其它细菌20抗原可为多糖并且可为糖蛋白，并且可选自金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、杀白细胞素(例如PVL(包括各个PVL亚单位，LukS-PV和LukF-PV)或Y-溶血素亚单位(HlgA、HlgB或HlgC)、来自金黄色葡萄球菌的LukE或LukD、来自金黄色葡萄球菌的LukM或LukF-PV、来自中间型葡萄球菌的LukF-I或LukS-I亚单位)、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。根据一实施例，筛选a-毒素抗体和/或其它细菌抗体效价为标准IVIG制剂中常见效价的2倍或更高、3倍或更高、4倍或更高、或5倍或更高的血桨。同样，待筛选个体可为人类或可为另一动物，例如小鼠、兔、大鼠或非人类灵长类动物。免疫球蛋白可通过习用血桨分级分离方法自动物血浆获得。用抗体组合物治疗和预防感染本发明也提供治疗或预防感染的方法，其是通过对有需要的个体投与上述抗体组合物(例如上述IVIG组合物)来达成。治疗和预防感染的目标患者群体包括感染细菌病原菌或有感染风险的哺乳动物，例如人类。在一实施例中，待治疗或预防的感染是金黄色葡萄球菌感染，包括耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌或产生a-毒素的金黄色葡萄球菌的感染或表皮葡萄球菌感染。根据一实施例，本发明提供使用包含金黄色葡萄球菌a-毒素抗体、特异性结合另一金黄色葡萄球菌抗原的抗体、和医药上可接受的载剂的组合物治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法。金黄色葡萄球菌a-毒素抗体和结合另一金黄色葡萄球菌抗原的抗体可为任一上述抗体。在一实施例中，抗体组合物是IVIG组合物或超免疫特异性IVIG组合物。在另一实施例中，抗体是重组或人化抗体。在另一实施例中，抗体为单克隆抗体。鉴于上述某些抗原具有交叉反应性和交叉中和活性，本发明包括中和与一种抗原相关的感染的方法，其是通过投与包含对与第一抗原交叉反应和交叉中和的不同抗原具有特异性的抗体的抗体组合物(包括IVIG组合物)来达成。例如，本发明包括使用包含Y-溶血素抗原(例如HlgA、HlgB和/或HlgC)特异性抗体的抗体组合物或IVIG来中和PVL感染的方法，以及使用包含PVL亚单位抗原(例如LukF-PV和LukS-PV)特异性抗体的抗体组合物或IVIG来中和Y-溶血素感染的方法。抗体组合物的治疗或预防有效量可通过业内常规方法来确定。熟习此项技术者可了解，所述量可根据组合物中具体抗体、组合物中抗体含量、投与频率、待治疗或预防的感染的严重性、和个体细节(例如年龄、体重和免疫情况)来改变。在某些实施例中，剂量可为至少50mgIVIG组合物/kg体重(mg/kg)，包括至少100mg/kg、至少150mg/kg、至少200mg/kg、至少250mg/kg、至少500mg/kg、至少750mg/kg和至少1000mg/kg。单克隆抗体组合物的剂量通常较低，例如是IVIG组合物剂量的1/10，例如至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约15mg/kg、至少约20mg/kg、或至少约25mg/kg。投与途径可为适合灭活疫苗的任一途径。因此，可想到静脉内、皮下、肌内、腹膜内和其它投与途径。如上所述，抗体的治疗或预防有效量是足以达成治疗或预防有益效应的量。保护性抗体组合物可中和和/或预防感染。保护性抗体组合物可包含自身不具有保护作用但在组合时可产生保护性抗体组合物的量的抗a-毒素抗体和/或抵抗另一细菌抗原的抗体。在组合疗法中，抗体组合物可与抗感染剂、抗生素和/或抗微生物剂一起投与。例示性抗感染剂包括(但不限于)万古霉素和溶葡萄球菌素。例示性抗生素和抗微生物剂包括(但不限于)耐青霉素酶的青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类，包括万古霉素、溶葡萄球菌素、青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、萘夫西林、氯唑西林、双氯西林、头孢菌素、头孢唑林、头孢力新、头孢霉定、头孢孟多、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、正大霉素、替考拉宁、林可霉素和氯林肯霉素。这些抗生素的剂量为所属领域中所知。例如，参见默克诊断和治疗手册，§13，第157章，第100版(比尔斯和伯科编辑，2004)。抗感染剂、抗生素和/或抗微生物剂可在投与之前组合，或与IVIG组合物同时或依序投与。在某些实施例中，投与相对少剂量的抗体组合物，例如一或两剂，并且采用习用抗生素疗法，其通常涉及于数天或数周内投与多份剂量。因此，可在一段时间内(例如在至少5天、IO天或甚至14天或更多天内)一次、两次或三次或多次投用抗生素，而抗体组合物通常仅投与一次或两次。然而，熟习此项技术者可选择并调节抗体组合物和抗生素的不同剂量、投药时间和相对量。以下实例仅为阐释性而非限制性，并且提供对本发明的更全面理解。实例1此实例说明大肠杆菌(Escherichiacoli.)中重组a—毒素突变体ALD/H35K(rALD/H35K)的克隆和表达。rALD/H35K含有氨基阀缺失(ALD)和在氨基酸35位上的点突变(由组氨酸到赖氨酸)(H35K)。无组氨酸-6-标记的重组a-毒素突变蛋白rALD/H35K的表达构建体是根据下文来制备。用预先制备的经组氨酸标记的构建体pTrcHis-ALD/H35K对ALD/H35K基因实施PCR扩增。引物经设计而去除组氨酸标记并分别在氨基和羧基末端纳入Ncol和BamHI限制位点。在扩增和限制酶切消化后，在Ncol和BamHI限制位点处将ALD/H35K基因连接入英杰(Invitrogen)pTrcHisB载体。通过使用Ncol限制位点的ATG来启动转译，去除载体编码的组氨酸标记和肠激酶裂解位点。结果是表达无额外N末端氨基酸的蛋白质。使用NcoI和BamHI对pTrcffis-B实施双限制酶切消化。然后使用PCR反应来产生无His6标记的双突变体ALD/H35K。PCR反应的引物是ALD-F(5'-GGCAGCATGCCATGGCAAATACTACAGTAAAAAC-3')(SEQIDNO:1)禾口AGO-2(5'-GGAATTCGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC-3')(SEQIDNO:2)。在PCR后，实施琼脂糖凝胶电泳。在分析并拍摄凝胶后，将凝胶置于UV透射仪上并切除载体和插入片段(PCR产物)。使用基质凝胶提取系统自琼脂糖片层中提取载体和插入片段。对PCR产物实施乙酸铵/乙醇沉淀，之后使用NcoI和BamHI对凝胶提取插入片段实施双限制酶切消化。然后对经消化插入片段实施二氧化硅树脂纯化。根据基因选择(Genechoice)TM快速连接试剂盒(RapidLigationKk)上的操作指示连接载体与插入片段。然后将连接产物转化入GC10感受态高效细胞中，所述细胞在转化板上生长。然后通过"菌落PCR"实施筛选。生长产生适当大小扩增子(约800bp)的菌落的过夜培养物。制备优良无性系的珠粒原液和小量制剂。对小量制剂实施限制性酶消化分析并出于测序目的对所述小量制剂实施定量。使用以下四种引物实施测序pTrcffis-正向(5'-GAGGTATATATTAATGTATCG-3')(SEQIDNO:3)、正向-1(5'-GGTACCATTGCTGG-3')(SEQIDNO:4)、正向-2(5'-CGATTGGTCATACACTG-3')(SEQIDNO:5)和正向-3(5'-CCAGACTTCGCTAC-3')(SEQIDNO:6)。测序检验插入片段的正确DNA序列。也自珠粒原液生长培养物并且在细胞溶解后通过SDS-PAGE分析蛋白表达。rALD/H35Ka-毒素突变体的可溶性过度表达得到证实。实例2此实例阐述构建缺少来自金黄色葡萄球菌的野生型a-毒素的毒性或溶血活性的a-毒素突变体。构建His35取代/缺失、氨基阀缺失(ALD)和干缺失(SDD)突变体以裂解七聚孔。据信这些区域在孔形成中具有关键作用。制备突变体作为重组蛋白，并且是通过PCR克隆技术来构建。然后用IPTG诱导突变体来表达蛋白，并评价所述突变体的毒性/溶血活性。使用普洛麦格(Promega)的WizardTM基因组DNA纯化试剂盒自金黄色葡萄球菌伍德(Wood)46菌株来纯化基因组DNA。使用下表1和2中列出的引物组合来实施PCR。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>然后对PCR扩增DNA片段和pTrcffisB载体DNA实施双限制酶切消化，之后对经消化DNA实施乙酸铵和乙醇沉淀。连接经限制酶切消化和乙醇沉淀的插入片段和载体DNA，并且用经连接DNA转化感受态大肠杆菌细胞并使其在琼脂板上生长。然后挑取菌落并制备质粒制剂。然后用BamHI和NcoI酶消化质粒并在琼脂糖凝胶上运行以筛选重组体。