从组织祖细胞和血管祖细胞从头形成和再生血管化组织的制作方法

专利名称：：从组织祖细胞和血管祖细胞从头形成和再生血管化组织的制作方法
技术领域：
：本发明整体上涉及从组织祖细胞和血管祖细胞从头形成和再生血管化组织。
背景技术：
：对于用于创伤重建、慢性疾病、肿瘤移除和先天性异常的组织移植的临床需求是大量的。目前的外科程序依赖于自体移植、同种异体移植、异种移植或合成材料。外科和科研团体已经广泛认识到了与目前临床程序相关的缺陷。大于100-200|um的组织装配需要经灌注的血管床以供给营养物以及清除废物、代谢中间产物和分泌物的事实限制了临床上可移植的三维工程(engineered)组织或器官的发展。考虑到血管发育是复杂的事件，其涉及各种各样的细胞类型以及许多不同的生长因素，成熟的功能性血管网络已经难以建造。在胚胎发育的过程中，内皮细胞形成管并结合形成初级毛细血管丛，该过程被称作血管生成。新血管是通过现有的血管分裂成两半或者通过从现有血管中萌发而形成的。在被称作血管成熟化的过程中，这种初级网络被改型和修剪以形成不同的微循环单位包括毛细管、动脉以及静脉。次优的血管生成仍然是组织工程的重要障碍，特别是对于重要尺寸组织缺陷。之前血管生成工程的途径依赖血管生成生长因子的释放或血管类似物的制造。然而，对于大组织移植物一直存在对生长因子递送的成本、潜在毒性、次优吻合和内皮迁移緩慢的关心。可以从单一的骨髓样品中分离两种干细胞的亚组间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。MSC能够分化成几乎全部的结締组织谱系细胞。HSC分化成内皮细胞，连同原本的血细胞一起对于血管化组织的形成是必要的。因此，存在对工程血管化组织构建体(contruct)的组合物，以及其生产方法的需求。发明概述本文公开了新的方法，其针对通过组织祖细胞和血管祖细胞的组合作用的血管化组织工程。使用所公开的组合物和方法生产的血管化组织组件(module)可以用于多种临床应用中。在某些方面中，本发明涉及血管化组织组件。在多种配置中，组织组件包括生物相容性基质、组织祖细胞和血管祖细胞。祖细胞可以被引入(例如通过同时或依次注射、内镜检查术或输注)到基质材料的生物相容性支架内或其上。本发明的另一方面提供了一种形成血管化组织组件的方法。这些方法包括提供生物相容性基质，并向该基质引入组织祖细胞和血管祖细胞。4吏用本领域中公知的方法例如通过注射、内镜;险查术或输注，祖细胞可以被递送到生物相容性基质内或其上。在多种配置中，递送可以是同时或者依次的。这些方法还进一步包括孵育含有组织和血管祖细胞的基质。在某些配置中，在孵育过程中，可以发生组织形态形成和/或细胞分化。这种孵育可以至少部分在体外，基本上在体外，至少部分在体内或者基本上在体内。在某些配置中，可以至少部分离体7(exvivo)形成组件，而在一些其他的配置中，生物相容性基质、组织祖细胞和血管祖细胞中的至少一种对于期待的受体例如需要治疗进行组织修复或置换的人而言是异源的。在多个方面中，组织祖细胞可以是间充质干细胞(MSC)、MSC衍生细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、施旺细胞(Schwanncell)、上皮细胞、真皮成纤维细胞、间质成纤维细胞、齿龈成纤维细胞、牙周成纤维细胞、颅缝成纤维细胞、腱细胞(tenocyte)、韧带成纤维细胞、尿道细胞、肝细胞、骨膜细胞、P-胰岛细胞或其组合。在某些配置中，优选组织祖细胞可以是MSC、MSC衍生细胞或其组合。在多个方面中，血管祖细胞可以是造血干细胞(HSC)、HSC衍生内皮细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、内皮细胞谱系、原代培养内皮细胞、衍生自干细胞的内皮细胞、骨髓衍生干细胞、脊索血衍生细胞(cordbloodderivedcell)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、淋巴腺内皮细胞、内皮祖细胞、分化成内皮细胞的干细胞、来自胚胎干细胞的血管祖细胞、来自脂肪组织或牙周组织或牙髓的内皮细胞，优选HSC或HSC衍生的内皮细胞。在多个方面中，基质可以包含材料例如纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、琼脂糖、藻酸盐、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚已内酯、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白(marineadhesiveprotein)、氰基丙烯酸酯、高分子水凝月交、类似物或其组合。在某些优选的配置中，基质材料可以是高分子水凝胶。在多个方面中，基质可以包含至少一个大通道和/或微通道。在某些实施方式中，多个大通道可以具有至少大约O.lmm至最高达大约50mm的平均直径。例如，大通道可以具有下列平均直径大约0.2mm、大约0.3mm、大约0.4mm、大约0.5mm、大约0.6mm、大约0.7mm、大约0.8mm、大约0.9mm、大约l.Omm、大约l.lmm、大约1.2mm、大约1.3mm、大约1.4mm、大约1.5mm、大约1.6mm、大约1.7mm、大约1.8mm、大约1.9mm、大约2.0mm、大约2.5mm、大约3.0mm、大约3.5mm、大约4.0mm、大约4.5mm、大约5.0mm、大约5.5mm、大约6.0mm、大约6.5mm、大约7.0mm、大约7.5mm、大约8.0mm、大约8.5mm、大约9.0mm、大约9.5mm、大约10mm、大约15mm、大约20mm、大约25mm、大约30mm、大约35mm、大约40mm或者大约45mm。在多个方面中，基质可以包含至少一种生长因子，优选血管生成生长因子，更优选bFGF、VEGF、PDGF、IGF、TGFb或其组合。祖细胞，其密度为总共大约0.5x100万个祖细胞(M)ml"大约100Mmr1。例如，在多种配置中，组织组件可以含有下列密度的祖细胞大约lMmr1、5Mml-1、10Mmr1、15Mml-1、20Mml-1、25Mml-1、30Mmr1、35Mml-1、40Mml-1、45Mml"1、50Mml-1、55Mmr1、60Mml-1、65Mml—1、70Mmr1、75Mmr1、80Mml-1、85Mml"、90Mmr1、95Mml"或100Mml人在某些配置中，组织组件可以含有密度为大约0.0001x100万个细胞(M)ml^大约1000Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为大约1Mml"至最高达大约100Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约5Mml"至最高达大约95Mmr1的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约10Mml"至最高达大约90Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约15MmK1至最高达大约85Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约20Mml"至最高达大约80Mm1—1的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约25Mml"至最高达大约75Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约30Mml"至最高达大约70Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约35Mml"至最高达大约65Mmr1的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约40Mml"至最高达大约60Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约45Mmr1至最高达大约55Mmr1的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约45Mml"至最高达大约50Mml"的祖细胞。在某些配置中，组织组件可以含有密度为至少大约50Mml"至最高达大约55Mml"的^且细月包。在多个方面中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约100:1至最高达大约1:100。例如血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或者1:20。在某些配置中，血管祖细胞与组织-且细胞的比例可以为大约20:1至最高达大约1:20。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为19:1大约1:19。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约18:1大约1:18。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约17:1大约1:17。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约16:1大约1:16。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约15:1大约1:15。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约14:1大约1:14。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约13:1大约1:13。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约12:1大约1:12。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约11:1大约1:11。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约10:1大约1:10。在某些配置中，血管^L细胞与组织;f且细胞的比例可以为大约9:1~大约1:9。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细月包的比例可以为大约。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约8:1大约1:8。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约7:1大约1:7。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约6:1大约1:6。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约5:1大约1:5。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约4:1大约1:4。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约3:1大约1:3。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约。在某些配置中，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以为大约2:1大约1:2。本发明的另一个方面提供了治疗组织或器官缺陷的方法。在多种配置中，这些方法包括将本发明的组织组件移植到有此需要的个体中。本发明进一步的一个方面提供了鉴定调控组织血管化的候选分子10的方法。这类方法包括形成本发明的组织组件；将基质、组织祖细胞、血管祖细胞、其组合或组织组件与候选分子接触；测量工程组织组合物的血管化；以及测定相对于未与候选分子接触的对照，是否候选分子调控工程组织组合物(engineeredtissuecomposition)中血管的形成。在某些配置中，可以在将基质与祖细胞组合之前，在将细胞接种在基质上之后但在发生血管形态形成之前，或者在开始血管化之后，将候选分子与基质、组织祖细胞或血管祖细胞接触。正如本文所使用的，调控组织血管化可以包括与对照相比，提高血管化或者降低血管化。其他的目的和特征将一部分清楚，一部分被指出。本领域技术人员能够理解下面所描述的附图仅仅是为了说明的目的。这些附图不以任何方式限制本发明的范围。图l是一系列组织切片图，其显示了人间充质干细胞(hMSC)分化成成骨细胞。图1A代表从从多个人供体之一制备的骨髓样品，其显示了大量的细胞。图1B代表hMSC从贴壁细胞群扩增培养成纺锤型细胞。图1C代表在成骨分化培养基中处理的MSC,其显示对碱性磷酸酶的阳性染色。图1D代表MSC衍生成骨细胞，根据冯库萨(vonKossa)染色所显示的，其产生了矿化结节。比例标尺(scalebar):100(im。在实施例1中提供了关于该方法的进一步细节。图2是一系列图，其显示来自衍生于人间充质干细胞(hMSC)的上皮细胞以及成骨细胞的工程骨构建体。图2A代表衍生自hMSC的成骨细胞被接种到磷酸三钙的孔内(TCP:淡红色)。在4。C下，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)扩增并接种到基膜水凝胶中，在水相中的Matrigel,并被输注到仅TCP的孔内，接着在37。C下Matrigel凝胶化。图2B显示在体内植入免疫缺陷小鼠背部中之后获得的样品中TCP区域内的类骨组织(B)的面积。图2C代表使用H&E染色的切片，其显示形成被圆形细胞所围绕的腔。如果将HUVEC均匀地接种在含水的Matrigel中，则在该构建体内腔和原始血管样(PV)结构的形成中存在明显的所接种HUVEC的重建。图2D代表使用更高放大倍数的冯库萨染色，其显示在TCP周围矿化组织岛。比例标尺100pm。在实施例1中提供了关于该方法的进一步细节。图3是一系列图和柱状图，其显示造血干细胞朝着工程血管化骨分化成内皮细胞。图3A代表所分离的骨髓、CD34+、非贴壁细胞被铺在涂覆纤连蛋白的细胞培养聚苯乙烯平板上。尽管这些细胞是与图1所示的MSC分离自相同的骨髓，但HSC的形态是圆形的，而图1B中的MSC是纺锤形的。图3B代表在培养两周后形成集落。图3C显示通过将形成集落的HSC接种在Matrigel内，在未结合的细胞之间所形成的管状结构。图3D显示正如Ac-LDL荧光的细月包内定位所证明的，对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的阳性标记。图3E显示HSC衍生内皮类细胞还表达一种天然内皮细胞的标记物-冯威勒布兰特因子(vonWillebrandFactor)(vWF):图3F证明HSC衍生内皮类细胞产生比对照细胞(成纤维细胞)(右柱)显著多的vWF(左柱)。在实施例2中提供了关于该方法的进一步细节。图4是一系列草图，其显示PEG水凝胶的结构。图4A代表仅有PEG水凝胶，没有bFGF或大通道。图4B代表PEG水凝胶，具有在光聚合之后形成的3个大通道(直径lmm),但没有bFGF。图4C代表PEG水凝胶，其在光聚合之后装载溶液中的10ug/mlbFGF,但没有大通道。图4D代表PEG水凝胶，其具有10ug/mlbFGF加上大通道。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图5是一系列照片，其描绘收获体内植入的样品。图5A显示所收获的PEG水凝胶、其没有细胞、bFGF或通道，显示了没有宏观宿主组织侵入。图5B显示所收获的具有3个大通道(均为直径lmm)的PEG水凝胶，其显示宿主组织在工程大通道的腔中向内生长。图5C显示所收获的负载bFGF但没有大通道的PEG水凝胶，其显示整体为红色。