甘油连接的peg化的糖和糖肽的制作方法

专利名称：甘油连接的peg化的糖和糖肽的制作方法
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本申请要求享有2006年10月4日提交的美国临时专利申请第60/828,208号的优先权，通过参考将该临时专利申请的全部内容并入本文用于所有目的。

发明内容
在示例性实施方案中，本发明的“糖聚乙二醇化的(glycopegylated)”分子是通过酶介导在糖基化或非糖基化的肽与可酶促转移的糖基(saccharyl)部分之间形成缀合物而产生的，所述可酶促转移的糖基部分在其结构内包括修饰基团，例如聚合物修饰基团例如聚(乙二醇)。在示例性实施方案中，所述肽是选自以下的成员骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)、神经营养蛋白(例如、NT-3、NT-4、NT-5)、生长分化因子(例如，GDF-5)、神经胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)、脑产生的神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、冯·维勒布兰德氏(von Willebrand)因子(vWF)蛋白酶、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、B-结构域缺失的因子VIII、具有全长因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、具有B-结构域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制剂)、葡糖脑苷脂酶、组织型纤溶酶原激活物(TPA)、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脱氧核糖核酸酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生长激素、TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2单克隆抗体(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒的蛋白F的单克隆抗体(SynagisTM)、TNF-α的单克隆抗体(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(ReoproTM)、CD20的单克隆抗体(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α单克隆抗体(MLB5075)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A和成纤维细胞生长因子。聚合物修饰基团连接于糖基部分(即，通过由两个活性基团反应而形成的单个基团连接)或通过连接体部分，例如，被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基等连接。
因此，在一个方面，本发明提供PEG部分(例如，PEG)和肽(其具有与本领域认可的治疗性肽相似或在其它方面类似的体内活性)之间的缀合物。在本发明的缀合物中，PEG部分通过完整的糖基(glycosyl)连接基团与肽共价连接。示例性的完整的糖基连接基团包括用PEG衍生化的唾液酸部分。
聚合物修饰基团可以连接于肽上的糖基部分的任何位置。此外，聚合物修饰基团可以连接于野生型肽或突变肽的氨基酸序列中的任何位置处的糖基残基。
在示例性实施方案中，本发明提供通过糖基连接基团与聚合物修饰基团缀合的肽。示例性的肽缀合物包括糖基连接基团，所述糖基连接基团具有选自以下的化学式
在式I、Ia、II或IIa中，R2为H、CH2OR7、COOR7、COO-或OR7，其中R7表示H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基。符号R3、R4、R5、R6和R6’独立地包括H、被取代的或未被取代的烷基、OR8、NHC(O)R9和糖基(saccaryl)部分。下标d为0或1。R8和R9独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一个包括聚合物修饰基团例如PEG。在示例性实施方案中，R6和R6’与它们所连接的碳合起来为唾液酸基(sialyl)部分的侧链的部分。在另一个示例性实施方案中，这个侧链用聚合物修饰基团官能化。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团通过连接体L结合于糖基连接基团，通常通过糖基核上的杂原子(例如，N、O)结合，如以下所示
R1为聚合物修饰基团和L选自键和连接基团。下标w表示选自1-6的整数，优选为1-3，更优选为1-2。示例性的连接基团包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基部分和唾液酸。连接体的示例性组成部分为酰基部分。另一个示例性的连接基团为氨基酸残基(例如，半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸和短的寡肽例如，Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Cys-Lys、Ser-Lys等)。
在L为键时，它是通过R1的前体上的反应性官能团与糖基连接基团的前体上的具有互补反应活性的反应性官能团进行反应所形成的。在L为非零级连接基团时，在与R1前体反应之前L可以位于糖基部分上。或者，可以将R1的前体和L合并为预先形成的盒(preformedcassette)，随后将该预先形成的盒连接于糖基部分。如本文中所述的，具有适当的反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围之内。此外，前体的偶联通过本领域中充分公知的化学方法进行。
在示例性实施方案中，L是由提供被修饰的糖的氨基酸或小肽(例如，1-4个氨基酸残基)形成的连接基团，在被修饰的糖中，聚合物修饰部分通过被取代的烷基连接体连接。示例性的连接体包括甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。本文中定义的氨基酸类似物也可用作连接体组分。所述氨基酸可以用通过酰基键共价连接的连接体(例如，烷基、杂烷基)的另外的部分来修饰，所述酰基键例如由氨基酸残基的胺部分形成的酰胺或氨基甲酸酯。
在示例性实施方案中，糖基连接基团具有式I或Ia的结构并且R5包括聚合物修饰基团。在另一个示例性实施方案中，R5既包括聚合物修饰基团又包括将聚合物修饰基团连接于糖基核的连接体L。L可以是直链或支链的结构。类似地，聚合物修饰基团可以是支化的或线性的。
所述聚合物修饰基团包括两个或更多个重复单元，其可以是水溶性的或是基本上不溶于水。用于本发明化合物中的示例性的水溶性聚合物包括PEG(例如，m-PEG)、PPG(例如，m-PPG)、多聚唾液酸、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、可生物降解型聚合物(例如，聚交酯、聚甘油酯)和官能化PEG(例如，末端官能化PEG)。
用于肽缀合物的糖基连接基团的糖基核心选自天然的和非天然的呋喃糖类和吡喃糖类。非天然的糖类任选地在环上包括烷基化或酰基化的羟基和/或胺部分，例如，醚、酯和酰胺取代基。其它非天然糖类包括位于环上位置上的H、羟基、醚、酯或酰胺取代基，在该位置处所述取代基不存在于天然的糖类中。或者，所述碳水化合物缺失在衍生出其名称的碳水化合物中存在的取代基，例如脱氧糖。另外的示例性的非天然糖包括被氧化(例如，-糖酸(-onic)和-糖醛酸(-uronic))和还原的(糖醇)碳水化合物。所述糖部分可以是单糖、寡糖或聚糖。
用作本发明的糖基连接基团的部分的示例性天然糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺、木聚糖(xylanose)、核糖、N-乙酰基葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。
在一个实施方案中，本发明提供包括以下部分的肽缀合物
其中D是选自以下的成员-OH和R1-L-HN-；G是选自以下的成员H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基；R1为包括直链或支化聚(乙二醇)残基的部分；以及L为连接体，例如，键(“零级”)、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基。在示例性实施方案中，在D为OH时，G为R1-L-；在G为-C(O)(C1-C6)烷基时，D为R1-L-NH-。
在另一个方面，本发明提供包括糖基连接基团的肽缀合物，其中所述糖基连接基团连接于所述肽的氨基酸残基，并且其中所述糖基连接基团包括具有选自以下的成员的化学式的唾液酸基(sialyl)连接基团
其中
是修饰基团。R2是选自以下的成员H、CH2OR7、COOR7、COO-和OR7。R7是选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基。R3和R4是独立地选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9。R8和R9独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基和唾液酸基。La为选自以下的连接体键、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基。X5、R16和R17独立地选自非反应性基团和聚合物部分(例如聚(氧化烯烃)、例如，PEG)。非反应性基团包括被认为是基本上无反应性的、中性的和/或在生理学pH下是稳定的基团，例如，H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基等等。示例性的聚合物部分包括在以下式IIIa及其示例中所示的支化结构。本领域技术人员应该理解，这些式中的PEG部分可以用其它聚合物代替。示例性的聚合物包括聚(氧化烯烃)家族的那些。X2和X4是将聚合物部分R16和R17连接于C的独立地被选择的连接片段。下标j为选自1到15的整数。
在另一个示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有下式所示结构
其中下标m和n是独立地选自0到5000的整数。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是独立地选自以下的成员被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有包括下式所示部分的结构
在上式的另一个示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有下式所示的结构
在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约5000的整数，优选约100到约4000，更优选约200到约3000，更优选约300到约2000和更优选约400到约1000。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约70、约70到约150、约150到约250、约250到约375和约375到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约10到约35、约45到约65、约95到约130、约210到约240、约310到约370和约420到约480的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约15到约30的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约50到约65的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约100到约130的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约210到约240的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约310到约370的整数。在示例性实施方案中，m和n为选自约430到约470的整数。在示例性实施方案中，A1和A2各自是选自-OH和-OCH3的成员。
根据这个实施方案的示例性聚合物修饰基团包括以下部分
本发明提供包括糖基连接基团的肽缀合物，其中糖基连接基团连接于肽的氨基酸残基，并且其中糖基连接基团包括下式所示的唾液酸基连接基团
其中
为修饰基团。下标s为选自1到20的整数。下标f为选自1到2500的整数。
Q是选自以下的成员H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基。
在示例性实施方案中，本发明提供下式所示的被修饰的糖
其中R1为聚合物部分；L选自键和连接基团；R2是选自以下的成员H、CH2OR7、COOR7和OR7；R7是选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；R3和R4是独立地选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9；以及R8和R9独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、唾液酸和多聚唾液酸。下标w表示选自1-6的整数，优选为1-3和更优选为1-2。示例性的连接基团包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基部分和唾液酸。连接体的示例性组成部分为酰基部分。
本发明提供形成肽的缀合物的方法。所述方法包括使肽与被修饰的糖供体接触，所述被修饰的糖供体带有与糖共价连接的修饰基团。被修饰的糖部分在酶的作用下从供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上。代表性的酶包括但不限于糖基转移酶，例如，唾液酸转移酶。所述方法包括在适合于将被修饰的糖部分从供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上的条件下使肽与a)被修饰的糖供体；以及b)能够将被修饰的糖部分从被修饰的糖供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上的酶接触，从而合成所述肽缀合物。
在一个优选的实施方案中，在步骤a)之前，使肽与唾液酸酶接触，从而除去肽上的至少一部分唾液酸。
在另一个优选的实施方案中，使肽与唾液酸酶、糖基转移酶和被修饰的糖供体接触。在这个实施方案中，使肽基本上同时地与唾液酸酶、糖基转移酶和被修饰的糖供体相接触，不论各种组分的添加顺序如何。反应在适合于唾液酸酶从肽除去唾液酸残基、以及糖基转移酶将被修饰的糖部分从被修饰的糖供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上的条件下进行。
在另一个优选的实施方案中，脱唾液酸化(desialylation)和缀合在同一容器中进行，并且优选经过脱唾液酸化的肽在缀合步骤之前不经纯化。在另一个示例性实施方案中，所述方法另外包括牵涉肽缀合物的唾液酸化(sialylation)的‘加帽’步骤。这个步骤在包含唾液酸酶、唾液酸转移酶和被修饰的糖供体的相同的反应容器中进行，而不进行事先纯化。
在另一个优选的实施方案中，进行肽的脱唾液酸化，并且将脱唾液酸肽纯化。然后使纯化的脱唾液酸肽经历缀合反应条件。在另一个示例性实施方案中，所述方法另外包括牵涉肽缀合物的唾液酸化的‘加帽’步骤。这个步骤在包含唾液酸酶、唾液酸转移酶和被修饰的糖供体的相同的反应容器中进行，而不进行事先纯化。
在另一个示例性实施方案中，加帽步骤，即肽缀合物的唾液酸化，在包含唾液酸酶、唾液酸转移酶和被修饰的糖供体的相同的反应容器中进行，而不进行事先纯化。
在示例性实施方案中，所述接触时间少于20小时，优选少于16小时，更优选少于12小时，甚至更优选少于8小时和更优选少于4小时。
在另一个方面，本发明提供肽缀合物反应混合物。所述反应混合物包括a)唾液酸酶；b)为选自以下成员的酶糖基转移酶、外切糖苷酶和内切糖苷酶；c)被修饰的糖；以及d)肽。
在另一个示例性实施方案中，唾液酸酶与肽的比选自0.1U/L∶2mg/mL到10U/L∶1mg/mL，优选0.5U/L∶2mg/mL，更优选1.0U/L∶2mg/mL，甚至更优选10U/L∶2mg/mL，还更优选0.1U/L∶1mg/mL，更优选0.5U/L∶1mg/mL，甚至更优选1.0U/L∶1mg/mL和还更优选10U/L∶1mg/mL。
在示例性实施方案中，所述肽缀合物中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％包括至多两个PEG部分。所述PEG部分可以通过一锅烩(one-pot)工艺添加，或者可以在将脱唾液酸肽纯化之后添加它们。
在另一个示例性实施方案中，所述肽缀合物的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％包括至多一个PEG部分。所述PEG部分可以通过一锅烩工艺添加，或者可以在将脱唾液酸肽纯化之后添加它。
在另一个示例性实施方案中，所述方法另外包括“加帽”，或向肽缀合物添加唾液酸。在另一个示例性实施方案中，添加唾液酸酶，随后推迟30分钟、1小时、1.5小时或2小时，然后添加糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶。
在另一个示例性实施方案中，添加唾液酸酶，随后推迟30分钟、1小时、1.5小时或2小时，然后添加糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶。通过以下的详细说明，本发明的其它目的和优点对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在另一个示例性实施方案中，所述方法包括(a)使包括选自以下的糖基基团的肽

以及
其中a为0到10的整数，与下式的被修饰的糖
以及将糖基连接基团转移到所述糖基基团的选自GalNAc、Gal和Sia的成员上的适当的转移酶在适合于所述转移的条件下接触。示例性的被修饰的糖为通过连接体部分用聚合物修饰的CMP-唾液酸，所述聚合物为例如直链或支化聚(乙二醇)部分。上式中的基团与上文中的相同式中发现的那些实质上相同。
所述肽可以从基本上任何来源获得，然而，在一个实施方案中，在如上所述进行修饰之前，所述肽在适合的宿主中进行表达。哺乳动物细胞(例如，BHK、CHO)、细菌细胞(例如，大肠埃希杆菌(E.coli))和昆虫细胞(例如，Sf-9)是提供可用于本文所述组合物和方法中的肽的示例性表达系统。
根据以下的详细说明，对于本领域技术人员而言本发明的其它目的和优点是显而易见的。