自重组体制备珠粒原液并测序。将测序结果与野生型a-毒素的序列匹配，并证明存在期望突变。也对突变体实施IPTG诱导和表达。突变体以可溶和不溶形式以不同方式表达。通过SDS-PAGE来确认表达。实例3此实例阐述无his标记的rALD/H35Ka类毒素的纯化和定性。用溶菌酶裂解含有表达质粒并且经诱导可表达rALD/H35Ka类毒素的细胞。然后用脱氧胆酸(DOC)溶解细胞膜。然后通过超声波处理降低细胞裂解物的粘度，之后用Dnase和Rnase酶来消化DNA/RNA。通过离心去除细胞碎片，并且倾析出含有o类毒素的上清液用于进一步处理。使用填充有ToyopeariTM苯基(Phenyl)650M树脂的柱对上清液实施色谱。使用考马斯(Coomassie)染色方法通过SDS-PAGE分析苯基650柱流份，并且对根据a类毒素的纯度和量选择的经汇集流份实施透析过滤。使用填充有安玛西亚汽巴克隆蓝色速流(AmershamCibacronBlueFastFlow)TM树脂的柱进一步实施色谱。再次通过SDS-PAGE分析柱流份，并对根据a类毒素的纯度和量选择的经汇集流份再次实施透析过滤。再使用填充有陶瓷羟基磷灰石(CHT)的柱实施色谱。通过SDS-PAGE分析来自CHT柱的流份，并根据流份中的a类毒素纯度和量汇集所选流份。整个纯化过程概述于下文中。用溶菌酶实施细胞壁消化用脱氧胆酸实施细胞膜溶解通过超声波处理降低粘度■■.+-用DNase禾BRNase消化DNA/RNA将硫酸铵浓度调节至1.5M通过离心实施澄清4—用苯基650M实施色谱实施缓冲液更换并用汽巴克隆蓝色速流(CibacronBlueFastFlow)实施色谱实施缓冲液更换并用陶瓷羟基磷灰石实施色谱通过BCA、SDS-PAGE和尺寸排除色谱法确认蛋白含量、纯度和分子量。用蛋白质印迹法和N末端测序鉴定rALD/H35Ka类毒素。夹心式ELISA显示，纯化过程获得12%的rALD/H35Ka类毒素的回收率。对rALD/H35Ka类毒素实施标准溶血分析显示所述类毒素不具有溶血活性。实例4此实例阐述对用作制备PS蛋白结合物的载体蛋白的ot-毒素的纯化和定性。构建H35K/ALD(rALD/H35K)双突变体并在大肠杆菌中过度表达。首先使用Ni-NTA(填充镍)亲和柱纯化突变体，然后通过使用陶瓷羟基磷灰石柱实施进一步纯化。通过免疫扩散和溶血活性评估a-毒素的抗原性和毒性。通过B-PER利用Benzonase和PMSF裂解大肠杆菌细胞。实施离心并收集上清液。使用Ni-NTA柱实施色谱并通过SDS-PAGE分析收集到的流份。汇集a-毒素流份并通过BCA蛋白分析法来分析总蛋白。使用HTP柱通过色谱进一步纯化经Ni-NTA纯化的a-毒素并通过SDS-PAGE再次分析所收集流份。然后汇集含a-毒素流份，浓縮并分析。所述纯化过程概述于下26文中。重组a-毒素H35K/ALD突变体蛋白纯化图细胞浆液(20g)细胞裂解iNi-NTA亲和柱(汇集第24-34号流份)5K-TFF透析过滤夜更换)亲和柱)第44-52号5K或10K搅拌细胞浓度最终经纯化重组a-毒素通过免疫扩散测试经纯化a-毒素突变体的同一性和抗原性。也对a-毒素突变体实施标准溶血分析，并表明所述突变体不具有可检测到的溶血活性。实例5此实例阐述可通过投与埃尔塔斯蒂夫(AltaStaph)以及所获得可抵抗重组ALD/H35Ka-类毒素突变体的a-毒素特异性抗体来达成针对高a-毒素产量金黄色葡萄球菌分离菌的协同被动保护作用。埃尔塔斯蒂夫TM(纳比生物制药公司(Na1^Biopharmaceuticals),罗克韦尔(RockviUe)，马里兰州(Maryland))含有高含量的抵抗金黄色葡萄球菌荚膜多糖5型和8型抗原的抗体。埃尔塔斯蒂夫TM是通过用包含荚膜多糖金黄色葡萄球菌5型和8型抗原的斯蒂夫VAX(纳比⑧生物制药公司，罗克韦尔，马里兰州)免疫健康人类志愿者来产生。目前生产的埃尔塔斯蒂夫TM是pH为6.2且存于0.075氯化钠、0.15M甘氨酸和0.01%聚山梨醇酯80中的无菌可注射5%人类血浆蛋白溶液。每lmL溶液含有50mg蛋白，其中超过96%的蛋白是IgG免疫球蛋白。IgA和IgM类是以Sl.Og/L部分iiBioRad-HTP1柱纯化(缓冲iBioRad-H'(汇集三次运27的浓度存在。将80只雌性BALB/c小鼠随机置于干净笼中并于研究开始前隔离6天。在细菌攻击前24小时，将抗体剂量投与至每组IO只小鼠的腹膜腔内。基于各抗体治疗的组名称阐述于表3中。表3(基于抗体治疗的研究组名称)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>金黄色葡萄球菌5型328分离菌是高a毒素产量分离菌，在37。C下经约20小时在10mL哥伦比亚(Columbia)Mg/CaCl2培养基中以200rmp恒定振荡使其生长过夜。第二天，使细菌在PBS中悬浮至在540nm下O.D.为0.1。此O.D.表示约2x107CFU/ml的浓度，之后以25mL总体积将其连续调节至约2xl(^CFU/ml。将经稀释细菌悬浮液置于冰上，准备与新制备的猪粘蛋白一起实施细菌攻击。在室温下经5至10分钟恒定搅拌将5克猪粘蛋白溶解于50mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。在混合后，以未包裹循环将悬浮液高压蒸汽灭菌IO分钟，将悬浮液用冰冷却并转移至存于冰填充容器中的动物设施中。在注射时，将细菌悬浮液悬浮于等体积10%猪粘蛋白中，装入3mL注射器中，并使用安装有25GS"针头的注射器将500pL注射至小鼠腹膜腔内。所计算实际攻击剂量是5.81x1()4CFU/500nL攻击。在第16、24、41、48、65、168小时记录每一组的攻击后发病率和死亡率。在攻击后第5天结束研究。每个单独经治疗组的存活数据概述于下表4中。经投与补充有4mga-类毒素(rALD/H35双突变体)衍生总兔IgG的200ugT5CP特异性IgG(埃尔塔斯蒂夫顶IGIV)的小鼠显示100%保护。经补充有2mg或lmg类毒素IgG的埃尔塔斯蒂夫免疫的小鼠保护程度降低。攻击5天后，2mg总IgG剂量的存活率为90%，而1mg剂量为60%。相反，未经补充的埃尔塔斯蒂夫具有30%存活率，而对于类毒素IgGMEPIGIV未观察到保护作用。表4埃尔塔斯蒂夫IGIV+a-类毒素(rALD/H35K)IgG抵抗分泌高毒性a-毒素的金黄色葡萄球菌的协同被动保护<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>5'GGAATTCGTGGATCCTTAATTTGTCATTTCTTC3'H35K-F:编码H35K突变的正向引物5'GAAAATGGCATGAAAAAAAAAGTATTTTATAGH35K-R:编码H35K突变的反向引物5'CTATAAAATACTTTTTTTTTCATGCCATTTTG3'CTH-R:编码His6标记终止密码子和BamHI位点的C末端引物5,AG01:编码NcoI位点、起始密码子、和之后的hla基因的N末端引物5'GGCAGCATGCCATGGCAGATTCTGATATTAAT3'根据制造商(英杰)所述程序或使用Ncol和BamHI位点将PCR产物克隆入pTrcHisB中。另外，随后将含有hla-ALD/H33K基因的NcoI-BamHI插入片段亚克隆入pET28(诺瓦真(Novagen))中。使用制造商的方案(基因选择)将所得构建体转化入大肠杆菌GC10细胞中。使用ABIPRISM染料终止子循环测序仪实施测序。将所有具有正确序列的无性系都转化入大肠杆菌GC10或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。实例7.rALD/H35K的表达和纯化在振荡烧瓶中，在37i:下于选择性培养基中培养含rALD/H35K质粒的大肠杆菌菌株GC10或BL21(DE3)pLysS直至对数中期，并使用1mM终浓度的IPTG诱导2至3小时。通过离心釆集细胞。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来分析振荡烧瓶培养物，显示在诱导前不明显的表观分子量为32KDa的区带。观察到的此分子量与存在的突变一致，而野生型重组a-毒素具有34KDa的表观分子量。将沉淀的细胞重新悬浮于20mMTris-HCl、50mMNaCl，pH8中并在室温下用2mg/g溶菌酶糊剂处理20分钟，随后用0.25%(w/v)脱氧胆酸裂解细胞膜并用美索尼克斯(Misonix)超声仪实施超声处理。将经裂解细胞悬浮液与等体积2.25M(NH4)2S04、20mMNa2HP04,pH7.0缓冲液混合。通过离心收集细胞裂解物的上清液。在Toyopearl苯基-650M上对可溶性蛋白实施色谱。使用1.5至0M(NH4)2S04和0至20%甘油存于20mMNa2HP04，pH7.0缓冲液中的线性梯度洗脱结合的rALD/H35K突变体。汇集含rALD/H35K的流份并以20mMTris，100mMNaCl，5%甘油，pH7.0透析过滤。