图5D显示所收获的具有bFGF和大通道而这的PEG水凝胶，其显示整体为红色，并且宿主组织在3个工程大通道的腔中向内生长。比例标尺6mm。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图6是一系列图，其显示在体内植入3周后使用H&E染色的PEG水凝胶样品。图6A代表不具有bFGF和大通道PEG水凝胶(H),其显示没有宿主细胞侵入。图6B代表宿主组织，其生长在具有3个大通道(C箭头)的PEG水凝胶(H)中。注意在PEG中大通道以外的部分没有宿主细胞渗透。图6C描述了负载bFGF但没有通道的PEG水凝胶(H),其显示明显随机的宿主组织渗透。图6D代表宿主组织渗透；这种渗透仅发生在bFGF-浸透的PEG水凝胶的大通道内。尽管图6C和图6D中bFGF的剂量相同，但具有大通道的负载bFGF的PEG(图6D)诱导了大量的宿主细胞向内生长。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图7是柱状图，其显示通过计算机组织形态计量向内生长的宿主组织的量。在负载bFGF的PEG水凝胶的大通道中向内生长的宿主组织的量比没有bFGF的PEG水凝胶的大通道中宿主组织的量显著地大。每组N二8。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图8是一系列图片，其描绘在PEG水凝胶中向内生长的宿主组织的H&E染色。图8A代表具有大通道，但没有bFGG的PEG水凝胶，其显示宿主组织仅在大通道内向内生长。箭头表示血管。图8B代表更高功率的图8A,其显示被内皮细胞类细胞排成的血管样结构(白色箭头)，并被成纤维细胞类细胞围绕。图8C代表PEG水凝胶(H),负载bFGF但没有大通道，其显示很少向内生长的宿主组织，被内皮细胞类细胞排成的血管样结构(黑色箭头)。图8D代表更高功率的图8C。图8E代表具有bFGF和大通道的PEG水凝胶，其显示以高密度血管样结构向内生长的紧密宿主组织(黑色箭头)。图8F代表图8E的更高功率图片，其显示具有类似血红细胞的大血管样结构(白色箭头)，并由内皮细胞类细胞排成。成纤维细胞类细胞围绕血管样结构。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图9是一系列图，其描绘使用抗-VEGF抗体染色的免疫定位组织切片。图9A代表PEG水凝胶(H),其不具有bFGF和大通道，其显示除了宿主纤维嚢(C)外缺少VEGF阳性组织。图9B代表PEG水凝胶，具有3个大通道但不具有bFGF,其显示大通道内宿主组织的强VEGF染色。图9C代表PEG水凝胶(H)，负载bFGF但没有大通道，其显示以明显随机的方式的VEGF阳性组织。图9D代表PEG水凝胶(H),具有bFGF和大通道，其显示在大通道内宿主组织的强VEGF染色。来自Stosich等人(2006)。在实施例3中提供了关于该方法的进一步细节。图10是一系列草图，其描绘细胞密度实验的实验安排。人间充质干细胞(MSC)、MSC-衍生成骨细胞(MSC-Ob)和MSC衍生软骨细胞(MSC-Cy)。对于每种细胞谱系，在PEG水凝胶中封装四种细胞密度每毫升细胞悬浮液0、500万、4000万和8000万个细胞。OS培养基骨生成刺激培养基，其含有地塞米松(dexamethosone)、抗坏血酸和b-甘油磷酸。CS培养基软骨生成培养基，其含有TGFb3。图IOA代表人MSC,没有分化成任何细胞谱系。图10B代表人MSC衍生的成骨细胞。图IOC代表人MSC衍生的软骨细胞。在每种情况中，以3D培养的细胞被胰蛋白酶处理并加载到细胞悬浮液中。接着将悬浮的细胞加载到PEG水凝胶的水相中，接着进行光聚合并形成凝胶。对于每种条件(A、B和C)，获得了封装MSC、MSC-Ob和MSC-Cy的凝胶化构建体用于进一步的体外和体内研究。来自Troken和Mao(2006)。在实施例4中提供了关于该方法的进一步细节。图ll是一系列图，其描绘在体外培养4周后，各种细胞密度的组织观察。上排在DMEM中培养的没有分化的对照或MSC。中排在成骨培养基中培养的MSC-成骨细胞(MSC-Ob)。下排在成软骨培养基中培养的MSC衍生的软骨细胞(MSC-Cy)。5M细胞/mL-每毫升细胞悬浮液500万个细胞。最左列代表无细胞PEG水凝胶。下一列代表每毫升500万个细胞的起始细胞接种密度，接着是每毫升4000万个细胞，最右列是每毫升8000万个细胞。对于每种细胞谙系，在体外孵育中保持起始细胞接种密度4星期。来自Troken和Mao(2006)。在实施例4中提供了关于该方法的进一步细节。图12是一系列图，其描绘描绘在体外培养4星期后PEG水凝胶的番红O染色，其中PEG水凝胶封装人间充质干细胞(MSC)(图13A-13D)和MSC衍生软骨细胞(MSC-Cy)(图13A'-13D')。最左列代表无细胞PEG水凝胶。下一列代表每毫升500万个细胞的起始细胞接种密度，接着是每毫升5000万个细胞，最右列是每毫升8000万个细胞。阳性的番红O染色显示了与起始细胞接种密度有关的标记面积。MSC是番红O染色阴性。起始细胞接种密度连同PEG水凝胶中分化的成软骨表型被维持。来自Troken和Mao(2006)。在实施例4中提供了关于该方法的进一步纟田节。图13是一系列图，其描绘在体外培养4星期后PEG水凝胶的冯库萨染色，其中PEG水凝胶封装人间充质干细胞(MSC)(图14A-14D)和MSC衍生成骨细胞(MSC-Ob)(图14A'-14D')。最左列代表无细胞PEG水凝胶。下一列代表每毫升500万个细胞的起始细胞接种密度，接着是每毫升4000万个细胞，最右列是每毫升8000万个细胞。冯库萨染色是阳性，并且显示了与起始细胞接种密度有关的标记面积。MSC是冯库萨染色阴性的。这暗示在没有加入下排的成骨刺激物时，MSC没有分化成成骨细胞。起始细胞封装密度连同PEG水凝胶中分化的成骨表型一皮维持。来自Troken和Mao(2006)。在实施例4中提供了关于该方法的进一步细节。图14是一对柱状图，其显示MSC衍生软骨细胞和MSC衍生成骨细胞基质形成的定量。图14A代表在4星期体内植入之后占整个支架面积的Alcian蓝色总面积。MSC衍生软骨细胞(MSC-Cy)合成了比hMSC和HMSC衍生成骨细胞(hMSC-Ob)多的GAG。图14B代表占整个支架面积的冯库萨染色总面积。MSC-Ob诱导比hMSC和HMSC-Cy显著多的矿化。每组N二8。来自Troken和Mao(2006)。在实施例4中提供了关于该方法的进一步细节。图15是一系列草图，其描绘PEG水凝胶的结构和相应的4星期后所植入水凝胶的免疫组织化学图。图15A描绘PEG水凝胶，具有大通道但没有bFGF。图15B描绘PEG水凝胶，具有bFGF但没有大通道。图15C描绘PEG水凝胶，具有大通道和bFGF。图15A'是所植入图15A的PEG水凝胶的免疫组织化学组织图片。图15B'是所植入图15B的PEG水凝胶的免疫组织化学组织图片。图15C'是所植入图15C的PEG水凝胶的免疫组织化学组织图片。在实施例20中提供了关于该方法的进一步细节。图16是一系列图，其描绘人间充质干细胞在35天离体培养过程中在体外分化成生脂细胞。使用油红O染色，hMSC衍生的生脂细胞与其反应阳性。图16A-16E代表没有生脂细胞分化的hMSC,而图16F-16J代表hMSC衍生的生脂细胞。在实施例21-22中提供了关于该方法的进一步细节。图17是一系列柱状图，其显示经过35天在hMSC和hMSC衍生的生脂细胞之间培养物样品的总DNA含量(图17A),以及hMSC和hMSC衍生的生脂细胞样品的甘油含量(图17B)。在实施例22中提供了关于该方法的进一步细节。图18是一系列草图和图片，其描绘封装在PEG水凝胶内的hMSC和hMSC衍生的生脂细胞在植入4星期后血管化生成脂肪。图18A描绘PEG水凝胶，不具有大通道，不具有bFGF,没有细胞递送。图18B描绘PEG水凝胶，具有大通道，具有bFGF,但没有细胞递送。图18C描绘PEG水凝胶，其具有大通道，具有bFGF,并递送hMSC-脂肪细胞。图19A，、19B，和19C，分别是图19A、19B和19C的PEG水凝胶在植入小鼠12星期后的照片。在实施例23中提供了关于该方法的进一步细节。图19是一系列图，其描绘经染色的组织切片，其中封装hMSC衍生的生脂细胞的具有大通道的PEG微通道水凝胶被植入12个星期。图19A是免疫组织化学染色的组织。图19B是被油红0(Oil-red0)染色阳性的组织。图19C是被抗VEGF抗体染色的组织。图19D是被抗WGA植物凝血素抗体染色的组织。在实施例23中提供了关于该方法的进一步细节。图20是一系列图，其显示血管祖细胞中血管内皮生长因子2或Flkl的表达。在实施例24中提供了关于该方法的进一步细节。图21是柱状图，其显示血管祖细胞中VEGF2的定量。在实施例24中提供了关于该方法的进一步细节。图22是图片，其显示在(3TCP支架中被绿色荧光蛋白(GFP)标记的骨祖细胞和一皮红色CM-DiI标记的血管祖细胞。在实施例25中提供了关于该方法的进一步细节。发明详述本文所描述的途径是至少部分基于通过应用造血干细胞和间充质干细胞的联合作用形成血管化组织的发现以进行组织工程。本文所证明的是在与组织祖细胞和血管祖细胞组合时，高分子生物材料的血管化。还证明了当被引入到含有组织祖细胞的多孔支架内或其上时，血管祖细胞会在体内诱导血管样结构。进一步证明了在基质材料中物理内置的大通道和/或血管生成生长因子在体内诱导宿主衍生的血管生成和血管化。因此，提供了一种通过血管祖细胞和组织祖细胞二者的协同作用弥补组织缺陷的新型再生途径，以便总效果可以大于各自效果的和。这些途径受益于本文所公开的关于在从头形成血管化组织或器官中血管祖细胞(例如HSC)、组织祖细胞(例如MSC)以及它们的细胞谱系衍生物与调控血管生成生长因子之间的相互作用的新理解。作为例子，本文所公开的组合物和方法能够提供生物上有活力的工程硬组织组件用于修复长骨缺陷例如节段性缺陷，在生物衍生全关节置换术中的软骨下骨再生，以及骨髓置换。作为另一个例子，本文所描述的组合物和方法能够提供生物上有活力的工程软脂肪组织，用于修复由于外伤、肿瘤切除术和先天性异常所引起的软组织缺陷。本发明的一个方面提供了工程血管化组织或器官的组合物。这些组合物通常包括被引入到生物相容性基质内或其上的组织祖细胞和血管祖细胞。本发明的另一个方面提供了用于形成这些工程血管化组织或器官的方法。根据这些用于组织工程和组织再生的方法，组织祖细胞和血管祖细胞被引入到生物相容性基质内或其上，以产生血管化组织或器官。进一步的方面提供了通过将本发明的组合物移植到有此需要的个体内来治疗组织缺陷的方法。生物上有活力的组织或器官能够从具有提高血管化的组织祖细胞通过使用血管祖细胞而被建造。根据本文所公开的方法能够形成的血管化组织或器官类型包括但不限于膀胱，骨，脑，乳房，骨软骨连接处，神经组织包括中枢神经系统、脊髓和外周神经、神经胶质，食道，输卵管，心脏，胰腺，肠，胆嚢，肾，肝，肺，卵巢，前列腺，脊髓，脾，骨骼肌，皮肤，胃，睾丸，胸腺，曱状腺，气管，泌尿生殖道，输尿管，尿道，间质软组织，骨膜，牙周组织，颅缝，毛嚢，口腔粘膜和子宫。通过本发明的方法所形成的优选软组织组合物是工程血管化脂肪组织。通过本发明的方法所形成的优选硬组织组合物是工程血管化骨组织。组织通常是具有相似形态和功能的细胞的集合体，并且通常得到具有多种细胞类型和血液供给的异源间质组织的支持。通常器官是发挥生物功能的组织的集合体。器官可以是但不限于膀胱、脑、神经组织、神经胶质组织、食道、输卵管、骨、滑液关节(synovialjoint)、颅缝、心脏、胰腺、肠、胆嚢、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、曱状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫、乳房、骨骼肌、皮肤、骨和软骨。可以使用本领域技术人员已知的标准方法检验器官的生物功能。输注和培养为了形成本发明的组合物，将组织祖细胞和血管祖细胞引入(例如植入、注射、输注或接种)到能够支持三维组织或器官形成的人工结构(例如包含基质材料的支架)内或其上。可以将组织祖细胞和血管祖细胞同时或依次引入。可以将组织祖细胞和血管祖细胞引入到相互之间相同的空间位置、类似的空间位置或者不同的空间位置。优选，组织祖细胞和血管祖细胞被引入到基质材料的不同区域内或其上。预期可以将多种类型的组织祖细胞引入到基质内。类似的，预期可以将多种类型的血管祖细胞引入到基质内。可以通过多种本领域已知的手段将组织祖细胞和/或血管祖细胞引入到基质材料中(参见例如实施例1;实施例4;实施例11;实施例12;实施例20,实施例23)。用于将祖细胞引入(例如输注、接种、注射等)到基质材料内或其内的方法在例如Ma和Elisseeff,ed.(2005)ScaffoldingInTissueEngineering,CRCISBN1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866中被讨论。例如，通过包括具有细胞悬浮液(例如，浓度为100个细胞/ml几百万个细胞/ml)的水合冻千支架的方法，祖细胞可以被引入到基质内或其上。加入额外试剂的方法会如下所讨论而有变化。培养和分化支架(scaffold)内或支架上的祖细胞是本领域中公知的(参见例如Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X;Vunjak-Novakovic和Freshney,eds.(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss，ISBN0471629359;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。正如本领域技术人员能够理解的，将一且细胞引入到基质内或其上与移植所得到的基质之间的时间可以根据特定的应用而变化。孵育(以及后续复制和/或分化)在基质材料中或其上含有组织祖细胞和血管祖细胞的工程组合物可以是例如至少部分在体外，基本上在体外，至少部分在体内，或者基本上在体内。确定最佳的培养时间属于本领域的技能。可以使用适当的培养基用于体外祖细胞输注、分化或细胞分化转移(参见例如Vunjak-Novakovic和Freshney，eds.(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss，ISBN0471629359;Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。培养时间可以在大约l小时、几小时、一天、几天、一星期、或几星期内变化。可以通过例如利用ELISA的形态学、通过蛋白质检验、通过遗传检验、通过机械分析、通过RT-PCR和/或通过免疫染色筛选细胞类型特异性标记物来对基质中存在的细胞的量和类型进行鉴定(参见例如Minuth等人(2005)TissueEngineering:FromCellBiologytoArtificialOrgans,JohnWiley&Sons,ISBN3527311866)。正如在本文所描述的，在某些实施方式中，通过将组织祖细胞和血管祖细胞引入到基质材料内或其上，形成工程血管化组织或器官，而不需要使用额外的生物活性剂，特别是生长因子等。不存在生长因子时形成工程血管化组织的能力提供了传统工艺在组织工程中所不具有的优点。血管化在导致组合物血管化的条件下，发生将组织祖细胞和血管祖细胞引入到基质材料内或其上。优选，血管组织在整个工程组织或器官内生长。可以在体外(参见例如实施例2;实施例22)、体内(参见例如实施例1;实施例3)或其组合，在组织工程或器官中产生血管化。例如，可以通过培养支架基质细胞内的组织祖细胞和血管祖细胞来进行分化。作为另一个例子，祖细胞可以被输注到基质内，并迅速将这种基质移植到个体内，使得在体内发生分化。何时将工程组织或器官引入个体的确定可以至少部分基于在组织或器官中所形成血管化的量。用于测量组织工程或器官中血管生成的方法是本领域中标准的(参见例如Jain等人(2002)Nat.Rev.Cancer2:266-276;Ferrara,ed.