编码艰难梭菌毒素a和毒素b受体结合域的密码子优化dna分子及其使用方法

专利名称：：编码艰难梭菌毒素a和毒素b受体结合域的密码子优化dna分子及其使用方法编码艰难梭菌毒素A和毒素B受体结合域的密码子优化DNA分子及其4吏用方法本申请要求2006年6月8日提交的美国临时专利申请序列号60/812,489的优先4又，其ilL明书以全文方式引入于此作为参考。本发明是在国家卫生研究院(NationalInstituteofHealth)项目基金第5K08AI58747-03号的政府资助下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
：艰难梭菌(C7a^rWMWd)是一种革兰氏阳性厌氧细菌，其临床表现包括腹泻、，I膜性结肠炎、败血病和死亡。从定殖(colonization)到感染和疾病复发的过程反映出并没有建立起有效的抗体反应来对抗由该细菌释》文的毒素。对于^艮难4炎菌相关疾病的常^见疗法包括停止最初的抗生素治疗并给予灭滴灵(metronidazole)或万古霉素(vancomycin)。然而，灭滴灵和万古霉素都有特定的缺点。万古霉素是美国食品药品管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration,USFDA)糸匕〉隹的口眷一疗法，其与革兰氏阳性病原体抗性的选^f奪相关，而灭滴灵似乎对严重的艰难梭菌疾病却没有万古霉素有效。两种药剂都不能预防在中止治疗之后艰难梭菌感染的复发，这种情况与较差的抗毒素免疫反应相关并且可能非常^^以治疗。因此，对于治疗和预防艰难梭菌相关疾病，还需要新的更为有效的方法。
发明内容本发明提供了一种含有编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。在另一种实施方式中，本发明-提供了一种用于在哺乳动物体内产生对抗艰难4炎菌毒素A的抗体的方法。该方法包括向哺乳动物给予有效量的本发明要求保护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。在又一种实施方式中，本发明提供了一种用于降低人体内患有艰难梭菌感染的风险的方法。该方法包括向人体给予有效量的本发明要求保护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。(与后面的一段相同)在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于在需要其的人体内治疗艰难梭菌感染的方法，该方法包括向人体内给予有效量的本发明要求保护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。在另一方面，本发明提供了一种含有编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素A对应框内密码子具有更高的使用率。200在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于在哺乳动物体内产生对抗艰难梭菌毒素A的抗体的方法，该方法包括向哺乳动物给予有效量的本发明要求^呆护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。在又一种实施方式中，本发明提供了一种用于降^[氐人体内含有艰难梭菌感染的风险的方法。该方法包括向人体内给药有效量的本发明要求保护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。(与前面的一,殳相同)在另一种实施方式中，本发明提供了一种在需要其的人体内治疗艰难梭菌感染的方法，该方法包括向人体内给予有效量的本发明要求保护的DNA分子，该DNA分子结合于载体中。。图1是艰难-陵菌毒素A的氨基酸序列(基因库登记号(GenBankAccessionno.)CAA63564，SEQ.ID.NO.:1)。艰难梭菌毒素A的受体结合域位于1839-2710氨基酸残基处(SEQ.ID.NO.:2)。图2是艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(基因库登记号A37052,SEQ.ID.NO.:3)。艰难梭菌毒素A的受体结合域位于1839-2710氨基酸残基处(SEQ.ID.NO.:4)。图3是艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(基因库登记号AAA23283,SEQ.ID.NO.:5)。艰难梭菌毒素A的受体结合域位于1839-2710氨基酸残基处(SEQ.ID.NO.:6)。10图4是艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(基因库登记号P16154,SEQ.ID.NO.:7)。艰难梭菌毒素A的受体结合域位于1839-2710氨基酸残基处(SEQ.ID.NO.:8)。图5是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:9),其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的^f匡内密码子具有更高的4吏用率。图6是艰难梭菌毒素A的抗原决定基(表位，epitope)的氨基酸序歹ll(SEQ.ID.NO.:10)。图7是含有编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核香酸序列(SEQ.ID.NO.:9)并且另外含有Kozak序列、tPA前导序列和五coRI限制位点的DNA分子(SEQ.ID.NO.:11)，其中根据表1,所述核苦酸序列的每一种氨基酸残基至少约100/。的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难冲炎菌毒素A对应的框内密码子具有更高的〗吏用率。图8是含有编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:9)并另外含有Kozak序列和EcoM限制位点的DNA分子(SEQ.ID.NO.:12),其中才艮据表l，所述核苦酸序列的每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。图9是天然存在的艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:13)。该序列是基因库登记号M30307位于5515-7914的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:14)。图IO是含有本发明要求保护的"tPA-TxA-RBD"DNA分子的质粒的示意图。图11是在BALB/c小鼠中测定的艰难梭菌毒素A的血清IgG抗体滴定度。小鼠采用以下之一进行免疫pVAX(每后肢肌肉注射25pg);TxA-RBD(每后月支月几肉注射25|ag);tPA-TxA-RBD(每后肢肌肉注射25|ug);TxA-RBD(每后月支电穿孔强化(EP)月几肉注射25|ag);或tPA-TxA-RBD(每后肢电穿孔强化(EP)肌肉注射25|ag)。这些小鼠在第0周和第2周进行注射。免疫之后6星期对小鼠取血样，并在第8周用艰难梭菌毒素A对抗(激发，challenge)。抗体滴定度通过ELISA测定。图12是艰难梭菌毒素B的氨基酸序列(基因库登记号P18177,SEQ.ID.NO.:15)。艰难梭菌毒素B受体结合域位于1755-2367氨基酸残基处(SEQ.ID.NO.:16)。图13是天然存在的艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:17)。该序列是基因库登记号X53138位于5263-7101的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:18)。图14是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:19),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核酸残基位置的基因组成冲亥酸残基4立置l-6是iWzel限制〗立点(GCTAGC);核酸残基位置5-13是Kozak序歹'J(GCCGCCACC);核酸残基位置14-16是ATG起始位点；核酸残基位置17-22是^w//1限制位点(GGATCC);核酸残基位置23-1861是毒素B受体结合域；核酸残基位置1862-1867是i限制位点(GAATTC)。12图15是质粒"TxA-RBD"和"tPA-TxA-RBD"的示意图。图16是含有编码^艮难梭菌毒素A受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:19)并且另外含有tPA前导序列的DNA分子(SEQ.ID.NO.:20),其中根据表l,所述核苷酸序列的每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素A的对应框内密码子具有更高的使用率。