图1说明CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的制备。
图2说明用于制备CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的反应条件。
图3说明用于纯化CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的方法。
图4说明用于CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的牵涉Q-琼脂糖的纯化方法。
图5是CMP-唾液酸-甘油PEG 40kD的1H NMR光谱。
图6是提供了可用于形成本发明的糖缀合物的示例性唾液酸转移酶的表格，例如获得带有被修饰的唾液酸的糖PEG化肽。
图7是可以被连接上一个或多个糖基连接基团以提供本发明的肽缀合物的肽的表格。
发明的详细说明和优选实施方案 缩写 PEG，聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰基半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰基葡糖胺基；Man，甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺基；Xyl，木糖基；NeuAc，唾液酸基或N-乙酰基神经氨酰基；Sia，唾液酸基或N-乙酰基神经氨酰基；及其衍生物和类似物。
定义 除非另有说明，否则本文使用的全部的科学术语和技术术语通常具有本发明所属领域内的普通技术人员常规理解的相同含义。通常，本文使用的命名法以及在细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学及杂交中的实验室方法是本领域公知的和常用的。使用标准技术用于核酸和肽的合成。通常，根据本领域的常规方法和各种一般参考文献实施所述技术和程序(一般参见，Sambrook等人，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其作为参考被并入本文)，其在本文中通篇中被提供。本文使用的命名法以及在分析化学中的实验室方法以及如下所述的有机合成是本领域公知的和常用的那些。使用标准技术或其改进用于化学合成和化学分析。
本文所述的所有的寡糖如下进行描述非还原糖类的名称或缩写(即Gal)，接着是糖苷键的构型(α或β)、环键(1或2)、牵涉键的还原糖类的环位置(2、3、4、6或8)，然后是还原糖类的名称或缩写(即GlcNAc)。每种糖类优选是吡喃糖类。对于标准的糖生物学命名法的综述请参见Essentials of Glycobiology，Varki等人编，CSHL Press(1999)。
寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端处的糖类是否实际上是还原糖。根据被认可的命名法，寡糖在本文中被描述为在左侧为非还原端和在右侧为还原端。
术语“唾液酸”或“唾液酸基”是指九碳羧基化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖九碳(nonulo)吡喃糖-1-糖酸(经常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基基团被羟基化。该家族的第三个成员是2-酮-3-脱氧-九碳糖酸(nonulosonicacid)(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。还包括9-取代的唾液酸，诸如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，例如，参见Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。在唾液酸化程序中的唾液酸化合物的合成和使用在1992年10月1日公布的国际申请WO 92/16640中公开。
“肽”是指其中单体是氨基酸并通过酰胺键连在一起的聚合物，或者被称为多肽。另外，还包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。未进行基因编码的氨基酸也可用于本发明中。另外，已经过修饰从而包含反应性基团、糖基化位点、聚合物、治疗性部分、生物分子等的氨基酸也可用于本发明。用于本发明中的所有的氨基酸可以是D-或者L-异构体。L-异构体通常是优选的。另外，其它的肽拟似物(peptidomimetics)也可用于本发明。本文使用的“肽”既指糖基化肽也指非糖基化肽。还包括这样的肽，该肽被表达其的系统不完全糖基化。关于一般性综述，参见，Spatola，A.F.，，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。本发明的一些肽的列表在图7中被提供。
术语“肽缀合物”是指其中如本文所阐述的那样肽与被修饰的糖缀合的本发明的物质。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及在后期被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有被修饰的R基团(例如正亮氨酸)或被修饰的肽骨架，但是仍保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构的化学化合物，但是其以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用。
本文使用的术语“被修饰的糖”或“被修饰的糖残基”是指在本发明的方法中被酶促附加到肽的氨基酸或糖基残基上的天然存在的或非天然存在的碳水化合物。被修饰的糖选自包括但不限于以下的酶底物糖核苷酸类(一、二和三磷酸类)，被活化的糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸化物)和既未活化又不是核苷酸类的糖。“被修饰的糖”用“修饰基团”进行共价官能化。有用的修饰基团包括但不限于PEG部分、治疗性部分、诊断性部分、生物分子等等。修饰基团优选不是天然存在的碳水化合物或未被修饰的碳水化合物。选择用修饰基团进行官能化的位置，以便其不妨碍“被修饰的糖”被酶促附加到肽上。
本文使用的术语“聚合物部分”是指水溶性的或非水溶性的聚合物。术语“水溶性的”是指在水中具有一定的可检测程度的溶解度的部分。用于检测和/或定量水溶性的方法是本领域公知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖类、聚醚、聚胺、聚羧酸等等。肽可以具有由单一氨基酸组成的混合序列例如聚赖氨酸。示例性的多糖是多聚唾液酸。示例性的聚醚是聚乙二醇。聚乙烯亚胺是示例性的聚胺，和聚丙烯酸是代表性的聚羧酸。优选的水溶性聚合物基本上是非荧光的，或者放射如此极微量的荧光从而使得它们在试验中不适合用作荧光标记物。可使用不属于天然存在的糖的聚合物。另外，还涵盖了使用通过共价连接另外的实体(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬氨酸、生物分子、治疗性部分、诊断性部分等等)进行修饰的其它天然存在的糖。术语“水溶性聚合物”还包括诸如以下的物质糖类(例如右旋糖酐、直链淀粉、透明质酸、多聚唾液酸、乙酰肝素、肝素等等)；聚氨基酸，例如聚谷氨酸；核酸；合成聚合物(例如聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇)；肽，蛋白质，等等。代表性的非水溶性的聚合物包括但不限于聚磷嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃(polyalkylene)、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚氧化烯烃、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯类、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸酸异丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、普卢兰尼克(pluronics)和聚乙烯基苯酚，及其共聚物。另外，还涵盖了使用通过共价连接另外的实体(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚天冬氨酸、生物分子、治疗性部分、诊断性部分等等)进行修饰的其它天然存在的糖。在本申请中描述了水溶性的和非水溶性的聚合物的附加实例。
水溶性聚合物的聚合物骨架可以是聚乙二醇(即PEG)。然而，可以理解的是，其它相关聚合物也适用于本发明的实践中并且术语PEG或聚乙二醇在这方面的使用被认为是包含性的而非排它性的。术语PEG包括任何其形式的聚乙二醇，包括烷氧基PEG，双官能PEG，多臂PEG，叉形PEG，支化PEG，有侧链的PEG(即，PEG或相关聚合物具有一个或多个悬垂在聚合物骨架上的官能团)，或其中具有可降解键的PEG。
聚合物可以是线性的或支化的。支化聚合物通常是本领域已知的。代表性地，支化聚合物具有中央的分支核心部分和许多与该中央分支核心相连的线性或支化聚合物链。PEG通常以支化形式被使用，该支化形式可以通过将氧化乙烯附加到各种多元醇诸如甘油、季戊四醇和山梨醇而制备。中央分支部分还可得自若干种氨基酸诸如赖氨酸。支化聚乙二醇可用通式R(-PEG-OH)m表示，其中R代表核心部分诸如甘油或季戊四醇，和m代表臂的数目。多臂型PEG分子诸如在美国专利No.5,932,462(其全文并入本文作为参考)中所述的那些也可用作聚合物骨架。在示例性实施方案中，支化聚合物自身连接于分支部分(例如半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸和赖氨酸的低聚物)。
许多其它的聚合物也可适用于本发明。非肽的和水溶性的、具有约2到约300个连接位点的聚合物骨架特别用于本发明。适当的聚合物的实例包括但不限于其他的聚亚烷基二醇诸如聚丙二醇(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚氧乙基化多元醇，聚烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚α-羟酸，聚乙烯醇，聚磷腈，聚噁唑啉，聚N-丙烯酰基吗啉，诸如在美国专利No.5,629,384(其全文并入本文作为参考)中描述的那些，及其共聚物、三元共聚物和混合物。尽管聚合物骨架的每条链的分子量可以改变，但是其代表性的范围为约100Da到约100,000Da，通常为约6,000Da到约80,000Da。
在对患者给予肽药物的背景下，本文使用的“曲线下面积”或“AUC”被定义为是描述在患者体循环中的药物浓度作为时间(从零到无限大)的函数的曲线下的总面积。
在对患者给予肽药物的背景下，本文使用的术语“半衰期”或“t1/2”被定义为是在患者中药物的血浆浓度减少一半时所需的时间。根据多清除机制、再分布和本领域公知的其它机制而异，存在与肽药物有关的超过一种的半衰期。通常，定义α和β半衰期，使得α相与再分布有关且β相与清除有关。然而，对于在很大程度上被限制在血流中的蛋白药物而言，可存在至少两个清除半衰期。对于一些糖基化肽，快速β相清除可以通过识别末端半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺、甘露糖或岩藻糖的巨噬细胞或内皮细胞上的受体来介导。更慢的β相清除可借助肾对有效半径＜2纳米的分子(约68kD)的肾小球滤过作用和/或在组织内的特异性的或非特异性的摄取和代谢而发生。糖PEG化可以封闭末端糖(例如半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺)并从而借助于识别这些糖的受体阻断快速α相清除。其还可赋予更大的有效半径并从而降低分布体积和组织摄取，从而延长后面的β相。因此，糖PEG化对α相和β相半衰期的精确影响可以根据大小、糖基化状态和本领域公知的其它参数的不同而异。“半衰期”的另外的解释说明参见Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RDSindelar编辑，Harwood Publishers，Amsterdam，pp 101-120)。
本文使用的术语“糖缀合”是指被修饰的糖物质与多肽如本发明的G-CSF肽的氨基酸或糖基残基的由酶促介导的缀合。“糖缀合”的下位概念是“糖-PEG化”，其中被修饰的糖的修饰基团是聚乙二醇、及其烷基衍生物(例如，m-PEG)或反应性衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
术语“大规模”和“工业规模”可互换使用并且是指在单个反应周期完成时产生至少约250毫克，优选至少约500毫克和更优选至少约1克的糖缀合物的反应周期。
本文使用的术语“糖基连接基团”是指共价连接有修饰基团(例如，PEG部分、治疗性部分、生物分子)的糖基残基；糖基连接基团使修饰基团结合于缀合物的其余部分。在本发明的方法中，“糖基连接基团”共价连接于糖基化肽或非糖基化肽，从而将试剂连接于肽上的氨基酸和/或糖基残基上。“糖基连接基团”通常从“被修饰的糖”通过“被修饰的糖”与肽的氨基酸和/或糖基残基的酶促连接衍生得到。糖基连接基团可以是在修饰基团-被修饰的糖盒的形成期间(例如氧化→席夫碱形成→还原)发生降解的糖类衍生结构，或者糖基连接基团可以是未经修饰的。“完整的糖基连接基团”是指从其中将修饰基团连接于缀合物的其余部分的糖类单体不发生降解、例如不被例如偏高碘酸钠氧化的糖基部分衍生得到的连接基团。本发明的“完整的糖基连接基团”可从天然存在的寡糖通过附加一个或多个糖基单元或从母体糖类结构中除去一个或多个糖基单元衍生得到。
本文使用的术语“非糖苷修饰基团”是指不包含直接连接于糖基连接基团的天然存在的糖的修饰基团。
本文使用的术语“靶向部分”是指选择性地定位在身体的特定组织或区域内的部分。该定位通过分子决定簇的特异性识别、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等等来介导。使试剂靶向于特定组织或区域的其它机制是本领域技术人员公知的。示例性的靶向部分包括抗体、抗体片段、铁传递蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等等。
本文使用的“治疗性部分”是指任何可用于治疗的试剂，包括但不限于，抗生素、抗炎药、抗肿瘤药、细胞毒素和放射性试剂。“治疗性部分”包括生物活性试剂的前体药物，其中超过一种的治疗性部分结合于载体的构建体，例如多价试剂。治疗性部分也包括蛋白质和包含蛋白质的构建体。示例性的蛋白质包括但不限于粒细胞集落刺激因子(GCSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，干扰素(例如，干扰素-α、-β、-γ)，白细胞介素(例如，白细胞介素II)，血清蛋白(例如凝血因子VII、VIIa、VIII、IX和X)，人绒毛膜促性腺激素(HCG)，促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)以及抗体融合蛋白(例如肿瘤坏死因子受体((TNFR)/Fc结构域融合蛋白))。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何材料，这些材料当与缀合物组合时保持缀合物的活性并且与受试者的免疫系统无反应性。其实例包括但不限于任何的标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液，和各种类型的湿润剂。其它载体还可包括无菌溶液，包括包衣片剂在内的片剂以及胶囊。代表性地，这种载体包含赋形剂诸如淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油类、树胶、二醇或其它已知的赋形剂。这种载体还可包括用于味道和颜色的添加剂或其它成分。包括这种载体的组合物通过公知的常规方法进行配制。
本文使用的“给予”是指口服给药，作为栓剂给药，局部接触，静脉内，腹膜内，肌肉内，病灶内，鼻内或皮下给药，或者植入缓释装置如迷你渗透泵到受试者。给药通过包括肠胃外和经粘膜(如经口、鼻、阴道、直肠或透皮)在内的任何途径进行。肠胃外给药包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。另外，当注射用于治疗肿瘤如诱导细胞编程性死亡时，可直接给予到肿瘤内和/或肿瘤周围的组织内。其它的递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等等。
术语“改善”是指在治疗包括任何客观或主观参数在内的病理症状或病况中的任何成功的标志，诸如症状的减轻、缓和或减弱，或患者身体或精神状态的改善。症状的改善可以基于客观的或主观的参数；包括身体检查和/或精神病学评价的结果在内。
术语“治疗”是指疾病或病况的“治疗”，包括预防疾病或病况在可能倾向于罹患该疾病但是尚未经历或表现出该疾病的症状的动物中发生(预防性治疗)，抑制疾病(减慢或阻止其进展)，提供疾病的症状或副作用的减轻(包括姑息性治疗)，和减轻疾病(引起疾病消退)。
术语“有效量”或“有效用于...的量”或“治疗有效量”或任何在语法上等同的含义的术语是指当被给予到动物用于治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。
术语“分离的”是指材料，其实质上或基本上与用于制造材料的组分分开。对于本发明的肽缀合物而言，术语“分离的”是指实质上或基本上与在用于制备该肽缀合物的混合物中的常与所述材料伴随的组分分开的材料。“分离的”和“纯的”可互换使用。代表性地，分离的本发明的肽缀合物具有的纯度水平优选用范围来表示。该肽缀合物的纯度范围的下限端值为约60％、约70％或约80％并且该纯度范围的上限端值为约70％、约80％、约90％或高于约90％。
当所述肽缀合物具有高于约90％的纯度时，它们的纯度也优选用范围来表示。该纯度范围的下限端值为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。该纯度范围的上限端值为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。
纯度通过任何被本领域认可的分析方法(例如，在银染色凝胶上的谱带强度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC或类似手段)进行测定。
本文使用的“群体的基本上每个成员”描述了本发明的肽缀合物的群体的特征，其中被附加到肽上的被选定百分数的被修饰的糖被附加到肽上的多个相同的接受体部位上。“群体的基本上每个成员”是指与被修饰的糖缀合的肽上的位点的“均一性”并且是指本发明的具有至少约80％，优选至少约90％和更优选至少约95％均一性的缀合物。
“均一性”是指缀合有被修饰的糖的接受体部分的群体之间的结构一致性。因此，在本发明的肽缀合物中，其中每个被修饰的糖部分缀合于接受体部位上，该接受体部位具有与缀合于每个其它被修饰的糖的接受体部位相同的结构，则该肽缀合物被认为具有约100％的均一性。均一性代表性用范围表示。关于肽缀合物的均一性范围的下限端值为约60％、约70％或约80％并且该均一性范围的上限端值为约70％、约80％、约90％或高于约90％。
当所述肽缀合物具有高于或等于约90％的均一性时，它们的均一性也优选用范围表示。该均一性范围的下限端值为约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限端值为约92％、约94％、约96％、约98％或约100％均一性。肽缀合物的纯度典型地通过本领域技术人员已知的一种或多种方法例如液相色谱法-质谱法(LC-MS)，基质辅助激光解吸附质量飞行时间光谱测定法(MALDITOF)、毛细管电泳等等来测定。
“实质上均一的糖形式”或“实质上均一的糖基化模式”当用来指糖肽物质时，是指通过目的糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)进行糖基化的接受体部分的百分数。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况下，如果实质上全部的(如下文所定义)的Gal β1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化类似物在本发明的肽缀合物中被岩藻糖基化时，则存在实质上均一的岩藻糖基化模式。在本文中所述的岩藻糖基化结构中，Fuc-GlcNAc连接通常是α1，6或α1，3连接，通常优选α1，6连接。本领域技术人员可理解的是，原料可包含糖基化接受体部分(例如岩藻糖基化Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算的百分数糖基化将包括通过本发明方法被糖基化的接受体部分，以及在原料中已发生糖基化的那些接受体部分。
在上述定义“实质上均一的”中的术语“实质上”一般是指对于特定的糖基转移酶而言至少约40％、至少约70％、至少约80％或更优选至少约90％、仍更优选至少约95％的接受体部分被糖基化。
当取代基团用其常规的从左至右书写的化学式进行说明时，它们同样地包括在化学上相同的可从将所述结构从右至左书写而产生的取代基，例如-CH2O-也意在描述-OCH2-。
术语“烷基”，其本身或作为另一个取代基的一部分，除非另有说明，是指直链或支链或环状的烃基团或其组合，其可以是全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可包括二价或多价基团，具有指定的碳原子数(即，C1-C10是指1-10个碳)。饱和烃基团的实例包括但不限于诸如以下的基团甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，其同系物和异构体，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，及其高级同系物和异构体。除非另作说明，否则术语“烷基”还意在包括在下文中更详细定义的烷基的那些衍生物，诸如“杂烷基”。局限于烃基团的烷基被成为“同型烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”，其本身或作为另一个取代基的一部分，是指从烷烃得到的二价基，例如，但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且另外包括在下文中被描述为是“杂亚烷基”的那些基团。代表性地，烷基(或亚烷基)基团含1-24个碳原子，在本发明中优选含10个或更少碳原子的所述基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是指具有更短链的烷基或亚烷基，通常具有8个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫基烷氧基)以其常规含义被使用，并且是指分别借助于氧原子、氨基或硫原子连接于分子的其余部分的那些烷基。
术语“杂烷基”，其单独地或与另外的术语组合时，除非另有说明，是指稳定的直链或支链或环状的烃基团或其组合，由指定数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。一个或多个杂原子O、N和S和Si可位于杂烷基基团的任何内部位置处或位于烷基与分子其余部分连接的位置处。实例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是相邻的，诸如，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”，其本身或作为另一个取代基的一部分时，是指由杂烷基得到的二价基，例如，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子还可占据链的任一终点或两个终点(例如，亚烷基氧基，亚烷基二氧基，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，其中被书写的连接基团的式子的方向并不暗示连接基团的取向。例如，式-C(O)2R’-既代表-C(O)2R’-又代表-R’C(O)2-。
术语“环烷基”和“杂环烷基”，其本身或与其它术语组合时，除非另有说明，分别代表环状形式的“烷基”和“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于，1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。
术语“卤基”或“卤素”，其本身或作为另一个取代基的一部分时，除非另有说明，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语诸如“卤代烷基”意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意指包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
术语“芳基”，除非另有说明，是指多不饱和的、芳香族的取代基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(优选1-3个环)。术语“杂芳基”是指包含1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基基团(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化并且一个或多个氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2，3-二氢苯并[1，4]二氧杂芑(dioxin)-6-基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。以上所述的每个芳基和杂芳基环体系的取代基选自如下所述的可接受的取代基。
为了简便起见，术语“芳基”当与其它术语组合使用时(例如芳基氧基、芳基硫氧基(thioxy)、芳基烷基)包括如上定义的芳基环和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基基团连接于烷基基团的那些基团(例如苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，所述烷基基团包括其中碳原子(例如亚甲基基团)已被例如氧原子置换的那些烷基基团(例如苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-萘基氧基)丙基)等等)。
每一上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意在包括所指基团的被取代形式和未被取代的形式。在下文提供对于每种类型基团的优选的取代基。
对于烷基和杂烷基基团(包括通常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基被统称为“烷基基团取代基”，并且它们可以是选自但不限于以下多种基团中的一种或多种-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，其数目范围从零到(2m’+1)，其中m’是在所述基团中的碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地是指氢、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基例如被1-3个卤素取代的芳基、被取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团或芳基烷基基团。例如，当本发明的化合物包括超过一个的R基团时，独立地选择每个R基团，正如当存在超过一个的R’、R”、R”’和R””基团时独立地选择这些基团中的每一个一样。当R’和R”连接于相同的氮原子时，它们可与氮原子组合形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”意在包括但不局限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述关于取代基的讨论，本领域技术人员可理解，术语“烷基”意在包括这样的基团，该基团包括与氢基团以外的基团连接的碳原子，诸如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
与关于烷基基团所述的取代基类似，用于芳基和杂芳基基团的取代基被统称为“芳基基团取代基”。所述取代基选自例如卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目范围从零到芳环体系上开放价(open valences)的总数；并且其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。例如，当本发明的化合物包括超过一个的R基团时，独立地选择每个R基团，正如当存在超过一个的R’、R”、R”’和R””基团时独立地选择这些基团中的每一个一样。在以下的方案中，符号X代表如上所述的“R”。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CRR’)u-U-的取代基置换，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，并且u是0到3的整数。作为替代，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基置换，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r是1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选地被双键所替代。作为替代，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR’)z-X-(CR”R”’)d-的取代基置换，其中z和d独立地是0到3的整数，且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或被取代的或未被取代的(C1-C6)烷基。
本文使用的术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
本文使用的因子VII肽既是指因子VII肽又是指因子VIIa肽。该术语泛指这些肽的变体和突变体，包括附加、删除、置换和融合蛋白突变体在内。当既使用凝血因子VII又使用凝血因子VIIa时，这一使用意在举例说明“因子VII肽”类别中的两种物质。
本发明意在包括本发明化合物的盐，其根据本文所述化合物上存在的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备而成。当本发明的化合物包含相对酸性的官能度时，可通过使中性形式的这种化合物与足够量的所需碱(其不与其它物质混合或在适当的惰性溶剂中)接触获得碱加成盐。碱加成盐的实例包括钠、钾、锂、钙、铵、有机氨基或镁的盐，或类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能度时，可通过使中性形式的这种化合物与足够量的所需酸(其不与其它物质混合或在适当的惰性溶剂中)接触获得酸加成盐。酸加成盐的实例包括从无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等得到的盐以及从相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、酞酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、枸橼酸、酒石酸、甲磺酸等等得到的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等等的盐(例如，参见，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，Journal of PharmaceuticalScience 661-19(1977))。本发明的某些具体化合物既包含碱性官能度又包括酸性官能度，这使得该化合物被转化为碱或酸加成盐。
优选使盐接触碱或酸并通过常规方式分离母体化合物而再生成中性形式的所述化合物。所述化合物的母体形式在某些物理性质诸如在极性溶剂中的溶解度方面与各种盐形式是不同的。
本文使用的“盐抗衡离子”是指当本发明化合物的部分之一带负电荷(如COO-)时与本发明的化合物结合的带正电荷的离子。盐抗衡离子的实例包括H+、H3O+、铵、钾、钙、锂、镁和钠。
本文使用的术语“CMP-SA-PEG”是与包括聚乙二醇部分的唾液酸相缀合的胞苷一磷酸分子。如果不具体说明聚乙二醇链的长度，则任何PEG链长都是可能的(例如1kD、2kD、5kD、10kD、20kD、30kD、40kD)。示例性CMP-SA-PEG是方案1中的化合物5。
I.引言 为了改善用于治疗性目的的重组肽的有效性，本发明提供了糖基化肽和非糖基化肽与修饰基团的缀合物。修饰基团可以选自聚合物修饰基团诸如例如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等，治疗性部分，诊断性部分，靶向部分等等。肽的修饰，例如用水溶性聚合物修饰基团的修饰，可以改善重组肽在患者循环中的稳定性和保留时间和/或降低重组肽的抗原性。
本发明的肽缀合物可以由被修饰的糖与糖基化肽或非糖基化肽通过酶促连接形成。糖基化位点和/或被修饰的糖基基团为携带修饰基团的被修饰的糖与肽的缀合提供了位点，例如通过糖缀合。
本发明的方法还使得有可能装配具有实质上均一的衍生化模式的肽缀合物和糖肽缀合物。用于本发明的酶通常对于肽的特定氨基酸残基、氨基酸残基的组合、特定的糖基残基或糖基残基的组合具有选择性。该方法还可实际用于肽缀合物的大规模生产。因此，本发明的方法提供了大规模制备具有预先选定的均一的衍生化模式的肽缀合物的实用手段。该方法特别好地适合于修饰治疗性肽，包括但不限于在细胞培养细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物中产生期间被不完全糖基化的糖肽。
本发明还提供了具有增加的治疗半衰期的糖基化和非糖基化肽的缀合物，这是由于例如清除速率降低或由免疫或网状内皮系统(RES)进行的摄取速率降低所导致的。另外，本发明的方法提供了用于掩蔽肽上的抗原决定簇从而降低或消除针对该肽的宿主免疫应答的手段。靶向剂的选择性连接还可用于使肽靶向于对该特定靶向剂特异性的特定的组织或细胞表面受体。
确定用于制备带有水溶性聚合物的肽缀合物的最佳条件例如包括优化许多参数，其取决于肽和水溶性聚合物的同一性。例如，当聚合物是聚乙二醇如支化聚乙二醇时，优选地在反应中所用的聚合物的量和反应混合物的可归因于聚合物的存在的粘度之间建立平衡如果聚合物过于高度浓缩，则反应混合物变得粘稠，减慢了物质转移和反应的速率。
另外，尽管直觉上显然可加入过量的酶，但是本发明人认为，当酶存在太过量时，过量的酶变为污染物，其除去需要额外的纯化步骤和材料并且不必要地增加了最终产物的成本。
另外，通常希望生产出具有受控修饰水平的肽。在有些情况下，希望优先附加一种被修饰的糖。在其它情况中，希望优先附加两种被修饰的糖。因此，优选控制反应条件以影响修饰基团与肽的缀合程度。
本发明提供了使具有所需缀合水平的肽的收率最大化的条件。在本发明的示例性实施方案中的条件也考虑了各种试剂和材料的花费和纯化产物所必需的时间本文所述的反应条件被最佳化以提供优异收率的所需产物，同时使昂贵试剂的浪费最小化。
II.物质/肽缀合物的组成 在第一方面，本发明提供了在被修饰的糖和肽之间的缀合物。本发明还提供了在修饰基团和肽之间的缀合物。肽缀合物可具有若干形式之一。在示例性实施方案中，肽缀合物可以包括肽和通过糖基连接基团与肽的氨基酸连接的修饰基团。在另一个示例性实施方案中，肽缀合物可以包括肽和通过糖基连接基团与肽的糖基残基连接的修饰基团。在另一个示例性实施方案中，肽缀合物可以包括肽和既连接于糖肽碳水化合物又直接连接于肽骨架的氨基酸残基的糖基连接基团。在又一个示例性实施方案中，肽缀合物可以包括肽和直接连接于肽的氨基酸残基的修饰基团。在这一实施方案中，肽缀合物可不包括糖基基团。在这些实施方案中的任一方案中，肽可被糖基化或可不被糖基化。
本发明的缀合物代表性地对应于以下通式
其中符号a、b、c、d和s代表正的非零整数；以及t是0或正整数。“试剂”或修饰基团可以是治疗剂，生物活性物质，可检测标记物，聚合物修饰基团诸如水溶性聚合物(例如，PEG，m-PEG，PPG和m-PPG)等等。“试剂”或修饰基团可以是肽，例如酶、抗体、抗原等等。连接体可以是下文所述的广泛系列连接基团中的任一种。作为替代，连接体可以是单键或“零级连接体”。
II.A.肽 在肽缀合物中的肽是选自图7中所示的肽的成员。在这些情况下，在肽缀合物中的肽是选自以下的成员骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神经营养蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生长分化因子(例如，GDF-5)，神经胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)，脑产生的神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，冯·维勒布兰德氏因子(vWF)蛋白酶，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，B-结构域缺失的因子VIII，具有全长因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，具有B-结构域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，红细胞生成素(EPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素α、干扰素β、干扰素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制剂，葡糖脑苷脂酶，组织型血纤维蛋白溶解酶原活化剂(TPA)，白细胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脱氧核糖核酸酶，胰岛素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生长激素，TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2单克隆抗体(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的单克隆抗体(SynagisTM)，TNF-α的单克隆抗体(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(ReoproTM)，CD20的单克隆抗体(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α单克隆抗体，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，胰高血糖素样肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纤维细胞生长因子。在某些实施方案中，在肽缀合物中的肽是凝血因子VIII。在其它实施方案中，在肽缀合物中的肽是干扰素α。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有包括下式所示部分的结构
在示例性实施方案中，m和n是独立地选自以下的整数约1到约5000，优选约100到约4000，更优选约200到约3000，更优选约300到约2000，和更优选约400到约1000。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自以下的整数约1到约500。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自以下的整数约1到约70、约70到约150、约150到约250、约250到约375和约375到约500。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自以下的整数约10到约35、约45到约65、约95到约130、约210到约240、约310到约370和约420到约480。在示例性实施方案中，m和n是选自约15到约30的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约50到约65的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约100到约130的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约210到约240的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约310到约370的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约430到约470的整数。在示例性实施方案中，A1和A2各自是选自-OH和-OCH3的成员。
根据本实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下所示部分
在示例性实施方案中，其中修饰基团是支化水溶性聚合物诸如如上所述的那些，通常优选唾液酸酶的浓度是反应混合物的约1.5到约2.5U/L。更优选唾液酸酶的量是约2U/L。
在另一个示例性实施方案中，约5到约9克的肽底物接触上述量的唾液酸酶。
被修饰的糖以约1克到约6克，优选约3克到约4克的量存在于反应混合物中。通常优选保持具有支化水溶性聚合物修饰部分例如如上所示部分的被修饰的糖的浓度低于约0.5mM。
在某些实施方案中，修饰基团是支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇，具有的分子量为约20kD到约60kD，更优选约30kD到约50kD，和甚至更优选约40kD。在其它实施方案中，修饰基团是支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇，具有的分子量为至少约80kD，优选至少约100kD，更优选至少约120kD，至少约140kD或至少约160kD。在又一个实施方案中，支化聚氧化烯烃例如聚乙二醇为至少约200kD，诸如至少约80kD到至少约200kD，包括至少约160kD和至少约180kD在内。正如本领域技术人员可理解的，聚合物的分子量常常是多分散性的，因此，在分子量背景下的措词“约”优选包括在所述数值左右的一定范围内的值。例如，优选的具有约40kD分子量的修饰基团是具有约35kD到约45kD的分子量的修饰基团。本领域技术人员可理解的是，对如上所述的支化PEG结构的引述仅仅是用于清楚示例的目的，PEG可以被实质上任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于那些在本文所述的“聚合物部分”的定义中阐述的那些物质。
关于糖基转移酶的浓度，在本发明的使用如上所述的修饰基团的优选方案中，糖基转移酶肽的比为约40μg/mL转移酶约200μM肽。
II.B.被修饰的糖 在示例性实施方案中，本发明的肽，诸如凝血因子VIII，干扰素α和图7中所列举的肽，与被修饰的糖反应，从而形成肽缀合物。被修饰的糖包括“糖供体部分”以及“糖转移部分”。糖供体部分是被修饰的糖的通过糖基部分或氨基酸部分连接于肽以形成本发明的缀合物的任何部分。糖供体部分包括那些原子，这些原子在其从被修饰的糖转移到肽缀合物的糖基连接基团期间发生化学变化。糖转移部分是被修饰的糖的不连接于肽形成本发明的缀合物的任何部分。例如，本发明的被修饰的糖是PEG化糖核苷酸、PEG-唾液酸CMP。对于PEG-唾液酸CMP，糖供体部分或PEG唾液酸基供体部分包括PEG-唾液酸，而糖转移部分或唾液酸基转移部分包括CMP。
在本发明的被修饰的糖中，糖基部分优选是糖类、脱氧糖类、氨基糖类或N-酰基糖类。术语“糖类”及其等同术语“糖基(saccharyl)”、“糖”和“糖基(glycosyl)”是指单体、二聚物、低聚物和聚合物。糖部分还可被修饰基团进行官能化。修饰基团典型地通过与糖上的胺、巯基或羟基部分例如伯羟基部分缀合而缀合于糖基部分上。在示例性实施方案中，修饰基团通过糖上的胺部分例如通过在胺与修饰基团的反应性衍生物进行反应期间形成的酰胺、氨基甲酸酯或脲进行连接。
任何糖基部分可被用作被修饰的糖的糖供体部分。糖基部分可以是已知的糖例如甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或具有已知糖的立体化学的物质。这些被修饰的糖的通式为