(2006)Angiogenesis,CRC,ISBN0849328446)。在早期血管形成过程中，在发育过程中，不成熟的血管通过具有相对大的直径和缺少血管形态分化而类似于血管丛。随着时间的过去，不成熟的血管生成血管的网状模式逐渐成熟为功能性微循环单位，其发育成具有分化的细动脉和小静脉的密集毛细管网。可以通过例如测量无分支血管节段的19数目(每单位面积内节段的数目)、功能性血管密度(每单位面积灌注血管的总长度)、血管直径或血管体积密度(根据每个节段的长度和直径所计算的，每单位面积血管总体积)。官提高的血管化。例如，与不是通过本文所描述的引入血管祖细胞和组织祖细胞二者所形成的相应工程组织或器官相比，工程组织或器官中的血管形成(例如血管生成、血管发生、形成不成熟的血管网络、血管改型、血管稳定化、血管成熟化、血管分化或功能性血管网络的建立)可以被提高至少5%、10%、20%、25%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%甚至多达100%、150%或200%。优选，工程组织或器官组合物的血管化是稳定的血管网络，其可以存在至少l天、2天、3天、4天、5天、6天、l星期、2星期、3星期、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或者甚至12个月或更长。优选地，工程组织或器官组合物的血管网络被通过引入而整合到组织、器官或个体的循环系统。对于使用小支架(尺寸小于100立方毫米)的组织或器官再生，可以体外手动改变培养基，并定时(例如每3~4天)加入额外试剂。对于大支架，可以将培养保持在例如生物反应器系统中，所述生物反应器系统可以使用微型泵用于改变培养基。可以将微型泵设置在孵育器内，将新鲜的培养基泵向支架的基质材料。培养基循环回收，并通过如此，基质可以具有大约1%~大约100%的新鲜培养基。泵速可以被调节以达到培养基和/或培养基中所包含额外试剂的最佳分配。可以根据所制造的组织或器官的类型定制培养基递送系统。优选，在无菌条件下进行所有培养。^且细月包本发明的组合物和方法采用组织祖细胞和血管祖细胞二者。这些细胞可以是通过本领域中已知的各种方法分离、纯化和/或培养的(参见例如实施例9;实施例21)。用于分离和培养祖细胞的方法:f皮讨论在例^口Vunjak-Novakovic禾口Freshney(2006)CultureofCellsforTissueEngineering,Wiley-Liss,ISBN0471629359中。在某些方面中，祖细胞可以衍生自与意欲移植的受体相同或不同的物种。例如，祖细胞可以书f生自动物包括]旦不限于脊推动物例如哺乳动物、爬4亍动物或鸟。杜呆g曰。直甲，1凡迅P用孑L初物孰马矢疋J^、亇、判、狗、千、诸或鸡，最优选人。本发明的组织祖细胞包括能够分化成目标组织或器官和/或经历形态形成以形成目标组织或器官的细胞。组织祖细胞的非限制性例子包括间充质干细胞(MSC),从MSC分化的细胞，成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，脂肪细胞，神经元细胞，神经元支持细胞例如神经胶质细胞(例如施旺细胞)，成纤维细胞细胞例如间质成纤维细胞、腱成纤维细胞(tendonfibroblasts真皮成纤维细胞、韧带成纤维细胞、牙周成纤维细胞例如齿龈成纤维细胞、卢贞面成纤维细胞，心肌细胞，上皮细胞，肝细胞，尿道细胞，肾细胞，骨膜细胞，膀胱细胞，(3-胰岛细胞，成牙质细胞，牙髓细胞，牙周细胞，肺细胞和心脏细胞。例如，在本发明的血管化骨组织中，引入到基质中的组织祖细胞可以是能够产生骨组织的祖细胞例如间充质干细胞(MSC)、MSC成骨细胞或MSC软骨细胞。需要理解，MSC软骨细胞是从MSC分化的软骨细胞。类似的，MSC成骨细胞是成骨细胞MSC成骨细胞。在另一个例子中，本发明的血管化脂肪组织中，引入到基质中的组织祖细胞可以是能够产生脂肪组织的祖细胞，例如MSC或MSC生脂细胞(即从MSC分化的生脂细胞)。引入到基质材料内或其上的血管祖细胞是能够分化成或以其他方式形成血管组织的祖细胞。血管祖细胞可以是例如能够分化成内皮细胞的干细胞例如造血干细胞(HSC)、HSC内皮细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、内皮细胞谱系、原代培养内皮细胞、衍生自干细胞的内皮细胞、骨髓衍生干细胞、脊索血衍生细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、淋巴腺内皮细胞、内皮祖细胞、内皮细胞谱系、体外从干细胞产生的内皮细胞、从脂肪组织提取的内皮细胞、平滑肌细胞、间质成纤维细胞、肌成纤维细胞、牙周组织、牙髓或血管衍生细胞。需要理解，HSC内皮细胞是从HSC分化的内皮细胞。能够从例如骨髓、软组织、肌肉、血液和/或血管系统分离血管祖细胞。在某些配置中，血管祖细胞可以衍生自组织祖细月包。本发明包括优化组织祖细胞和血管祖细胞二者(以及它们的谱系衍生物)的密度以便使得血管化组织或器官的再生结果最大化的方法(参见例如实施例4;实施例5;实施例6)。在这些方法中，可以监控随基质中经过一段时间以及在终点的细胞密度。可以确定组织的性质，例如使用本领域技术人员已知的标准技术，例如组织学、结构分析、免疫组织化学、生化分析和机械性能。正如本领域技术人员能够认识到的，组织祖细胞和/或血管祖细胞的细胞密度会根据例如祖细胞类型、组织或器官类型、基质材料、基质体积、输注方法、接种模式、培养基、生长因子、孵育时间、孵育条件等而变化。通常，对于组织祖细胞和血管祖细胞二者，基质中每种细胞的细胞密度可以独立地为0.0001x1(^个细胞(M)ml"大约1000Mmr1。例如，组织祖细胞和血管祖细胞均可以以下列密度在基质中存在大约0.001Mmr1、0.01Mmr1、0.1Mml-1、1Mml"、5Mml—1、10Mml—1、15Mmr1、20Mml-1、25Mml"、30Mml1、35Mml"、40Mmr1、45Mmr1、50Mmr1、55Mmr1、60Mml-1、65Mmr1、70Mml-1、75Mmr1、80Mml-1、85Mmr1、90Mml-1、95Mml"、100Mml"、200Mml.1、300Mmr1、400Mml-1、500Mml"、600Mmr1、700Mmr1、800Mml"或900Mml.1。可以以各种比例将血管祖细胞和组织祖细胞引入到基质内或其上(参见实施例5)。正如本领域技术人员能够理解的，血管祖细胞与组织祖细胞的细胞比例能够根据例如祖细胞类型、目标组织或器官类型、基质材料、基质体积、输注方法、接种模式、培养基、生长因子、孵育时间和/或孵育条件等而变化。通常，血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以是大约100:1大约1:100。例如血管祖细胞与组织祖细胞的比例可以是大约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20。在某些实施方式中，帔引入基质的祖细胞可以包括异源核酸以便表达生物活性分子例如异源蛋白或用于过表达异源蛋白。在非限制性的例子中，被引入基质的祖细胞能够表达荧光蛋白标记物，例如GFP,EGFP,BFP,CFP,YFP或RFP。在另一个例子中，被引入基质的祖细胞能够表达血管生成相关因子例如激活素A、肾上腺髓质素、aFGF、ALK1、ALK5、ANF、血管生成素、血管形成素-1、血管形成素-2、血管形成素-3、血管形成素-4、血管生长抑制因子、血管趋向素、血管紧张素-2、AtT20-ECGF、(3细胞素、bFGF、B61、bFGF诱导活性、4丐粘素、CAM-RF、cGMP类似物、ChDI、CLAF、claudins、胶原、胶原受体a]Pi和ot2p!、连接蛋白、Cox-2、ECDGF(内皮细胞衍生生长因子)、ECG、ECI、EDM、EGF、EMAP、endoglin、内皮素、内皮抑制素、内皮细胞生长抑制剂、内皮细胞活力维持因子、内皮分化鞘糖G蛋白偶联受体-l(EDGl)、ephrms、Epo、HGF、TNF-a、TGF-P、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8、生长激素、纤维蛋白片段E、FGF-5、纤维连接蛋白和纤维连接蛋白受体a5(3i、因子X、HB-EGF、HBNF、HGF、HUAF、血管细胞扩增的心脏衍生抑制剂、IFN-y、IL1、IGF-2IFN-y、整合素受体(例^口a亚基(例i口ai、a2、a3、ou、ot5、a6、0c7、as、0c9、oce、ay、ociib、aL、aM、ax)的各种组合、K-FGF、LIF、平滑肌瘤衍生生长因子、MCP-1、巨噬细胞衍生生长因子、单核细胞衍生生长因子、MD-ECI、MECIF、mmP2、mmP3、mmP9、尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂、神经毡蛋白(NRP1、NRP2)、neurothelin、一氧化氮供体、一氧化氮合成酶(NOS)、notch、闭合蛋白、带状闭合蛋白、制瘤素M、PDGF、PDGF-B、PDGF受体、PDGFR隱p、PD-ECGF、PAI-2、PD-ECGF、PF4、P1GF、PKR1、PKR2、PPAR-y、PPAR-y配体、磷酸二酯酶、催乳激素、环前列腺素、蛋白质S、平滑肌细胞衍生生长因子、平滑肌细胞衍生迁移因子、鞘氨醇-l-磷酸-l(SlPl)、Syk、SLP76、速激肽、TGF-(3、Tie1、Tie2、TGF-(3和TGF-(3受体、TIMP、TNF-a、TNF-(3、转铁蛋白、血小板反应素、尿激酶、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF、VEGF164、VEGI、EG-VEGF、VEGF受体、PF4、催乳激素的16kDa片段、前列腺素E1和E2、类固醇、肝素、l-丁酰甘油(单丁酸甘油酯)或尼克酰胺。作为另一个例子，被引入基质的祖细胞可以含有遗传序列，其降低或消除宿主中的免疫应答(例如通过抑制细胞表面抗原例如I类和II类组织兼容性抗原的表达)。在某些实施方式中，除了第一组织祖细胞和第一血管祖细胞外，还可以将一种或者多种细胞类型引入到基质材料中或其上。这些额外的细胞类型可以选自上面所讨论的，并且/或者可以包括(但不限于)皮肤细胞、肝细胞、心脏细胞、肾细胞、胰腺细胞、肺细胞、膀胱细胞、胃细胞、肠细胞、泌尿生殖道细胞、乳房细胞、骨骼肌细胞、皮肤细胞、骨细胞、软骨细胞、角化细胞、肝细胞、胃肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、乳腺细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、软组织细胞、破骨细胞或软骨细胞。可以在基质血管化之前，过程中，或之后引入这些细胞类型。这种引入可以发生在体外或者体内。如果在体内引入这些细胞，则引入可以在工程血管化组织或器官组合物的位点，或者与其无关的位点。施用这些细胞的示例性路线包括注射和手术植入。基质本发明的组合物和方法采用基质，向其中或其上引入祖细胞，以便形成组织或器官构建体。这些基质材料能够允许细胞附着并迁移；递送和保留细胞和生化因子；实现细胞营养物和所表达产物的扩散；和/或发挥某些机械和生物学影响以改变细胞期的行为。通常，基质是生物兼容材料的多孔微孔支架，其提供物理支持和粘附基材用于在体外培养和后续体内植入过程中引入血管祖细胞和组织祖细胞。优选，具有高多孔性和适当孔径大小的基质，以促进引入细胞和在整个结构中扩散细胞和营养物。基质的生物可降解性也是优选的，因为周围组织对基质的吸收能够避免对手术除去的需要。降解发生的速度需要与组织或器官形成的速度尽可能一致。因此，当细胞在构建体围绕它们的自身天然结构时，基质能够提供结构的整体性，并最终分解而留下新生组织，新形成的组织或器官，其能够呈现机械负载。可注射性在某些临床应用中也是优选的。适当的基质材料被描述在例如Ma和Elisseeff,ed.(2005)ScaffoldinginTissueEngineering,CRC,ISBN1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesfortheDesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X中。基质结构能够以来待修复或产生的组织或器官，但优选基质是柔软的、生物兼容的多孔模板，其允许血管和目标组织或器官生长。基质可以被制造成结构支持物，其中该结构的布局(例如形状、大小、多孔性、微通道或大通道)被根据应用而定制。基质的多孔性是一种设计参数，其影响细胞引入和/或细胞渗透。基质能够被设计成采用影响细胞粘附和在基质中迁移的细胞外基质蛋白质。基质可以由合成聚合物形成。这些合成聚合物包括但不限于聚氨酯、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白(marineadhesiveprotein)和氰基丙烯酸酯或类似物或上述的混合物、组合和衍生物。可替换的，成。这些聚合物包括但不限于琼脂糖、藻酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、胶原、凝胶、透明质酸和其他适当的聚合物和生物聚合物或上述的类似物、混合物、组合和衍生物。同样，基质可以从天然存在的生物聚合物和合成聚合物的混合物形成。基质材料基质可以包括例如胶原凝胶、聚乙烯醇海绵、聚(D,L-丙交酯_共聚_乙交酯)纤维基质、聚乳糖(polyglactin)纤维、藻酸钙凝胶、聚乙醇酸网、聚酯(例如聚(L-乳酸)或聚酐)、多糖(例如藻酸盐)、聚磷腈或聚丙烯酸酯或聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。基质可以从蛋白质(例如胞外基质蛋白例如纤维蛋白、胶原和纤维连接蛋白)、聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)或透明质酸形成。也可以使用合成的聚合物，其包括生物可侵蚀聚合物(例如聚(丙交酯)、聚(乙醇酸)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯)、可降解聚氨酯、不可侵蚀的聚合物(例如聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的醋酸纤维素和其衍生物)、不可侵蚀的聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯代磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、teflon和尼龙。基质还可以含有酶、离子、生长因子和/或生物试剂的一种或者多种。例如基质可以含有生长因子(例如血管生成生长因子或组织特异性生长因子)。可以以大约0~1000ng/mL的浓度提供这类生长因子。例如生长因子可以以大约100700ng/mL的浓度，以大约200-400ng/mL的浓度，或者以大约250ng/mL的浓度存在。基质可以含有一个或者多个物理通道。这些物理通道包括微通道和大通道。微通道通常具有大约O.l^m大约1,000]im的直径。正如本文所显示的，基质大通道可以促进血管生成和骨或脂肪组织形成，以及引导血管化和宿主细胞入侵的发生(参见例如实施例3;实施例20;实施例23)。微通道和/或大通道可以是某些基质材料天然存在的部件和/或基质材料中特异构建体的部件。微通道和/或大通道的形成可以是根据例如机械和/或化学手段。大通道可以在基质内延伸多种深度，或者完全穿过基质。大通道可以是多种直径的。通常可以根据提高的灌注优化、组织生长和组织组件的血管化来选择大通道的直径。大通道可以具有例如大约0.1mm大约50mm的平均直径。