图17是质并立"TxB-RBD"和"tPA-TxB-RBD"的示意图。图18是在BALB/c小鼠中测定的艰难梭菌毒素B的血清IgG抗体滴定度。该小鼠釆用以下之一进行免疫pVAX(每后肢肌肉注射25|iig);TxB-RBD(每后月支肌肉注射25|ug);tPA-TxB-RBD(每后肢肌肉注射25|ug);TxB-RBD(每后肢电穿孔强化(EP)肌肉注射25|ug);或tPA-TxB-RBD(每后肢电穿孔强化(EP)肌肉注射25pg)。免疫之后6星期对小鼠取血样，并在第8周用艰难梭菌毒素B对抗。抗体滴定度通过ELISA测定。图19是5^艮难才炎菌毒素A对抗之后采用pVAX载体(EP)、tPA-TxA-RBD(IM)、tPA-TxA-RBD(EP)、TxA-RBD(IM)或TxA-RBD(EP)给药的BALB/c小鼠存活曲线图。300ng从VPI10463菌林中纯化的活性艰难梭菌毒素A,在100|aL灭菌盐水中通过腹膜内注射》于动物-进4亍只于#元。图20是艰难冲炎菌毒素B对抗之后采用pVAX载体(EP)、TxB-RBD(IM)或TxB-RBD(EP)给药的BALB/c小鼠存活曲线图。400ng从VPI10463菌株中纯化的活性艰难梭菌毒素B,在50jaL灭菌盐水中通过对尾静脉进行静脉内注射而对动物进行对抗。13图21是在BALB/c小鼠中测定的艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的血清IgG抗体滴定度。该小鼠采用以下之一进行免疫pVAX(每后月支月几肉注射25pg);TxA-RBD(每后月支月几肉注射25)ag);TxB-RBD(每后月支月几肉注射25pg);或TxA-RBD和TxB-RBD("TxA-TxB")(每后肢肌肉注射25|ug)。这些小鼠在第0周和第2周进行注射。免疫之后6星期对小鼠取血样，并在第8周用艰难梭菌毒素A或毒素B进行对抗。抗体滴定度通过ELISA观'J定。图22是用艰难梭菌毒素A和毒素B进行对抗之后的BALB/c小鼠存活曲线图。该小鼠采用以下之一进行免疫pVAX(每后肢月几肉注射25ng);TxA-RBD(每后月支月几肉注射25);TxB-RBD(每后肢肌肉注射25|^g);或TxA-RBD和TxB-RBD的组合("TxA-TxB")(每后月支月几肉注射每种质粒25|ag)。4姿所述实施毒素对抗。图23是在仓鼠中测定的艰难梭菌毒素A和B的血清IgG抗体滴定y复。仓鼠采用以下之一通过电穿孔-强化(ep)月几肉注射进^亍免疫pVAX(每后月支注射lOOjig);TxA-RBD(每后月支注射lOOpg("高剂量，，))；TxA-RBD(每后肢注射11|ag("低剂量"))；TxB-RBD(每后肢注射100|^g("高剂量"))；或TxB-RBD(每后肢注射llpg("低剂量"))。免疫之后10星期对仓鼠取血样，并通过ELISA测定4元体滴定度。图24是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:21)，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A乂十应的才匡内密码子具有更高的4吏用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:21含有2619个核苷酸，其中位置l-2619对应于基因库登记号M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中位置4-267表示框图25是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:22),其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约20%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:22含有2619个核苷酸，其中位置l-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置154-681表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图26是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:23),其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约30%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的才匡内密码子具有更高的4吏用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:23含有2619个核香酸，其中位置l-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置667-1458表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图27是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:24)，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约40%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的才匡内密码子具有更高的^f吏用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:24含有2619个核苷酸，其中位置1-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置769-1824表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。15图28是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:25),其中才艮据表l,每一种氨基酸残基至少约50%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A的对应框内密码子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:25含有2619个核苷酸，其中位置l-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置31-1350表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图29是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:26)，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约60%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A的对应的^f医内密码子具有更高的^f吏用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:26含有2619个核苷酸，其中位置1-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸/f立置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的4立置415-1998表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图30是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:27)，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约70%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:27含有2619个核苷酸，其中位置l-2619对应于基因库登记号M30307的核苷酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置226-2073表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应框内密码子具有更高的使用率。