以及
可用于形成本发明的组分的其它糖基部分包括但不限于岩藻糖和唾液酸，以及氨基糖类例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺类似物等等。糖基部分可以是在自然界中存在的结构或者其可以经过修饰以提供用于缀合修饰基团的部位。例如，在一个实施方案中，被修饰的糖提供了其中9-羟基部分被胺置换的唾液酸衍生物。胺容易地被所选择的修饰基团的活化类似物所衍生化。
本发明的被修饰的糖的实例在PCT专利申请No.PCT/US05/002522中被描述，其作为参考并入本文。
在另一个示例性实施方案中，本发明采用的被修饰的糖中的6-羟基位置被转化为相应的胺部分，其携带如上文所述的那些连接体-修饰基团盒。可被用作为这些被修饰的糖的核心的示例性糖基基团包括Glu、Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等等。根据这一实施方案的代表性的被修饰的糖如下式所示
其中R11-R14是独立地选自H、OH、C(O)CH3、NH和NH C(O)CH3的成员。R10是与另一个糖基残基(-O-糖基)或与凝血因子VII/凝血因子VIIa肽(-NH-(凝血因子VII/凝血因子VIIa))的氨基酸连接的连接体。R14是OR1、NHR1或NH-L-R1。R1和NH-L-R1的定义如上所述。
II.C.糖基连接基团 在示例性实施方案中，本发明提供了在本发明的被修饰的糖与肽之间形成的肽缀合物。在另一个示例性实施方案中，当被修饰的糖上的修饰基团包括以下部分时
在肽缀合物中的肽是选自图7中所示的肽中的成员。在又一个示例性实施方案中，在肽缀合物中的肽是选自以下的成员骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神经营养蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生长分化因子(例如，GDF-5)，神经胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)，脑产生的神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，冯·维勒布兰德氏因子(vWF)蛋白酶，凝血因子VIII，凝血因子VIIa，凝血因子VII，凝血因子IX，凝血因子X，凝血因子XI，B-结构域缺失的凝血因子VIII，具有全长凝血因子VIII的vWF-凝血因子VIII融合蛋白，具有B-结构域缺失的凝血因子VIII的vWF-凝血因子VIII融合蛋白，红细胞生成素(EPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素α、干扰素β、干扰素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制剂，葡糖脑苷脂酶，组织型血纤维蛋白溶解酶原活化剂(TPA)，白细胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脱氧核糖核酸酶，胰岛素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生长激素，TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2单克隆抗体(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的单克隆抗体(SynagisTM)，TNF-α的单克隆抗体(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(ReoproTM)，CD20的单克隆抗体(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α单克隆抗体，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，胰高血糖素样肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纤维细胞生长因子。在某些实施方案中，所述肽是凝血因子VIII或干扰素α。在这一实施方案中，被修饰的糖的糖供体部分(例如糖基部分和修饰基团)变成“糖基连接基团”。“糖基连接基团”可替代地被称作糖基部分，其被插入在肽和修饰基团之间。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团包括具有下式所示结构的部分
在示例性实施方案中被修饰的糖上的修饰基团包括以下所示部分
在示例性实施方案中，A1和A2各自是选自-OH和-OCH3的成员。
根据这一实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下所示的部分
正如本领域技术人员可容易理解的，在上面所示的每一结构中的PEG部分可以被任何其它聚合物部分所代替，所述任何其它聚合物部分包括但不限于在本文中被定义为“聚合物部分”的那些物质。
由于可用于附加和/或修饰肽上的糖基残基的方法的多样性，糖基连接基团可以实质上具有任何结构。在下面的讨论中，通过参考被选择的呋喃糖和吡喃糖的衍生物的使用来对本发明进行说明。本领域技术人员可以理解的是，该讨论的焦点是用于清楚示例的目的，并且所述的结构和组分通常适用于所有类别的糖基连接基团和被修饰的糖。糖基连接基团可实际上包括任何的单糖或寡糖。糖基连接基团可以通过侧链或者通过肽骨架连接于氨基酸。作为替代，糖基连接基团可以通过糖基部分连接于肽。该糖基部分可以是肽上的O-连接的或N-连接的聚糖结构的一部分。
在示例性实施方案中，本发明提供肽缀合物，其包括完整的糖基连接基团，该基团具有选自以下所示的式子