将所得经透析过滤流份施加至蓝色琼脂糖(BlueSepharose)6FF柱上并用0.1至2.5MNaCl存于20mMTris，5%甘油，pH7.0缓冲液中的线性梯度洗脱。汇集含rALD/H35K流份并以20mMTris,100mMNaCl,5%甘油，pH6.8透析过滤。然后在陶瓷羟基磷灰石1型柱上使用100至750mMNaCl存于20mMNa2HP04，5%甘油pH6.8缓冲液中的线性梯度对渗余物实施色谱，其产生纯rALD/H35K。对于蛋白质印迹分析，将蛋白质转移至PVDF膜并使用a-毒素突变体的一级单克隆抗体使用所属领域中己知的标准程序加以处理。印迹证实存在大致在约32kDa处具有区带的rALD/H35K抗原。另外，rALD/H35K的N末端测序证实存在hla-ALD/H35K基因产物。使用同一方法纯化a-毒素突变体rALD和rH35K。实例8a-毒素rALD/H35K多克隆抗体的生成以1:1比率分3次将rALD/H35K(50昭)与佐剂(CFA，随后为IFA)—起注射至新西兰白兔(NewZealandWhiterabbit)中，中间相隔2周。在针对抗原的免疫扩散分析中rALD/H35K抗血清将rALD/H35K和天然金黄色葡萄球菌a—毒素(里斯特生物实验室(ListBiologicalLaboratories))识别为相同的抗原。rALD/H35K抗血清同时识别野生型和突变a-毒素二者，如蛋白质印迹和ELISA所示。这些结果表明，rALD/H35K疫苗产生可与天然a-毒素反应的抗体。合并阳性血并在蛋白G柱上纯化IgG。然后将经纯化抗ALD/H35KIgG用于动物模型中。实例9a-毒素抗原的免疫化学分析在1%琼脂糖凝胶中实施双免疫扩散来测定rALD/H35K抗血清的特异性，以及测定a-毒素抗原的抗原性。简单来说，在湿环境下使10)aL/孔200昭/mL的每种a-毒素抗原(外部孔)和10pL/孔rALD/H35K抗血清(中央孔)透过凝胶扩散过夜。然后在PBS中洗涤琼脂糖凝胶并加压，干燥并用考马斯蓝染色。对凝胶实施沉淀素带分析，所述沉淀素带是在抗原与抗体结合在一起形成抗体-抗原复合体时形成D当将两种具有与抗血清反应的共享表位的抗原置于毗邻孔中并对相同抗血清扩散时，其沉淀素线将融合在一起形成"一致性线"。当在两种抗原中并不同时存在所有与来自抗血清的Ab反应的表位时，在两种抗原间形成部分一致性线(在两条沉淀素线的交汇点处的突起)。四种蛋白，即自金黄色葡萄球菌纯化的天然a-毒素(里斯特生物实验室)、和重组突变体rALD/H35K、rALD和rH35K，其每一种都与抗rALD/H35K血清反应为单沉淀素带，其形成一致性线，表明针对rALD/H35K产生的抗血清可将天然金黄色葡萄球菌a-毒素、和突变体rALD和rH35K和rALD/H35K识别为相同或极为类似的抗原。图1。实例IOa-类毒素杂交瘤生成用rALD免疫BALB/c小鼠。在此研究中自小鼠收集经免疫脾细胞，并使用50%聚乙二醇使其与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。将融合细胞再悬浮于选择培养基中，接种于96孔组织培养板中并在具有8%C02的37。C培养器中及增湿条件下培养。在涂布有经纯化rALD抗原的ELISA板上筛选生长培养物上清液中的单克隆抗体(MAb)分泌者。在连续2次克隆过程后生成若干杂交瘤并且建立11个MAb分泌者。自这些无性系建立的大量培养物产生接种原液，并利用这些无性系产生小鼠腹水，自小鼠腹水制备经纯化MAb并对其实施进一步定性。实例lla-毒素单克隆抗体的定性定性分析揭示，在如上所述制备的11种经建立a-毒素(Alt)MAb中有9种在蛋白质印迹评估中特异性结合天然金黄色葡萄球菌a-毒素(里斯特生物实验室)，而11种中有2种不识别天然a-毒素。所有具有蛋白质印迹阳性的MAb在红血细胞(RBC)溶血实验(参见实例15)中都可中和野生型a-毒素。同种型评估揭示所有11种已建立MAb都是IgGlK亚类。由已建立无性系的大量培养物产生接种原液，其也用于产生小鼠腹水，自小鼠腹水制备经纯化MAb并对其实施进一步定性。实例12通过溶血分析在活体外测定细胞毒性活性在含有0.85呢氯化钠(NaCl)，pH7.2的10mMTris-HC1溶液(稀释/洗涤缓冲液)中制备1.0Mg/mL的经纯化a-毒素溶液。在96孔板上对a-毒素抗原实施连续2倍稀释。每一分析板上都包括仅含有缓冲液(无a-毒素)的细胞对照孔。将兔RBC(科罗拉多血清(ColoradoSerum)公司，目录号CS1081)连续洗涤2次，每次洗涤是以10体积实施，然后用洗涤缓冲液重新调整至初始浓度。将等体积RBC悬浮液添加至含有a-毒素和洗涤缓冲液的各孔中。在37t下将板培养30分钟以使a-毒素裂解RBC。然后将板离心以沉淀所有RBC和细胞碎片，继而在另一聚苯乙烯ELISA板的对应孔中用洗涤缓冲液对各上清液进行稀释。借助于ELISA板读数器在450nm处测量上清液的光学密度(OD)，在报告数据前减去作为背景的细胞对照(无毒素)0D。然后计算由a-毒素活性导致裂解的RBC的百分率。使用于0.5pg/mL天然金黄色葡萄球菌a-毒素或0.5pg/mL野生型重组a-毒素时观察到完全或接近100%的溶血(表5)。然而，在此分析中使用多于185倍以上的rALD/H35K抗原(92.8昭/mL)时未检测到可测量溶血活性。这些结果表明，rALD/H35K在活体外不具有溶血性且因此rALD/H35K可用作疫苗来产生与金黄色葡萄球菌天然a-毒素反应的抗体。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实例13金黄色葡萄球菌a-毒素溶血活性的多克隆抗体中和在96孔分析板上对兔血清抗体(来自4只不同兔子的抗rALD/H35K)或标准兔血清实施2倍连续稀释。在每个分析板上都包括仅含有洗涤缓冲液的细胞对照孔(无a-毒素并且无抗体)和a-毒素对照孔(无抗体)。将等体积存于洗涤缓冲液中的4X浓縮a-毒素(2pg/mL)添加至所有具有抗体的孔中和仅具有洗涤缓冲液的孔中(用于毒素阳性对照)。将等体积洗涤缓冲液添加至所有仅含洗涤缓冲液的细胞对照孔中。以与各孔中相等的体积向每一具有经稀释抗体、a-毒素和洗涤缓冲液(用于细胞对照)的孔中添加经洗涤RBC。结果，所有抗体和毒素浓度都稀释成起始浓度的1/4。在增湿37'C培养器中将各板培养30分钟。然后对板实施离心以沉淀所有RBC和细胞碎片，继而在另一聚苯乙烯ELISA板的对应孔中用洗涤缓冲液对各上清液实施稀释。借助ELISA板读数器在450nm处测量上清液的光学密度(OD)，在报告数据前减去作为背景的细胞对照(无毒素)OD。以a-毒素阳性对照为基准测定各抗体的中和能力。结果(列于表6中)表明，所有4只用rALD/H35K免疫的兔都产生针对金黄色葡萄球菌天然a-毒素的中和抗体。抗ALD/H35K超免疫血清能以约1:2648至1:6125的稀释度中和大致50%的。-毒素溶血活性，而标准兔血清在1:100稀释度下以浓縮25倍以上的浓度也不能中和50%的a-毒素溶血活性。这些数据清楚地表明，ALD/H35K特异性抗体在活体外可有效中和天然a-毒素活性。表6用多克隆血清在活体外中和a-毒素溶血活性血清稀释倍数中和百分比抗rALD/H35K第76b号兔抗rALD/H35K第76a号兔抗rALD/H35K第77a号兔抗rALD/H35K第77b号兔标准兔血清100100.8101.0101.1101.30.120099.9100.3100.2100.5约6.8400100.2100.3跳3100.4约5.5800100.0100.2100.0100.3约0.9160099.895.785.799.9约1.7320080.361.447.082.33.0640038.329.929.447.06.01280029.929.528.430.616.22560013.8U.79.510.611.85120012.210.513.611.413.51024006.85.37.54.910.720480014.58.813.3-3.6".2中和50%时的稀释倍数5506435526486125不可测量簡实例14a-毒素抗原的免疫原性和抗rALD/H35K的反应性以及对天然金黄色葡萄球菌a-毒素的中和活性33通过免疫10只小鼠/组制备多克隆超免疫小鼠血清。使用含有或不含有明矾作为佐剂的2.5昭抗原(rALD/H35K、rH35K、rH35R或rALD)对小鼠实施3次注射，中间相隔2周。在最后一次注射后l周抽取小鼠的血液，汇集各抗原的小鼠血清，并且实施标准定量性ELISA来测定IgG对野生型a-毒素和对同源抗原的效价。所有小鼠血清汇集物都可识别同源抗原和金黄色葡萄球菌天然a-毒素。这些结果表明，与其它单点突变抗原相比，双突变体rALD/H35K能产生较高含量的a-毒素IgG并且可获得大于或类似于rALD抗原的效价。如实例13中所述，也测试小鼠血清汇集物在活体外对金黄色葡萄球菌a-毒素所造成溶血活性的中和作用。结果(列于表7中)显示，抗rALD/H35K血清可有效中和溶血活性。表7多克隆小鼠血清的免疫原性、与天然a-毒素的反应性以及对于溶血活性的中和作用小鼠血清抗天然a-毒素IgG(EU/ml)507。