图31是编码艮难4发菌毒素A受体结合域的核普酸序列(SEQ.ID.NO.:28),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约80%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A16对应的框内密码子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:28含有2619个核苷酸，其中位置1-2619对应于基因库登记号M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置193-2112表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图32是编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:29),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约90%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:29含有2619个核苷酸，其中位置1-2619对应于基因库登记号M30307的核苦酸位置5675-8293(SEQ.ID.NO.:39)。图中的位置16-2391表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素A的对应的框内密码子具有更高的使用率。图33是编码艰难;陵菌毒素B受体结合域的核苷S吏序列(SEQ.ID.NO.:30)，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:30含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核香酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置1075-1260表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图34是编码艮难4炎菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:31),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约20%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:31含有1839个核苦酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置16-387表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应框内密码子具有更高的使用率。图35是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:32),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约30%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.TD.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:32含有1839个核普酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核苷酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置145-372表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图36是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:33)，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约40%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核苦酸序列SEQ.ID.NO.:33含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号(X53138的核香酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置325-1098表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图37是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:34)，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约50%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核香酸序列SEQ.ID.NO.:34含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的冲盆苦酸4立置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的^f立置448-1377表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。18图38是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:35),其中才艮据表l,每一种氨基酸残基至少约60%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:35含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核苷酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置676-1836表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图39是编码艮难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:36),其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约70%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的才匡内密石马子具有更高的4吏用率。核苷酸序列SEQ.ID.NO.:36含有1839个核苦酸，其中位置卜1839对应于基因库登记号X53138的核普酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置196-1497表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图40是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苦酸序列(SEQ.ID.NO.:37),其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约80%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。核苦S臾序列SEQ.ID.NO.:37含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置22-1509表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。图41是编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.:38),其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约90%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B19对应的冲匡内密码子具有更高的^f吏用率。核普酸序列SEQ.ID.NO.:38含有1839个核苷酸，其中位置1-1839对应于基因库登记号X53138的核苦酸位置5661-7499(SEQ.ID.NO.:40)。图中的位置70-1743表示框内密码子，根据表1其在人类基因组中比艰难梭菌毒素B的对应的框内密码子具有更高的使用率。具体实施例方式DNA分子在一个方面，本发明提供了一种含有编码艰难梭菌毒素A受体结合域(RBD)的核香酸序列的修饰的DNA分子(modifiedDNAmolecule)。艰难梭菌毒素A天然存在的受体结合域的核苷酸序列如图9所示(SEQ.ID.NO.:13)。艰难梭菌毒素A的氨基酸序列如图14所示(分别为SEQ.ID.NO:1,3,5和7)。艰难梭菌毒素A受体结合域的氨基酸序列在SEQ.ID.NO:2，4,6和8中列出。在另一方面中，本发明提供了一种含有编码艰难梭菌毒素B受体结合域(RBD)的核苷酸序列的DNA分子。艰难梭菌毒素B天然存在的受体结合i或的核普酸序列如图14所示(SEQ.ID.NO.:17)。艰难梭菌毒素B的氨基酸序列如图12所示(SEQ.ID.NOs:15)。