例如，大通道可以具有下列的平均直径大约0.2mm、大约0.3mm、大约0.4mm、大约0.5mm、大约0.6mm、大约0.7mm、大约0.8mm、大约0.9mm、大约l.Omm、大约l.lmm、大约1.2mm、大约1.3mm、大约1.4mm、大约1.5mm、大约1.6mm、大约1.7mm、大约1.8mm、大约1.9mm、大约2.0mm、大约2.5mm、大约3.0mm、大约3.5mm、大约4.0mm、大约4.5mm、大约5.0mm、大约5.5mm、大约6.0mm、大约6.5mm、大约7.0mm、大约7.5mm、大约8.0mm、大约8.5mm、大约9.0mm、大约9.5mm、大约10mm、大约15mm、大约20rnm、大约25mm、大约30mm、大约35mm、大约40mm或者大约45mm。本领技术人员能够理解，大通道直径的分布可以是正态直径分布，或者非正态直径分布。力口入的药物和/或诊断剂在某些实施方式中，本发明的方法和组合物还包括其他试剂，连同组织祖细胞和血管祖细胞被引入到基质内或其上。可以引入的各种实际包括但不限于生物活性分子、生物药物、诊断试剂和增强剂。基质还可以含有生物活性分子。基质的细胞可以被遗传改造以表达生物活性分子，或者可以将生物活性分子加入到基质中。也可以在存在生物活性分子时培养基质。可以在将祖细胞引入到基质之前，过程中，或之后加入生物活性分子。生物活性分子的非限制性离子包括激活素A、肾上腺髓质素、aFGF、ALK1、ALK5、ANF,血管生成素、血管形成素-1、血管形成素-2、血管形成素-3、血管形成素-4、血管生长抑制因子、血管趋向素、血管紧张素-2、AtT20-ECGF、p细胞素、bFGF、B61、bFGF诱导活性、《丐粘素、CAM-RF、cGMP类似物、ChDI、CLAF、claudins、胶原、胶原受体od(3！和ot2^、连接蛋白、Cox-2、ECDGF(内皮细胞书f生生长因子)、ECG、ECI、EDM、EGF、EMAP、endoglin、内皮素、内皮抑制素、内皮细胞生长抑制剂、内皮细胞活力维持因子、内皮分化鞘糖G蛋白偶联受体-l(EDGl)、ephrins、Epo、HGF、TNF-a、TGF-P、PD-ECGF、PDGF、IGF、IL8、生长激素、纤维蛋白片段E、FGF-5、纤维连接蛋白、纤维连接蛋白受体a5^、因子X、HB-EGF、HBNF、HGF、HUAF、血管细胞扩增的心脏衍生抑制剂、IFN-y、IL1、IGF-2IFN-y、整合素受体(例如a亚基(例如a!、a2、a3、a4、a5、a6、otx)和(3亚基(例如&、(32、(33、p4、(35、(36、(37和(38)的各种组合)，K-FGF、LIF、平滑肌瘤衍生生长因子，MCP-1、巨噬细胞衍生生长因子、单核细胞衍生生长因子，MD-ECI、MECIF、mmP2、mmP3、mmP9、尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂、神经毡蛋白(NRP1、NRP2)、neurothelin、一氧化氮供体、一氧化氮合成酶(NOS)、notch、闭合蛋白、带状闭合蛋白、制瘤素M、PDGF、PDGF-B、PDGF受体、PDGFR-p、PD-ECGF、PAI陽2、PD-ECGF、PF4、P1GF、PKR1、PKR2、PPAR-y、PPAR-y配体、磷酸二酯酶、催乳激素、环前&1日盒去恭添c:尿；界日n.脍义:+AA向4亚《界Ein/t;茶^么阳/j/jaj^/g、、_33nz"、i,。"〃ui'j_j--j_>、Hj，i,fg"'"少w"lji<(j~h子、鞘氨醇-l-磷酸-l(SlPl)、Syk、SLP76、速激肽、TGF-(3、Tiel、Tie2、TGF-p受体、TIMP、TNF-a、TNF-(3、转铁蛋白、血小板反应素、尿激酶、VEGF-A.VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF、VEGF164、VEGI、EG-VEGF、VEGF受体、PF4、催乳激素的16kDa片段、前列腺素E1和E2、类固醇、肝素、l-丁酰甘油(单丁酸甘油酯)和尼克酰胺。在其他优选的实施方式中，基质含有化学治疗剂或免疫调节分子。这些制剂和分子是本领域技术人员已知的。优选，基质含有bFGF、VEGF或PDGF或者他们的某些组合(参见实施例3;实施例7)。可以根据生长因子的控制释放调节工程组织移植物中的HSC-和MSC衍生血管生成。作为内皮细胞异常高渗透性的结果，工程血管组织可以是"漏的"。可以通过在植入体内的HSC-和MSC衍生血管化组织移植物的微嚢化递送血管生成生长因子而增强HSC内皮细胞的成熟。可以加入到本发明组合物的生物药物包括免疫调节剂和其他生物应答修饰剂。生物应答修饰剂通常包括参与修饰生物应答例如免疫应答或组织或器官生长和修复的生物分子(例如肽，肽片断，多糖，脂质，抗体)，其以一种增强特定期望治疗的方法，例如细菌细胞的细胞裂解，或组织或器官特异性细胞的生长，或者血管化。生物药物也可以直接引入到基质组分中。本领域技术人员能够理解或者能够容易确定其他可以作为适当非生物药物和生物药物的物质。本发明的组合物也可以被修饰以引入诊断试剂，例如射线透不过的试剂。这些试剂的存在使得医生能够监控内部发生的伤口修复的进展。这些化合物包括硫酸钡，以及各种含有碘的有机化合物。后者化合物的例子包括硤醋胺酸，硤胆胺，硤沙酸葡曱胺，碘番酸以及泛影葡胺钠。可以在本发明的组合物中使用的其他造影剂可以被本领域技术人员容易确定，并且可以包括使用放射性标记的脂肪酸或其类似物。组合物中试剂的浓度将根据化合物的性质，生理作用和期望的治疗或诊断效果而变化。治疗有效量通常是显示期望的效果而没有不适当的毒性的充分的治疗试剂浓度。诊断有效量通常是能够有效监控组织移植物的整合而使潜在的毒性最小化的诊断试剂的浓度。无论如何，本领域技术人员都容易确定特定化合物在特定情况中的期望浓度。基质组合物可以通过使用补充物例如人血清白蛋白(HSA)、羟乙基淀粉、右旋糖苷或其组合而得到强化或增强。也可以通过加入非变性非离子去污剂例如聚山梨醇酯80来增强基质组合物的溶解度。用于或者能够不需要过多实验而容易确定的。基质组合物也可以被通过使用可选择的稳定剂或溶剂而被进一步增强。适当使用这些将是本领域技术人员已知的，或者能够不需要过多实验而容易确定的。植入本发明的工程组织或器官组合物具有显著的临床价值，因为与通过本领域已知的其他手段所产生的类似阶段的工程组织或器官相比，他们具有提高的血管化水平。血管化的这种提高实现了更有效的组织项。通常通过与所涉及的组织或器官缺陷一致的历史和身体检查来评定对治疗需要的确定。被鉴定为需要治疗的个体包括具有被诊断的组织或器官缺陷的个体。优选个体是动物，包括但不限于哺乳动物，爬行动物和鸟类，更优选马、牛、狗、猫、羊、猪或鸡，最优选人。作为例子，有需要的个体可以缺少至少5%、10%、25%、50%、75%、90%或更多的特定细胞类型。作为另一个例子，有需要的个体可以具有组织或器官的损伤，并且该方法提供了组织或器官生物功能提高至少5%、10%、25%、50%、75%、90%、100%或者200%,甚至多达300%、400%或500%。作为另一个例子，有需要的个体可以患有疾病，紊乱或病症，该方法提供了工程组织或器官构建体，足以改善或稳、定疾病，紊乱或病症。例如，该个体可以患有疾病，紊乱或病症，这导致细胞的损失，萎缩，功能障碍或死亡。所治疗的示范性病症包括神经，神经胶质，或肌肉退行性疾病，肌肉萎缩或营养失调，心脏疾病例如先天性心力衰竭，肝炎或肝硬化，自体免疫性疾病，癌症，导致需要除去组织或器官的先天性缺陷，或者需要切除组织或器官的疾病、紊乱或病症例如心绞痛，心肌梗塞和力支体缺血性疾病，意外组织缺失或损伤例如骨折或创伤。在进一步的例子中，有需要的个体可以具有发生疾病，紊乱或病症的高风险，本发明可以延迟或防止其发生。组织或器官可以选自膀胱，脑，神经组织，神经胶质，食道，输卵管，心脏，胰腺，肠，胆嚢，肾，肝，肺，卯巢，前列腺，脊髓，脾，胃，睾丸，胸腺，曱状腺，气管，泌尿生殖道，输尿管，尿道，子宫，乳房，骨骼肌，皮肤，骨和软骨。血管祖细胞和/或组织祖细胞可以来自与工程组织组合物移植的个体相同的个体。可替换的，祖细胞可以来自相同的物种，或者甚至不同的物种。植入工程组织或器官构建体属于本领域的技能。基质和细胞装配物可以被完全或部分植入个体的组织或器官内以成为其功能部分。优选，植入物开始时通过细胞单层结合宿主或与宿主交流。经过一段时间，所引入的细胞能够扩增并迁移出聚合物基质达到周围组织。在植入后，工程血管化组织组合物周围的细胞能够通过细胞迁移进入。工程组织周围的细胞可以被生物活性材料吸引，包括生物应答调节剂，例如多糖，蛋白质，肽，基因，抗原和能够选择性掺入基质的抗体，以提供所需要的选择性，例如，将细胞受体限定到基质，或刺激细胞迁移进入基质，或者二者。通常，基质是多孔的，其具有相互连接的微通道和/或大通道，其能够实现通过生物和物理化学梯度而放大的细胞迁移。例如，围绕所植入基质的细胞可以被生物活性材料吸引，包括VEGF，成纤维细胞生长因子，转化生长因子-P,内皮生长因子，P-选择素，和细胞间粘附分子的一种或者多种。本领域技术人员能够接受和知道如何使用其他适于将细胞吸引到基质上的生物活性材料。可以将生物分子引入基质，以使生物分子嵌入其内。可替换的，可以使用化学修饰方法以在基质的表面共价连接生物分子。通过使用本领域中已知的偶联剂例如醛化合物，二酰亚胺等，基质组分的表面官能团可以与生物分子的官能团偶联形成共价键。另外，可以使用间隔物分子用于中断胶原中表面活性基团和生物分子的活性基团，以使基质表面上的这些分子更柔韧。生物分子结合到基质内部或外部的其他类似方法将是本领域技术人员已知的。本发明的方法、组合物和设备可以包括同时或依次使用酵、离子、生长因子和生物试剂中的一种或者多种例如凝血酶和钓或其组合进行处理。本发明的方法，组合物和设备可以包括使用非生物药物和/或生物药物同时或依次进4亍处理。筛选本发明的另一个方面提供了一种筛选调控血管形成的分子的方法。该方法包括下列步骤将组织祖细胞和血管祖细胞引入到基质材料；培养基质材料以形成工程组织；将基质材料或工程组织与候选分子接触；测量工程组织的血管化；以及确定相对于未接触候选分子的对照，候选分子是否调控基质/组织中血管的形成。任选地，该筛选方法也可以包括将基质材料或工程组织引入到个体中，并诱导内源性组织祖细胞和/或血管祖细胞迁移到所植入的构建体中。优选，候选分子是测试混合物的一部分，例如细胞裂解液、来自组织的裂解液或文库。与相应的未接触该分子的个体相比，调控血管形成的分子能够在培养物、基质、组织或器官中提高或者降低血管形成(例如血管生成，血管形成，不成熟血管网络的形成，血管改型，血管稳定化，血管成熟，血管分化，或建立功能型血管网络)至少5%、10%、20%、25%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、卯％,或者甚至多达100%、150%或者200%。经过详细描述了本发明，明显的是，一些修饰，变化和等价的实施方式是可能的，而不离开在后面权利要求中所限定的本发明的范围。而且，需要理解本文中的所有实施例都是作为非限制性实施例提供的。所引用的参考文献通过参照将本申请中所引用的所有出版物，专利，专利申请和其他参考文献整体并入本文，达到如同在这里具体和单独地描述每一篇通过参照整体并入本文的出版物，专利，专利申请和其他参考文献一样的成都。本文引用参考文献不应该认为承认这些是本发明的现有技术。实施例提供了下面的非限制性实施例，以进一步说明本发明。本领域技的发明人已经发现在实施本发明时充分发挥功能的途径，因此被认为是构成了其实施模式的例子。然而，本领域技术人员根据本发明的公开内容，能够理解可以对所公开的具体实施方式进行许多改变，而仍能够获得相同或类似的结果，这并不离开本发明的主旨和范围。应该理解，在实施例中所描述的任何方法可以是已经实际进行或者没有进行的，或者在实施例中描述的任何组合物可以是已经实际形成或者没有形成的，这所使用的动词时态无关。实施例1:空间上与MSC成骨细胞共同接种的内皮细胞在体内工程骨构建体中产生了血管样结构准备人骨髓样品(AllCells,Berkeley,CA),根据之前建立的方法(Shi等人，1998;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Marion等人，2005;Moioli等人，2006;Troken和Mao,2006)分离间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。图1A描绘了起始铺平板的骨髓含量，其显示浓密的已知是异源的细胞群。(参见Alhadlaq和Mao,2004;Marion和Mao,2006)。间充质干细胞会分化成成骨细胞。两种不同的细胞谱系人间充质干细胞(MSC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)被用于体内血管化骨工程中。根据上面所述的，从人骨髓样品中分离MSC(参见例如图1B)(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006)。扩增培养的/iMSCA分化成成骨细胞(Marion等人，2005;Moioli等人，2006)。hMSC衍生成骨细胞(hMSC-Ob)对碱性磷酸酶(参见例如图IC)和冯库萨染色(参见例如图ID)是阳性的。hMSC衍生成骨细胞(5xio6个细胞/mL)被接种在轻度减压中的(3-磷酸三钙盘的多孔表面((3TCP;平均孔径300inm)(参见例如，图2A，淡粉红区域)。内皮细胞与MSC成骨细胞共同接种在体内工程骨构建体中。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)被扩增培养，接着以5x1(^个细胞/mL的密度同样在轻度减压4X:下封装在Matrigel的液相中(参见例如图2A,红点)。Matrigel是底膜高分子水凝胶，其已经被广泛用于内皮细胞粘附以及血管生成研究(Abilez等人；2006;Baker等人，2006;Bruno等人，2006;Mondrinos等人，2006;Rajashekhar等人，2006)。HUVEC-Matrigel构建体(参见例如图2A,红点)被输注进已经被接种hMSC衍生成骨细胞的PTCP盘的孔内。随后，通过在37。C孵育使Matrigel聚合。输注具有HUVEC的复合构建体，并将接种hMSC-Ob的PTCP构建体(参见例如图2A)植入到严格组合免疫缺陷(SCID)小鼠的背部4星期。对照构建体包括接种hMSC-Ob的PTCP盘和无细胞的PTCP盘。收获体内植入后，回收的所输注HUVEC、接种hMSC-Ob的(3TCP构建体显示矿化面积以及冯库萨染色切片中PTCP的支架材料(参见例如图2B)。通过苏木精和曙红染色(参见例如图2C),在矿化结节中发现内皮类细胞所形成的血管类内腔(参见例如，图2C中的PV)。通过更高放大倍数的冯库萨染色切片，|3TCP构建体的大量区域被矿化(参见例如图2D)。如果HUVEC被均匀地接种在Matrigel中，则内皮类细胞所排成的内腔类结构的形成(参见例如图2C)显然在体内植入后参与HUVEC的重建。这些数据证明被共同接种在生物相容性材料不同空间区域内的人MSC成骨细胞和人内皮细胞可以在矿化组织内介导血管样结构。因此，许多细胞谱系可以在工程血管化骨内被优化，例如HSC、MSC、和/或他们的谱系衍生物包括HSC衍生内皮细胞和MSC衍生成骨细胞。实施例2:骨髓衍生造血干细胞在体外分化成内皮类细胞。对于临床应用，可以从骨髓中连同MSC分离HSC,优选通过最低限度侵入性途径。已经发现HSC经历了緩慢扩增(Shih等人，2000;Li等人，2004)。FGF-2已经被证明会加速HSC扩增速度(Wilson和Trump,2006;Yeoh等人，2006)。本发明人的经-睑是HSC的确以比MSC和HUVEC慢的速度扩增。可替代的，HSC可以分化成内皮细胞，接着扩增HSC衍生内皮细胞。制备骨髓样品(同前)用于分离HSC。CD34和磁珠分离被用于分离非粘附性细胞(EasySep.AllCells，Berkeley,CA)。所分离的CD34阳性细胞(CD34+)被认为是HSC。在涂覆纤连蛋白的平板中，HSC显示为圆形细胞(参见例如图3A),其形状与在2D培养中呈现纺锤形的MSC明显不同(参见例如图1B)。