以及
在式I和Ia中，R2是H、CH2OR7、COOR7或OR7，其中R7代表H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基。当COOR7是羧酸或羧酸根时，两种形式都由单个结构COO-或COOH的命名来表示。在式I、Ia、II或IIa中，符号R3、R4、R5、R6和R6’独立地表示H、被取代的或未被取代的烷基、OR8、NHC(O)R9。下标d是0或1。R8和R9独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、唾液酸或多聚唾液酸。R3、R4、R5、R6或R6’中至少之一包括修饰基团。该修饰基团可以是聚合物修饰部分，例如通过键或连接基团连接的PEG。在示例性实施方案中，R6和R6’与它们所连接的碳一起是唾液酸的pyruvyl侧链的组分。在另一个示例性实施方案中，pyruvyl侧链被聚合物修饰基团官能化。在另一个示例性实施方案中，R6和R6’与它们所连接的碳一起是唾液酸的侧链的组分并且聚合物修饰基团是R5的部分。
在示例性实施方案中，本发明采用了下式所示的糖基连接基团
其中J是糖基部分，L是键或连接体和R1是修饰基团，例如聚合物修饰基团。示例性的键是在糖基部分上的NH2部分与修饰基团上的具有互补反应活性的基团之间形成的那些。例如，当R1包括羧酸部分时，该部分可被活化并与糖基残基上的NH2部分连接，产生具有结构NHC(O)R1的键。J优选是这样的糖基部分，该糖基部分是“完整的”，没有因为暴露于使吡喃糖或呋喃糖结构裂解的条件下例如氧化条件例如高碘酸钠条件下而发生降解。
示例性的连接体包括烷基和杂烷基部分。连接体包括连接基团，例如基于酰基的连接基团，例如，-C(O)NH-、-OC(O)NH-等等。连接基团是在本发明的物质的组分之间形成的键，例如在糖基部分和连接体(L)之间或在连接体和修饰基团(R1)之间形成的键。其它示例性的连接基团是醚、硫醚和胺。例如，在一个实施方案中，连接体是氨基酸残基，诸如甘氨酸残基。甘氨酸的羧酸部分通过与糖基残基上的胺反应被转化为相应的酰胺，并且甘氨酸的胺通过与修饰基团的被活化的羧酸或碳酸酯反应被转化为相应的酰胺或氨基甲酸酯。
NH-L-R1的示例性物质具有下式 -NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中下标s和t独立地是0或1。下标a、b和d独立地是0到20的整数，和c是1到2500的整数。其它类似的连接体基于其中-NH部分被另一个基团例如-S、-O或-CH2替代的物质。本领域技术人员可理解的是，对应于下标s和t的括号内部分中的一种或多种可被替换为被取代的或未被取代的烷基或杂烷基部分。
更具体地说，本发明采用了其中NH-L-R1是以下结构的化合物NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)O(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1。在这些式中，下标a、b和d独立地选自0到20，优选1到5的整数。下标c是1到约2500的整数。
在示例性实施方案中，选择c从而使得PEG部分的分子量为约1kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD或45kD。
为了方便目的，在本节其余处的糖基连接基团基于唾液酸基部分。然而，本领域技术人员可理解其它的糖基部分例如甘露糖基、半乳糖苷、葡糖基或藻岩糖基可代替唾液酸基部分被使用。
在示例性实施方案中，糖基连接基团是完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的一个或多个糖基部分不被化学(例如，偏高碘酸钠)或酶促(例如，氧化酶)过程所降解。被选择的本发明的缀合物包括连接于氨基糖类例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等的胺部分的修饰基团。根据该模体的示例性的修饰基团-完整的糖基连接基团盒基于唾液酸结构，诸如具有下式的那些

以及
在上式中，R1和L的定义如上所述。关于示例性的R1基团的结构的另外的细节在下文被提供。
在又一个示例性的实施方案中，缀合物在肽和被修饰的糖之间形成，其中修饰基团通过在被修饰的糖的6-碳位置处的连接体进行连接。因此，根据这一实施方案的示例性的糖基连接基团具有下式
其中各基团如上文所讨论。糖基连接基团包括但不限于葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、甘露糖、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺等等。
在一个实施方案中，本发明提供了包括以下糖基连接基团的肽缀合物
其中D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自H和R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成员；R1是包括直链或支化聚乙二醇残基的部分；以及L是连接体，例如键(“零级”)、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基。在示例性实施方案中，当D是OH时G是R1-L-，和当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
在一个实施方案中，本发明提供了包括以下糖基连接基团的肽缀合物
D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成员；R1是包括选自直链聚乙二醇残基和支化聚乙二醇残基的成员的部分；以及M是选自H、盐抗衡离子和单个负电荷的成员；L是连接体，其是选自键、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基的成员。在示例性实施方案中，当D是OH时，G是R1-L-。在另一个示例性实施方案中，当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
在本发明的任何化合物中，COOH基团可以替代地是COOM，其中M是选自H、负电荷和盐抗衡离子的成员。
本发明提供了包括下式的糖基连接基团的肽缀合物
其中D和G的定义如上所述。
在其它实施方案中，糖基连接基团如下式所示
其中D和G如上所述且下标t是0或1。
在又一个示例性实施方案中，糖基连接基团如下式所示
其中D和G如上所述且下标t是0或1。
在又一个实施方案中，糖基连接基团如下式所示
其中D和G如上所述且下标p代表1到10的整数；以及a是0或1。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括选自下式所示的糖基部分














以及
其中下标a和连接体La如上文所讨论。下标p是1到10的整数。下标t和a独立地选自0或1。这些基团中的每一个可以作为如上所述的单-、二-、三-和四-触角糖类结构的组分被包括。AA是肽的氨基酸残基。本领域技术人员可理解的在这些式中的PEG部分可以被其它的无反应性基团和聚合物部分所替代。示例性的聚合物包括聚氧化烯烃家族的那些。无反应性基团包括被认为在生理学pH条件下基本上是无反应性的、中性的和/或稳定的的那些基团，例如为H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基等等。示例性的聚合物部分包括在下式IIIa及其示例中所示的支化结构。
在示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约20kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约5kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约10kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约40kD。在其它实施方案中，修饰基团是支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇，具有的分子量为至少约80kD，优选至少约100kD，更优选至少约120kD、至少约140kD或至少约160kD。在又一个实施方案中，支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇具有的分子量为至少约200kD，诸如至少约80kD到至少约200kD，包括至少约160kD和至少约180kD。在示例性实施方案中，支化聚合物自身连接于支化部分(例如，半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸和赖氨酸的低聚物)。
在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-10kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团是基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-10kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-10kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-10kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-5kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个、两个或三个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-5kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个、两个或三个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于半胱氨酸残基的支化SA-PEG-40kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是基于赖氨酸残基的支化SA-PEG-40kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括选自下式所示的糖基部分


以及
其中R2、R3、R4、R5或R6中至少之一具有作为选自以下的成员的结构
其中各变量的定义如上所述。本领域技术人员可以理解的是，如上所述的支化PEG结构仅仅用于清楚示例的目的，PEG可以实质上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物部分”的定义中所述的那些物质。
在示例性实施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中至少之一具有下式所示的结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
根据这一实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括
在示例性实施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中仅有一个具有包括如上描述的修饰基团的结构。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括选自下式所示的糖基部分


以及
其中R2、R3、R4、R5或R6的定义如上所述。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括选自下式所示的糖基部分


以及
其中L-(R1)w是选自以下的成员
其中各变量的定义如上所述。
在示例性实施方案中，L-(R1)w具有下式所示结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
根据这一实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括
在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约1000的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约70、约70到约150、约150到约250、约250到约375和约375到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约10到约35、约45到约65、约95到约130、约210到约240、约310到约370和约420到约480的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约15到约30的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约50到约65的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约100到约130的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约210到约240的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约310到约370的整数。在示例性实施方案中，m和n是选自约430到约470的整数。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括选自下式所示的糖基部分


以及
其中各变量的定义如上所述。
在另一个示例性实施方案中，根据这一实施方案的物质包括



以及
其中各变量如上文所讨论。
在示例性实施方案中，本发明的糖PEG化肽缀合物选自下式

以及
其中各变量的定义如上所述。
在上式中，下标t是0到1的整数，和下标p是1到10的整数。符号R15’表示H，OH(例如，Gal-OH)，唾液酸基部分，唾液酸基连接基团(即，唾液酸基连接基团-聚合物修饰基团(Sia-L-R1)，或连接有聚合物修饰的唾液酸基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”))，半乳糖基部分，半乳糖基连接基团(即，半乳糖基连接基团-聚合物修饰基团(Gal-L-R1)，或连接有聚合物修饰的半乳糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Gal-L-R1)(“Sia-Galp”))，半乳糖胺基部分，半乳糖胺基连接基团(即，半乳糖胺基连接基团-聚合物修饰基团(GalNAc-L-R1)，或连接有聚合物修饰的半乳糖胺基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-GalNAc-L-R1)(“Sia-GalNAcp”))，葡萄糖基部分，葡萄糖基连接基团(即，葡萄糖基连接基团-聚合物修饰基团(Glc-L-R1)，或连接有聚合物修饰的葡萄糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Glc-L-R1)(“Sia-Glcp”))，葡糖胺基部分，葡糖胺基连接基团(即，葡糖胺基连接基团-聚合物修饰基团(GlcNAc-L-R1)，或连接有聚合物修饰的葡糖胺基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-GlcNAc-L-R1)(“Sia-GlcNAcp”))，甘露糖基部分，甘露糖基连接基团(即，甘露糖基连接基团-聚合物修饰基团(Man-L-R1)，或连接有聚合物修饰的甘露糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Man-L-R1)(“Sia-Manp”))，岩藻糖基部分，岩藻糖基连接基团(即，岩藻糖基连接基团-聚合物修饰基团(Fuc-L-R1)，或连接有聚合物修饰的岩藻糖基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Fuc-L-R1)(“Sia-Fucp”))。示例性的聚合物修饰的糖基部分具有式I、Ia、II或IIa所示的结构。本发明的示例性的肽缀合物包括至少一个聚糖，该聚糖具有R15’，R15’包括式I、Ia、II和IIa所示的结构。式I、Ia、II或IIa的具有开放价的氧优选通过糖苷键连接于Gal或GalNAc部分的碳上。在另一个示例性实施方案中，氧连接于在半乳糖残基的3位处的碳上。在示例性实施方案中，被修饰的唾液酸以α2，3-连接于半乳糖残基上。在另一个示例性实施方案中，唾液酸以α2，6-连接于半乳糖残基上。
在示例性实施方案中，唾液酸基连接基团是连接有聚合物修饰的唾液酸基部分的唾液酸基部分(例如，Sia-Sia-L-R1)(“Sia-Siap”)。这里，糖基连接基团通过唾液酸基部分连接于半乳糖基部分
根据这一模体的示例性物质通过采用形成Sia-Sia键的酶例如CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV将Sia-L-R1缀合于聚糖的末端唾液酸上而制备。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物上的聚糖具有选自以下所述的式结构

以及
及其组合。
在上式各式中，R15’如上文所讨论。另外，本发明的示例性的肽缀合物包括至少一个聚糖，该聚糖具有R15部分，该R15部分具有式I、Ia、II或IIa所示的结构。
在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团包括至少一个下式所示的糖基连接基团

以及
其中R15是所述的唾液酸基连接基团；以及下标p是选自1到10的整数。
在示例性实施方案中，糖基连接部分具有下式结构
其中b是0-1的整数。下标s表示1-10的整数；以及下标f表示1到2500的整数。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团是PEG。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约20kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约5kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约10kD。在另一个示例性实施方案中，PEG部分的分子量为约40kD。在另外的实施方案中，修饰基团是支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇，具有的分子量为至少约80kD，优选至少约100kD，更优选至少约120kD、至少约140kD或至少约160kD。在又一个实施方案中，支化聚氧化烯烃，例如聚乙二醇具有的分子量为至少约200kD，例如至少约80kD到至少约200kD，包括至少约160kD和至少约180kD。
在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性SA-PEG-10kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团是线性SA-PEG-20kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性SA-PEG-5kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个、两个或三个共价连接于肽。在示例性实施方案中，糖基连接基团是线性SA-PEG-40kD部分，并且这些糖基连接基团中的一个或两个共价连接于肽。
在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团是具有下式的唾液酸基连接基团
在另一个示例性实施方案中，Q是选自H和CH3的成员。在另一个示例性实施方案中，其中所述糖基连接基团具有下述结构