艰难梭菌毒素B受体结合域的氨基酸序列在SEQ.ID.NO:15中列出。在另一方面，本发明提供了一种含有编码艰难梭菌毒素A和毒素B受体结合域的核香酸序列的DNA分子。该DNA分子包含编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约10%的冲匡内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率，并且该DNA分子还包含编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。此处所用的术语"DNA分子"是指脱氧核糖核苷酸《连。术语"DNA分子"等同于"DNA链"，或"DNA",或"DNA聚合物"，或"DNA序列"。"重组DNA分子"是指由借助分子生物学技术连才妄到一起的DNA片^殳构成的DNA分子。艰难梭菌毒素A和毒素B是主要的艰难梭菌毒性因子。毒素A和毒素B是较大(250-31OkDa)的多肽，其结构中具有多个功能域。两种毒素的N-端结构域含有葡萄糖基转移酶活性。中心结构域是疏水区，这对于毒素的跨细胞膜迁移来说是很重要的。毒素的C-端结构域，此处称为受体结合域，主要负责与表达在靶细胞表面上的受体结合。可用于本发明DNA分子中的核苷酸序列包括编码艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B的全长受体结合域的那些序列。可用于本发明要求保护的DNA分子的编码艰难梭菌毒素A全长受体结合域的核苦酸序列的一个实例在SEQ.ID.NO.:9中列出(图5)。编码艰难才炎菌毒素B全长受体结合i或的核苷酸序列的一个实例在SEQ.ID.NO.:19中列出(图14)。如此处所用，术语"编码艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B受体结合域的核苷酸序列"包括它们的片段。艰难梭菌毒素A或毒素B受体结合域片段的氨基酸最小数量为约44个氨基S臾，优选约50个氨基酸，而更优选约60个氨基酸。因此，本发明要求保护的DNA分子的核苷酸序列中，核苦酸的最小凄t目是约132个核苦酸，优选约150个核普酸，而更优选约180个核普酸。21艰难梭菌毒素A或毒素B受体结合域片段的氨基酸最大数量为至多约870个，约860个，约850个或约840个氨基酸。因此，在本发明要求保护的DNA分子的核苷酸序列中核苷酸的最大数目为约2610个4亥苷酸，约2580个4亥普S吏，约2550个核苦S臾或约2520个核苦酸。艰难梭菌毒素A和毒素B受体结合域的独特特征是存在21-、30-或50-氨基酸残基的4炎菌重复寡肽(clostridialrepeatoligopeptide)。毒素A受体结合域的序列含有3038个梭菌重复寡肽。在毒素B受体结合域的序列中，大约有1924个梭菌重复寡肽。例如，在SEQ.ID.NO.:5(图3)中艰难梭菌毒素A在以下氨基酸残基处含有梭菌重复寡肽1810-1829;1851-1870;1872-1891:1923-19422057-20762191-22102325-23442459-24781943-19622077-20962211-22302346-23652480-24991964-19832098-21172232-22512367-23862501-25201985-20042119-21382252-22712388-24072552-25712006-20252140-21592305-23242439-24582572-25912593-2612;2643-2662;2663-2682;2685-2704<在SEQ.ID.NO.:15(图12)中艰难梭菌毒素B在以下氨基酸残基处含有4炎菌重复寡月太1832-1851;1853-1872;1875-1894;1925-1944;1966-1985;1986-2005;2006-2025;2056-2075;2076-2096;2098-2117;2118-2137;2138-2157;2208-2230;2232-2251j2252-2271;2272-2291;2322-2341;2342-2361。编码艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B受体结合域片段的核苷酸序列可以编码梭菌重复寡肽。编码艰难梭菌毒素A受体结合域片段的核苷酸序列，可以编码最少1个梭菌重复寡肽、2个梭菌重复寡肽、5个梭菌重复寡肽，10个梭菌重复寡肽或15个梭菌重复寡肽。编码艰难梭菌毒素A受体结合域片段的核苦酸序列，可以包括艰难梭菌毒素A的所有梭菌重复寡肽的最大数量，约35个梭菌重复寡肽、约25个梭菌重复寡肽或约15个梭菌重复寡肽。编码艰难梭菌毒素B受体结合域片段的核苦S吏序列，可以编码最少1个梭菌重复寡肽、2个梭菌重复寡肽、5个梭菌重复寡肽、10个梭菌重复寡肽或15个梭菌重复寡肽。编码艰难梭菌毒素B受体结合域片段的核苷S吏序列，可以包括艰难梭菌毒素B的所有梭菌重复寡肽的最大数目，约20个重复的梭菌重复寡肽、约15个梭菌重复寡肽或约IO个梭菌重复寡肽。编码艰难一炎菌毒素A或艰难一炎菌毒素B受体结合域的核苷酸序列，可以包括位于梭菌重复寡肽末端之外的核香酸。另外，编码艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B受体结合域片段的核苦酸序列，可以包括位于梭菌重复寡肽末端之外的核苷酸。例如，在一种实施方式中，核苦g吏序列^尤选编石马在SEQ.ID.NO.:10(图6)中列出的含有表位的艰难梭菌毒素A受体结合域的片段。该表位的氨基酸序列也示出在SEQ.ID.NO.:5(图3)中的残基2098-2141处。该表位的氨基酸序列包括艰难梭菌毒素A的两个梭菌重复寡肽，位于SEQ.ID.NO.:5(图3)中的残基2098-2117和残基2119-2138处。SEQ.ID.NO.:5中的残基2118和2139-2141代表包含在？艮难冲炎菌毒素A受体结合域片段之内的位于梭菌重复寡肽末端之外的残基。因此，该表位的对应核苷g臾序列包括位于梭菌重复寡肽末端之外的核苷酸。在SEQ.ID.NO.:13(图9)和SEQ.ID.NO.:9(图5)中位置778-909处的核苷酸，编码在SEQ.ID.NO.:10(图6)示出的氨基酸序列中所列出的表位。在另一种优选的实施方式中，核苦S臾序列编码含有在SEQ.ID.NO.:7(图4)氨基酸残基2456-2710处的表位的艰难梭菌毒素A受体结合域的片段。在SEQ.ID.NO.:13(图9)中的最后762个核苷酸编码SEQ.ID.NO.:7的位置2456-2710处的氨基酸残基。在本发明要求保护的DNA分子中，根据表1(下文为使用率)，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:对应的框内密码子具有更高的使用率。表1:人类密码子使用表。数字表示在人类基因组中每种密码子的使用百分率(percentusage)。氛丞酸密码子'人类基因组中的使用率PHE(F)TTC20.417.4LEU(L)CTGCTCCTTTTGTTACTA39.919.713.112.87.67.1ILE(I)ATCATTATA20.915.87.4MET(M)AUG22.1VAL(V)GTGGTCGTTGTA28.314.511.07.1SER(S)AGCTCCTCTTCAAGTTCG19.417.715.112.212.14.524<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>例如，如果SEQ.ID.NO.:13(图9)中的框内密码子之一是TTG,其在人类基因组中的使用率为12.8并编码氨基酸亮氨酸，那么可用于DNA分子的核苷酸序列中对应的框内密码子可以用对于亮氨酸具有更高使用率的任何密码子来代替。那些对于亮氨酸使用率超过12.8的密码子是CTG、CTC和CTT。本发明的DNA分子中的每一种氨基酸残基优选至少约20%，更优选至少约30%,更加优选至少约40%,最优选至少约50%的框内密码子，比具有SEQ.ID.NO.:13的？艮难冲炎菌毒素A或具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。对于为核苦酸序列中每一种氨基酸所选择的框内密码子，适宜的至少约50%、更加适宜至少约75%、且最适宜100%为具有最高-使用率的密码子。艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B的野生型核酸序列具有约30。/o的鸟噤呤(G)和胞嘧啶(C)含量。利用在人体内具有较高使用率的密码子通常会导致GC含量的增加。在一种实施方式中，可用于DNA分子中的核酸序列包括比艰难梭菌毒素A或毒素B相应的野生型密码子具有更高GC含量的密码子。优选地，核苦酸序列的GC含量为至少约40%、更4尤选至少约50%、而最伊匸选至少约60%。通过本领域中#支术人员已知的任何方法都能够合成该核香酸序列。例如，该核普酸序列可被分成一定长度的寡核苷酸(例如，100个核苦酸)。该寡核苷酸可i殳计具有互补的悬挂区域(hangingregion),并结合至固相基质。