在将HSC转移到新培养板后，将内皮细胞分化补充物加入到DMEM,其含有VEGF(10ng/mL)、bFGF(lng/mL)和IGF-l(2ng/mL)(Shi等人1998;Shih等人，2000;Li等人，2004)。HSC在大约2星期内开始形成集落(参见例如图3B)。进一步，在内皮分化补充物的刺激下，HSC分化成未连接的细胞，其形成互连细胞的管状结构(参见例如图3C)。正如Ac-LDL焚光的细胞内定位所证明的，HSC衍生细胞对乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)是阳性的，其中Ac-LDL是一种典型的内皮细胞标记物(参见例如图3D)。正如抗体染色所证明的，HSC衍生内皮细胞还表达冯威勒布兰特因子(vWF),—种天然内皮细胞的标记物(参见例如图3E)。HSC衍生内皮细胞(HSC-EC)表达量比对照成纤维细胞(FB)(参见例如图3F，右柱)显著高的vWF(参见例如图3F,左柱)。综上所述，这些数据证明正如天然内皮细月包形态学和标记物所证明的，从人骨髓分离的HSC可以分化成内皮细胞类细胞。这些HSC衍生的内皮细胞形成细胞间管状连接。因此，可以通过掺合HSC和MSC、和/或HSC衍生的内皮细胞与MSC衍生成骨细胞产生工程血管化骨。这模拟了在发育过程中如何通过血管侵入形成天然骨。长骨的中部骨干区的骨生成带有血管，这极好地证明了造血干细胞和间充质干细胞在天然(血管化)血管生成中的协同作用。实施例3:生长因子在体内诱导高分子水凝胶中的血管生成。本文已经证明HSC和MSC能够分化成最终细胞语系例如内皮细胞和成骨细胞，其构成了某些血管和骨的构建体组件。还证明了血管样结构能够被在体内被建造在骨支架内。然而，现有的文献已经显示工程血管可能会由于异常高的内皮细胞渗透性而是漏的(Richardson等人，2001;Valeski和Baldwin,2003)。为了确定bFGF对宿主衍生的血管生成的影响，将血管生成因子bFGF递送到密集的高分子水凝胶,聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)中，在以前的研究中已知其在体内对宿主衍生血管细胞是不能渗透的(Alhadlaq和Mao,20(B;Alhadlaq等人，2004;Alhadl叫和Mao,2005;Stosich和Mao,2006)。当组织工程骨被朝向临床应用扩大以修复大的，严重尺寸的骨缺陷时，次优的血管化会是特别有问题的。下面所显示的数据证明物理大通道和封装在高分子水凝胶中的生物活性因子诱导寄主衍生的血管生成。在PEG水凝胶中设计了四种结构(参见例如图4)(Stosich等人，2006)。组1由PEG水凝胶单独构成。以6x4mm(直径x厚度)的尺寸形成PEG圆柱体(参见例如图4A)。组2由大通道单独构成。在光聚合PEG圆柱体中总共形成3个大通道(直径均为lmm)(参见例如图4B)。组3由bFGF单独构成。在PEG水凝胶的液相中装载总共10pg/mLbFGF,接着进行光聚合。在该组中没有形成大通道(参见例如图4C)。组4由bFGF和大通道构成。在PEG水凝胶的液相中装载总共10|ig/mLbFGF,接着进行光聚合并形成3个大通道(直径均为lmm)(参见例如图4D)。在任何四个组中都没有递送外源细胞。所有的PEG圆柱体都具有相同的6x4mm(直径x厚度)尺寸，并净皮皮下体内植入SCID小鼠的背部4个星期。在体内植入免疫缺陷小鼠内4周后，通过所提取的样品分析注意到了下列。没有设置bFGF或大通道的PEG水凝胶显示出没有血管渗透的宏观证据(参见例如图5A)。相反具有3个物理大通道的PEG水凝胶在体内收获的时候显示出3个红点(参见例如图5B)。下面的组织学和免疫组织化学证据暗示这些含有宿主衍生的血管组织。负载bFGF但没有大通道的PEG水凝胶整体颜色上要更深(参见例如图5C)。下面的组织学和免疫组织化学证据暗示宿主衍生血管组织渗透的随机区域。具有大通道并负载bFGF的PEG水凝胶不仅整体颜色上更深，而且在体内收获的时候还显示出3个红点(参见例如图5D)。下面的组织学和免疫组织化学证据证明组织细胞仅渗透进大通道的内腔中，而不在PEG水凝胶的其他位置。组织学和免疫组织化学发现(Stosich等人(2006))如下。不具有bFGF或大通道的PEG水凝"交(组l)显示没有宿主细胞渗透或者任何血管生成的迹象(参见例如图6A),这与之前的数据一致(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao，2005;Stosich34和Mao,2005)。具有大通道但没有bFGF的PEG水凝胶(上面的组2)证明宿主细胞仅渗透进大通道内，而不在PEG的其他部分(参见例如图6B)。相反，负载bFGF而没有大通道的PEG水凝胶(组3)显示出宿主细胞渗透明显随机的区域(参见例如图6C)。负载bFGF并具有大通道的PEG水凝胶(上面的组4)证明宿主细胞仅渗透进大通道内，而不在PEG的其他部分(参见例如图6D)。这些结果显示下列。具有大通道和bFGF二者的PEG水凝胶具有0.47士0.18mm2的宿主组织向内生长量，这显著地比具有大通道而没有bFGF的PEG水凝胶的0.13士0.05mm2高(平均值士S.D.;P<0.01;N二每组8个)(参见例如图7)。因此在PEG水凝胶中的物理和生物活性组合设计会促进宿主组织向内生长。更高功率图像的分析显示血管渗透进入PEG水凝胶，但会抵抗宿主组织向内生长(参见例如图8)。在具有或不具有bFGF的宿主组织中发生向内生长(参见例如图8A,9B和图8E，9F)。然而如在图7中所示，在负载bFGF的PEG水凝胶的大通道中所渗透的宿主组织的量(参见例如图8E，9F)显著地大于没有bFGF的具有大通道PEG水凝胶(参见例如.图8A,9B)。负载bFGF但没有大通道的PEG水凝胶显示出稀少的组织向内生长(参见例如图8C,9D)。血管样结构在由内皮类细胞排列成并被成纤维细胞类细胞所围绕的血管样结构中，含有类似血红细胞的细胞(参见例如图8E,9F)。使用抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体染色的免疫定位显示向内生长的宿主组织是血管组织。在具有或不具有bFGF的大通道中所渗透的宿主组织中出现强抗VEGF染色(参见例如图9B,IOD)。VEGF抗体还标记组织嚢(参见例如图9A)以及渗透到具有bFGF但没有大通道的PEG水凝胶中的宿主组织。(参见例如图9C)。这些数据证实血管样结构(正如在例如图8中所示)是由PEG水凝胶中的bFGF和/或大通道所诱导的宿主衍生血管生成。在没有bFGF或大通道的PEG水凝胶中不存在血管生成(参见例如图9A)。正如在先前工作中成脂细胞、成软骨和成骨细胞的存活所证明的，PEG水凝胶的孔可能足够大以允许生长因子和营养物扩散(Burdick等人，2003;Kim等人，2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli等人，2006;Stosich和Mao，2006)。然而，PEG水凝胶的孔径的大小不足以允许宿主细胞向内生长，除非引入通道和生长因子例如bFGF。因此，在大通道中宿主组织向内生长可用于引导血管生成和宿主细胞沿着预定的路线入侵。此外，bFGF或其他血管生成因子的放大有助于进一步加速向内生长。这些发现支持宿主衍生血管生成的调节，和增强骨构建体中工程血管的成熟。实施例4:组织工程(engineering)中的细胞接种密度在工程(engineering)生物结构中^f艮实际的问题是将多少细胞引入支架中(Moioli和Mao,2006)。在发育中间充质干细胞产生成骨祖细胞以及最后阶段的成骨细胞时，细胞分裂的密度依赖性抑制(之前被称作接触抑制)是细胞存活的因素(Alberts等人，2002)。在工程组织支架中接种过多的细胞可能会造成局部可利用丝裂原、生长因子和存活因子的短缺，可能导致细胞凋亡以及造成体外细胞扩增时间的不必要浪费(Moioii和Mao，2006)。另一方面，在工程组织支架中接种太少的细胞，可能会导致再生结果差。因此，需要确定HSC、MSC和它们语系衍生物的最佳密度，以使得工程血管化骨的再生结果最大化(参见例如图10)。这里报道了MSC、MSC衍生成骨细胞和MSC衍生软骨细胞的各种起始细胞密度的影响。从多个健康供体的多种骨髓细胞样品的每一种中分离人MSC,在单层培养中扩增，并如上和根据现有方法分别分化为成软骨细胞和成骨细胞(Alhadlaq等人，2004;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006)(参见例如.图10)。对每种细胞谱系hMSC,hMSC-Ob和hMSC-Cy,采用四种细胞密度0xi()6个细胞/mL、5x1()6个细胞/mL、40x1()6个细胞/mL和80x1()6个细胞/mL。以前研究了中间的细胞接种密度20x106个细胞/mL(Alhadlaq和Mao，2005)。0x1(^个细胞/mL-没有细胞的构建体。将每种细胞密度和语系的细胞悬浮液封装在PEG水凝胶的水相中，接着进行光聚合，以及连续培养3DPEG构建体4星期(参见例如图10)。在分别在DMEM、成骨补充DMEM或成软骨补充DMEM中，利用频繁更换培养基连续培养3DPEG水凝胶构建体4星期之后，进行组织染色和生物化学检验。成骨培养基含有lOOnM地塞米松、50pg/ml抗坏血酸和lOOmMP-甘油磷酸，而成软骨补充培养基含有10ng/mlTGFP^细节如下)。结果显示在相应的DMEM、成骨补充DMEM或成软骨补充DMEM培养基中孵育4星期后，在PEG水凝胶中维持起始的细胞接种密度(参见例如图ll)(参见例如，Troken和Mao,2006)。图11描述了H&E染色的示范性结果，并且显示在PEG水凝胶中封装并进行4星期3D构建体培养的各种密度的hMSC(上排)、hMSC衍生成骨细胞(中排)和hMSC衍生软骨细胞(下排)的组织学观察。通常，PEG水凝胶支架中终点细胞密度遵循了类似的起始细胞接种密度模式5M个细胞/ml、40M个细胞/ml和80M个细胞/ml(5M/ml=每毫升细胞悬浮液500万个细胞)。在PEG水凝胶中孵育4星期后，hMSC衍生软骨细胞(hMSC-Cy)不仅保持了他们的成软骨表型，而且还保持了他们相应的起始细胞接种密度(参见例如.图12,番红O染色)(参见例如，Troken和Mao,2006)。番红O是阳离子染料，其结合软骨相关的粘多糖例如硫酸角蛋白和硫酸软骨素，并且已经广泛用于标记自然关节和生长平板软骨(参见例如，Mao等人，1998;Wang和Mao,2002;Sundaramurthy和Mao，2006)。然而，在PEG水凝胶中孵育4星期后，尽管hMSC保持了他们的起始接种密度，但他们对番红O染色是阴性的(参见例如图12)。在PEG水凝胶中孵育4星期后，hMSC衍生成骨细胞(hMSC-Ob)不仅保持了他们的成骨表型，而且还保持了他们相应的起始细胞接种密度(参见例如图13,冯库萨染色)(Troken和Mao,2006)。冯库萨染色通常被用于标记天然成骨和组织工程成骨中的矿化形成(参见例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Marion等人，2005;Moioli等人，2006)。然而，在PEG水凝胶中孵育4星期后，尽管hMSC保持了他们的起始接种密度，但他们对冯库萨染色是阴性的(参见例如图13)。在植入封装相同密度hMSC、hMSC-Ob和hMSC-Cy的PEG水凝胶到棵鼠中后，体内数据显示提高的细胞接种密度会导致提高的hMSC衍生成骨细胞和hMSC衍生软骨细胞所形成基质的量(参见例如图14),这延续了上面所提供的体外数据(参见例如，图11-14)。该细胞密度实验确认了之前通过比较两种细胞密度5x106个细胞/mL和20x106个细胞/mL(Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005)在高细胞接种密度的再生结果中的发现例如20x1(^个细胞/mL优于5x1(^个细胞/mL的接种密度。然而，过高的细胞接种密度会引起组织例如营养物短缺，细胞间接触异常以及体外细胞扩增时间不必要浪费(Moioli和Mao,2006)。通常优选最短的离体的扩增时间。这些细胞密度实验证明了在组织工程支架中所封装的细胞接种密度的优化能够使再生结果最大化(参见Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Troken和Mao，2006)。实施例5:HSC和MSC之间的最佳比例下面的实验研究血管化骨工程最佳的HSC和MSC之间的比例。表2在8X8X2设计中使用因子设计方法研究HSC和MSC对血管化骨工程的相对贡献细胞比例(8)x样品尺寸(8)x体内植入时间(2)。在体外支架中细胞的总数目(HSC和MSC结合)保持恒定在8x106个细胞/mL，而HSC和MSC的相对比例在1:11:15之间，因此能够确定HSC和MSC对工程血管化骨的相对贡献。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>根据上面所述的究以及之前所建立的方法，从多种骨髓样品的每一种中分离人HSC和MSC(Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadl叫和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006;Stosich等人，2006)。来自单个供体的HSC和MSC被用于每种构建体<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>中以消除任何可能的免疫排斥问题。如同上述研究，HSC^:均匀接种中在Matrigd中，并输注到已经被预先接种MSC的pTCP的孔中。细胞支架构建体被植入到不会排斥人细胞的棵鼠的背部。体内植入8星期和16星期的原理是根据先前的经验，如果发生，则期望在该期限内发生(Stosich等人，2006)。收获所植入的样品，并进行下表3所列的分析。表3.工程血管化骨的结果检验和成功标准。后面讨论这些技术的细节方法<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>H&E:苏木精和曙红，整体组织学颜色用于区分多种组织；Masson三色染色血管的组织学染色；OCN:骨钙蛋白，成骨细胞的粘附蛋白，成骨分化的晚期标记物；OPN:骨桥蛋白，成骨细胞的粘附蛋白，成骨分化的晚期标记物；vWF:冯威勒布兰特因子，在内皮细胞上发现的表面糖蛋白，内皮细胞分化的晚期标记物；VEGFR:血管内皮生长因子受体，内皮细胞分化的早晚期标记物；KDR/VEGFR-2/Flk-l:血管内皮生长因子受体2,内皮细胞分化的早晚期标记物。根据下面所描述的详细方法数字X-射线和^CT对工程血管化骨进行定量。使用利用原子力显微镜(AFM)的微压、以及使用传统机械测试的压缩和切力测试进行工程血管化骨的机械分析。工程血管化骨的微观机械性能是感兴趣的，并且容易被AFM所研究，但不能通过利用Instron或MTS的宏观尺寸机械测试而获得。然而，MTS能够测试工程血管化骨的整体压缩和切力性能，这不能够通过AFM所测试。因此，AFM和MTS是工程血管化骨的互补机械测试途径。所有的数字表示的数据都被进行统计分析。对于数据正态分布，使用利用Bonferroni检验的偏差分析(ANOVA)。如果数据分布是不对称的，则使用非参数检验例如Kruskal-Wallis偏差分析。统计显著性为0.05的a水平。自体细胞和同种异体细胞都已经被用于组织工程中。本文所提供的是组织工程中自体细胞的模型(植入棵鼠中的人细胞)。棵鼠作为模拟人的"孵育器"。与同种异体细胞相比，自体细胞具有许多重要的优点，例如缺少免疫排斥和病原体传播。同种异体细胞能够容易被制成适于受体，因此节省了与自体细胞相关的细胞操作所需的时间。然而，可能需要给药免疫抑制药物，以及可能会使得血管化骨的组织工程结果复杂。