以及
其中R15是所述的唾液酸基连接基团；以及下标p是选自1到10的整数。在示例性实施方案中，糖基连接基团包括下式结构
其中下标b是选自0和1的整数。在示例性实施方案中，下标s是1；以及下标f是选自约200到约300的整数。
II.D.修饰基团 本发明的肽缀合物包括修饰基团。该基团可以通过氨基酸或糖基连接基团共价连接于肽。在另一个示例性实施方案中，当修饰基团包括以下所示的部分时
在肽缀合物中的肽是选自图7中所示的肽中的成员。在另一个示例性实施方案中，在肽缀合物中的肽是选自如下物质的成员骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)，神经营养蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)，生长分化因子(例如，GDF-5)，神经胶质细胞系产生的神经营养因子(GDNF)，脑产生的神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，冯·维勒布兰德氏因子(vWF)蛋白酶，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，因子X，因子XI，B-结构域缺失的因子VIII，具有全长因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，具有B-结构域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白，红细胞生成素(EPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素α、干扰素β、干扰素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制剂)，葡糖脑苷脂酶，组织型血纤维蛋白溶解酶原活化剂(TPA)，白细胞介素-2(IL-2)，尿激酶，人脱氧核糖核酸酶，胰岛素，乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)，人生长激素，TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(EnbrelTM)，抗-HER2单克隆抗体(HerceptinTM)，呼吸道合胞病毒的蛋白F的单克隆抗体(SynagisTM)，TNF-α的单克隆抗体(RemicadeTM)，糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(ReoproTM)，CD20的单克隆抗体(RituxanTM)，抗凝血酶III(AT III)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)，α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)，促卵泡激素，β-葡糖苷酶，抗-TNF-α单克隆抗体，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，胰高血糖素样肽-2(GLP-2)，β-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶A和成纤维细胞生长因子。“修饰基团”可以包括许多结构，包括靶向部分、治疗性部分、生物分子在内。另外，“修饰基团”包括聚合物修饰基团，其是可以改变肽的性质例如改变其生物利用度或其体内半衰期的聚合物。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有包括下式所示的部分的结构
在根据上式的另一个示例性实施方案中，聚合物修饰基团包括下式所示的部分
在示例性实施方案中，A1和A2各自是选自-OH和-OCH3的成员。
根据这个实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下部分
为了方便起见，在本节其余处的修饰基团将主要地基于聚合物修饰基团例如水溶性聚合物和非水溶性聚合物。然而，本领域技术人员可以理解的是，其它修饰基团，例如靶向部分、治疗性部分和生物分子，可代替聚合物修饰基团被使用。另外，本领域技术人员可以理解的是，如上所述的支化PEG结构仅仅用于清楚示例的目的，PEG可以实质上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物”的定义中所述的那些部分。
II.D.i.修饰基团的连接体 修饰基团的连接体用来将修饰基团(即，聚合物修饰基团、靶向部分、治疗性部分和生物分子)连接到肽。在示例性实施方案中，聚合物修饰基团连接于糖基连接基团，通常通过核心上的杂原子例如氮通过连接体L进行连接，如下所示
R1是聚合物部分和L选自键和连接基团。下标w代表选自1-6，优选1-3和更优选1-2的整数。示例性的连接基团包括被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基部分和唾液酸。连接体的示例性组成部分是酰基部分。
本发明的示例性化合物具有以上式I、Ia、II或IIa的结构，其中R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一个具有下式结构
在根据这一实施方案的另一个实施例中，R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的至少一个具有下式结构
其中s是0到20的整数和R1是线性聚合物修饰部分。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团-连接体构建体是支化结构，其包括连接于中央部分的两个或更多个聚合物链。在这一实施方案中，所述构建体具有下式结构
其中R1和L如上文所讨论，并且w’是2到6，优选2到4和更优选2到3的整数。
当L是键时，该键在R1的前体上的反应性官能团与糖基核心上的具有互补反应活性的反应性官能团之间形成。当L是非零级连接体时，在与R1前体反应之前L的前体可以位于糖基部分上。或者，R1和L的前体可以被合并成预先形成的盒，该预先形成的盒随后连接于糖基部分。如本文所述的，具有适当的反应性官能团的前体的选择和制备在本领域技术人员的能力范围内。另外，前体的偶联通过本领域公知的化学法进行。
在示例性实施方案中，L是从提供被修饰的糖的氨基酸或小肽(例如，1-4个氨基酸残基)形成的连接基团，其中聚合物修饰基团通过被取代的烷基连接体连接。示例性的连接体包括甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和半胱氨酸，PEG部分可以通过酰胺或氨基甲酸酯键连接于连接体的胺部分。PEG分别通过硫醚键或醚键连接于半胱氨酸和丝氨酸的硫或氧原子。
在示例性实施方案中，R5包括聚合物修饰基团。在另一个示例性实施方案中，R5既包括聚合物修饰基团又包括将修饰基团连接于分子的其余部分的连接体L。如上文所讨论，L可以是线性或支化结构。类似地，聚合物修饰基团可以是支化的或线性的。
II.D.ii.水溶性聚合物 许多水溶性聚合物是本领域技术人员公知的那些并且可用于实践本发明。术语水溶性聚合物包括诸如以下的物质糖类(例如，右旋糖酐、直链淀粉、透明质酸、多聚唾液酸、乙酰肝素、肝素等等)；聚氨基酸，例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸；核酸；合成聚合物(例如，聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇；肽，蛋白质等等。本发明可使用具有唯一限制的任何水溶性聚合物进行实践，所述限制是该聚合物必须包括点，在该点处可以连接缀合物的其余部分。
用于聚合物活化的方法还可见于WO 94/17039，美国专利No.5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，美国专利No.5,219,564，美国专利No.5,122,614，WO 90/13540，美国专利No.5,281,698，还有WO 93/15189，用于在被活化的聚合物与肽之间进行缀合的方法，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、携氧分子(美国专利No.4,412,989)、核糖核酸酶和过氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
示例性的水溶性聚合物是其中在聚合物样品中相当比例的聚合物分子具有大约相同的分子量的那些；这种聚合物是“均一分散”的。
另外参考聚乙二醇缀合物举例说明本发明。可以获得关于PEG的官能化和缀合的几篇综述和专题论文。例如，参见，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；以及Bhadra，等人，Pharmazie，575-29(2002)。制备反应性PEG分子和使用该反应性分子形成缀合物的路线是本领域是已知的。例如，美国专利No.5,672,662公开了选自线性的或支化的聚氧化烯烃、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇和聚丙烯酰基吗啉的聚合物酸的活性酯的水溶性的和可分离的缀合物。
美国专利No.6,376,604阐述了用于制备水溶性的非肽聚合物的水溶性的1-苯并三唑基碳酸酯的方法，通过在有机溶剂中使聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑基)碳酸酯反应进行。该活性酯用于与生物活性剂例如蛋白质或肽形成缀合物。
WO 99/45964描述了包括生物活性剂和被活化的水溶性聚合物的缀合物，所述活化的水溶性聚合物包括具有至少一个末端的聚合物骨架，所述端点通过稳定的键与聚合物骨架连接，其中的至少一个末端包括支化部分，该支化部分具有与支化部分连接的近端活性基团，其中生物活性剂连接于近端活性基团中的至少一个上。其它的支化聚乙二醇描述在WO 96/21469中，美国专利No.5,932,462描述了与支化PEG分子形成的缀合物，所述支化PEG分子包括包含反应性官能团的支化末端。游离的活性基团可以用来与生物学活性物质诸如蛋白质或肽反应，在聚乙二醇与生物学活性物质之间形成缀合物。美国专利No.5,446,090描述了双官能PEG连接体及其在形成在每一PEG连接体末端具有肽的缀合物中的用途。
包括可降解型PEG键的缀合物描述在WO 99/34833中；以及WO99/14259以及美国专利No.6,348,558中。这种可降解的键适用于本发明。
如上所述的本领域公认的聚合物活化方法在本发明的背景下用于本文所述的支化聚合物的形成以及用于这些支化聚合物与其它物质如糖、糖核苷酸等等的缀合。
示例性的水溶性聚合物是聚乙二醇，例如甲氧基-聚乙二醇。用于本发明的聚乙二醇不受限于任何特定形式或分子量范围限制。对于非分支聚乙二醇分子而言，分子量优选为500到100,000。优选使用2000-60,000的分子量，优选约5,000到约40,000的分子量。
II.D.iii.支化水溶性聚合物 在另一个实施方案中，聚合物修饰部分是支化PEG结构，其具有超过一个的被连接的线性或支化的PEG部分。支化PEG的实例描述在以下文献中美国专利No.5,932,462；美国专利No.5,342,940；美国专利No.5,643,575；美国专利No.5,919,455；美国专利No.6,113,906；美国专利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，BioconjugateChemistry 5283-288(1994)；以及Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。
代表性的聚合物修饰部分包括基于包含侧链的氨基酸例如丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸和小肽例如lys-lys的结构。在一些实施方案中，聚合物修饰部分是基于寡肽例如三赖氨酸肽的支化PEG部分。适合使用的示例性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸和丝氨酸。在这种实施方案中，连接于肽结构的每个聚合物亚单元可以是线性PEG部分或支化PEG部分。例如，三赖氨酸可以是用线性PEG部分、支化PEG部分或线性和支化PEG部分的组合进行单-、二-、三-或四-PEG化。示例性的支化结构包括以下部分

本领域技术人员可以理解的是，在二赖氨酸结构中的游离胺还可通过酰胺或氨基甲酸酯键用线性PEG部分或者支化PEG部分进行PEG化。
本领域技术人员可以理解的是，除了上面所示的线性PEG结构之外，在前述章节中示例说明的支化聚合物还可连接于支化部分(例如，半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸和赖氨酸的低聚物)上而不是连接于一个或多个线性PEG结构上。另外，本领域技术人员可以理解的是，如上所述的PEG结构仅仅用于清楚示例的目的，PEG可以实质上被任何聚合物部分所替代，所述任何聚合物部分包括但不限于在本文的“聚合物部分”的定义中所述的那些部分。
具有任何分子量例如1kD、2kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD和45kD的PEG可用于本发明。具有更大分子量的PEG也可用于本发明，所述更大分子量包括最高约200kD，例如至少约180kD、约160kD、约140kD、约120kD、约100kD、约90kD、约80kD和约70kD。在某些实施方案中，PEG的分子量为约80kD。在另外的实施方案中，PEG的分子量为至少约200kD、至少约180kD、至少约160kD或至少约140kD。
支化聚合物修饰部分的每个PEG部分可具有如上定义的分子量，或者聚合物修饰部分中所有PEG部分的总的分子量可以如上定义。例如，在某些实施方案中，支化聚合物修饰部分的每个PEG部分的分子量可为约80kD或聚合物修饰部分中所有PEG部分的总的分子量可为约80kD。同样地，在某些实施方案中，支化聚合物修饰部分的每个PEG部分的分子量可为约200kD或聚合物修饰部分中所有PEG部分的总的分子量可为约200kD。
根据这一实施方案的示例性物质具有下式结构

以及
其中下标e、f和f’独立地选自1到2500的整数；以及下标q、q’和q”独立地选自1到20的整数。
本领域技术人员可理解的是，可用于本发明的支化聚合物包括对上述主题进行的各种变化。例如，如上所示的二赖氨酸-PEG缀合物可以包括三种聚合物亚单元，键合于α-胺的在上述结构中显示为未经修饰的第三种。类似地，以所需方式用聚合物修饰部分标记的三种或四种聚合物亚单元进行官能化的三赖氨酸的使用也在本发明的范围内。
正如本文的讨论，在本发明的缀合物中使用的PEG可以是线性的或支化的。用于形成根据本发明这一实施方案的包含支化PEG的肽缀合物的示例性前体具有下式结构
用于形成根据本发明这一实施方案的包含支化PEG的肽缀合物的另一个示例性前体具有下式结构
根据该式的支化聚合物物质是基本上纯的水溶性聚合物。X3’是包括可电离的官能团(例如，OH、COOH、H2PO4、HSO3、HPO3，及其盐等等)或其它反应性官能团的部分，例如下文所述。C是碳。X5、R16和R17独立地选自非反应性基团和聚合物部分(例如聚氧化烯烃，例如PEG)。非反应性基团包括被认为是在生理学pH条件下基本上不起反应的、中性的和/或稳定的基团，例如，H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基等等。示例性的聚合物部分包括以下式IIIa及其示例中所示的支化结构。本领域技术人员可以理解，在这些式中的PEG部分可以被其它聚合物所替代。示例性的聚合物包括聚氧化烯烃家族中的那些。(例如，H、未被取代的烷基、未被取代的杂烷基)和聚合物臂(例如，PEG)。X2和X4是优选在生理学条件下基本上无反应性的连接片段，其可相同或不同。示例性的连接体既不包括芳族部分又不包括酯部分。替代地，这些连接可以包括被设计为在生理学相关条件下降解的一个或多个部分，例如，酯、二硫化物等等。X2和X4将聚合物臂R16和R17连接到C。当X3’与连接体、糖或连接体-糖盒上的具有互补反应活性的反应性官能团反应时，则X3’被转化为连接片段X3的组分。
关于X2、X3和X4的示例性的连接片段独立地选自并包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O和o是1-50的整数。在示例性实施方案中，连接片段X2和X4是不同的连接片段。
在示例性实施方案中，前体(式III)或其被活化的衍生物，与糖、被活化的糖或糖核苷酸反应并从而与之结合，所述反应通过在X3’和糖部分上的具有互补反应活性的基团如胺之间的反应进行。替代地，X3’与连接体L的前体上的反应性官能团反应。式I、Ia、II或IIa的R2、R3、R4、R5、R6或R6’中的一个或多个可以包括支化聚合物修饰部分或者通过L连接的这一部分。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有包括下式所示的部分的结构
在根据上式的另一个示例性实施方案中，支化聚合物具有下式所示的结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
根据这个实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下部分
在示例性实施方案中，以下部分
是连接体臂L。在该实施方案中，示例性的连接体来自天然的或非天然的氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物，或由一种或多种这些物质形成的小肽。例如，在本发明的化合物中发现的某些支化聚合物具有下式结构
Xa是连接片段，该连接片段由支化聚合物修饰部分的前体上的反应性官能团例如X3’与糖部分上的反应性官能团的反应形成的，或者是连接体的前体。例如，当X3’是羧酸时，其可被活化并直接与悬垂在氨基糖类(例如，Sia、GalNH2、GlcNH2、ManNH2等等)上的胺基结合，形成作为酰胺的Xa。另外的示例性的反应性官能团和被活化的前体在下文中描述。下标c代表1到10的整数。其它符号具有与上面讨论的相同含义。
在另一个示例性实施方案中，Xa是与另一个连接体形成的连接部分
其中Xb是第二连接片段并且独立地选自关于Xa所述的那些基团，并且与L类似地是，L1是键、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基。
关于Xa和Xb的示例性基团包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O和OC(O)NH。
在另一个示例性实施方案中，X4是与R17连接的肽，其是氨基酸、二肽(例如，Lys-Lys)或三肽(例如，Lys-Lys-Lys)，其中一个或多个α-胺部分和/或一个或多个侧链杂原子用聚合物修饰部分修饰。
在另一个示例性实施方案中，本发明的肽缀合物包括例如R15部分的部分，其具有选自下式的结构

其中由各种符号表示的基团的含义与在上文中讨论的含义相同。如上关于L和L1所讨论的，La是键或连接体，例如，是被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基部分。在示例性实施方案中，La是用所述聚合物修饰部分进行官能化的唾液酸的侧链的部分。示例性的La部分包括被取代的或未被取代的烷基链，其包括一个或多个OH或NH2。
在又一个示例性实施方案中，本发明提供了具有下式所示部分例如R15部分的肽缀合物

以及
其中由各种符号表示的基团的含义与在上文中讨论的含义相同。本领域技术人员可以理解的是，在式VIII和IX中的连接体臂同样适用于本文所述的其它被修饰的糖。在示例性实施方案中，式VIII和IX的部分是连接于本文所述的聚糖结构的R15部分。
在又一个示例性实施方案中，肽缀合物包括具有作为选自以下成员的式结构的R15部分

以及
其中基团的含义如上文所讨论。关于La的示例性基团是-(CH2)jC(O)NH(CH2)hC(O)NH-，其中下标h和j独立地选自0到10的整数。另一个示例性的基团是-C(O)NH-。下标m和n是独立地选自0到5000的整数。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是独立地选自以下的成员被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
如上所述的本发明的实施方案进一步参考其中聚合物是水溶性聚合物特别是聚乙二醇(“PEG”)例如甲氧基-聚乙二醇进一步进行示例说明。本领域技术人员可以理解的是，下面章节的焦点是用于清楚示例的目的并且使用PEG作为示例性聚合物进行阐述的多种模体同样适用于其中采用不是PEG的聚合物的物质。
在示例性实施方案中，R15部分具有的式结构是选自以下的成员