寡核普酸能够经由其重叠区域成组地进4亍杂交并共价连接以4是供最终的核苷酸序列。可替;也，可委才乇商业7>司，侈'B口BlueHeronBiotechnology,Inc.,Bothell,WA(华盛顿)来合成冲亥普酸序列。本发明要求保护的DNA分子可选地包括一个或多个附加核苷酸。任何核苷酸都可加入到上述DNA分子中。附加核苦酸可加入到编码艰难梭菌毒素A或毒素B受体结合域的核苷酸序列的5'或3'端。对于附加核苦酸凄t目没有上限。一4S:而言，向DNA分子中加入不超过约10,000个核苷酸，优选不超过约5,000个核苷酸，更优选不超过约3,000个核香酸，更加优选不超过约1,000个核苦酸。26在一种实施方式中，附加核苷酸包括前导序列的基因。本文中所使用的术语"基因"是指编码所给氨基酸序列的核酸序列。前导序列包括分泌信号和信号肽序列。前导序列通常加入到编码艮难4炎菌毒素A或毒素B受体结合域的核苷酸序列的5'端。可用于前导序列的核香酸序列的一个实例包括tPA等的信号肽。在另一种实施方式中，附加核苦酸包括Kozak序列。Kozak序列优选包括核芬酸序列ACCATGG和(GCC)RCCATGG，其中R是噤呤(A或G)。本发明要求保护的含有Kozak序列和艰难梭菌毒素A受体结合i或核苦酸序列的DNA分子的一个实例，如图8(SEQ.ID.NO.:12)所示。在该实施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:12中列出的序列。本发明要求保护的含有Kozak序列和^艮难4臾菌毒素B受体结合域核苦酸序列的DNA分子的一个实例，如图14(SEQ.ID.NO.:19)所示。在该实施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:19中列出的序列。本发明要求保护的含有Kozak序列、tPA信号肽基因和艮难才炎菌毒素A受体结合域核苷S吏序列的DNA分子的一个实例，如图7(SEQ.ID.NO.:ll)所示。在该实施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:11中列出的序列。本发明要求保护的含有Kozak序列、tPA信号肽基因和艰难梭菌毒素B受体结合域核苦酸序列的DNA分子的一个实例，如图16(SEQ.ID.NO.:20)所示。在该实施方式中，DNA分子是在SEQ.ID.NO.:20中列出的序列。27在另一种实施方式中，附加核苷S臾可包含任何细菌序列或非细菌序列基因。例如，细菌序列可来自病原或非病原细菌。细菌的实例包4舌大肠杆菌(￡.co//)、分4支杆菌(iV^co^tcfe〃'w附)、链J求菌(5^取OCOCCW51)等。非细菌序列可来自病毒(例如，HIV、CMV、HBV、HCV等)和获自免疫细胞(例如，CD4+细胞)的表位。在另一种实施方式中，附加核苷酸包^:聚腺苷酸尾(polyAtail)。聚腺苷酸尾通常加入到编码艰难梭菌毒素A或毒素B受体结合i或的4t苦酸序列的3'端。在一种实施方式中，本发明要求-隊护的DNA分子结合至载体中。例如，载体可用于复制或扩增DNA分子，或用于表达编码的蛋白。载体可以包含染色体DNA序列、非染色体DNA序列和合成的DNA序列的片段。该载体可以是{壬<可重组载体。重组载体具有复制起点，,人该复制起点引发载体和引入DNA分子的复制。重组载体的实例包括质粒、粘粒和噬菌体。质粒是典型的能够自发复制的环状双链DNA分子。一般而言，质粒含有细胞进行基因表达所需的信息，例如启动子、Kozak序列、甲硫氨酸起始点、聚腺苷酸尾。质粒的实例包括pVAXTM和pUC。pVAXTM可从英杰生命技术公司(Invitrogen,Carlsbad，Calif)商购获得。pUC可从纽英伦生物才支术有卩艮^^司(NewEnglandBioLabs,Ipswich，MA)商购获4f。28载体可以进一步包括可选#"的标记，例如药物抗性标记、可检测的基因标记、复制起点和/或方便对插入的DNA分子进行操作的多个克隆位点，这在本领域中已众所周知。药物抗性标记的实例包括四环素、氨千西林和卡那霉素。可检测的基因标记的实例包括P-半乳糖苷酶和乳糖Z。多个克隆位点通常是含有一个或多个限制位点的DNA片段。限制位点的实例包^舌5"w/ZI、丑coiI、Pstl位点。复制起点一般是DNA复制开始的DNA序列。一般而言，复制起点富含AT。对艮难4炎菌毒素A或毒素B产生抗体的方法在一个方面，本发明提供了一种在哺乳动物体内产生艰难梭菌毒素A抗体的方法。在另一方面，本发明^是供了一种在哺乳动物体内产生？艮》1M菱菌毒素B4元体的方法。在这两种实施方式中，该方法包括向哺乳动物给予有效量的上述结合至载体中的DNA分子。在另一个方面，本发明提供了一种在哺乳动物体内产生艰难梭菌毒素A和毒素B的抗体的方法。该方法包括向哺乳动物纟合予有效量的上述含有编码艰难一炎菌毒素A和毒素B受体结合域的核苦酸序列的DNA分子。在另一个方面，本发明提供了另一种在哺乳动物体内产生艰难才炎菌毒素A和毒素B4元体的方法。该方法包纟舌向哺乳动物纟合予有效量的上述编码7艮难梭菌毒素A受体结合域的DNA分子和上述编码艰难梭菌毒素B受体结合域的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分别或组合《合予哺乳动物。29DNA分子-载体复合物能够纟会予任何哺乳动物。哺乳动物包才舌，例如，人类、狒狒和其4&灵长类动物、以及宠物如狗和猫、实-验室动物如大鼠和小鼠、以及家畜如马、羊和牛。在哺乳动物体内产生的抗体能够进行纯化、固定到固体载体上作为艰难4炎菌的探针。可替代地，该抗体能够作为治疗组合物给予人体。在一种实施方式中，该哺乳动物是人类。DNA分子-载体复合物能够在任何时候作为治疗组合物给予人体。例如，DNA分子-载体复合物能够在人体潜在暴露于艰难梭菌或感染艰难^^菌之前或之后纟会予人体。降低艰难梭菌感染风险的方法在另一方面，本发明提供了降低人体内感染艰难梭菌风险的方法。任何人都有感染艮难4炎菌的风险。一^:而言，7艮难梭菌感染是医院病原菌。因此，具有感染艰难梭菌风险的人的实例包括那些医院或类医院环境(hospital-likesetting)中的患者或者即^1寻成为医院或类医院环境中患者的人。类医院环境的实例包括疗养院(nursinghome)、生活辅助机构(assistedlivingfacility)等。具有感染艰难梭菌风险的人的其他实例包括那些已进行、正在进行或即将进行灌肠术、胃管插入术以及胃肠道手术的人。正常肠菌类发生改变的人也具有感染艰难梭菌的风险。例如，使用抗生素如青霉素、氨千西林、氯林肯霉素和头孢菌素可以改变正常肠菌类而增加感染^艮难^炎菌的风险。另外，艰难梭菌也与使用诸如氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和阿霉素的化合物进4于化学疗法的患者的疾病有关。正在进4亍或即将进行这种化学疗法的患者也是具有感染艰难梭菌风险的人的实例。艮难冲炎菌感染的常见并发症是反复性疾病(recurrentdisease)或复发性疾病(relapsingdisease)。疾病复发在临床上可表现为抗生素相关性腹泻(AAD)、抗生素相关性肠炎(AAC)、或伪膜性肠炎(PMC)。复发一次的患者更可能再次复发。因此，具有或曾经具有反复性或复发性艰难梭菌感染的患者是具有该风险的人的实例。降低人体感染艰难梭菌风险的方法包括向人体内给予有效量的上述结合至载体中的DNA分子。在另一个方面，降低人体感染艰难梭菌风险的方法包括向人体内给予有效量的上述结合至载体的对于毒素A的DNA分子和结合至载体的对于毒素B的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分开或者組合^会予人体。在另一方面，降低人体感染艰难梭菌风险的方法包括向人体内给予有效量的上述含有编码艰难梭菌毒素A和毒素B两种毒素的受体结合域的核苷酸序列的DNA分子。DNA分子-载体复合物能够在人潜在暴露于艰难梭菌感染风险之前的任何时候进行给药。例如，DNA分子-载体复合物可以在潜在暴露于艰难梭菌感染风险的前一天、前两天、优选前一个星期、更优选前两个星期、更加优选前一个月以及更加优选前两个月或更长时间进^f于纟合药。风险降低的程度通常因人而异，其取决于诸如给予的DNA分子的用量、致病因素(例如，医院环境、改变常失见肠菌类的因素等)的因素。感染艰难梭菌的风险通常可以降低至少约10%、更常见降31低至少约25%,更常见地降低至少约50%，甚至更常见降低至少约75%,而且更常见地降低至少约90%。最佳情况是感染艰难梭菌的风险完全消除。治疗》艮71M炎菌感染的方法另一个方面中，提供了一种在需要其的人体内治疗艰难梭菌感染的方法。感染艰难梭菌的任何人都需要根据本发明要求保护的方法进行治疗。通常，需要治疗的人是由内科医师或临床医生诊断患有艰难梭菌感染的人。用于治疗人体内艰难梭菌感染的方法包括向人体内给予有效量的上述结合至载体中的DNA分子。在另一方面，用于治疗人体内艰难梭菌感染的方法包括向人体内给予有效量的上述结合至载体的对于毒素A的DNA分子和结合至载体中的3于于毒素B的DNA分子。因此，上述DNA分子可以分开或者组合乡合予人体。