骨髓干细胞的选择是至少部分基于观察到正如在上面所述研究中所证明的，骨髓衍生MSC和HSC已经被充分鉴定，并且具有建立血管化骨的能力。脂肪衍生干细胞最近被报道，并且可以提供骨髓衍生细胞的替代品。实施例6:HSC、MSC和他们语系衍生物的最佳细胞密度使得工程血管化骨的产量最大化。尽管HSC和MSC在血管化骨发育中协同发挥功能，但还有一些其他的细胞系也参与血管骨生成包括内皮细胞和成骨细胞。成骨细月包是一种MSC衍生的最后阶段的细胞之一。因此，需要研究是否血管化骨生成工程会被掺合HSC与MSC衍生成骨细胞以及MSC与HSC衍生内皮细胞而最大化。是否内皮细胞书f生自MSC、HSC或其他祖细胞，<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>根据上面所述的研究以及之前所建立的方法，从多种骨髓样品的每一种中分离人HSC和MSC(Alhadlaq和Mao，2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Marion和Mao,2006;Troken和Mao,2006;Stosich等人，还未被完全了解(Yin和Li，2006)。内皮类细胞是从HSC分化的，因下面的实验;爻计研究在血管化骨工程中的纟:^接种密度，不仅是HSC和MSC，还有他们的语系衍生物包括HSC衍生内皮细胞和MSC衍生成骨细胞。表4:实验设计，实验l-HSC和MSC衍生成骨细胞。在8x8x2设计中使用因子设计方法研究HSC和MSC衍生成骨细胞血管化骨工程中的相对贡献。纟田胞比例(8)x样品尺寸(s)x体内植入时间(2)。组HSC衍生.成骨细胞HS|^sc-样品尺寸'(ft个细胞Zal)(s个细胞/m).)比例_('每继S个裸鼠)体内植入时间(堪期)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>2006)。来自单个供体的HSC和MSC被用于每种细胞接种构建体中以消除可能的免疫排斥问题。对于实验1,根据之前建立的途径，MSC分化成成骨细胞类细胞(Alhadlaq和Mao，2003;Alhadlaq等人，2004;Yourek等人，2004;Alhadlaq和Mao,2005;Moioli和Mao,2006;Troken和Mao，2006;Marion和Mao,2006)。对于实验2，根据在上面所述研究中的途径，HSC分化成内皮细胞类细胞。如上面所述研究，HSC衍生内皮细胞被均匀接种在Matrigel中，并输注到已经被预先接种MSC衍生成骨细胞的PTCP的孔中。对于实验2，在将HSC衍生内皮细胞接种在Matrigel之前，首先将MSC接种在(3TCP的孔中。对于实验1和2，细胞支架构建体被植入到不会排斥人细胞的棵鼠。体内植入8星期和16星期的原理是根据先前的经验，如果发生，则期望在该期限内发生(Stosich等人，2006)。结果检验和数据分析和统计如上所述。同时接种HSC衍生内皮细胞与MSC衍生成骨细胞或软骨细胞也能够发生。实施例7:血管生成生长因子促进在HSC-和MSC衍生血管化骨中血管的成熟。工程血管系统必须正确地发挥功能例如在新形成的骨组织内提供适当的营养物供给，充氧，气体交换和细胞供给。血管形成包括一系列事件级联，其包括内皮细胞激活、迁移和增殖。工程血管可能由于异常高的渗透性而泄漏(Richardson等人,2001;Valeski和Baldwin,2003)。已知许多血管生成生长因子在天然发育中调节血管的形成(Thurston,2002;Ehrbar等人，2003;Valeski和Baldwin,2003;Fer腦，2005)。在骨中血管生成的开始几天VEGF高度表达(Nissen等人，1996;Hu等人，2003;Bohnsack和Hirschi,2004;Ferrara,2005)。在VEGF作用之后，PDGF影响脉管系统，并增强血管内皮细胞的成熟(Darland和D，Amore，1999;Richardson等人，2001;Bohnsack和Hirschi，2004)。组织工程中"漏的"血管的原因是因为少量相关的壁细胞例如周边细胞和平滑肌细胞。PDGF已经显示诱导壁细胞的招募(Darland和D，Amore,1999;Ya腳poulos等人，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara，2005)。因此，递送PDGF也^"对通过招募壁细月包而^f吏工程新生脉管系统成熟。为了鉴定VEGF和PDGF在诱导来自HSC和HSC衍生细胞的工程血管的成熟中的最佳剂量，探索比已知生理剂量高和低的剂量。在血管生成细胞的招募和增殖中，快速释放VEGF是期望的(Nissen等人，1996;Hu等人，2003;Ferrara,2005)。因此，VEGF被吸入到(3TCP盘中以在体内植入的开始几个小时或几天快速释放。PDGF的作用在VEGF之后，并且不仅促进内皮细胞的成熟，而且作为壁细胞的趋化因子(Darland和D，Amore,1999;Yancopoulos等人，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara,2005)。因此，PDGF被封装在微球体中用于持续释放而没有起始脉沖期(Moioh等人，2006),以便能够在更快速释放的VEGF发挥功能之后，逐步持续释放PDGF。根据上面所述研究中的经验，在Matrigel中封装PDGF微球体将进一步延緩其释放速率。表6.用于增强工程骨中新生脉管系统成熟的实-险设计。HSC-EC:造血干细胞衍生内皮细胞；MSC-Ob:间充质干细胞衍生成骨细胞。在8x5x2设计中使用因子设计方法研究结果样品尺寸(8)x生长因子剂量(5)x体内植入时间(2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>VEGF被吸入到Matrigel中，接着输注到卩TCP的孔中，进行快速释放。通过技术细节在本文中描述的双乳化技术以及根据现有的方法，PDGF被封装在PLGA微球体中(Moioli等人，2006)。以緩慢的速度而没有起始脉冲期释放PDGF。在负载生长因子之前，细胞接种的程序与实施例1相同。结果检验和数据分析和统计如上所述。从上述和现有文献中获得VEGF和PDGF的剂量(参见例如，Darland和D,Amore,1999;Yancopoulos等人,2000;Richardson等人.,2001;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara，2005)。可替换的，可以使用bFGF替换VEGF,也是根据先前的经验(Stosich等人，2006)。增加多种生长因子进行细胞递送形成了复杂的系统，尽管这是天然血管生成和成骨如何发生的。将VEGF吸入Matigel的替换是冻干pTCP。PLGA已知会在降解的过程中产生酸性副产物。然而，由于只有少量的PLGA用于制造微球体，因此酸性副产物问题不是重要的，并且在先前的工作中已经达到最小(Moioli等人，2006)。正如现有文献所证明的，PDGF被认为招募血管平滑肌细胞(Darland和D，Amore,1999;Yancopoulos等人.，2000;Valeski和Baldwin,2003;Ferrara,2005)。考虑到最终临床治疗的经济，通常采用最低的有效剂量。通过引入HSC和MSC到工程血管化骨，有可能所需血管生成生长因子的量不如没有引入HSC和MSC(和/或语系衍生物)时的高。逻辑上，HSC和MSC和/或它们的谱系衍生物也可能介导必要的血管生成生长因子。实施例8:HSC、MSC和/或血管生成生长因子的优化递送有效地修复严重尺寸的颅盖缺陷。上面所描迷的实验提供了优化的基于细胞和/或生长因子的途径用于使用异位成骨途径的工程血管化骨。颅盖骨缺陷代表了重要的临床需求，也代表了测试在工程血管化骨中优化的基于细胞和/或生长因子的途径的同位位点。该实验提供了同位骨缺陷环境以测试是否通过上面列出的方法确定的优化的条件能够比任何单独的成分和/或传统骨组织工程途径更有效地修复严重尺寸的颅盖缺陷。颅盖缺陷代表了与在上面所描述的实验中所利用的同位移植位点不同的实验^t型。表7.实验设计用于利用优化的工程血管化骨的途径修复严重尺寸的颅盖缺陷；MSC-Ob:间充质干细胞衍生成骨细胞。在8x7x2设计中使用因子设计方法研究结果细胞成分(7)x样品尺寸(8)x体<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>大鼠总数112=8个4f品x7组x2个时间点如上检验结果。另外，在预定处死时间进行后续新形成颅骨的鉴定之前2星期和1星期，腹腔注射钙黄绿素和茜素(Parfitt等人，1987;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。数据分析和统计如上所述。另外，通过荧光显微镜利用动态组织测量学定量骨形成速度(BFR)和矿化接合速度(MAR)进行定量(Parfitt等人，1987;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。中侵入的宿主细胞也有复合影响。例如，除了促进血管生成外，PDGF促进骨祖细胞的增殖(Park等人，2000)。这种复杂的系统对于提供不会修复重要尺寸的颅盖缺陷的参与工具是必要的。双生长因子的剂量(此处为VEGF和PDGF)，尽管在上面实施例3中进行了优化，但仍可能需要根据可能在颅盖缺陷模型中存在的内源性生长因子进行修饰。实施例9:分离和扩增培养骨髓衍生造血干细胞和间充质干细胞。根据上面的研究中所描述的和我们先前所开发的方法，分离骨髓衍生造血干细胞和间充质干细胞(参见例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006;Stosich等人，2006)。如同在先前的工作一样(Alhadlaq等人，2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005),通过商业渠道获得匿名成年人所捐献的骨髓样品(AllCells,Berkeley,CA)将每种骨髓样品的一部分用于使用RosetteSep试剂盒(AllCells,Berkeley,CA)的负选择技术分离间充质干细胞(hMSC)。使用Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium-LowGlucose(DMEM-LG;Sigma,St.Louis,MO)扩增培养所分离的MSC，其中所述DMEM-LG^皮补充10%的胎牛血清(FBS)(Biocell,RanchoDominguez,CA)和1%抗生素(1x抗生素-抗真菌剂，含有100单位/ml的青霉素G钠，lOOpg/ml的硫酸链霉素和0.25jxg/ml的两性霉素B(Gibco,Invitrogen,Carlsbad,CA)(Alhadlaq等人，2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005,Moioli等人2005;Stosich等人，2006)。每个骨髓样品，hMSC扩增不超过3代用于每个实验。根据先前的经验，几乎不必要扩增35代。培养是在95%空气/5%C02中37。C下孵育。每个供体利用相同的骨髓样品来分离造血干细胞。使用连接到磁珠上的CD34抗体进行阳性选择(RosetteSep)。使用流式细胞仪的纯化细胞用于确定所分离CD34(CD34+)阳性细胞的百分比。还通过台盼蓝拒染法(TrypanBlueexclusion)评估细J包的活力。,人起始非贴壁细月包分离CD34+细胞。通过在37。C下孵育在96孔纤维连接蛋白涂覆的具有加入10%FBS的IMDM(HSC生长培养基)的塑料盘中3天接着收集非贴壁细胞，而分离CD34+细胞(Shi等人1998)。移出非贴壁细胞，并转移到新孔中。重复该过程两次，之后将仍存留的悬浮细胞铺平板并使其粘附到纤维连接蛋白涂覆的平板上。实施例10:HSC分化成内皮类细胞，MSC分化成成骨细胞类细胞。汇合之后，将hHSC连续转移到纤维连接蛋白涂覆的24孔、12孔和6孔组织盘，并最终转移到Petri盘。HSC衍生内皮细胞类细胞将继续扩增。初步数据显示这些细胞显示出内皮细胞形态，并表达一些内皮细胞标记物(参见例如，上面的图3)。另外，hHSC衍生内皮细胞表达比对照细胞显著多的一种内皮细胞标记物-冯威勒布兰特因子(vWF)。使用具有内皮细胞分化补充物(ECS)的含有10%FBS的HSC生长培养基，使纤维连接蛋白的贴壁细胞分化，其中所述ECS包括VEGF(10ng/mL)、bFGF(lng/mL)和IGF-1(2ng/mL)。根据之前的方法，利用成骨刺激补充物，MSC分化成成骨细胞类细胞，其中所述成骨刺激补充物含有lOOnM地塞米松、50pg/ml抗坏血酸和100mMp誦甘油磷酸(参见例如，Alhadlaq和Mao,2003;Alhadlaq等人，2004;Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006)。实施例11:制造PLGA微球和封装PDGF。这些程序遵循上面所描述以及在Moioli等人(2006)中所描述的研究。PLGA是生物相容性和生物可降解的聚(L-乳酸)和聚(乙醇酸)合成共聚物，并已经被广泛使用(参见例如，Lu等人，2000;Shea等人，2000;Burdick等人，2001;Hedberg等人，2003;Karp等人，2003a;Ochi等人，2003;Moioli等人，2006)。将总共250mg聚(L-乳酸)和聚(乙醇酸)(PLGA:50:50,PLA:PGA)(Sigma,StLouis,Mo)溶解在lmL二氯乙烷中。通过如在我们以前的工作中所描述的双乳化技术使用PLGA微球体封装PDGF(Moioli等人，2006)。将该混合物漩涡1分钟。加入2ml1。/。PVA后，将混合物再旋涡1分钟。将所得到的乳化物加入到100ml0.1%PVA溶液中。将PVA/微球体的混合物加入到100ml2%异丙醇中以除去二氯乙烷，并硬化微球体,并在化学通风柜下连续搅拌2小时。通过过滤收集PDGF微球体，并接着冷冻干燥，接着溶解到氯仿中4小时，接着剧烈摇晃2分钟。在澄清4小时后，使用PDGFELISA试剂盒(R&DSystems,St.Louis，MO),根据产品规程对每单位微球体所封装的PDGF的浓度进行定量。将封装预定量的PDGF的微球体悬浮在lOjulPBS中。接种细胞后，在植入之前，将PLGA微球体封装的PDGF通过microtip注射到Matrigel溶液中。实施例12:灌注接种细胞的构建体如果Matrigel输注的(3TCP构建体中细胞存活差，则可以通过在先前工作中开发的灌注生物反应器增强物质传递(Vunjak-Novakovie等人，1999;2002)。简言之，以线性速度建立灌注培养基通过10100pm范围内的支架，这对应于天然骨的灌注速度。在每个通道中，在外部环形气体交换器氧气和pH方面，培养基保持平衡。以每天50%的速度更换培养基。根据上面表3所列出的工程血管化骨结果，对灌注时间沐A化Xk实施例13:形成完全厚度的颅盖缺陷以及工程构建体的手术植入。将11周大的棵鼠通过腹腔注射(IP)含有90%克他命(100mg/ml;Aveco，FortDodge,IA)和10%曱苯p塞口秦(20mg/ml;Mobay,Shawnee,KS)的混合物麻醉。聚维酮碘(10。/。)用于对手术区域进行消毒。沿着头骨的径向中线切3cm长的线性切口。拨开皮下组织和骨膜，暴露出脑皮质骨表面。根据之前所使用的方法，使用磷酸緩沖盐水冲洗的无菌牙科手机，在顶骨的中央形成全厚度的颅盖缺陷(5ximm3:直径5mm)(参见例如，Hong和Mao,2004;Moioli等人，2006)。根据先前的经验，该5mm直径全厚度的颅盖缺陷构成了重要的缺陷，不通过骨移植无法将其修复(参见例如，Hong和Mao,2004;Moioli等人，2006)。硬脑膜和邻近的头盖缝保持原样(Kopher和Mao,2003;Hong和Mao，2004;Moioli等人，2006)。如在上述的研究中，在轻度减压4。