以及
在每一上述结构中，连接体片段-NH(CH2)a-可存在或不存在。
在其它的示例性实施方案中，肽缀合物包括选自以下的R15部分
以及
在上式各式中，下标e和f独立地选自1到2500的整数。在另一个示例性实施方案中，选择e和f以提供约1kD、2kD、5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD、40kD和45kD的PEG部分。具有更大分子量的PEG也可用于本发明，包括最高约200kD，例如至少约180kD、约160kD、约140kD、约120kD、约100kD、约90kD、约80kD和约70kD。在某些实施方案中，PEG的分子量为约80kD。在另外的实施方案中，PEG的分子量为至少约200kD、至少约180kD、至少约160kD或至少约140kD。符号Q代表被取代的或未被取代的烷基(例如，C1-C6烷基，例如甲基)、被取代的或未被取代的杂烷基或H。
其它支化聚合物具有基于二赖氨酸(Lys-Lys)肽的结构，例如


以及
和基于三赖氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的结构，例如

以及
在上式各式中，下标e、f、f’和f”代表独立地选自1到2500的整数。下标q、q’和q”代表独立地选自1到20的整数。本领域技术人员可以理解的是，除了上面所示的线性PEG结构之外，在前述章节中示例说明的支化聚合物还可连接于支化部分(例如，赖氨酸和赖氨酸的低聚物)上而不是连接于一个或多个线性PEG结构上。
在另一个示例性实施方案中，修饰基因
具有作为选自以下成员的式结构


以及
其中Q是选自H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基的成员。下标e和f是独立地选自1到2500的整数，和下标q是选自0到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，修饰基团
具有作为选自以下成员的式结构


以及
其中Q是选自H和被取代的或未被取代的C1-C6烷基的成员。下标e、f和f’是独立地选自1到2500的整数，以及q和q’是独立地选自1到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，支化聚合物具有包括下式所示部分的结构
其中下标m和n是独立地选自0到5000的整数。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自以下的成员H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13。A12和A13是独立地选自以下的成员被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
式IIIa是式III的子集。由式IIIa描述的结构也被式III所包含。
在示例性实施方案中，聚合物修饰基团具有包括下式所示部分的结构

以及
在根据上式的另一个示例性实施方案中，支化聚合物具有包括下式所示部分的结构
在示例性实施方案中，A1和A2是独立地选自-OH和-OCH3的成员。
根据这个实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下部分
其中各变量的定义如上所述。
在示例性实施方案中，被修饰的糖是唾液酸并且所选择的用于本发明的被修饰的糖化合物具有下式结构
下标a、b和d是0到20的整数。下标c是1到2500的整数。如上所述结构可以是R15的组成部分， 在另一个示例性实施方案中，糖的伯羟基部分被修饰基团官能化。例如，唾液酸的9-羟基可以被转化为相应的胺并被官能化以提供本发明的化合物。根据这一实施方案的式包括
如上所述结构可以是R15的组成部分。
尽管在前述章节中参考PEG示例说明了本发明，但是本领域技术人员可以理解的是，一系列的聚合物修饰部分可用于本文所述的化合物和方法中。
在被选择的实施方案中，R1或L-R1是支化PEG，例如上述物质之一。在示例性实施方案中，支化PEG结构基于半胱氨酸肽。根据这一实施方案的示例性的被修饰的糖包括
其中X4是键或O。在每一上述结构中，烷基胺连接体-(CH2)aNH-可存在或不存在。如上所述的结构可以是R15/R15’的组成部分。
正如本文的讨论，用于本发明的被聚合物修饰的唾液酸还可是线性结构。因此，本发明提供了包括来自诸如以下结构的唾液酸部分的缀合物
其中下标q和e如上文所讨论。
示例性的被修饰的糖用水溶性聚合物或非水溶性聚合物修饰。有用的聚合物的示例进一步示例说明如下。
在另一个示例性实施方案中，肽来自昆虫细胞，通过将GlcNAc和Gal附加到甘露糖核心进行重建以及使用携带线性PEG部分的唾液酸进行糖PEG化，得到包括至少一个具有下式的部分的肽
其中下标t是0到1的整数；下标s代表1到10的整数；以及下标f代表1到2500的整数。
在一个实施方案中，本发明提供了包括以下的糖基连接基团的肽缀合物
D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成员；R1是包括选自直链聚乙二醇残基和支化聚乙二醇残基的成员的部分；以及 M是选自以下的成员H、盐抗衡离子和单个负电荷；L是连接体，其是选自以下的成员键、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基。在示例性实施方案中，当D是OH时，则G是R1-L-。在另一个示例性实施方案中，当G是-C(O)(C1-C6)烷基时，D是R1-L-NH-。
在示例性实施方案中，L-R1具有下式结构
其中a是选自0到20的整数。
在示例性实施方案中，R1具有包括选自以下的部分的结构


以及
其中e、f、m和n是独立地选自1到2500的整数；以及q是选自0到20的整数。
在示例性实施方案中，R1具有作为选自以下成员的结构


以及
其中e、f和f’是独立地选自1到2500的整数；以及q和q’是独立地选自1到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，R1具有作为选自以下成员的结构

以及
其中e、f和f’是独立地选自1到2500的整数；以及q和q’是独立地选自1到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，R1具有作为选自以下成员的结构

以及
其中e和f是独立地选自1到2500的整数。
在另一个示例性实施方案中，糖基连接体具有下述结构
其中各变量的定义如上所述。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个选自下式的所述糖基连接体

以及
其中D和G如上所述，AA是所述肽缀合物的氨基酸残基和t是选自0和1的整数。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个所述糖基连接体，其中每一所述糖基连接体具有作为独立地选自下式成员的结构

其中D和G如上所述，AA是所述肽缀合物的氨基酸残基，和t是选自0和1的整数。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个选自下式的所述糖基连接体

其中D和G如上所述，AA是所述肽缀合物的氨基酸残基，和t是选自0和1的整数。在示例性实施方案中，不存在选自0和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。在示例性实施方案中，不存在选自1和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个选自下式的所述糖基连接体

其中D和G如上所述，AA是所述肽缀合物的氨基酸残基和t是选自0和1的整数。在示例性实施方案中，不存在选自0和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。在示例性实施方案中，不存在选自1和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个选自下式的所述糖基连接体

其中D和G如上所述，AA是所述肽缀合物的氨基酸残基和t是选自0和1的整数。在示例性实施方案中，不存在选自0和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。在示例性实施方案中，不存在选自1和2个不包括G的唾液酸基部分的成员。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了在适合的宿主中产生的肽。本发明还提供了表达这种肽的方法。在另一个示例性实施方案中，宿主是哺乳动物表达系统。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了治疗有其需要的受试者的病况的方法，所述病况的特征在于所述受试者的凝血效力受损，所述方法包括对所述受试者给予有效改善所述受试者的所述状况的量的本发明的肽缀合物的步骤。在另一个示例性实施方案中，所述方法包括对所述哺乳动物给予一定量的根据本文所述方法制备的肽缀合物。
在另一个方面，本发明提供了制备本文所述的包括糖基连接体的肽缀合物的方法。所述方法包括(a)使包括如下糖基部分的肽
与本文所述的PEG化核苷酸类糖以及将PEG化糖转移到所述糖基部分的Gal上的酶在适合于所述转移的条件下接触。
在另一个示例性实施方案中，以下部分
具有作为选自以下成员的式结构
其中e、f、m和n是独立地选自1到2500的整数；以及q是选自0到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，以下部分
具有作为选自以下成员的式结构


以及
其中e、f和f’是独立地选自1到2500的整数；以及q和q’是独立地选自1到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，糖基连接体包括下式结构
在另一个示例性实施方案中，肽缀合物包括至少一个具有下式结构的糖基连接体。



以及
其中AA是所述肽的氨基酸残基；t是选自0和1的整数；以及R15是被修饰的唾液酸基部分。
在另一个示例性实施方案中，所述方法包括在步骤(a)之前(b)在适合的宿主中表达所述肽。
II.D.iv.非水溶性聚合物 在另一个实施方案中，类似于上面讨论的那些，被修饰的糖包括非水溶性聚合物而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物还可包括一种或多种非水溶性聚合物。通过采用缀合物作为介质来说明本发明的这一实施方案，使用该介质来以受控方式递送治疗性肽。聚合物药物递送系统是本领域已知的。例如，参见，Dunn等人编辑，POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员可以理解实质上任何已知的药物递送系统适用于本发明的缀合物。
如上关于R1、L-R1、R15、R15’和其它基团所述的模体同样适用于非水溶性聚合物，其可被并入线性和支化结构，不限于采用本领域技术人员容易获得的化学。
代表性的非水溶性聚合物包括但不限于聚膦嗪，聚乙烯醇，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烯烃，聚丙烯酰胺，聚亚烷基二醇，聚氧化烯烃，聚亚烷基对苯二甲酸酯，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯基卤化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸异丁酯，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸异癸酯，聚甲基丙烯酸月桂酯，聚甲基丙烯酸苯基酯，聚丙烯酸甲酯，聚丙烯酸异丙酯，聚丙烯酸酸异丁酯，聚丙烯酸十八烷基酯，聚乙烯，聚丙烯，聚乙二醇，聚环氧乙烷，聚对苯二甲酸乙二酯，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，普卢兰尼克和聚乙烯基苯酚，及其共聚物。
可用于本发明缀合物中的合成的改性天然聚合物包括但不限于烷基纤维素，羟烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯和硝化纤维素。宽泛类别的合成的改性天然聚合物的特别优选的成员包括但不限于甲基纤维素，乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，醋酸纤维素，丙酸纤维素，醋酸丁酸纤维素，醋酞纤维素，羧甲基纤维素，三乙酸纤维素，纤维素硫酸酯钠盐，和丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯和海藻酸的聚合物。
本文讨论的这些聚合物和其它聚合物可以容易地得自商业来源，诸如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO.)，Polysciences(Warrenton，PA.)，Aldrich(Milwaukee，WI.)，Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或者另外从这些供应商获得的单体使用标准技术进行合成。
可用于本发明缀合物中的代表性的可生物降解型聚合物包括但不限于聚丙交酯，聚乙交酯及其共聚物，聚对苯二甲酸乙二酯，聚丁酸，聚戊酸，聚(丙交酯-共-己内酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚酐，聚原酸酯，及其共混物和共聚物。特别使用的是形成凝胶的组合物，诸如包括胶原蛋白、普卢兰尼克等等的那些。
用于本发明的聚合物包括“杂化”聚合物，其包括非水溶性材料，该非水溶性材料在其结构的至少一部分内包括生物可吸收的分子。这种聚合物的实例是包含非水溶性共聚物的聚合物，该非水溶性共聚物在每个聚合物链内具有生物可吸收区域、亲水区域和多个可交联的官能团。
为了本发明的目的，“非水溶性材料”包括在水或含水环境中实质上不溶的材料。因此，尽管共聚物的某些区域或片段可能是亲水的或甚至是溶于水的，但是聚合物分子作为一个整体在水中没有任何实质可测量的溶解。
为了本发明的目的，术语“生物可吸收的分子”包括这样的区域，该区域能够通过正常排泄途径被机体代谢或分解和再吸收和/或消除。这种代谢物或分解产物优选对身体是实质上无毒的。
生物可吸收区域可以是疏水性的或亲水性的，只要该共聚物组分作为一个整体不表现水溶性即可。因此，基于聚合物作为一个整体保持水不溶性的优先性来选择生物可吸收区域。因此，对相对性质，即，由生物可吸收区域所包含的官能团的种类，和生物可吸收区域的相对比例，以及亲水性区域进行选择，从而确保有用的生物可吸收的组分保持非水溶性。
示例性的可再吸收型聚合物包括，例如，合成制备的聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧化烯烃)的可再吸收型嵌段共聚物(参见，Cohn等人，美国专利No.4,826,945)。这些共聚物不是交联的并且是可溶于水的，从而身体可以排泄被降解的嵌段共聚物组分。参见，Younes等人，JBiomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；以及Cohn et al.，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
本发明优选的生物可吸收的聚合物包括选自以下的一种或多种组分聚酯，聚羟基酸，聚内酯，聚酰胺，聚酯-酰胺，聚氨基酸，聚酐，聚原酸酯，聚碳酸酯，聚膦嗪，聚磷酸酯，聚硫酯，多糖，及其混合物。仍更优选地是，生物可吸收的聚合物包括聚羟基酸组分。在聚羟基酸类中优选聚乳酸，聚乙醇酸，聚己酸，聚丁酸，聚戊酸，及其共聚物和混合物。
除了形成在体内被吸收的片段(“生物可吸收的”)之外，用于本发明方法中的优选的聚合物涂层还可形成可排泄和/或可代谢的片段。
在本发明中还可使用更高级共聚物。例如，Casey等人的美国专利No.4,438,253，其在1984年3月20日被授权，公开了由聚羟基乙酸和被羟基封端的聚亚烷基二醇进行酯交换所得的三嵌段共聚物。这类组分被公开用作可再吸收型单丝缝线。这类组分的挠性通过并入芳族原碳酸酯例如原碳酸四对甲苯基酯到所述共聚物共结构内来进行控制。
还可使用基于乳酸和/或羟基乙酸的其它聚合物。例如，Spinu的美国专利5,202,413，其在1993年4月13日被授权，公开了可生物降解型多嵌段共聚物，该多嵌段共聚物通过丙交酯和/或乙交酯在低聚二醇或二胺残基上开环聚合，然后使用二官能化合物例如二异氰酸酯、二酰基氯或二氯甲硅烷进行链延长而制备的具有按序排列的聚丙交酯和/或聚乙交酯的嵌段。
可用于本发明的涂层的生物可吸收区域可被设计为可水解裂解的和/或可酶促裂解的。为了本发明的目的，“可水解裂解的”是指共聚物，特别是生物可吸收区域在水或含水环境中对水解的敏感性。类似，本文中使用的“可酶促裂解的”是指共聚物，特别是生物可吸收区域对内源性或外源性酶的裂解的敏感性。
当置于体内时，亲水性区域可被加工为可排泄的和/或可代谢的片段。因此，亲水性区域可以包括，例如，聚醚，聚氧化烯烃，多元醇，聚乙烯基吡咯烷，聚乙烯醇，聚烷基噁唑啉，多糖，碳水化合物，肽，蛋白质，及其共聚物和混合物。另外，亲水性区域还可以是，例如，聚氧化烯烃。这种聚氧化烯烃可以包括，例如，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，及其混合物和共聚物。
作为水凝胶的组分的聚合物也可用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合物材料。形成水凝胶的化合物的实例包括但不限于聚丙烯酸，羧甲基纤维素钠，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷，明胶，角叉藻聚糖和其它多糖，羟基乙烯甲基丙烯酸(HEMA)，及其衍生物等等。水凝胶可被制备为是稳定的、生物可降解的和生物可吸收的。另外，水凝胶组合物可包括表现出这些性质中的一种或多种的亚单元。
其完整性可以通过交联进行控制的生物相容性水凝胶组合物是已知的并且在本发明中优选用于本发明的方法中。例如，Hubbell等人的美国专利Nos.5,410,016，其在1995年4月25日被授权，和5,529,914，其在1996年6月25日被授权，公开了水溶性系统，其是交联的嵌段共聚物，具有夹在两个对水解不稳定的伸长段之间的水溶性中央嵌段片段。这种共聚物进一步用可进行光聚合的丙烯酸酯官能团进行末端封端。当交联时，这些系统变成水凝胶。这种共聚物的水溶性中央嵌段可以包括聚乙二醇；而对水解不稳定的伸长段可以是聚(α-羟基酸)，例如聚乙醇酸或聚乳酸。参见，Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一个优选实施方案中，凝胶是热致可逆凝胶。包括诸如普卢兰尼克、胶原蛋白、明胶、透明质酸、多糖、聚氨酯水凝胶、聚氨酯-脲水凝胶及其组合的组分的热致可逆凝胶在本发明中是优选的。
在又一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包括脂质体的组分。脂质体可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，根据Eppstein等人的美国专利No.4,522,811中所述方法制备。例如，脂质体制剂可以通过将适当的一种或多种脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰胆碱，花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中然后进行蒸发，在容器的表面上留下干燥的脂质薄膜进行制备。活性化合物或其药学上可接受的盐的水溶液然后被引入到容器中。然后用手将容器涡旋以从容器侧面释放脂质材料和使脂质聚集体分散，从而形成脂质体悬浮液。
上述的微粒和制备微粒的方法通过示例方式被提供并且这些示例不意在限制在本发明中所使用的微粒的范围。本领域技术人员显而易见的是，通过不同方法制造的一系列微粒可用于本发明中。
在水溶性聚合物背景下如上讨论的结构形式，无论是直链的还是支化的，通常对于非水溶性聚合物也是适合的。因此，例如，半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸支化核心可以被两个非水溶性聚合物部分进行官能化。用于制备这些物质的方法通常与用于制备水溶性聚合物的那些方法密切地相似。
II.D.v.制备聚合物修饰基团的方法 聚合物修饰基团可以进行活化用于与糖基或糖基部分或氨基酸部分反应。被活化的物质(例如碳酸酯和活性酯)的示例性结构包括