在另一方面，用于治疗人体内？艮难梭菌感染的方法包括向人体给予有效量的上述含有编码艰难梭菌毒素A和毒素B两种毒素的受体结合域的核苷酸序列的DNA分子。DNA分子-载体复合物可以在^艮难才炎菌感染期间的任何时4,美进行给药。优选在感染艰难梭菌后尽快给予DNA分子-载体复合物。例如，本发明要求保护的DNA分子-载体复合物在感染后约一个月内给药，优选在约两星期内给药，更优选在约一星期内给药，甚至更优选约内给药Cwm(9//".A^/.7Tzw.，2003,5:10-19和Liu等，尸A^S,2004,101:14567-14571。含有DNA分子的质粒的实例如图IO所示。32本领域中技术人员已知的任何方法可以用于给予DNA分子-载体复合物。例如，DNA分子-载体复合物可肠内或非肠道多会药如,争脉注射、肌肉注射、作为可注射的溶液或悬浮液进行皮下注射、或腹膜内注射。例如，DNA分子-载体复合物可以通过体内电穿《L方式纟合药。简而言之，体内电穿孔涉及在注射DNA分子-载体复合物时向人体组织同时施加电月永冲。一4殳而言，通过体内电穿孔l会药能够增加细胞摄入DNA分子-载体复合物的量。可替代地，DNA分子-载体复合物可以通过DNA生物喷射器(biojector)给药。简而言之，生物喷射器是无针头注射技术，通过促使悬浮于液体中的化合物高速穿过紧贴(holdagainst)皮肤的微孔(tinyorifice)而发挥作用。生物喷射器能够递送肌肉或皮下注射物。生物喷射器能够从BiojectMedicalTechnologies(Inc，Tualatin,Oregon)商购获得。用于给予DNA分子-载体复合物的另一种方法是借助于基因枪。通过基因枪对基因进行体内给药，已在Frelin等777^.，2004，11:522-533中披露。关于通过基因枪进行体内给药的相关部分以引用方式结合于此作为参考。基因4色可以从Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA商购获4寻。DNA分子-载体复合物以可在人体内有岁文地产生抗体或者导致免疫反应的量进行给药。DNA分子-载体复合物的实际有效量将根据例如4吏用的编码受体结合域的具体核苦酸序列、质粒、给药方式、给药的具体位置以及接受治疗的对象(例如年龄、性别、尺寸等)而变化。这种有效量可在临床前和临床试验期间由内科医师和临床医生容易地确定。33DNA分子-载体复合物可在合适的药物载体中进行配制。在本i兌明书中，正如本领i或中的才支术人员所理解的是，药物载体应理解为4某介物(vehicle)或赋形剂的同义词。载体的实例包括淀粉、乳液(或奶，milk)、糖、某些类型的粘土、凝胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸4美或钙、滑石、才直物油脂或才直物油、初W交和乙二醇。DNA分子-载体复合物能够配制成含有一种或多种以下物质的组合物稳定剂、表面活性剂，优选非离子表面活性剂、以及可选的盐和/或緩沖剂。例如，稳定剂可以是氨基酸，例如甘氨酸；或寡糖，例如蔗糖、四聚糖(tetralose)、乳糖或葡聚糖。可替代地，稳定剂可以是糖醇，例如甘露醇；或它们的组合。优选稳定剂或稳定剂的组合占DNA分子-载体复合物重量的约0.1wt约10wt%。表面活性剂优选为非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯。合适的表面活性剂的一些实例包括吐温20、吐温80;聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙二醇，如约0.001%(w/v)至约10%(w/v)的PluronicF-68。盐或緩冲剂可以是任何盐或緩冲剂。合适的盐包括，例如，氯化钠或氯化钾。合适的緩冲剂包括，例如，碳酸氬钠或碳酸氲钾、石粦酸二氢钠或^粦酸二氢钾。优选緩冲剂将DNA分子-载体复合物配制物的pH值维持在约5.5至约7.5的范围内。盐和/或緩冲剂对于4巴重量克分子渗透压浓度维持在适于给药的水平内也是有益的。优选盐或緩冲剂以约150mM约300mM的大致等渗压浓度存在。DNA分子-载体复合物可以配制成可另外含有一种或多种常规添加剂的组合物。这些添加剂的一些实例包括增溶剂，例如甘油；抗氧化剂，例如笨扎氯铵(季铵化合物的混合物，称为"季铵化物(quart)"、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉剂，例如吗啡衍生物；或等渗压剂等，例如上述那些。为了进一步预防氧化或其他变质腐败，组合物可以在氮气下储存于用不可渗透的塞子密封的小瓶。实施例实》包例1纟元体的产生无内毒素质粒制备物乂人AldevronInc，FargoND获得。质粒在无菌盐水中稀释成100lag/50pL浓度的盐水。分成5组小鼠，每组中3只BALB/c小鼠(CharlesRiverLaboratories)并只于它们注射DNA。组1注射pVAXTM载体；组2仅注射TxA-RBD，标准的肌肉(IM)注射；组3注射tPA-TxA-RBD，IM注射；组4仅注射TxA-RBD,IM电穿孔；组5注射tPA-TxA-RBD,IM电穿孔。在第0周和第2周用100|ag/50nL(100|ugin50|aL)的盐水在右后肢接种。在接种前(第0周)和研究结束(第6周)时抽血并分离血清。血清的分析通过ELISA进行，采用商购的毒素A作为高蛋白结合性Costar板上的结合抗原，采用商购的抗小鼠辣根-过氧化物酶(HRP)作为第二抗原。ELISA采用DAKO显影系统进行显影。图11显示了TxA-RBD和tPA-TxA-RBD者P是免疫原性的。单独使用TxA-RBD比tPA-TxA-RBD提供的IgG反应要高10倍。对于两种质粒，电穿孔都将IgG反应提高了100倍。实施例2TxA-RBD和tPA-TxA-RBD质粒的质粒设计以下质粒采用标准克隆^支术构建(Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989))。对与艰难梭菌菌林VPI10463毒素A蛋白相应的全长氨基酸序列(基因库登记号AAA23283,参见图3)进行评价，并识别与位于该蛋白的羧基-末端第三位的假定受体结合域相应的残基(图16A)。RBD氨基酸序列在计算机中(/ww7/co)使用人细胞中最常用的密石马子反寿争i奪(back-translated)成豸斤的基因序列(http:Vwww.entelechon.com/)。A^d卩艮制序列、Kozak序列和曱石克氨酸起始位点占才居了SEQ.ID.NO.:12(图8)中的116石成基乂于。优-f匕的基因由SEQ.ID.NO.:12(图8)的23~2641石成基对构成。最后，将限制序列包含在3'末端，并将S"m别限制位点引入SEQ.ID.NO.:12(图8)的位置17-22中，以允"i午以后的f务饰。然后将该基因递交-进4亍商业合成(BlueHeronBiotechnology,Seattle,WA)。基因插入片段,皮消化(tV/^1/Eco尺1，NewEnglandBiolabs)而结合到商购载体中，即pVAX丁m(Invitrogen，Carlsbad，CA),其是满足美国食品和药品监督局关于用于人的准则的质粒。消化插入片段CSam//l/Eco7l),并将其插入具有事先定位的组织纤溶酶原激活子(tPA)序列以及上述iWd、Kozak和ATG起始密码子(图16B)的pVAXTM载体中。在进行限制性消化并采用T4连接酶(Roche)连接过夜之后，将连接产物转化至TOP10化学上适当的大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通过在补充有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)平板上进行涂板选择出阳性克隆。通过限制性消化和DNA测序来马佥"i正基因插入物(GeneWiz,NorthBrunswick,NJ)。两种质粒(TxA-RBD和tPA-TxA-RBD)仅仅在ATG起始密码子之后是否存在tPA前导序列方面有所不同。实施例3TxA-RBD的体外表达293T细胞在转染之前裂解24h并在12孔培养皿内以5乂105个细胞/孔的浓度在具有10%的惰性FBS(v/v)(Gibco)和1%青霉素36-链霉素(Gibco)的DMEM中进行涂板。在涂板24h后，根据厂商的i兑明书，采用LipofectamineTM2000(Invitrogen,Calsbad，CA)，用2|iig质粒DNA、TxA-RBD、TxB國RBD、tPA-TxA-RBD、tPA-TxB-RBD或pVAXTM-GFP(作为阴性对照)转染细月包。转染后48h,收集上清液和/或细月包溶解产物。在免疫印迹之前以22，000xg离心30min来澄清上清液。才羊品在进行分冲斤前4诸存于-20。C下。采用InvitrogenSureLock系统，根据厂商的建议来实施免疫印迹。筒而言之，将32.5jaL的样品力口入到12|uLNuPAGELDS加样緩冲液和5jliL还原剂中并在10min内力。热到70。C。样品在200V恒定电压下在10°/。