C下，HSC或HSC衍生内皮细胞被接种在Matrigel的水相中。Matrigel是基膜高分子水凝胶，其已经被广泛用于内皮细胞粘附和血管生成实验(参见例如，Abilez等人，2006;Baker等人，2006;Bruno等人，2006;Mondrinos等人，2006;Rajashekhar等人，2006)。将细胞-Matrigel溶液输注到已经被接种hMSC衍生成骨细胞的PTCP盘的孔中，接着在37。C下形成凝胶。(3TCP是通过商业渠道获得的，其孔径在200400|im之间(BDBioscience,SanDiego,CA)。具有(3TCP支架的工程组织构建体将适合5mm直径全厚度的颅盖缺陷，随后使用4-0普通内脏可吸收手术缝合线(plaingutabsorbablesurgicalsuture)缝合手术组织，该手术组织由骨膜、皮下软组织和皮肤构成。实施例14:组织收获、组织学和免疫组织化学。将所收获的含有工程骨的颅盖样品用于进行去矿化制备物，以用于石蜡包埋，以及不去矿化包埋在塑料中，对新形成骨的进行使用双荧光标记的定量骨组织形态学(钓黄绿素和茜素)。对于去矿化制备物，将样品固定在10%多聚曱醛中，在等体积的20%梓檬酸钠和50%曱酸中去矿化，包埋在石蜡中，使用如上述研究中的标准组织学程序以lOpm的厚度横平面进行切片(参见Mao等人，1998;Wang和Mao，2002;Kopher等人，2003)。将连续的切片使用苏木精和曙红、冯库萨染色以及Masson三染色以进行工程骨中各种区域的显形。未去矿化的制备物是下面所描述的。成骨和血管生成标记物的免疫组织化学遵循之前所开发的方法(参见例如，Alhadlaq和Mao,2005;Stosich等人，2006;Simdaramurthy和Mao，2006)。实施例15:通过计算机组织形态计量定量骨几何学。通过计算机组织形态计量分离对工程骨进行定量检验(ImageProandNikonEclipseE800,NikonCorp.，Melvie,NY)。构建标准的才各栅(1175x880pm"并在4倍物镜下置于组织样品之上，以便能够对工程骨进行定量。将数字数据进行如在每个实施例中所描述的统计分析。实施例16:通过双荧光标记以及计算机辅助动态骨组织形态计量对新形成颅盖骨进行定量。在处死前2星期和1星期，将钙黄绿素绿(15mg/kg)和茜素红(20mg/kg)腹腔注射，并通过计算机辅助动态骨组织形态计量进行显形(Parfitt等人，1997;Mao,2002;Kopher和Mao,2003;Clark等人，2005)。在梯度乙醇和丙酮中将颅盖样品进行修整(trim)和脱水，进一步使用850/。曱基丙烯酸曱酉旨(MMA)和15%邻苯二曱酸二丁酯制备用于未除钙包埋。使用带锯(bandsaw)对聚合的MMA-样品块进行修整。使用能够切未去矿化的4丐化组织样品的Leica多切超薄切片机，连续切割未去矿化的15-)im切片。在荧光显微镜下对未去矿化切片中被4丐黄绿素标记的新矿化骨进行成像(Mao,2002;Kopher和Mao，2003;Clark等人，2005)。通过测量后续4丐黄绿素和茜素标记之间的平均距离除以注射标记的时间间隔(7天)来计算矿化接合速度(MAR)(Clark等人，2005)。骨形成速度(BFR)被定义为骨形成速度(BFR/BS)被定义为MARXBSf/BS(Clark等人，2005)。将数字数据进行如在每个实施例中所描述的统计分析。实施例17:使用原子力显微镜显微鉴定工程骨通过使用原子力显微镜(AFM)建立的方法测试工程骨的机械性能(参见例如，Hu等人，2001;Patel和Mao,2003;Radhakrishnan等人？nm-Allen《a1/Tcin.nri4-Tnml^nr;ci容人？nnd-广lQrL禁人2005)。使用AFM的机械测试比宏观机械测试有利，因为后者不能区分工程骨的单独的机械性能。使用快速干燥氰基丙烯酸盐在载玻片上快速干燥样品。使用双面胶带，将载玻片固定到AFM的不锈钢底盘上，接着磁力安装到AFM的压电扫描器上。在AFM微压的过程中将样品持续灌注磷酸緩沖液。将额定力常数k=0.12N/m的悬臂和氧化物削尖的Si3N4尖端用于对新收获的构建体表面施加微压。通过在Z平面中推动悬臂尖端获得力谱数据。记录力分布图谱包括在悬臂尖端的伸长和收回过程中微压负载以及在Z平面中相应的位移的数据采集。接着从力谱数据通过下面的Hertz模型计算杨氏模量(E)，其定义了接触半径、微压负载和中心位移之间的关系E=3F(1-v》/4々R53"其中，E是杨氏模量(Young'smodulus),F是所施加的纳米机械负载(nanomechanicalload),v是给定区域的泊松比率(Poisson，sratio),R是AFM尖端的曲率半径，5是压痕(indentation)的量。确定所有组构建体的杨氏模量值，并与之前所获得的天然松质骨的类似值进行比较。对不同位置的平均杨氏模量进行统计分析以分别显示他们的机械'性台匕fi匕。实施例18:使用双轴MTS机械测试设备对工程骨进行压缩和切力性质进4于^l4成测试。收集全部工程骨。使用PBS溶液对所收集的样品进行清洗，完全吸水以出去过多的水，并使用牙科石膏进行包裹(potted)(LabBuff,MilesDentalProducts,SouthBend,IN)以在测试设备中保护样品(MTS858MiniBionixIIMachine,MTSCorp.,Minneapolis,MN)。以O.lmm/s的起始负载速度压缩负载样品。测量力(N)比位移(mm),并计算每个样品的弹性模量，E(KPa)。对于切力测试，将侧面包裹的骨的末端之一连接到负载轴上，同时使其它侧面部分连接到固定台架(fixedstage)上。对移动轴施加起始低位移(0.01mm/s),相对于固定端移动活动侧。使用StationManager软件测量所得到的剪切模量。对于压缩和切力负载测试，均研究不同的负载速度以确定对机械测试结果对负弃\还/丈日'、J7-卞J，W且，口水W孰迷乂支7-叮M水,义''"^L乂卞J14rtZ日"3"-王JM载范围内的负载速度(Collins等人，2004)。实施例19:使用数字X轴和pCT对工程骨进行成像。使用数字X-射线(Faxitron,Wheeling,IL)根据我们公开的途径(Collins等人2005)对工程骨进行成像。将工程骨固定在10%福尔马林中，并使用微型计算机X射线断层扫描OCT)系统(ViVaCT40,Scanco,Switzerland)以21的分辨率利用多层进行成像。将图像重构成5x5xlmm3体积，并根据从图像柱状图中骨像素和软组织像素峰之间的谷确定临界值。对工程骨的几何宽度进行定量。所有的数值都进行利用Bonferroni检验的ANOVA。还通过^CT对邻接的天然人字形骨(lamboidalbone)进行成像作为工程骨的对照。对天然人字形骨的pCT数据的分析与工程骨相同。实施例20:大通道和bFGF促进宿主组织的新生血管化。进行与在实施例3中所描述相似的实验，但使用较低的bFGF浓度。将聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)中(MW3400;Nektar,Huntsville,AL,USA)溶解在PBS(6.6%w/v)中，补充133单位/mL青霉素和133mg/mL链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。以50mg/mL的浓度加入光引发剂2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-曱基-l-丙酮(Ciba,Tarrytown,NY,USA)。使用365nm的UV光对所得到的PEG圓柱体进行光聚合5分钟(Glo-Mark,UpperSaddleRiver,NJ,USA)。制造总共3种PEG水凝胶结构l)在光聚合PEG水凝胶中穿孔总共3个大通道(直径lmm)(参见例如图15A);2)0.5貼批bFGF装载到PEG水凝胶中，而没有大通道(参见例如图15B);以及3)0.5pg/^LbFGF和大通道的组合(参见例如图15C)。将严格组合免疫缺陷(SCID)雄性小鼠(C.B17林；鼠龄4-5星期)通过腹腔注射克他命(100mg/kg)和曱苯噻。秦(4mg/kg)麻醉。修建小鼠背部的毛发，并置于卧姿，接着使用10%聚维酮碘和70%乙醇进行消毒。沿着背部上中切线(uppermidsagittalline)切除1cm的长线型切口，接着进行钝器解剖以形成皮下陷凹。每只SCID小鼠接受三种PEG水凝胶植入物具有大通道但没有bFGF的PEG,负载bFGF但没有大通道的PEG,氛者具有bFCiF和大逋道二者的PEG。1更用晋適内/1ii可吸收4-0缝合线缝合切口。在体内植入所有PEG水凝胶圆柱体4星期。在SCID小鼠背部皮下植入4星期之后，收获PEG水凝胶样品。。在C02窒息后，在SCID小鼠的背部无菌地切口。在小心地移出周围纤维嚢后，从宿主分离PEG水凝胶圆柱体，使用PBS清洗，并在10%福尔马林中固定24小时。接着将PEG样品包埋在石蜡中，并以5pm厚度的横平面进行切片(横断大通道，参见图15A)。使用苏木精和曙红对石蜡切片进行染色。制备连续的邻接切片用于免疫组织化学。将切片进行去石蜡，在PBS中清洗，在室温下使用牛睾丸透明质酸酶(1600U/ml)在具有150mM氯化钠的pH5.5醋酸钠緩沖液中消化30分钟。所有的免疫组织化学程序遵循我们之前的方法(Mao等人，1998;Alhadlaq和Mao,2005;Sundaramurthy和Mao,2006)。简言之，在室温下使用5%的牛血清白蛋白(BSA)对切片处理20分钟，以阻断非特异性反应。使用下列抗体抗血管内皮生长因子因子(抗-VEGF)(ABcam,Cambridge,MAUSA)和生物素标记的来自甜菜U〃"wmvw/gar&)(麦芽凝集素)的植物凝血素(WGA)，具有或者不具有其抑制剂乙酰脲酸(actyleuraminicadd)(Sigma,St.Loms，MI,USA)。WGA结合富含a-D-GlcNAc和NeuAc的血管内皮细胞的糖基(Jinga等人，2000;Izumi等人，2003)。在潮湿箱中与初级抗体孵育过夜后，使用PBS清洗切片，并与抗小鼠IgG的二级抗体(1:500;AntibodiesInc.,Davis，CA)孵育30分钟。接着，将切片与链霉素-HRP偶联物在潮湿箱中孵育30分钟。在PBS中清洗后，重复使用二级抗体的双连接程序。使用diaminobenzadine(DAB)溶液产生玻片，并使用Mayer's苏木精复染色35分钟。复染色的玻片在梯度乙醇中脱水，并在二甲苯中清洗。除省去一级抗体以外，对阴性对照进行相同的程序。结果显示，在SCID小鼠背部体内植入4星期后，具有大通道但没有bFGF的无细胞PEG水凝胶显示了宿主组织渗透，其仅在大通道的内腔中，而不在PEG的其他位置(参见例如图15A')。相反，负载bFGF但没有大通道的无细胞PEG水凝胶明显具有随机和独立的宿主组织渗透的区域(参见例如图15B')。而具有大通道和bFGF二者的PEG水凝胶则显示宿主组织向内生长在大通道中而不在PEG的其他位置(参见例如图15C')。大通道和bFGF二者均缺少的PEG水凝胶显示没有宿主/一》—、/j*、-i>,丄一.b,，一、、i_L-、一cTP一'—f.I-、A—/■I>_>_rt厶.、《fe、1、"LI"l_f、--^^-A、,w"JKA""TQ—i—、'J—，_-r"'匕T)T—Il,'V~r~~1*/■卜,*/■U11甲/~~1WITHITrt,',"7T^一A、XtL》、。.J^、个直'J、J，々一yfg'J义'J、—山尺乂1日工-旦"、,八1日/J。/^_0^X4UPEG水凝胶的数据一致(Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;2006)。实施例21:分离和扩增培养人骨髓衍生间充质干细胞(hMSC)与在实施例9中所列出的程序一致，进行分离和扩增培养人骨髓衍生间充质干细胞(hMSC)。才艮据之前的方法(参见例如，Marion等人，2005;Yourek等人，2005;Moioli等人，2006;Marion和Mao,2006)，从两名匿名成年供体的新鲜骨髓样品分离人MSC(AllCells,Berkeley,CA)。将骨髓样品转移到50mL管后，加入总共750RosetteSep(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada),并在室温下孵育30分钟。接着加入15mL在20/)FBS和lmMEDTA溶液中的PBS到骨髓样品中，达到总体积为大约30ml。接着将骨髓样品在15mLFicoll-Paque(StemCellTechnologies)上分层，并在室温下3000g离心25分钟。将整个富集的细胞层从Ficoll-Paque界面取出。将混合物以lOOOrpm离心10分钟。将溶液抽吸到500^LDulbecco'sModifiedEagle'sMedium(Sigma-AldrichInc.StLouis,MO),其中Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium^卜充了10%月台牛血清(FBS)(AtlantaBiologicals,Lawrenceville,GA)和1%抗生物-抗真菌剂(Gibco，Carlsbad,CA),在后面将其称作基础培养基。对所分离的单核细胞计数，按照大约每lOOmmPetri盘0.51x106个细胞铺平板，并在基础培养基总37。C下5%。02中聘育。24小时候，除去非贴壁细胞，并使用磷酸盐緩沖液(PBS)清洗两次，通过每隔一天更换新鲜培养基孵育12天(25)。90%汇合之后，使用0.25%胰蛋白酶和lmMEDTA在37。C下5分钟从平板取出细胞，并重新铺在100mmPetri盘中，#皮称作1代细胞。实施例22:人间充质干细胞分化成生脂细胞。根据之前的方法(参见例如，Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005,2006;Marion和Mao,2006),通过暴露到成脂培养基，二代和三代hMSC被诱导分化成生脂细胞，其中所述成脂培养基由被补充0.5地塞米松、0.5juM异丁基甲基黄噪呤(IBMX)和50jiM茚甲新的基础培养基构成。在基础培养基中连续培养hMSC的亚群，也是在95%空气和5%C02中37。C下，每隔一天更换培养基。使用油红O染色(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)确认脂肪生成(脂肪形成)。为了体夕卜检验脂肪生成分化，使用成脂培养基处理hMSC最高达到5星期。将使用或不使用脂肪生成分化的单层培养hMSC固定在10%福尔马林中，并进行油红O染色。在反相显微镜下以IOX放大倍数检测平板脂肪泡的存在或缺少。结果显示经过离体培养的35天，人间充质干细胞在体外分化成生脂细胞(参见例如图16)。与没有脂肪生成分化的hMSC相比(参见例如图16A-17E),hMSC衍生生脂细胞与油红O染色阳性反应，并且经过35天日益增多(参见例如图16F-17J)。这与之前的数据一致，之前的数据显示在成脂培养基中处理低于2星期后，hMSC衍生生脂细胞表达PPAR-i^(参见例如，Alhadlaq等人，200》。经过所观察的35天，在hMSC和hMSC衍生生脂细胞之间，培养样品的总DNA含量缺乏统计显著差异。然而在培养的第28天和35天，hMSC衍生生脂细胞的甘油含量显著地比hMSC高，这暗示hMSC衍生生脂细胞在体外逐步聚集细胞内脂肪泡。实施例23:在PEG水凝胶中封装hMSC衍生生脂细胞并体内植入。在利用上述在PEG水凝胶中具有大通道和生物活性因子的模型系统的平行实验中(参见实施例3),hMSC和hMSC衍生生脂细胞被封装以确定是否工程大通道和bFGF促进血管化脂肪形成。将PEG水凝胶溶解在无菌PBS中，补充100U/ml青霉素和100pg/ml链霉素(Gibco，Carlsbad,CA)达到10％的最终溶液。