中和时的EU抗rALD/H35K1000.307具有明矾的抗rALD/H35K1890.459具有明矾的抗rH35K690.194具有明矾的抗rAU^2070.3%具有明矾的抗rH35RnNA抗rH35R6NA具有明矾的抗rH35K3NA抗rH35K6NA具有明矾的抗rALX^60NA抗rALD45NA*结果是来自两种不同小鼠血清汇集物的报告。实例15单克隆抗体对a-毒素溶血活性的中和鉴定含有抗a-毒素MAb(如实例10中所述获得)的组织培养上清液在体外中和a-毒素的能力。作为阴性对照，分别评估对尼古丁和标准兔血清具有特异性的Mab的中和活性。在96孔板上对抗体实施连续2倍稀释。每个分析板上都包括仅含有洗涤缓冲液的细胞对照孔(无a-毒素并且无抗体)和a-毒素对照孔(无抗体)。将存于洗涤缓冲液中的等体积a-毒素(2昭/mL)添加至所有具有抗体的孔和仅具有洗涤缓冲液(用于毒素阳性对照)的孔中。将等体积洗涤缓冲液添加至所有仅含洗涤缓冲液的细胞对照孔中。向每一具有经稀释抗体、a-毒素和洗涤缓冲液(用于细胞对照)的孔中添加34与各孔同体积的经洗涤RBC。结果，所有抗体和毒素浓度都稀释成起始浓度的1/4。在增湿37'C培养器中将各板培养30分钟。然后对板实施离心以沉淀所有RBC和细胞碎片，继而在另一聚苯乙烯ELISA板的对应孔中用洗涤缓冲液对各上清液实施稀释。借助于ELISA板读数器在450nm处测量上清液的光学密度(OD)，在报告数据前减去作为背景的细胞对照(无毒素)OD。以a-毒素阳性对照为基准测定各抗体的中和能力。如蛋白质印迹分析所表明，与天然a-毒素结合的9种Mab经显示可中和天然a-毒素的活体外溶血活性(数据列于表8中)。在蛋白质印迹分析中不结合天然a-毒素的两种MAb和非特异性单克隆抗体(2Nic311)不具有a-毒素中和活性。表8单<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>NA=未检测到可测量中和活性或未达成50%中和。实例16多克隆兔血清对金黄色葡萄球菌细胞培养物上清液中a-毒素溶血活性的中和在活体外溶血分析中证明抗rALD/H35K抗体中和金黄色葡萄球菌分泌的a-毒素的能力。将来自分离菌伍德(ATCC10832号，a-毒素原型分离菌)和Nabi临床分离菌MRSA的金黄色葡萄球菌过夜培养物调节至2.0OD54。nm，离心并过滤所得上清液。然后将四倍稀释的上清液添加至连续稀释的兔抗rALD/H35K兔血清中并培养IO分钟。于培养后，添加新获得的兔红细胞并于37'C下将板培养30分钟。在培养后，以2000rpm将微量滴定板离心IO分钟，并且通过使用ELISA读数器于410nm波长处测量所释放血红素的含量来定量裂解程度。结果(列示于表9中)证明抗rALD/H35血清具有中和活性。于1:1000稀释度下，抗ALD/H35K能够在活体外完全中和100ng/mL经纯化天然a-毒素和细菌分泌的a-毒素(来自两种金黄色葡萄球菌临床分离菌)。表9抗rALD/H35K兔血清对来自金黄色葡萄球菌细胞培养物上清液的a—毒素溶血活性的中和<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实例17单克隆和多克隆抗体对金黄色葡萄球菌天然a-毒素攻击的活体内中和如下所述评价如实例10中所述获得的a-毒素MAb之一(MAb1Alt660)和抗rALD/H35K多克隆抗体的活体内中和效力。向BALB/c小鼠腹膜腔内(IP)投与100WgMAb1Alt660。作为对照，给予另一组小鼠针对大肠杆菌细胞壁组份产生的MAb(MAb158)。同样，对小鼠投与如实例8中所述自rALD/H35K接种兔获得的500叱总抗ALD/H35KIgG，并且对另一组小鼠投与等量的标准兔IgG作为对照。24小时后，用10吗天然a-毒素(里斯特生物实验室)经皮内(ID)攻击小鼠，并在7天内观察皮肤损伤和致死率。被动免疫数据表明，两种单克隆抗体lAlt660和抗ALD/H35KIgG都能阻止伤口形成和a-毒素诱导的死亡。结果概述于表10中。表10单克隆和多克隆抗体对BALB/c小鼠中天然金黄色葡萄球菌a-毒素攻击的活体内中和<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实例18抗rALD/H35KIgG和斯蒂夫VAXIgG(5型和8型IgG)抵抗金黄色葡萄球菌致死性攻击的用途为表现在治疗中组合中和抗体和调理抗体来对抗高毒性金黄色葡萄球菌分离菌的优势，通过腹膜内途径对BALB/c小鼠投与抗ALD/H35K兔IgG(中和抗体)以及200叱调理抗体，即金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖人类抗体(埃尔塔斯蒂夫，纳比生物制药公司)。作为对照，对小鼠投与等剂量的包含抗rALD/H35KIgG的抗体或仅埃尔塔斯蒂夫或非免疫IgG(标准人类IGTV)。24小时后，用存于5%猪粘蛋白中的5x104CFU金黄色葡萄球菌NabiMRSA328(其分泌大量a-毒素)IP攻击小鼠，并于细菌攻击后24小时、40小时和5至7天监控发病率和死亡率。结果(列示于表11中)展示金黄色葡萄球菌中和抗体与调理抗体组合的保护性效力。因此，用兔抗rALD/H35KIgG(中和)以及埃尔塔斯蒂夫(抗5型和8型荚膜多糖调理IgG)免疫的小鼠不受高毒性金黄色葡萄球菌攻击的影响，而仅接受抗-!"八1^/105&1§0或埃尔塔斯蒂夫的小鼠未能在攻击后存活。表ll抗rALD/H35KIgG和斯蒂夫VAXIgG抵抗金黄色葡萄球菌致死性攻击的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实例19使用rALD/H35K作为载体蛋白制备结合疫苗的方法非毒性a-毒素突变体rALD/H35K在多糖蛋白结合疫苗中用作蛋白载体。本实例阐述使表皮葡萄球菌多糖抗原PS1与rALD/H35K结合的方法。在0.1MMES缓冲液中制备PS1溶液(IOmg/mL)。添加呈干粉形式的己二酸二酰肼(ADH)以产生0.2M的终浓度。为引发反应，添加乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)至0.05M的终浓度并将其另外搅拌30分钟。然后以1MNaCl透析含衍生PS1(PS1.ah)的反应混合物，随后以蒸馏水透析，然后通过葡聚糖凝胶(Sephadex)G25柱实施色谱以去除残留盐。通过三硝基苯磺酸(TNBS)分析以比色法测定纳入抗原PSUh上的ADH的量。于含0.3MNaCl的0.05M磷酸钠/0.2M咪唑缓冲液中制备含rALD/H35K(2mg/mL)的溶液。随后，以2:1的w/w比率向蛋白质中添加琥珀酸酐并使用1MNaOH将pH维持在8并保持2小时，同时加以搅拌。然后以0.2MNaCl透析衍生载体蛋白rALD/H35K孤，并于葡聚糖凝胶-G25柱上进一步纯化，汇集并浓縮。通过BCA(Pierce)测量蛋白质含量，并且在反应之前和之后通过用TNBS分析测量氨基来估算蛋白质琥珀酰基化的效率。在1mL0.1MMES/0.2MNaCl缓冲液，pH5.7-5.8中制备含有10mgPS1.八h禾口10mgrALD/H35K-sue的溶液。向反应混合物中添加EDC以达50mM的终浓度，并在搅拌的情况下将反应维持30分钟，随后以0.2MNaCl透析。通过在用0.2MNaCl洗脱的丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)S-300柱上实施尺寸排除色谱获得纯结合物。结合物中PS1和载体蛋白(rALD/H35K)的量是分别通过磷分析和BCA分析(Pierce)测定。作为对照，使用相同方法制备PS1与绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A的非毒性突变体(rEPA)的结合物(PS1-rEPA)。表12对表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K与PSl-rEPA结合物的特性加以比较。在通过氨基数量降低所监测的琥珀酰基化效率方面，rALD/H35K和rEPA的琥珀酸衍生物具有极类似的特性，其琥珀酰基化效率分别是80%和75%。所得结合物PSl-rALD/H35K和PSl-rEPA具有类似的w/wPS/PR比率(0.71和0.61)。表12使用rALD/H35K或rEPA作为载体蛋白制备的表皮葡萄球菌PS1结合物的定性<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实例20表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K结合疫苗的免疫原性为评估PSl-rALD/H35K的免疫原性，用含有和不含有佐剂(QS-21)的2.5和10昭PSl-rALD/H35K结合物将每组10只BALB/c小鼠免疫3次，中间间隔2周。于第3次注射后7天，对小鼠实施放血并收集血清。分别使用PSl或天然a-毒素(里斯特生物实验室)作为固定抗原通过ELISA测量血清样品中的抗PS1IgG和抗a-毒素IgG应答。