BisTris月交(Invitrogen,Carlsbad,CA)中进4亍电穿孔。将样品转移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜并在封闭緩冲液(5%奶粉、磷酸盐緩冲液中(PBS)的0,5%牛清蛋白(Gibco))中封闭2h。膜在4°C下用初始抗体(primaryantibody)(山羊多克隆抗毒素A(ListBiologicalLaboratories,Inc.)1:2000在去于闭纟爰冲液中i咅养过夜。然后，用沖洗緩冲液(PBS,含0.05%的TweenTM,Sigma)沖洗膜，按照指示的稀释度向封闭緩沖液中加入辣根-过氧化物酶(HRP)-偶耳关的抗山羊二抗(1:8000)(SigmaInc.,St.Louis，MO)并^f呆才争lh。如上对月莫进行冲洗，并采用AmershamECL显影系统(GEHealthcare,Piscataway，NJ)进行显影。实施例4动物接种和艰难梭菌毒素对抗为了实施免疫原性研究，获得6-8周大的近亲繁殖BALB/c小鼠(每组6只小鼠)和远亲杂交的CD-l、Swiss-Webster小鼠(每组5只小鼠)(马萨诸塞州，威尔明顿，查理斯河实验室)并在洛克菲勒大学(RockefellerUniversity)的实-验室的动物研究中心(LaboratoryAnimalResearchCenter)进4亍々司养。戶斤有的步芬聚者卩是才安照洛克菲勒大学的动物护理和^吏用委员会(AnimalCareandUseCommittee)糸匕准的方案进4亍实施的。得到用于接种的无内毒素(<100IU)的质粒DNA(AldevronInc.,Fargo,ND)。5组小鼠(每组5-10只)在第0周和第2周用50昭质粒DNA(分为两份剂量)通过标注的注射器肌肉注射(IM)或电穿孔强化(EP)肌肉注射递送到每一个后肢进行接种。对于艰难梭菌毒素A对抗实验，组1^义注射pVAXTM;组2注射TxA-RBD(IM);组3注射tPA-TxA-RBD(IM);组4注射TxA-RBD(EP);而组5注射tPA-TxA-RBD(EP)。参见图11。对于艰难梭菌毒素B对抗实验，组l仅注射pVAXTM;组2注射TxB-RBD(IM);组3注射tPA-TxB-RBD(IM);组4注射TxB-RBD(EP);而组5注射tPA-TxB-RBD(EP)。参见图18。在对抗毒素前，在注射6周后获取血清用于进行免疫评价。在对抗艰难梭菌毒素A(图19)和对抗艰难梭菌毒素B(图20)后90h内监控动物症状或死亡情况。实施例5抗毒素ELISAIgG滴定度用在1MNaHC03緩沖液中的0.5pg纯化的完全(whole)艰难梭菌毒素A或0.5|ag纯化的完全艰难梭菌毒素B涂覆96-孔高蛋白结合性聚苯乙烯EIA4反(Costar9018,CorningInc.,Coming,NY),在4。C下过夜。第二天，用封闭緩冲液(PBS-T,5Q/。奶粉w/v,0,5%牛血清清蛋白w/v)封闭l.5h。以指示的稀释度一式两份地加入从实施例4的方案中获得的血清样品，并在37。C下培养2h。用冲洗緩冲液(PBS-0.05%吐温20tm)冲洗板5次，并用石咸性磷酸酶(AKP)偶联的大鼠抗小鼠二抗(I:IO，OOO，在封闭緩冲液中)培养lh。采用AMPAKELISA显影试剂盒4艮据厂商i兑明书(DAKOCorporation,Carpinteria,CA)对板进行显影。在490nm下测定^反孔的光密度(DynexTechnologies,Chantilly,Va)。端点抗体滴定度表明最后稀释4勿(thelastdilution)的又又向稀释(reciprocaldilution)才是供了比在实施的最低稀释度下的血清对照O.D.值高2倍的O.D.值。参见图11、18、21和23。实施例6TxB-RBD和tPA-TxB-RBD质粒的质粒i殳计以下质粒采用标准克隆技术构建(Sambrook，etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989》。对与艰难梭菌菌林VPl10463的毒素B蛋白相应的全长氨基酸序列(基因库登记号P18177，参见图12)进行评价，并识别与占据该蛋白羧基-末端第三位的假定受体结合域相应的残基(图17)。RBD氨基酸序列在计算机中(/"w7/co)使用人细胞中最常用的密码子反转i,成新的基因序列(http:Vwww.entelechon.com/)。A7zd限制序列、Kozak序列和曱硫氨酸起始位点占据SEQ.ID.NO.:19(图14)的116碱基对。优化的基因由SEQ.ID.NO.:19(图14)的23-1861碱基对构成。最后，五co^l限制序列包含在3'端，S"w/iYl限制位点引入到SEQ.ID.NO.:19(图14)的17-22位置，以容许以后的《奮饰。然后，一夺该基因递交进4亍商业合成(BlueHeronBiotechnology,Seattle:WA)。基因插入片段被消化(Md/Eco招，NewEnglandBiolabs)而结合到商购载体中，即pVAXTM(lnvitrogen,Carlsbad,CA)，其是满足美国食品和药品监督局关于用于人的准则的质粒。消化插入片l殳(5aw//l/￡:co/l),并将其插入具有事先定位的组织纤溶酶原激活子39(tPA)序列以及上述A^d、Kozak和ATG起始密码子(图17)的pVAXTM载体中。在进行限制性消化并采用T4连接酶(Roche)连接过夜之后，将连接产物转化至TOP10化学上适当的大肠杆菌细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通过在补充有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)平板上进行涂板选择出阳性克隆。通过限制性消化和DNA测序来验证.基因插入物(GeneWiz,NorthBrunswick,NJ)。两种质粒(TxA-RBD和tPA-TxA-RBD)仅仅在ATG起始密码子之后是否存在tPA前导序列方面有所不同。实施例7组合疫苗免疫原性方案BALB/c小鼠，每组5只，用编码pVAXTM、TxA-RBD、TxB-RBD或TxA-RBD和TxB-RBD组合物(此处称为"TxA-TxB")的DNA在第0周和第2周进行接种。才姿照以下剂量4是4共DNA:pVAX、TxA-RBD和TxB-RBD以50(ag/100|il的无菌盐水在两后月支间分开注射。关于TxA-TxB共递送，对于每种DNA质粒(即TxA-RBD质粒和TxB-RBD质粒)，将DNA调制为50昭/50pd无菌盐水，然后，进行混合，从而在单次注射中4是供每种质粒的浓度为50ng/100pl。在用氯胺酮/甲苯噻溱通过腹膜内注射进行镇静后，通过眼球后穿弟'J(retro-orbitalpuncture)q欠集血才羊。才艮据先前在实施例5中所述的方案进行ELISA,参见图21中的结果。在实验开始后8星期，用在100juL无菌盐水中的300ng纯化艰难梭菌毒素A通过腹膜内(IP)注射对抗(激发)动物，接着每12h监看症状或死亡情况。结果参见图22。在还存在的动物中用在50juL无菌盐水中的400ng纯化的艰难梭菌毒素B通过静脉注射进行对抗，接着每12h监看症状或死亡情况。结果参见图22。实施例8仓鼠免疫原性实-睑仓鼠(叙利亚金黄仓鼠，每组5只)用pVAXTM、TxA-RBD或TxB-RBD接种。所有接种采用电穿孔(EP)-强化肌肉注射，按照IchorMIDicalSystems,Inc.指示采用3.0mmTriGrid-EP分析来进4亍。TxA-RBD或TxB-RBD以两种剂量冲是供1)200ng/100|il无菌盐K在两后月t间分开注射或2)22jug/25juL无菌盐K注射单个后月支。动物在第0周和第4周注射，通过眼球后穿刺采集血清以进行抗-毒素ELISA。在动物上实施的所有步骤都是都是按照洛克菲勒大学方案进行实施。96-孔高蛋白结合性聚苯乙烯EIA板(Costar9018,CorningInc.,Corning,NY)用在PBS中的50ng纯化的完全艰难梭菌毒素A或50ng纯化的完全艰难梭菌毒素B涂覆，在4。C下过夜。第二天，用封闭緩冲液(PBS-T、5%奶粉w/v、0.5%牛血清清蛋白w/v)封闭1.5h。在封闭緩冲液中经过一系列稀释后一式两份地加入血清样品，并在37°C下培养2h。用冲洗姿爰冲液(PBS-0.05%吐温20)冲洗々反5次，并用AKP-偶^:的抗仓鼠二抗培养lh。41采用AMPAKELISA显影试剂盒根据厂商的说明书(DAKOCorporation,Carpinteria,CA)对才反子进4亍显影。在490nm下测定一反孔的光密度(DynexTechnologies,Chantilly,Va)。参见图23。端点抗体滴定度表明最后稀释物的双向稀释(reciprocaldilution)提供了比在实施的最低稀释度下的血清对照O.D.值高2倍的O.D.值。权利要求1.一种包括编码艰难梭菌毒素A受体-结合域的核苷酸序列的DNA分子，其中根据表1，每一种氨基酸残基至少约10％的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中每一种氨基酸残基至少约20%的所述框内密码子具有更高的使用率。