光引发剂2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-曱基-l-丙酮(Ciba,Tarrytown,NY,USA)加入到PEGDA溶液中。在基础培养基中成脂肪分化或培养1星期后，使用0.25%胰蛋白酶和ImMEDTA在37。C下5分钟从培养平板取出hMSC或hMSC衍生生脂细胞，并以3x1(^个细胞/mL的密度分别重悬浮在PEG聚合物/光引发剂溶液中。将一份75^1细胞/聚合物/光引发剂悬浮液加载到0.075mL微离心管(6x4mm:直径x高.度)的无菌塑料帽中(FisherScientific,Hampton,NH),接着使用长波365nm紫外灯(Glo-Mark,UpperSaddleRiver,NJ)大约4mW/cm2的强度进行光聚合5分钟。从塑料帽取出光聚合的细胞-PEG构建体，并转移到相应成脂肪培养基的12孔平板中。在光聚合之前，将总共0.5pg/|LiLbFGF负载到PEG水凝胶中。根据上面所述的途径形成3个大通道(参见实施例20)。在无胸腺棵鼠的背部皮下植入12星期后，收获PEG水凝胶圆柱体。所有的组织处理、组织学和免疫组织化学程序与上述相同(参见实施例20)。结果显示PEG水凝胶不允许细胞渗透(参见例如图18A')。这些发现与之前的研究一致(参见例如，Alhadlaq等人，2005;Stosich和Mao,2005;2006)。然而负载所工程化大通道和bFGF的PEG水凝胶不仅显示较深的颜色，而且在横平面具有3个红圏(参见例如图18B')。进一步，具有大通道和bFGF二者并被接种hMSC衍生生脂细胞的PEG水凝胶显示不仅有较深的颜色，而且还有红圈(参见例如图18C)。在组织学和免疫组织化学检验之后，封装hMSC衍生生脂细胞以及构建的大通道和bFGF的PEG水凝胶显示了形成组织岛(参见例如图19A)。如在图19B中所显示的，许多工程组织岛是油红阳性的，这暗示存在脂肪生成。抗VEGF抗体在明显间质组织中显示阳性染色(参见例如图19C),而抗WGA凝集素抗体定位在工程脂肪组织的附近(参见例如图19D),这暗示工程新生血管会促进脂肪生成。实施例24:血管内皮细胞的分子标记血管祖细胞被分析血管内皮生长因子2或Flk1的表达，二者均为血管内皮细胞的分子标记物。与在实施例2中所描述的一致，进行造血干细胞分离、培养、分化和标记。结果显示与緩沖溶液(buffersulocation)不表达VEGF/Flkl相比，血管祖细胞(第一列中的1代细胞，和第2列中的2代细胞^皮发现表达血管内皮细胞生长因子2或Flk1二者(参见例如图20)。VEGF2含量的定量显示PI和P2细胞均表达比緩冲基质显著多的VEGF2(参见例如图21)。这些数据证明正如通过两种内皮细胞标记物VEGF和Flkl的表达所证明的，从人骨髓分离的HSC能够分化成内皮细胞类细胞。实施例25:细胞标记实验。对被接种骨祖细胞和血管祖细胞的多孔(3TCP支架进行分析，两种细胞类型的同时占据。支架输注祖细胞的方法与实施例1所描述的方法一致。结果显示绿色荧光蛋白(GFP)标记的骨祖细胞与红色CM-Dil标记的血管祖细胞同时占据在多孔(3TCP支架内(参见例如图22)。如上所述，体内植入接种骨祖细胞和血管祖细胞的PTCP支架产生了形成血管化骨，(参见例如，实施例1;图2)。这些数据证明被共同接种在生物兼容材料不同空间区域中的人骨祖细胞和血管祖细胞在共同占据支架的同时，能够成功地分别分化成骨和血管组织。附件所引用的文献AWtezO,BenharashP，MehrotraM,MiyamotoE,GaleA,PicquetJ,XuC,ZarinsC(2006》Anovelculturesystemshowsthatstemcellscanbegrownin3Dandunderphysiologicpulsatileconditionsfortissueengineeringofvasculargrafts.JSurgRes132:170-178，AlbertsB，JohnsonB,LewisJ，RaffM,RobertsK,WalterP(2002)MolecularBiologyoftheCell.4thEd，NewYork,GarlandPublishing,pp.1183-1184.AlhadlaqA,ElisseeffJH,HongL，WilliamsCG,CaplanAl,SharmaB'KopherRA,TomkoriaS,LennonDP,LopezA，MaoJJ(2004)Adultstemcelldrivengenesisofhuman-shapedarticularcondyle.AnnBtomedEng32:911-923.AlhadlaqA,MaoJJ(2003)Engineeredneogenesisofhuman-shapedmandibularcondylefromratmesenchymalstemcel,s，JDentRes82:951-956,AlhadlaqA,MaoJJ(2004)Mesenchymalstemcells:Isolationandtherapeutics.StemCellsDev13:436>448.AlhadlaqA,Mao(2005)OsteochondralTissueEngineering-RegenerationofArticularCondylefromMesenchymalStemCells.InMaPX,曰isseeffJH(Ed)ScaffoldingforTissueEngineering,Taylor&Francis,BocaRaton,FL，pp.545-564.AlhadlaqA,MaoJJ(2005)Tissue-engineeredosteochondralconstructsintheshapeofanarticularcondyle,JBoneJointSurgAm87:936-944.Alhadlaq,A,and丄丄M曰o,Tissue-engineeredneogenesisofhuman-shapedmandibularcondylefromratmesenchymalstemcells,JDentRes82:951-956,2003.Alhadlaq,A.,and丄丄Mao，Mesenchymalstemcells:Isolationandtherapeutics.StemCellsDev.13:436~448,2004.Alhadlaq,A,，丄H.Elisseeff,LHong,C.G.Williams,A丄Captan，B.Sharma,R.A.Kopher，S.Tomkorla,D.P.Lennon,A>Lopez,丄丄Mao,Adultstemcelldrivengenesisofhuman-shapedarticularcondyle.AnnBiomedEng32:911-923,2004.Alhadlaq,A.，M,H.Tang，丄丄Mao.Engineeredadiposetissuefromhumanmesenchymalstemcellsmaintainspredefinedshapeanddimension:implicationsinsofttissueaugmentationandreconstruction.TissueEng.11:556-66,2005.AllenDM,MaoJJ(2004)Heterogeneousnanostructuralandnanoelasticpropertiesofpericellularandinterterritorialmatricesofchondrocytesbyatomicforcemicroscopy.JStructBiol145:196-204.AlmubarakR,DasHveiraA,MaoJJ(2005)Expressionandmechanicalmodulationofmatrixmetalloproteinase1and2genesinfacialandcranialsutures-Cell&TissRes321:465-471.AlsbergE，AndersonKW,AlbeirutiA,RowleyJA，MooneyDJ(2002>Engineeringgrowingtissues,ProcNatlAcadSciUSA17邻:12025-12030.Anusaksathien,O.'andW.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ationsforceH-basedtherapies.TissueEng7:211-228，权利要求1.组织组件，其包括(a)生物相容性基质；(b)血管祖细胞；和(c)组织祖细胞；其中所述组件是离体的，或者(a)、(b)或(c)中至少一种对于脊椎动物受体是异源的。2.形成血管化组织组件的方法，其包括将(a)生物相容性基质、(b)组织祖细胞和(c)血管祖细胞组合；这样形成了基质、组织祖细胞和血管祖细胞的组合。3.权利要求2的方法，其还包括孵育基质、组织祖细胞和血管祖细胞的组合。4.权利要求2-3任一项的方法，其中所述组合是在离体进行。5.权利要求3-4任一项的方法，其中所述孵育包括离体孵育。6.权利要求3-5任一项的方法，其中所述孵育包括体内孵育。7.权利要求l-6任一项的组件或方法，其中所述组织祖细胞选自下列间充质干细胞(MSC)、MSC衍生细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、神经"交质细胞、成纤维细胞、心肌细胞、肝细胞、肾细胞、膀胱细胞、P-胰岛细胞、成牙质细胞、牙髓细胞、牙周细胞、腱细胞、肺细胞、心脏细胞及其组合。8.权利要求7的组件或方法，其中所述成纤维细胞选自下列间质成纤维细胞、腱成纤维细胞、韧带成纤维细胞、牙周成纤维细胞和颅面成纤维细^^。9.权利要求1-8任一项的组件或方法，其中所述组织祖细胞是MSC软骨细胞。10.权利要求1-9任一项的组件或方法，其中所述组织祖细胞是MSC。11.权利要求1-10任一项的组件或方法，其中所述血管3且细胞选自下列造血干细胞(HSC)、HSC内皮细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、培养内皮细胞、原代培养内皮细胞、骨髓干细胞、脊索细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、淋巴腺内皮细胞、内皮祖细胞、分化成内皮细胞的干细胞、平滑肌细胞、间质成纤维细胞和肌成纤维细胞。12.权利要求1-11任一项的组件或方法，其中所述血管祖细胞是HSC。13.权利要求1-11任一项的组件或方法，其中所述血管祖细胞是HSC内皮细胞。14.权利要求1-13任一项的组件或方法，其中所述基质包括选自下列的材料纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、海洋粘附蛋白、氰基丙烯酸酯、高分子水凝胶和其组合。15.权利要求1-14任一项的组件或方法，其中所述基质包括高分子水凝胶。16.权利要求1-15任一项的组件或方法，其中所述基质包括至少一个物理通道。17.权利要求16的组织组件或方法，其中所述基质包括多个平均直径为至少大约O.lmm至最高达大约50mm的物理通道。18.权利要求17的组织组件或方法，其中所述多个物理通道具有下列平均直径大约0.2mm、大约0.3mm、大约0.4mm、大约0.5mm、大约0.6mm、大约0.7mm、大约0.8mm、大约0.9mm、大约l.Omm、大约l.lmm、大约1.2mm、大约1.3mm、大约1.4mm、大约1.5mm、大约1.6mm、大约1.7mm、大约1.8mm、大约1.9mm、大约2.0mm、大约2.5mm、大约3.0mm、大约3.5mm、大约4.0mm、大约4.5mm、大约5.0mm、大约5.5mm、大约6.0mm、大约6.5mm、大约7.0mm、大约7.5mm、大约8.0mm、大约8.5mm、大约9.0mm、大约9.5mm、大约10mm、大约15mm、大约20mm、大约25mm、大约30mm、大约35mm、大约40mm或者大约45mm。19.权利要求1-18任一项的组件或方法，其中所述基质还包含生长因子或将生长因子引入到所述基质材料的步骤。20.权利要求18的组件或方法，其中所述生长因子是血管生成生长因子。21.权利要求19-20任一项的组件或方法，其中所述生长因子选自bFGF、VEGF、PDGF、TGFb和其组合。22.权利要求1-21任一项的组件或方法，其中所述组件包括祖细胞，所述祖细胞的密度为至少大约0.0001x100万个细胞(M)ml"至最高达大约1000Mmr1。23.权利要求22的组件或方法，其中所述祖细胞以下列密度出现在基质中大约1Mml"、大约5Mml"、大约10Mml"、大约15Mmr、大约20Mml—1、大约25Mmr1、大约30Mmr1、大约35Mmr1、大约40Mmr1、大约45Mmr1、大约50Mmr1、大约55Mml—1、大约60Mmr1、大约65Mmr1、大约70Mmr1、大约75Mmr1、大约80Mml"、大约85Mmr1、大约90Mml"、大约95Mml"或大约100Mml:24.权利要求1-23任一项的组件或方法，其中血管祖细胞与组织祖细胞的比例为大约100:l至最高达l:100。25.权利要求24的组件或方法，其中血管祖细胞与组织祖细胞的比例为大约20:1、大约19:1、大约18:1、大约17:1、大约16:1、大约15:1、大约14:1、大约13:1、大约12:1、大约11:1、大约10:1、大约9:1、大约8:1、大约7:1、大约6:1、大约5:1、大约4:1、大约3:1、大约2:1、大约1:1、大约1:2、大约1:3、大约1:4、大约1:5、大约1:6、大约1:7、大约1:8、大约1:9、大约1:10、大约1:11、大约1:12、大约1:13、大约1:14、大约1:15、大约1:16、大约1:17、大约1:18、大约1:19或者大约1:20。26.治疗组织或器官缺陷的方法，其包括将权利要求1或6-15任一项的组件移植到有此需要的个体内。27.鉴定提高组织血管化的候选分子的方法，其包括将基质、组织祖细胞、血管祖细胞、其组合或权利要求1或7-26任一项的组织组件与候选分子接触；孵育所述组织组件；以及测量所述组织组件的血管化。28.权利要求27的方法，其还包括测定相对于未与候选分子接触的对照组织组件，在所述组织组件中，血管化是否提高。29.鉴定降低组织血管化的候选分子的方法，其包括将基质、组织祖细胞、血管祖细胞、其组合或权利要求1或7-26任一项的组织组件与候选分子接触；孵育所述组织组件；以及领'J量所述组织组件的血管化。30.根据权利要求29的方法，其还包括测定相对于未与候选分子接触的对照组织组件，在所述组织组件中，血管化是否降低。31.权利要求l-30任一项的组件或方法，其中所述组织组件是骨、脂肪、膀胱、脑、乳房、骨软骨连接处、中枢神经系统、脊髓、外周神经、神经胶质、食道、输卯管、心脏、胰腺、肠、胆嚢、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、脾、骨骼肌、皮肤、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、间质软组织、骨膜、牙周组织、颅缝、毛嚢、口腔粘膜或子宫组织组件。32.权利要求1-31任一项的组件或方法，其中所述组织组件是骨组织组件。33.权利要求1-31任一项的组件或方法，其中所述组织组件是脂肪组织组件。全文摘要发现通过组织祖细胞和血管祖细胞的联合作用，血管化组织或器官能够被建造。本发明提供了针对工程血管化组织或器官的组合物和方法，所述工程血管化组织或器官是通过将组织祖细胞和血管祖细胞引入到基质材料的生物相容性支架内或其上所形成的。还提供了用于治疗组织缺陷的方法，其通过将这些组合物移植到有此需要的个体中。文档编号A61F2/01GK101534747SQ200780026277公开日2009年9月16日申请日期2007年7月10日优先权日2006年7月10日发明者J·J·毛申请人:哥伦比亚大学