免疫结果以表示为ELISA单位/mL(EU/mL)的血清IgG的组几何平均(GM)值给出。将抗PS1IgG效价与任意指定为100EU/mL的参考血清加以比较。100EU/mL的效价代表在ELISA中于1:2000稀释度下给出2.0的OD45。的特异性IgG的浓度。通过内插至任意指定为5,000EU/mL的参考血清来计算抗a-毒素IgG效价。5,000EU/mL的效价代表在ELISA中于1:5,000稀释度下给出2.0的OD45()的特异性IgG的浓度。评估所有血清样品在活体外对天然a-毒素溶血活性的中和，如实例13中所述。免疫后，抗PS1IgG以及抗a-毒素IgG应答都以剂量依赖性方式增加，并且当在免疫期间使用佐剂时表现出效价增高。尽管PSl-rALD/H35K结合物可诱导显著抗a-毒素效价，但仅使用极高效价血清(>300EU/mL)即可在体外中和天然a-毒素的溶血活性。在接受具有佐剂(QS-21)的2.5或10|agPSl-rALD/H35K的动物中90%至100%的动物诱导抗a-毒素IgG的所述相关毒素中和程度，而在无佐剂的情况下，用10昭结合物免疫在2/10的动物中诱导50%中和效价。这些数据表明，rALD/H35K可作用多糖结合物(例如PSl-rALD/H35K)的载体蛋白，其可用于刺激高效价的PS抗体以及a-毒素抗体，有效地中和天然ci-毒素溶血活性。表13表皮葡萄球菌PSl-rALD/H35K结合疫苗的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>GNfc几何平均*若一组10份中有6份血清未达到可测量的50%中和效价，则不计算GM值。最低50%中和效价是"4"并且对应于中和分析中纯血清(未经稀释血清)的使用。实例21调理(抗5型、抗8型和抗336)和中和(抗LukS-PV和抗ALD/H35K)多克隆抗体的生成将抗原注射入新西兰白兔中5至6次，中间间隔2周。兔子接受(l)5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物各50吗，(2)各50昭的1:1的rALD/H35K和rLukS-PV:佐剂(5%Titermax),(3)5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物各50昭，和各50昭的1:1的rALD/H35K和rLukS-PV:佐剂(5%Tite觀x)，或(4)1:1的PBS:佐剂(5%Titermax)<>通过用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物对兔实施免疫产生的抗血清在ELISA和免疫扩散中识别5型、8型和336多糖。通过用rALD/H35K和rLukS-PV对兔实施免疫产生的抗血清于ELISA和免疫扩散中识别天然金黄色葡萄球菌a-毒素(里斯特生物实验室)和rLukS-PV。通过用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物以及rALD/H35K和rLukS-PV对兔实施免疫产生的抗血清于ELISA和免疫扩散中识别5型、8型和336多糖、a-毒素和LukS-PV。合并阳性血并于蛋白G或A柱上纯化IgG。然后在动物模型实验中使用以下经纯化IgG:(1)抗5型和抗8型荚膜多糖IgG和抗336IgG(调理抗体)；(2)抗a-毒素ALD/H35K和抗LukS-PVIgG(中和抗体)；(3)抗5型和抗8型荚膜多糖IgG、抗336IgG、抗a-毒素ALD/H35KIgG和抗LukS-PVIgG(调理和中和抗体)。实例22通过用5型结合物、8型结合物、336结合物、rALD/H35K和rLukS-PV实施主动免疫来抵抗金黄色葡萄球菌攻击评价包含5型结合物、8型结合物、336结合物、rALD/H35K和rLukS-PV的疫苗抵抗金黄色葡萄球菌诱导皮肤感染的能力。如实例21中所述对5至6月龄新西兰雌性兔实施免疫以产生高含量抗体。于第5或第6次注射后7天对兔实施放血，并通过ELISA评价5型、8型和336多糖以及a-毒素和LukS-PVIgG抗体的效价。在所有相关血清中，这些抗原的效价都经1:105-106稀释以达成0045()11111=2.0。将兔的背部剃光并皮内注射108CFU/100mL金黄色葡萄球菌菌株USA300-01114(产生PVL的CA-MRSA)。观察动物皮肤坏死损伤的形成状况。用5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物、rALD/H35K和rLukS-PV接种可分别诱导每种亚单位的高抗体效价(稀释1:105-106以达成0045()11111=2)。据显示这些抗体可抵抗由产生PVL的金黄色葡萄球菌分离菌(或CA-MRSAUSA300)所导致的脓肿形成。也就是说，在用五价组合(5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物、rALD/H35K和rLukS-PV)免疫的兔中观察到注射位点仅略微发红。相反，在接受安慰剂(PBS加Titemiax)的对照兔中观察到脓肿形成。用所有5种抗原(5型rEPA、8型rEPA和336-rEPA结合物、rALD/H35K和rLukS-PV)免疫的兔子在第8天还很健康。然而，观察到用安慰剂免疫的兔具有临床发病体征(体重减轻，嗜睡)。因此，用含有5型结合物、8型结合物、336结合物、rALD/H35K和rLukS-PV的五价金黄色葡萄球菌疫苗免疫可预防金黄色葡萄球菌感染，包括由高致病性PLV生成菌株诱导的感染。实例235型/8型/336IgG(调理IgG)与a-毒素/PVLIgG(中和IgG)抵抗金黄色葡萄球菌攻击的协同作用为表现调理与中和多克隆抗体(pAb)的组合抵抗高毒性金黄色葡萄球菌分离菌的优势，用下列抗体经腹膜内被动免疫BALB/c小鼠(1)抗5型和抗8型荚膜多糖IgG和抗336IgG调理pAb;(2)抗a陽毒素ALD/H35K和抗LukS-PV兔IgG中和pAb;或(3)抗5型和抗8型荚膜多糖IgG、抗336IgG、抗ALD/H35KIgG和抗LukS-PVIgG(例如调理与中和pAb的组合)。作为对照，对小鼠投与等剂量的2mg总IgG的标准兔IgG。24小时后，剃去小鼠背部的毛发，并通过皮内(ID)途径用lxl()SCFU金黄色葡萄球菌USA300-01114攻击，其为分泌PVL和a-毒素的CA-MRSA菌株。于16和72小时观察小鼠的皮肤坏死损伤情况。结果(列示于表14中)展示金黄色葡萄球菌中和与调理pAb的组合的保护效力。因此，用调理和中和pAb(抗5型、抗8型、抗336、抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV)免疫的小鼠可抵抗高毒性金黄色葡萄球菌攻击，而仅接受调理pAb(抗5型、抗8型和抗336)或仅接受中和pAb(抗a-毒素ALD/H35K和抗LukS-PV)的小鼠不能抵抗此攻击。表14调理pAb与中和pAb于抵抗金黄色葡萄球菌感染中的协同作用攻击后具有皮肤坏死损免疫剂伤的/，、鼠数16小时72小时抗5型、抗8型、抗336兔IgG0/101/10(调理pAb，1mg总IgG)禾口抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV兔IgG(中和pAb，lmg总IgG)抗5型、抗8型、抗336兔IgG(调理pAb，1mg总IgG)和标准0/105/10兔IgG(lmg总IgG)抗a-毒素rALD/H35K和抗LukS-PV图IgG(中和pAb，1mg总0/104/10IgG)和标准兔IgG(1mg总IgG)标准兔IgG(2mg总IgG)0/10謂PBS-安慰剂0/1010/10实例24金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位的克隆、表达和纯化自金黄色葡萄球菌菌株ATCC49775提取基因组DNA，并且引物经设计以在赋予氨苄西林抗性的pTrcHisA质粒载体中克隆Y-溶血素基因hlgA、hlgB禾BhlgC。使用聚合酶链反应(PCR)自所有三种基因去除信号肽，并构建BamHI和Ncol位点以实41施克隆。用BamHI和NcoI消化PCR产物，并将三种基因各自分别与以类似方式消化的载体连接。然后将经连接DNA转化入在含有氨苄西林的LB琼脂板上生长的GC-10大肠杆菌化学感受态细胞中。使用PCR筛选具有正确基因插入片段的菌落，并使阳性菌落在LB培养液中生长，之后提取质粒DNA并用BamHI和Ncol消化来加以确认。然后对具有正确基因插入片段的样品实施测序，继而将具有正确插入片段的质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞中以迸行蛋白表达。使用相同的方法通过以下方式来纯化HlgA、HlgB和HlgC:使表达各亚单位的大肠杆菌分别在37。C下于2L循环生长(Circlegrow)培养基中生长，随后于3(TC下用IPTG诱导。