在上式中，q是选自1-40的成员。其它适合于活化在制备本文所述的化合物中使用的线性和支化PEG的活化基团或离去基团包括但不限于以下物质


以及
用这些和其它物质活化的PEG分子以及制备活化PEG的方法在WO 04/083259中阐述。
本领域技术人员可以理解的是，如上所示的支化聚合物的一个或多个m-PEG臂可以被具有不同端点例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等等的PEG部分所替代。另外，上述结构可容易地通过在α-碳原子和氨基酸侧链的官能团之间插入烷基连接体(或除去碳原子)进行修饰。因此，“均”衍生物和高级同系物，以及低级同系物处在可用于本发明的支化PEG的核心的范围内。
本文所述的支化PEG物质容易地通过诸如以下方案中阐述的方法制备
其中Xd是O或S和r是1到5的整数。下标e和f独立地选自1到2500的整数。在示例性实施方案中，这些下标之一或二者经过选择从而使得聚合物的分子量为约5kD、10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、35kD或40kD。具有更大分子量的PEG也可用于本发明，包括最高约200kD，例如至少约180kD、约160kD、约140kD、约120kD、约100kD、约90kD、约80kD和约70kD。在某些实施方案中，PEG的分子量为约80kD。在其它实施方案中，PEG的分子量为至少约200kD、至少约180kD、至少约160kD或至少约140kD。
因此，根据这一方案，天然的或非天然氨基酸与被活化的m-PEG衍生物接触，在该情况，与甲苯磺酸酯接触，通过使侧链杂原子Xd烷基化形成1。单官能化m-PEG氨基酸与反应性m-PEG衍生物经历N-酰基化条件，从而装配支化m-PEG 2。如本领域技术人员可以理解的，甲苯磺酸酯离去基团可以用任何适合的离去基团如卤素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等等所替代。类似地，用于使胺进行酰基化的反应性碳酸酯可以用活性酯例如N-羟基琥珀酰亚胺等所替代，或者酸可以使用脱水剂例如二环己基碳二亚胺、羰二咪唑等等被原地活化。
在其它示例性实施方案中，脲部分用诸如酰胺的基团所替代。
II.E.物质的均一分散肽缀合物组合物 除了提供通过化学或酶促方式附加糖基连接基团形成的肽缀合物之外，本发明提供了包括在其取代模式中是高度均一的肽缀合物的物质的组合物。使用本发明的方法，有可能形成这样的肽缀合物，在该肽缀合物中，在整个的肽缀合物群体中，相当比例的糖基连接基团和糖基部分连接于结构相同的氨基酸或糖基残基上。因此，在第二方面，本发明提供了这样的肽缀合物，该肽缀合物具有水溶性聚合物部分的群体，其通过糖基连接基团例如完整的糖基连接基团与肽共价结合。在本发明的示例性的肽缀合物中，水溶性聚合物群体中的基本上每个成员借助于糖基连接基团结合于肽的糖基残基上，并且肽的连接有糖基连接基团的每个糖基残基具有相同的结构。
本发明还提供了与上述那些类似的缀合物，其中肽借助于糖基连接基团缀合于修饰基团，例如治疗性部分、诊断性部分、靶向部分、毒素部分等等。每一上述的修饰基团可以是小分子、天然聚合物(例如多肽)或合成聚合物。当修饰基团连接于唾液酸时，通常优选所述修饰基团实质上无荧光性。
在示例性实施方案中，本发明的肽包括至少一个O-连接的或N-连接的糖基化部位，该部位用包括聚合物修饰基团例如PEG部分的被修饰的糖进行糖基化。在示例性实施方案中，PEG借助于完整的糖基连接基团或借助于非糖基连接体例如被取代的未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基与肽共价连接。糖基连接基团共价连接于肽的氨基酸残基或糖基残基上。作为替代地，糖基连接基团连接于糖肽的一个或多个糖基单元上。本发明还提供了其中糖基连接基团既连接于氨基酸残基又连接于糖基残基上的缀合物。
本发明的肽上的聚糖通常对应于根据本文所述方法进行重制后在由哺乳动物(BHK、CHO)细胞或昆虫(例如Sf-9)细胞产生的肽上所发现的那些。例如，使用三甘露糖基核心表达的昆虫产生的肽随后接触GlcNAc供体和GlcNAc转移酶以及Gal供体和Gal转移酶。通过二步骤或单一步骤实现GlcNAc和Gal附加到三甘露糖基核心上。如本文所讨论的那样将被修饰的唾液酸附加到糖基部分的至少一个分枝上。未用被修饰的唾液酸进行官能化的那些Gal部分任选地通过在唾液酸转移酶存在的条件下与唾液酸供体反应而被“加帽”。
在示例性实施方案中，在肽群体中至少60％的末端Gal部分被唾液酸加帽，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％并且甚至更优选至少95％、96％、97％、98％或99％被唾液酸加帽。
II.F.核苷酸糖 在本发明的另一个方面，本发明还提供了糖核苷酸。根据这一实施方案的示例性物质包括



以及
其中y是选自0到2的整数，并且R2、R3、R4、R5或R6中的至少一个具有选自以下成员的结构
其中各变量如上所述。
在示例性实施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中的至少一个具有下式所示的结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
根据这一实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下所示的部分
在示例性实施方案中，R2、R3、R4、R5或R6中只有一个具有包括如上所述的修饰基团的结构。
在另一个示例性实施方案中，根据这一实施方案的物质包括



以及
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，根据这一实施方案的物质包括

其中L-(R1)w是选自以下的成员
其中各变量如上所述。
在示例性实施方案中，L-(R1)w具有下式所示结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
根据这一实施方案的示例性的聚合物修饰基团包括以下所示的部分
在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约1000的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约1到约70、约70到约150、约150到约250、约250到约375和约375到约500的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约10到约35、约45到约65、约95到约130、约210到约240、约310到约370和约420到约480的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约15到约30的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约50到约65的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约100到约130的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约210到约240的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约310到约370的整数。在示例性实施方案中，m和n是独立地选自约430到约470的整数。
在另一个示例性实施方案中，根据这一实施方案的物质包括



以及
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，根据这一实施方案的物质包括

以及
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，核苷酸糖具有作为选自以下成员的式
其中各变量如上所述。
根据这一实施方案的示例性核苷酸糖具有以下结构
其中各变量如上所述。
根据这一实施方案的示例性核苷酸糖具有以下结构
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，核苷酸糖基于下式
其中R基团和L代表如上讨论的部分。下标“y”是0、1或2。在示例性实施方案中，L是在NH和R1之间的键。碱基是核酸碱基。
在示例性实施方案中，L-R1是选自以下的成员
其中各变量如上所述。
在示例性实施方案中，L-R1具有下式所示结构
在示例性实施方案中，A1和A2各自选自-OH和-OCH3。
III.方法 除了上面讨论的缀合物之外，本发明还提供了用于制备这些缀合物和其它缀合物的方法。另外，本发明提供了预防、治疗或改善疾病状态的方法，通过对处在发展为所述疾病的危险中的受试者或罹患所述疾病的受试者给予本发明的缀合物进行。
在示例性实施方案中，在聚合物修饰部分和糖基化肽或非糖基化肽之间形成缀合物。聚合物借助于糖基连接基团缀合于肽，所述糖基连接基团被插入到肽(或糖基残基)和修饰基团(例如水溶性聚合物)之间并与后二者共价连接。所述方法包括使肽接触包含被修饰的糖和将被修饰的糖缀合于底物的酶例如糖基转移酶的混合物。该反应在适合于在被修饰的糖和肽之间形成共价键的条件下进行。被修饰的糖的糖部分优选选自核苷酸糖。合成肽缀合物的方法包括合并a)唾液酸酶；b)能够催化糖基连接基团转移的酶例如糖基转移酶、外切糖苷酶或内切糖苷酶；c)被修饰的糖；d)肽，从而合成肽缀合物。所述反应在适合于在被修饰的糖和肽之间形成共价键的条件下进行。被修饰的糖的糖部分优选选自核苷酸糖。
在示例性实施方案中，被修饰的糖例如如上所述的那些被活化为相应的核苷酸糖。可用于本发明的示例性的糖核苷酸在其被修饰形式中包括核苷酸类一、二或三磷酸酯或其类似物。在优选实施方案中，被修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。甚至更优选地，被修饰的糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-岩藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。在示例性实施方案中，核苷酸类磷酸酯连接于C-1。
本发明还提供了在6-碳位置处用L-R1修饰的糖核苷酸的使用。根据这一实施方案的示例性物质包括
其中R基团和L代表如上讨论的部分。下标“y”是0、1或2。在示例性实施方案中，L是在NH和R1之间的键。碱基是核酸碱基。
用于本发明的示例性的核苷酸糖如本文所述。在另一个示例性实施方案中，可用于本发明的核苷酸糖是其中在6-位置处的碳被包括具有GDP甘露糖立体化学的物质修饰的那些，例如

以及
其中X5是键或O并且其余变量如上所述。下标i代表0或1。下标a代表1到20的整数。下标e和f独立地代表1到2500的整数。Q，如上文所讨论，是H或被取代的或未被取代的C1-C6烷基。本领域技术人员可以理解的是，其中S用O所替代的丝氨酸衍生物也落入这一一般主题范围内。
在又一个示例性实施方案中，本发明提供了其中被修饰的糖基于UDP半乳糖的立体化学的缀合物。可用于本发明的示例性的核苷酸糖具有以下所示结构
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立体化学。根据这一实施方案的示例性物质具有下式结构

以及
其中各变量如上所述。
因此，在其中糖基部分是唾液酸的示例性实施方案中，本发明的方法采用了具有下式结构的化合物
其中L-R1如上文所讨论并且L1-R1代表与修饰基团连接的连接体。与L类似地，根据L1的示例性连接体物质包括键、烷基或杂烷基部分。
另外，如上文所讨论，本发明提供了被线性或支化的水溶性聚合物修饰的核苷酸糖的使用。例如，具有下式结构的化合物可用于制备在本发明范围内的缀合物