3.根据权利要求1所述的DNA分子，其中每一种氨基酸残基至少约30%的所述冲匡内密码子具有更高的4吏用率。4.根据权利要求1所述的DNA分子，其中每一种氨基酸残基至少约40%的所述框内密码子具有更高的使用率。5.根据权利要求1所述的DNA分子，其中每一种氨基酸残基至少约50%的所述*1内密码子具有更高的4吏用率。6.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少为40%。7.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少为50%。8.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述核苷酸序列的GC含量至少为60%。9.根据权利要求1所述的分子，其中所述序列在SEQ.ID.NO.:9中列出。10.根据权利要求1所述的分子，其中所述分子进一步包括一个或多个附力口核苷酸。11.根据权利要求IO所述的分子，其中所述附加核苦酸包括前导序列。12.根据权利要求1所述的分子，其中所述分子结合至载体中。13.根据权利要求12所述的分子，其中所述载体是质粒。14.根据权利要求13所述的分子，其中所述质粒是pVAX。15.根据权利要求13所述的分子，其中所述质粒是pUC。16.根据权利要求1所述的分子，其中所述序列编码所述艰难梭菌毒素A的受体结合域的片段。17.—种用于在哺乳动物体内产生艰难梭菌毒素A抗体的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子包括编码所述艰难才炎菌毒素A受体—结合域的核苦酸序列，其中才艮据表i,每一种氛基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。18.根据斥又利要求17所述的方法，其中所述结合至载体中的分子通过肌肉注射进行给药。19.根据4又利要求17所述的方法，其中所述结合至载体中的分子通过体内电穿孔进行给药。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述结合至载体中的分子通过DNA生物喷射器进行给药。21.根据权利要求17所述的方法,通过基因枪进行给药。22.23.24.根据权利要求17所述的方法,SEQ.ID.NO.:9中列出。25.根据权利要求17所述的方法，或多个附加核苷酸。26.才艮据权利要求25所述的方法，序列。27.根据权利要求17所述的方法，28.根据权利要求27所述的方法，29.根据权利要求28所述的方法，30.根据权利要求28所述的方法，其中所述结合至载体中的分子其中所述DNA分子的序列在其中所述分子进一步包括一个其中所述附加核苦酸包括前导其中所述分子结合至载体中。其中所述载体是质粒。其中所述质并立是pVAX。其中所述质粒是pUC。根据权利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的至少约50%的核苷酸是鸟噤P令或胞嘧咬。根据权利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的至少约60%的核苦酸是鸟噤f令或"包嘧，定。31.冲艮据权利要求17所述的方法，其中所述DNA分子的序列编码所述艰难4炎菌毒素A受体结合域的片^爻。32.根据权利要求17所述的方法，其中所述哺乳动物是人。33.—种用于降j氐人体内感染艰难冲炎菌风险的方法，所述方法包括向人体《会予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子包括编码艰难梭菌毒素A受体-结合域的核苷酸序歹寸，其中才艮据表l,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的？艮难4麦菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。34.—种用于在需要其的人体内治疗艰难梭菌感染的方法，所述方法包括向人体给予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子含有编码艰难梭菌毒素A受体-结合域的核苦酸序列，其中才艮据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的才匡内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率。35.—种包括编码艰难梭菌毒素B受体结合域核普酸序列的DNA分子，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。36.—种用于在哺乳动物体内产生艰难一炎菌毒素B的抗体的方法，所述方法包4舌向所述哺乳动物给予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子含有编码所述艮难冲炎菌毒素B受体-结合域的核普酸序列，其中才艮据表i,每一种氛基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。37.—种用于降低人体内感染^艮难梭菌风险的方法，所述方法包括向人体给予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子含有编码艮难4炎菌毒素B受体-结合域的核苷酸序歹寸，其中根据表l,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的？艮难才炎菌毒素B对应的框内密码子具有更高的^f吏用率。38.—种用于在需要其的人体内治疗？艮难冲炎菌感染的方法，所述方法包括向人体给予有效量的结合至载体中的DNA分子，其中所述DNA分子含有编码艰难梭菌毒素B受体-结合域的核苷酸序列，其中根据表l，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。39.—种DNA分子，包括a.编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列，其中冲艮据表1,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率，以及b.编码艰难梭菌毒素B受体结合域的核普酸序列，其中根据表1,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。40.—种用于在哺乳动物体内产生艮难梭菌毒素A和毒素B抗体的方法，所述方法包i舌向所述哺乳动物给予有效量的DNA分子，所述DNA分子包括a.编码所述艮难一炎菌毒素A受体结合i或的核苦酸序列，其中根据表1,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率，以及b.编码所述艮难4炎菌毒素B受体-结合域的核苷酸序列，其中根据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的^f吏用率。41.一种用于降低人体内感染艰难梭菌风险的方法，所述方法包括向人体给予有效量DNA分子，所述DNA分子包括a.编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列，其中根据表1,每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难冲炎菌毒素A对应的框内密码子具有更高的4吏用率，以及b.编码^艮难才炎菌毒素B受体-结合域的核苦酸序列，其中才艮据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:17的艰难梭菌毒素B对应的框内密码子具有更高的4吏用率。42.—种用于在需要其的人体内治疗？艮难才炎菌感染的方法，所述方法包括向人体纟合予有效量的DNA分子，所述DNA分子包括a.编码艰难梭菌毒素A受体结合域的核苷酸序列，其中根据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ.ID.NO.:13的艰难梭菌毒素A对应的框内密码子具有更高的使用率，以及b.编码艰难冲炎菌毒素B受体-结合域的核苦酸序列，其中才艮据表1，每一种氨基酸残基至少约10%的框内密码子在人类基因组中比具有SEQ的艰难梭菌毒素B的对应框内密码子具有更高的^f吏用率。全文摘要在一个方面，本发明提供了一种DNA分子。该DNA分子包括编码艰难梭菌毒素A或毒素B的受体-结合域的核苷酸序列，其中每一种氨基酸残基至少约10％的框内密码子在人类基因组中比具有已知序列的艰难梭菌毒素A或毒素B对应的框内密码子具有更高的使用率。本发明还提供了用于产生艰难梭菌毒素A或毒素B的抗体的方法，以及用于降低感染艰难梭菌毒素A或毒素B风险的方法、以及用于治疗艰难梭菌的方法。文档编号A61K31/70GK101500581SQ200780029271公开日2009年8月5日申请日期2007年6月7日优先权日2006年6月8日发明者戴维·F·加德纳申请人:科内尔研究基金会