然后通过离心采集细菌细胞，并使细胞浆液暴露于使用20%蔗糖溶液的渗透冲击下，随后再悬浮于低渗缓冲液中。通过离心去除细胞碎片并过滤上清液，然后将其装入SP琼脂糖阳离子交换柱上。使用氯化钠溶液的线性梯度实施洗脱，并于SDS-PAGE上分析经洗脱样品。汇集含有正确大小的蛋白质的样品并将其装于陶瓷羟基磷灰石(CHT)柱上，仍使用氯化钠的线性梯度实施洗脱。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对样品实施分析。对于蛋白质印迹分析，将蛋白质转移至PVDF膜并使用所属领域中已知的标准程序以抗LukS-PV或抗LukF-PV抗体实施处理。印迹法以大致在约32-34kDa处的区带证实存在rHlgA、rHlgB和rfflgC抗原。实例25杀白细胞素多克隆抗体的生成和定性将rLukS-PV、rLukF墨PV、rHlgA、rHIgB或rHlgC(各50yg)与佐剂(西格玛(Sigma)Titermax或CFA，之后为IFA)—起以1:1之比注射至新西兰白兔中，注射3至6次，间隔2周。LukS-PV抗血清在对抗原的免疫扩散分析中将rLukS-PV识别为相同抗原，而rLukF-PV抗血清识别LukF-PV。rLukS-PV或rLukF-PV不与异源抗血清反应。实例26金黄色葡萄球菌杀白细胞素亚单位HlgA、HlgB,HlgC与PVL抗体的交叉反应性在1%琼脂糖凝胶中实施双免疫扩散来测定PVL抗血清的特异性，以及测定Hlg亚单位抗原的抗原性。简单来说，使10nL/孔的200iag/mL各杀白细胞素抗原(外部孔)和10)iL/孔的LukS-PV抗血清(中央孔)在潮湿环境下透过凝胶扩散过夜。然后在PBS中洗涤琼脂糖凝胶并加压、干燥并用考马斯蓝染色。对凝胶实施沉淀素带分析，所述沉淀素带在抗原与抗体结合在一起形成抗体-抗原复合体时形成。当将具有可与抗血清反应的共享表位的两种抗原置于毗邻孔中并对相同抗血清扩散时，其沉淀素线将融合在一起形成"一致性线"。当两种抗原中并不同时存在所有与抗血清Ab反应的表位时，在两种抗原间形成部分一致性线(在两条沉淀素线交汇点的突起)。三种金黄色葡萄球菌杀白细胞素S亚单位rHlgA(A)、rHlgC和LukS-PV(S)与抗42LukS-PV血清以单沉淀素带形式反应，形成部分一致性线，并且这些S亚单位不与抗LukF-VP抗血清反应。此表明，针对rLukS-PV产生的抗血清将金黄色葡萄球菌Y-毒素S亚单位、HlgA和HlgC识别为并不具有全部但具有某些共享表位的类似抗原。同样，两种杀白细胞素F亚单位rHlgB(B)和rLukF-PV(F)与抗LukF-PV血清以单沉淀素带形式反应，形成部分一致性线，并且不与LukS-PV抗血清反应。此表明，针对rLukS-PV产生的抗血清将金黄色葡萄球菌Y-溶血素F亚单位、HlgB识别为并不具有全部但具有某些共享表位的类似抗原。因此，PVL抗体与金黄色葡萄球菌杀白细胞素(Y-溶血素)具有交叉反应性。用抗LukS-PV和抗LukF-PV两种抗体实施定量ELISA，证实在各杀白细胞素S亚单位(rHlgA、rHlgC和rLukS-PV)之间、以及在各杀白细胞素F亚单位(rHlgB和rLukF-PV)之间存在交叉反应性。据证明，杀白细胞素S与F亚类间不存在交叉反应性。实例27杀白细胞素抗体的反应性使用标准ELISA技术评估兔多克隆抗体(抗LukS-PV、抗LukF-PV、抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC)与各种杀白细胞素抗原(包括rLukS-PV、rLukF-PV、rHlgA、rfflgB禾口rHlgC)的反应性。简单来说，用lyg/mL特异性杀白细胞素抗原涂布96孔板，然后洗涤板并用BSA封闭。再次洗涤板，然后将抗杀白细胞素兔血清或参考对照兔血清在板上连续稀释并加以培养。再次洗涤板并添加与辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二抗体。洗涤板，然后使用过氧化物酶底物系统显影，并通过在OD450nm处读取来确定活性。当在450nm处的OD大于0.2时视为具有交叉反应性。ELISA数据表明，杀白细胞素S亚单位(rLukS-PV、rHlgA禾口rHlgC)与抗LukS-PV、抗HlgA和抗HlgC抗体反应，而杀白细胞素F亚单位(rLukF-PV和rHlgB)与抗LukF-PV和抗HlgB抗体反应(表15)。杀白细胞素S亚单位(rLukS-PV、rHlgA禾口rfflgC)不与抗HlgB和抗LukF-PV抗体反应，而杀白细胞素F亚单位(rLukF-PV和rHlgB)不与抗LukS-PV、抗HlgA或抗HlgC抗体反应。因此，杀白细胞素S抗体与异源杀白细胞素S亚单位交叉反应，并且杀白细胞素F抗体与异源杀白细胞素F亚单位交叉反应。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>实例28杀白细胞素多克隆抗体对金黄色葡萄球菌Y-溶血素的中和在DMSO的存在下，使HL-60细胞在补充有10呢胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中生长7天以诱导分化。然后通过慢速离心采集细胞，继而使用不含FBS的培养基以5x105细胞/孔将其接种于96孔板中。于37i:下将不同浓度的Y-溶血素(HlgA/HlgB或HlgC/HlgB)与不同稀释度的兔多克隆抗LukS-PV抗体、抗LukF-PV抗体或标准兔血清培养一起30分钟。然后将抗体与毒素的混合物添加至细胞中，并将其培养24小时。然后向细胞中添加XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺内盐)溶液并测量450nm处的吸光度以测定细胞存活率。作为对照，在不添加任何兔血清的情况下实施反应。HlgA/HlgB和HlgC/B分别在250ng/mL和32叱/mL的浓度下对HL-60细胞具有细胞毒性。抗LukS-PV和抗LukF-PV抗血清二者都能中和HlgA/HlgB和HlgC/HlgB的细胞毒性。抗血清的中和效应具有稀释度依赖性，而标准兔血清的效应却相反，其显示较低程度的非特异性中和。抗LukF-PV和抗LukS-PV抗血清在1:20的稀释度下分别将HlgA/HlgB细胞毒性活性中禾卩84%和74%。抗LukF-PV和抗LukS-PV在1:5的稀释度下分别将HlgC/HlgB细胞毒性中和91%和72%。此明确表明，抗杀白细胞素抗体可交叉中和异源杀白细胞素。表16抗LukS-PV和抗LukF-PV抗体对Y-溶血素HlgA/HlgB和HlgC/HlgB的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>实例29杀白细胞素多克隆抗体对金黄色葡萄球菌PVL细胞毒性的中和在DMSO的存在下使HL-60细胞于补充有10呢胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中生长7天以诱导分化。然后通过慢速离心采集细胞，继而使用不含FBS的培养基以5x105细胞/孔将其接种于96孔板中。于37。C下将PVL(32昭/mL的rLukS-PV和rLukF-PV)与不同稀释度的兔多克隆抗HlgA、抗fflgB和抗HlgC抗体或标准兔血清一起培养30分钟。然后将抗体与毒素的混合物添加至细胞中并培养24小时。然后向细胞中添加XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰苯胺内盐)溶液并测量450nm处的吸光度以测定细胞存活率。作为对照，在不添加任何兔血清的情况下实施反应。PVL在32昭/mL的浓度下对HL-60细胞具有细胞毒性。兔抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清能中和PVL的细胞毒性。抗血清的中和效应具有稀释度依赖性，而标准兔血清的效应却相反，其显示较低程度的非特异性中和。当以1:5稀释血清时，抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清分别将PVL细胞毒性活性中和32%、26%和26%。于1:5稀释度下标准兔血清显示极低或不显示中和活銜1%)。由此证明，杀白细胞素特异性抗体可中和异源杀白细胞素。表17抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗体对PVL毒素的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>实例30杀白细胞素多克隆抗体对金黄色葡萄球菌杀白细胞素细胞毒性的中和本实例阐述杀白细胞素细胞毒性和杀白细胞素抗体对杀白细胞素细胞毒性的中和。在37。C下将杀白细胞素(PVL或Y-溶血素HlgC/HlgB，各为400ng/mL)与不同稀释度的兔多克隆抗HlgA、抗HlgB或抗HlgC抗体或标准兔血清一起培养30分钟。然后使用不含FBS的培养基将抗体/毒素混合物添加至5x105细胞/孔人类多形核白细胞(PMN)中并将其培养2小时。将XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5—甲酰苯胺内盐)溶液添加至细胞中并且在450nm下测量吸光度以测定细胞存活率。作为对照，在不添加任何兔血清的情况下实施反应。金黄色葡萄球菌PVL和Y-溶血素(HlgOHlgB)在400ng/mL的浓度下对PMN具有细胞毒性。兔抗HlgA、抗HlgB和抗HlgC抗血清能够中和PVL细胞毒性，并且抗LukS-PV和抗LukF-PV能够中和HlgC/HlgB细胞毒性。抗血清的中和效应具有稀释度依赖性，而标准兔血清的效应却相反，其显示较低程度的非特异性中和。这些数据表明，杀白细胞素特异性抗体能够中和异源杀白细胞素。表18杀白细胞素抗体对金黄色葡萄球菌杀白细胞素PVL和Y-溶血素的交叉中和<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>实例315型/8型/336单克隆抗体(调理抗体)与a-毒素/杀白细胞素单克隆抗体(中和抗体)抵抗金黄色葡萄球菌的协同作用为表现在针对高毒性金黄色葡萄球菌分离菌的治疗中组合中和与调理单克隆抗体(mAb)的优势，用以下抗体经腹膜内被动免疫BALB/c小鼠(1)抗5型和抗8型荚膜多糖mAb和抗336mAb(调理mAb),(2)抗a-毒素和抗LukS-PVmAb(毒素中和mAb)，或(3)抗5型和抗8型荚膜多糖mAb和抗336mAb、和抗a-毒素和抗LukS-PVmAb(调理与中和mAb的组合)。作为对照，对小鼠投与非特异性单克隆抗体或PBS。24小时后，剃去小鼠背部的毛发，并通过皮内(ID)途径用1x108CFU金黄色葡萄球菌USA300-01114进行攻击，其为分泌PVL和a-毒素的CA-MRSA菌株。在第72小时观察小鼠的皮肤和软组织感染情况。结果(列于表19中)阐述在用金黄色葡萄球菌分离菌USA300进行细菌攻击后72小时，与单独用中和或调理抗体免疫的保护效应相比，金黄色葡萄球菌毒素中和与调理抗体的组合的保护效力。接受非特异性单克隆抗体或PBS的对照小鼠不能抵抗细菌感染，这是因为所有小鼠都出现坏死性皮肤损伤并具有更高器官移种率。用毒素中和抗体(抗a-毒素和抗杀白细胞素单克隆抗体)免疫的小鼠显示皮肤损伤数量降低，而用调理抗体(抗5型、抗8型和抗336单克隆抗体)免疫的小鼠显示器官移种降低。同时用调理与中和抗体(抗5型、抗8型、抗336、抗a-毒素和抗LukS-PV单克隆抗体)免疫的小鼠可抵抗高毒性金黄色葡萄球菌攻击，这是因为其具有数量减少的皮肤损伤以及更低器官移种率。因此，调理与毒素中和抗体的组合在预防皮肤和软组织感染和器官移种方面展示出保护效应。表19调理和中和抗体在抵抗金黄色葡萄球菌攻击中的保护效应<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*高剂量500Ug每种调理抗体和lOOUg每种中和抗体**低剂量=100)ag每种调理抗体和50叱每种中和抗体尽管已足够详细地阐述和例示了本发明使得熟习此项技术者可制备和使用本发明，但在不背离本发明精神和范围的情况下各种改变、修改和改良是显而易见的。本文所提供实例是代表性和例示性的，并且不意欲限制本发明范围。熟习此项技术者可构想出其中的修改和其它应用。这些修改涵盖于本发明精神内并且是由权利要求范围所限定。说明书中所提及的所有专利和出版物都指明本发明所属领域一般技术者的水平。所有专利和出版物都是以引用方式并入本文中，其并入程度如同明确地及个别地指明每个单独出版物是以引用方式并入一般。权利要求1、一种五价葡萄球菌(Staphylococcal)抗原组合物，其包含(i)金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型抗原，(ii)金黄色葡萄球菌8型抗原，(iii)金黄色葡萄球菌336抗原，(iv)金黄色葡萄球菌α-毒素抗原，和(v)葡萄球菌杀白细胞素抗原。2、如权利要求1所述的组合物，其中所述葡萄球菌抗原中的至少一者是保护性抗原。3、如权利要求1所述的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与所述5型抗原、所述8型抗原、所述336抗原和所述杀白细胞素抗原中的至少一者结合。4、如权利要求l所述的组合物，其中所述a-毒素抗原相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，其含有至少两处降低其毒性的改变。5、如权利要求1所述的组合物，其中所述葡萄球菌杀白细胞素抗原是选自由帕顿-瓦伦丁(Panton-Valentine)杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和Y-溶血素亚单位抗原组成的群组。6、如权利要求5所述的组合物，其中所述葡萄球菌杀白细胞素抗原是选自由下列组成的群组(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位，(iii)HlgA金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(iv)HlgB金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(v)HlgC金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD，(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE，(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM，(ix)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(x)来自中间型葡萄球菌(S.intermedius)的LukF-I亚单位；和(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。7、如权利要求1所述的组合物，其另外包含一或多种其它细菌抗原。8、如权利要求7所述的组合物，其中所述一或多种其它细菌抗原中的至少一者是选自由下列组成的群组的葡萄球菌抗原表皮葡萄球菌(S.epidermidis)PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白、和其组合。9、一种组合物，其包含金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和医药上可接受的载剂，其中所述a-毒素抗原相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，其含有至少两处降低其毒性的改变。10、如权利要求9所述的组合物，其中所述改变中的至少一者是化学改变。11、如权利要求9所述的组合物，其中所述改变中的至少一者是分子改变。12、如权利要求9所述的组合物，其中所述改变中的至少一者是化学改变并且所述改变中的至少一者是分子改变。13、如权利要求11所述的组合物，其中所述分子改变是野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的取代、插入或缺失。14、如权利要求13所述的组合物，其中所述分子改变是野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基酸序列中的取代。15、如权利要求14所述的组合物，其中所述取代发生在对应于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的His-35的位置。16、如权利要求15所述的组合物，其中所述取代是用Arg、Lys、Ala、Leu或Glu取代His。17、如权利要求14所述的组合物，其中所述分子改变是野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基阀结构域(latchdomain)中的取代、插入或缺失。18、如权利要求17所述的组合物，其中所述分子改变是野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的氨基阀结构域中的缺失。19、如权利要求13所述的组合物，其中所述分子改变是野生型金黄色葡萄球菌a-毒素的干结构域(stemdomain)中的缺失。20、一种组合物，其包含(i)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多种不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原。21、如权利要求20所述的组合物，其中所述一或多种其它细菌抗原中的至少一者是选自由下列组成的群组的其它葡萄球菌抗原金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、葡萄球菌杀白细胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白、和其组合。22、如权利要求21所述的组合物，其中所述其它葡萄球菌抗原是保护性抗原。23、如权利要求20所述的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与所述一或多种其它细菌抗原中的至少一者结合。24、如权利要求20所述的组合物，其中所述a-毒素抗原相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，其含有至少两处降低其毒性的改变。25、一种制备超免疫特异性静脉注射免疫球蛋白(IVIG)制剂的方法，其包含(i)对个体投与如权利要求l、9或20中任一权利要求所述的组合物，(ii)自所述个体采集血浆，和(iii)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。26、一种五价葡萄球菌抗体组合物，其包含(i)特异性结合金黄色葡萄球菌5型抗原的第一抗体，(ii)特异性结合金黄色葡萄球菌8型抗原的第二抗体，(iii)特异性结合金黄色葡萄球菌336抗原的第三抗体，(iv)特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的第四抗体，和(v)特异性结合葡萄球菌杀白细胞素抗原的第五抗体。27、如权利要求26所述的组合物，其中所述第一至第五抗体中的至少一者是单克隆抗体。28、如权利要求26所述的组合物，其中所述第一至第五抗体中的至少一者是中和抗体。29、如权利要求26所述的组合物，其中所述第五抗体特异性结合选自由帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和Y-溶血素亚单位抗原组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原。30、如权利要求29所述的组合物，其中所述第五抗体特异性结合选自由下列组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位，(iii)HlgA金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(iv)HlgB金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(v)HlgC金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD，(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE，(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM，(k)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(x)来自中间型葡萄球菌的LukF-I亚单位；禾n(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。31、一种保护性抗体组合物，其包含(i)特异性结合金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的第一抗体，和(ii)至少一种特异性结合不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的细菌抗原的第二抗体。32、如权利要求31所述的组合物，其中所述第一和第二抗体中的至少一者是单克隆抗体。33、如权利要求31所述的组合物，其中所述第一和第二抗体中的至少一者是中和抗体。34、如权利要求31所述的组合物，其中所述至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由下列组成的群组的其它葡萄球菌抗原金黄色葡萄球菌5型、金黄色葡萄球菌8型、金黄色葡萄球菌336、葡萄球菌杀白细胞素抗原、表皮葡萄球菌PS1、表皮葡萄球菌GP1、脂磷壁酸(LTA)和识别粘附基质分子的微生物表面组份(MSCRAMM)蛋白。35、如权利要求34所述的组合物，其中所述至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由帕顿-瓦伦丁杀白细胞素(PVL)抗原亚单位和Y-溶血素亚单位抗原组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原。36、如权利要求35所述的组合物，其中所述至少一种第二抗体中的至少一者特异性结合选自由下列组成的群组的葡萄球菌杀白细胞素抗原(i)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(ii)金黄色葡萄球菌PVL的LukS-PV亚单位，(iii)HlgA金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(iv)HlgB金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(v)HlgC金黄色葡萄球菌Y-溶血素亚单位，(vi)来自金黄色葡萄球菌的LukD，(vii)来自金黄色葡萄球菌的LukE，(viii)来自金黄色葡萄球菌的LukM，(ix)金黄色葡萄球菌PVL的LukF-PV亚单位，(x)来自中间型葡萄球菌的LukF-I亚单位，和(xi)来自中间型葡萄球菌的LukS-I亚单位。37、如权利要求31所述的组合物，其包含次优量的所述第一抗体和次优量的所述第二抗体。38、如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物是通过包含下列步骤的方法来制备(a)对人类个体投与(i)金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和(ii)一或多种不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原，(b)自所述个体采集血浆，和(C)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。39、如权利要求38所述的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原与所述一或多种其它细菌抗原中的至少一者结合。40、如权利要求38所述的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原相对于野生型金黄色葡萄球菌a-毒素，其含有至少两处降低其毒性的改变。41、如权利要求31所述的组合物，其中所述组合物是通过包含下列步骤的方法来制备(a)筛选尚未投与金黄色葡萄球菌a-毒素抗原和不同于所述金黄色葡萄球菌a-毒素抗原的其它细菌抗原的人类个体，(b)自所述个体采集血浆，和(c)纯化来自所述个体的免疫球蛋白。42、一种治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包含对有需要的个体投与如权利要求l、9、20、31或36所述的组合物。43、如权利要求42所述的方法，其另外包含投与选自由抗感染剂、抗生素和抗微生物剂组成的群组的药剂。44、如权利要求43所述的方法，所述药剂是选自由万古霉素(vancomycin)、溶葡萄球菌素(lysostaphin)和氯林肯霉素(clindamycin)组成的群组。45、如权利要求42所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染与耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌相关。46、如权利要求42所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌产生a-毒素。47、一种中和金黄色葡萄球菌PVL感染的方法，其包含对有需要的患者投与包含以下的组合物(i)葡萄球菌杀白细胞素抗原或(ii)特异性结合葡萄球菌杀白细胞素抗原的抗体。48、一种中和葡萄球菌杀白细胞素感染的方法，其包含对有需要的患者投与包含以下的组合物(i)金黄色葡萄球菌PVL抗原亚单位或(ii)特异性结合金黄色葡萄球菌PVL抗原亚单位的抗体。全文摘要本发明提供包含金黄色葡萄球菌(S.aureus)α-毒素抗原和医药上可接受的载剂的疫苗，并且所述疫苗可用于治疗和预防感染。所述金黄色葡萄球菌α-毒素抗原可含有至少两处降低其毒性的改变和/或可与另一细菌抗原结合或共同投与。所述疫苗可包含一或多种其它细菌抗原。本发明也提供包含抵抗α-毒素和视情况一或多种其它细菌抗原的抗体的抗体组合物，并且所述组合物可用于治疗和预防感染。文档编号A61K39/40GK101466406SQ200780021183公开日2009年6月24日申请日期2007年2月27日优先权日2006年6月12日发明者金伯利·L·泰勒,阿里·I·法汤姆申请人:Nabi生物制药公司