以及
其中X4是O或键。
通常，糖部分或糖部分-连接体盒和PEG或PEG-连接体盒基团通过采用活性基团被连接在一起，活性基团通常通过连接方法被转化为新的有机官能团或无反应性的物质。一个或多个糖反应性官能团位于糖部分上的任何位置处。可用于实践本发明的活性基团和反应类型通常是生物缀合化学领域中公知的那些。目前的可与反应性糖部分进行的有利的反应类型是在相对温和条件下进行的那些。这些反应包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电子取代(例如烯胺反应)和碳-碳加成和碳-杂原子多重键加成(例如，迈克尔加成反应，狄尔斯-阿德耳加成)。这些反应和其它有用的反应在例如以下中讨论，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，MODIFICATION OFPROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，AmericanChemical Society，Washington，D.C.，1982。
作为糖核心或修饰基团的侧基的有用的反应性官能团包括但不限于 (a)羧基及其多种衍生物，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯，N-羟基苯并三唑酯，酰卤，酰基咪唑，硫酯，对硝基苯酯，烷基、烯基、炔基和芳族酯； (b)羟基基团，其可被转化为例如酯、醚、醛等等。
(c)卤代烷基基团，其中卤化物可随后被亲核基团诸如例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或烷氧化物离子置换，从而在卤素原子的官能团处产生新基团的共价连接； (d)亲二烯体基团，其能够参与狄尔斯-阿尔德反应，诸如例如马来酰亚胺基团； (e)醛或酮基团，从而借助形成羰基衍生物诸如例如亚胺、腙、半卡巴腙或肟，或借助诸如格氏加成或烷基锂加成的机制可能随后进行衍生化； (f)磺酰卤基团，用于随后与例如胺反应以形成磺酰胺； (g)硫醇基，其可例如被转化为二硫化物或与酰卤反应； (h)胺或巯基，其可例如被酰化、烷基化或氧化； (i)烯烃，其可经历例如环加成、酰基化、迈克尔加成等等；以及 (j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应。
反应性官能团可以进行选择从而使得它们不参与或不干涉装配反应性糖核心或修饰基团所需的反应。作为替代，反应性官能团可以通过保护基的存在而被保护起来以免参与反应。本领域技术人员可以理解如何保护特定的官能团从而使其不干涉所选择的反应条件设置。关于有用的保护基的实例例如参见Greene等人的PROTECTIVE GROUPSIN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
在下述的讨论中，阐述了可用于实践本发明的被修饰的糖的许多特定实例。在示例性实施方案中，唾液酸衍生物被用作连接有修饰基团的糖核心。关于唾液酸衍生物的讨论的焦点仅仅用于清楚示例的目的，其不被认为限制本发明的范围。本领域技术人员可以理解的是，许多其它的糖部分以与使用唾液酸作为实例所阐述的类似方式进行活化和衍生化。例如，用于修饰仅以半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖作为几个糖底物的实例可采用许多方法，这些糖底物可容易地通过本领域公知方法进行修饰。例如，参见，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；and Schafer et al.，J.Org.Chem.6524(2000))。
在示例性实施方案中，被修饰的糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。
在上述的方案中，下标n代表1到2500的整数。在示例性实施方案中，该下标经过选择从而使得聚合物的分子量为约10kD、15kD或20kD。符号“A”代表活化基团例如卤基、活化酯的部分(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)、碳酸酯的部分(例如对硝基苯基碳酸酯)等等。本领域技术人员可以理解的是，其它PEG-酰胺核苷酸糖可容易地通过这一方法和类似方法制备。
肽通常从无到有被合成，或者在原核细胞(例如细菌细胞诸如大肠杆菌)或在真核细胞诸如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中被重组表达。所述肽可以是全长蛋白质或片段。另外，肽可以是野生型肽或者是突变肽。在示例性实施方案中，所述肽包括突变，所述突变将一个或多个N-或O-连接的糖基化位置附加到肽序列上。
本发明的方法还提供了对重组产生的不完全糖基化肽的修饰。许多重组产生的糖蛋白是不完全糖基化的，曝露出具有不受欢迎的性质(如免疫原性、RES的识别性)的碳水化合物残基。在本发明的方法中采用被修饰的糖，肽可以同时地被进一步糖基化并且用例如水溶性聚合物、治疗剂等等衍生化。被修饰的糖的糖部分可以是适当地缀合于完全糖基化肽内的受体上的残基，或者是具有所需性质的另一个糖部分。
本领域技术人员可以理解的是，本发明可以采用实质上得自任何来源的任何肽或糖肽进行实践。可用于实践本发明的示例性肽在WO03/031464及其所引述的参考文献中阐述。
通过本发明方法修饰的肽可以是合成肽或野生型肽，或者它们可以是突变肽，通过本领域已知的方法诸如定位诱变产生。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。示例性的N-连接是被修饰的糖与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于碳水化物部分与天冬酰胺侧链进行酶促连接的识别顺序。因此，任何一个这些三肽序列在多肽中的存在产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化是指一种糖(例如N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)与羟基氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链的连接，尽管还可使用非常见的或非天然的氨基酸，例如5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
另外，除了肽之外，本发明的方法还可用其它生物学结构(例如糖脂、脂质、鞘氨基醇、神经酰胺、全细胞等等，其包含糖基化位点)进行实践。
将糖基化位点附加到肽或其它结构上方便地通过改变氨基酸序列从而使得其包含一个或多个糖基化位点来实现。所述附加也可通过将一种或多种提供-OH基团的物质优选丝氨酸或苏氨酸残基并入到肽的序列内(用于O-连接的糖基化位点)来进行。所述附加可以通过肽的突变或全化学合成来进行。肽氨基酸序列优选通过在DNA水平下发生改变而被改变，特别是通过在预先选定的碱基下使编码该肽的DNA发生突变从而使得产生可被翻译为所需氨基酸的密码子。DNA突变优选使用本领域已知的方法进行。
在示例性实施方案中，糖基化位点通过改组(shuffling)多核苷酸被附加。编码候选肽的多核苷酸可以用DNA改组规程进行调节。DNA改组是递推式(recursive)重组和突变过程，该过程通过相关基因池随机碎裂成片段、随后通过类似聚合酶链式反应过程将所述片段进行重新装配进行。例如，参见Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；以及美国专利Nos.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
可用于实践本发明的示例性肽、附加或除去糖基化位点的方法和附加或除去糖基结构或亚结构的方法详细描述在WO03/031464和相关的美国申请和PCT申请中。
本发明还利用了附加到肽上(或从肽中除去)一个或多个被选择的糖基残基，之后将被修饰的糖缀合于肽的至少一个被选择的糖基残基上。本发明的实施方案可用于，例如，当希望将被修饰的糖缀合于被选择的糖基残基上时，所述糖基残基不存在于肽上或不以所需量存在。因此，在将被修饰的糖偶联于肽之前，被选择的糖基残基通过酶促或化学偶联被缀合于肽上。在另一个实施方案中，糖肽的糖基化模式在被修饰的糖缀合之前通过从糖肽上除去碳水化合物残基被改变。例如，参见WO 98/31826。
附加或除去糖肽上存在的任何碳水化合物部分通过化学或酶促进行。通过将多肽变体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物下进行示例性的化学去糖基化。这一处理引起除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基乳糖胺)之外大部分或所有的糖裂解，同时留下完整的肽。化学去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)描述。在多肽变体上的碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用由Thotakura等人Meth.Enzymol.138350(1987)所述的内切糖苷酶和外切糖苷酶来完成。
在示例性实施方案中，所述肽在进行肽上的糖缀合或重制步骤之前用神经氨糖酸苷酶基本上完全脱唾液酸化。在糖缀合或重制之后，所述肽任选地用唾液酸转移酶进行再唾液酸化。在示例性实施方案中，再唾液酸化发生在唾液酸基受体的群体中的基本上每个(例如，＞80％，优选大于85％，大于90％，优选大于95％，和更优选大于96％、97％、98％或99％)末端糖基受体处。在优选实施方案中，糖类具有实质上均一的唾液酸化模式(即，实质上均一的糖基化模式)。
糖基部分的化学附加通过本领域公认的方法进行。糖部分的酶促附加优选使用本文所述方法的改进法进行，用未经修饰的天然糖基单元代替本发明中使用的被修饰的糖。附加糖部分的其它方法公开在美国专利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577中。
用于被选择的糖基残基的示例性的连接点包括但不限于(a)用于N-糖基化的被一致认可的部位，和用于O-连接的糖基化的位点；(b)作为糖基转移酶的受体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基，诸如半胱氨酸的那些；(f)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(g)芳族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的酰胺基。用于本发明的示例性方法描述在1987年9月11日公开的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，第259-306页(1981)中。
在一个实施方案中，本发明提供了通过连接基团连接两个或更多个肽的方法。连接基团具有任何有用的结构并且可选自直链和支链结构。优选地，与肽连接的连接体的每个端点包括被修饰的糖(即，开始形成的完整的糖基连接基团)。
在本发明的示例性方法中，两个肽借助于包括聚合物(例如PEG连接体)的连接体部分被连接在一起。该构建体与上式所述的一般结构符合。如本文所述的，本发明的构建体包括两个完整的糖基连接基团(即，s+t＝1)。关注包括两个糖基基团的PEG连接体是用于清楚示例的目的并且不被解释为限制了在本发明的这一实施方案中可用的连接体臂的同一性。
因此，PEG部分在第一端点被第一糖基单元官能化并在第二端点被第二糖基单元官能化。第一和第二糖基单元优选是用于不同的转移酶的底物，允许第一肽和第二肽分别垂直连接于第一糖基单元和第二糖基单元上。在实践中，(糖基)1-PEG-(糖基)2连接体与第一肽和以第一糖基单元作为底物的第一转移酶接触，从而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。转移酶和/或未反应的肽然后任选地从反应混合物中被除去。第二肽和以第二糖基单元作为底物的第二转移酶被附加到(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2缀合物，形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；至少一个糖基残基是直接或间接地O-连接的。本领域技术人员可以理解的是，如上所述的方法也适用于在超过两个肽之间形成缀合物，例如通过使用支化PEG、树枝型聚合物、聚(氨基酸)、多糖等等进行。
在示例性实施方案中，通过本发明方法进行修饰的肽是糖肽，其在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)和在转基因动物中产生，并因此包含N-和/或O-连接的寡糖链，其是不完全唾液酸化的。缺乏唾液酸且包含末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以被PEG化、PPG化或者以其它方式用被修饰的唾液酸进行修饰。
在方案1中，氨基糖苷1用被保护的氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯处理，将糖胺残基转化为相应的被保护的氨基酸酰胺加合物。所述加合物用醛缩酶处理以形成α-羟基羧酸盐2。化合物2在CMP-SA合成酶的作用下被转化为相应的CMP衍生物，然后该CMP衍生物进行催化氢化得到化合物3。通过甘氨酸加合物的形成而被引入的胺作为通过化合物3与活化的PEG或PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-对硝基苯基)反应的PEG连接位点，分别得到诸如4或5的物质。
方案1
在示例性实施方案中，被修饰的糖可以与肽上的O-聚糖结合位点连接。可用于产生这一肽缀合物的糖基转移酶包括用于Ser56(-Glc-(Xyl)n-Gal-SA-PEG-半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶；用于Ser56-Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG-木糖转移酶；以及用于Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-PEG-GlcNAc转移酶。
III.A.被修饰的糖与肽的缀合 使用适当的用于介导缀合的酶将用PEG修饰的糖缀合于糖基化或非糖基化肽。优选地，被修饰的供体糖、酶和受体肽的浓度经过选择从而使得糖基化进行直到受体被消耗。在以下讨论的需要考虑的事项，尽管在唾液酸转移酶的背景下被阐述，但是其一般适用于其它的糖基转移酶反应。用于本发明的一系列优选的唾液酸转移酶提供于图6中。
使用糖基转移酶来合成所需的寡糖结构的许多方法是已知的并且一般适用于本发明。示例性方法描述在例如以下中，WO 96/32491，Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)，美国专利Nos.5,352,670，5,374,541，5,545,553，共同拥有的美国专利Nos.6,399,336和6,440,703，和共同拥有的公开的PCT申请WO 03/031464，WO 04/033651，WO04/099231，其作为参考并入本文。
本发明使用单个的糖基转移酶或糖基转移酶的组合进行实践。例如，可以采用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在那些使用超过一种酶的实施方案中，酶和底物优选在最初的反应混合物中混合，或者，当第一酶促反应完成或几乎完成时将用于第二酶促反应的酶和试剂加入到反应介质中。通过在单个容器中按照次序进行两个酶促反应，在其中中间体物质被分离的整个过程中的总回收率得以改善。另外，额外的溶剂和副产物的提纯和处理被减少。
在优选实施方案中，第一酶和第二酶中每一种是糖基转移酶。在另一个优选实施方案中，一种酶是内切糖苷酶，在另外的优选实施方案中，使用超过两种酶来装配本发明的被修饰的糖蛋白。所述酶用于在将被修饰的糖附加到肽之前或之后的任一时间点改变肽上的糖类结构。
在另一个实施方案中，该方法采用一种或多种外切糖苷酶或内切糖苷酶。糖苷酶通常是突变体，其经过工程化以形成糖基键而不是使其破裂。突变聚糖酶通常包括用氨基酸残基置换活性部位的酸性氨基酸残基。例如，当内切聚糖酶是endo-H时，被取代的活性部位残基典型地是在130位的Asp、在132位的Glu或其组合。氨基酸通常被丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺所替换。
突变酶催化反应，通常通过与内切聚糖酶水解步骤的逆反应类似的合成步骤进行。在这些实施方案中，糖基供体分子(例如，所需的寡糖或单糖结构)包含离去基团并且反应继续进行从而供体分子被附加到蛋白质上的GlcNAc残基上。例如，离去基团可以是卤素，诸如氟化物。在其它实施方案中，离去基团是Asn或Asn-肽部分。在另一个实施方案中，在糖基供体分子上的GlcNAc残基被修饰。例如，GlcNAc残基可以包括1，2噁唑啉部分。
在优选实施方案中，用于产生本发明的缀合物的每种酶以催化量存在。特定酶的催化量根据酶底物的浓度以及反应条件诸如温度、时间和pH值的不同而异。在预先选定的底物浓度和反应条件下测定关于给定酶的催化量的方法是本领域技术人员公知的。
以上过程进行的温度可以仅仅为冰点以上到最敏感的酶发生变性的温度。优选温度为约0℃到约55℃，和更优选为约20℃到约37℃。在另一个示例性实施方案中，本发明方法的一个或多个组成部分在高温下使用嗜热酶进行。
反应混合物保持使受体足以被糖基化的时段，从而形成所需的缀合物。一些缀合物通常在几小时后被检测到，通常在24小时或更短时间内获得可回收的量。本领域技术人员可理解的是，反应速率根据多种变化要素(例如，酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)的不同而异，其针对被选择的系统进行优化。
本发明还提供了被修饰的肽的工业规模生产。本文中使用的工业规模通常产生至少1克的最终的纯化缀合物。
在下述的讨论中，本发明通过被修饰的唾液酸部分与糖基化肽的缀合进行示例说明。示例性的被修饰的唾液酸用PEG标记。以下关于使用被PEG修饰的唾液酸和糖基化肽的讨论的焦点用于清楚示例的目的并且不意在暗示本发明限于这两种配对体的缀合。本领域技术人员可理解的是，所述讨论一般适用于除了唾液酸之外的被修饰的糖基部分的附加。另外，所述讨论同样适用于用除了包括其它PEG部分治疗性部分和生物分子在内的PEG之外的试剂进行糖基单元的修饰。
可使用酶促手段用于选择性地引入PEG化或PPG化碳水化合物到肽或糖肽上。所述方法采用了包含PEG、PPG或被掩蔽的反应性官能团的被修饰的糖，并且结合适当的糖基转移酶或糖合成酶。通过选择糖基转移酶，该糖基转移酶将产生所需的碳水化合物连接并采用被修饰的糖作为供体底物，可将PEG或PPG直接引入到肽骨架上、到糖肽的已有糖残基上或到已被附加到肽上的糖残基上。
在示例性实施方案中，用于唾液酸转移酶的受体存在于要被修饰的肽上，所述肽是天然存在的结构或者其经过重组、酶促或化学布置。适合的受体包括例如半乳糖基受体诸如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本领域技术人员已知的其它受体(例如，参见，Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。示例性的唾液酸转移酶如本文所述。
在一个实施方案中，唾液酸转移酶的受体存在于当在体内合成糖肽时要被修饰的糖肽上。这种糖肽可以用本发明要求保护的方法进行唾液酸化而不用进行糖肽的糖基化模式的事先修饰。替代地，本发明的方法可用于使不包括适合的受体的肽唾液酸化；首先通过本领域技术人员已知的方法对肽进行修饰以包括受体。在示例性实施方案中，GalNAc残基在GalNAc转移酶的作用下被附加。
在示例性实施方案中，半乳糖基受体通过将半乳糖残基连接到与肽例如GlcNAc连接的适当的受体上进行装配。所述方法包括将待修饰的肽与包含适当量的半乳糖基转移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和适合的半乳糖基供体(例如UDP-半乳糖)的反应混合物培养。允许反应进行到实质上完成，或者，当附加预选定量的半乳糖残基时使反应终止。其它装配被选择的糖类受体的方法是本领域技术人员显而易见的。
在又一个实施方案中，与糖肽连接的寡糖首先进行全部或部分“修剪”以暴露出唾液酸转移酶的受体或可附加一个或多个适当的残基以获得适当受体的部分。诸如糖基转移酶和内切糖苷酶的酶(例如，参见，美国专利No.5,716,812)可用于连接和修剪反应。在该方法的另一个实施方案中，肽的唾液酸部分基本上被完全除去(例如，至少90％、至少95％或至少99％)，暴露出用于被修饰的唾液酸的受体。
在下述的讨论中，本发明的方法通过使用连接有PEG部分的被修饰的糖进行示例说明。该讨论的焦点用于清楚示例的目的。本领域技术人员可以理解的是，该讨论同样适用于其中被修饰的糖携带治疗性部分、生物分子等等的那些实施方案。
在本发明的示例性实施方案中，其中碳水化合物残基在附加被修饰的糖之前进行“修剪”，高甘露糖被削减到第一代双触角(biantennary)结构。携带PEG部分的被修饰的糖缀合于一个或多个通过“削减”而暴露的糖残基上。在一个实施例中，PEG部分借助于缀合于PEG部分的GlcNAc部分被附加。被修饰的GlcNAc连接于具有双触角结构的末端甘露糖残基的一个或二者上。作为替代，未经修饰的GlcNAc可以被附加到支化物质的端点的一个或二者上。
在另一个示例性实施方案中，PEG部分借助于具有半乳糖残基的被修饰的糖被附加到具有双触角结构的末端甘露糖残基的一个或二者上，所述半乳糖残基缀合于被附加到末端甘露糖残基上的GlcNAc残基上。作为替代，未经修饰的Gal可被附加到一个或两个末端GlcNAc残基上。
在又一个实施例中，使用诸如以上讨论的那些的被修饰的唾液酸将PEG部分添加到Gal残基上。
在另一个示例性实施方案中，高甘露糖结构被“削减”到双触角结构发生支化的甘露糖。在一个实施例中，PEG部分借助于用聚合物修饰的GlcNAc被附加。作为替代，未经修饰的GlcNAc被附加到甘露糖，然后是具有被连接的PEG部分的Gal。在又一个实施方案中，未经修饰的GlcNAc和Gal残基被顺序地附加到甘露糖上，然后是用PEG部分修饰的唾液酸部分。
高甘露糖结构还可被削减到基本的三甘露糖基核心。
在另一个示例性实施方案中，高甘露糖被“削减”到连接有第一甘露糖的GlcNAc。GlcNAc缀合于携带PEG部分的Gal残基。作为替代，未经修饰的Gal被附加到GlcNAc，然后是附加用水溶性糖修饰的唾液酸。在又一个实施例中，末端GlcNAc与Gal缀合，然后所述GlcNAc用携带PEG部分的被修饰的岩藻糖进行岩藻糖基化。
高甘露糖还可被削减到连接有肽的Asn的第一GlcNAc。在一个实施例中，GlcNAc-(Fuc)a残基的GlcNAc与携带水溶性聚合物的GlcNAc缀合。在另一个实施例中，GlcNAc-(Fuc)a残基的GlcNAc用Gal修饰，Gal携带水溶性聚合物。在又一个实施方案中，GlcNAc用Gal修饰，随后缀合于用PEG部分修饰的唾液酸的Gal上。
其它示例性实施方案在共同拥有的美国专利申请公报中阐述20040132640；20040063911；20040137557；美国专利申请Nos10/369,979；10/410,913；10/360,770；10/410,945和PCT/US02/32263，其各自作为参考并入本文。
如上所述的实施例提供了本文所述方法的功效的示例说明。使用本文所述的方法，有可能“削减”并装配具有实质上任何所需结构的碳水化合物残基。被修饰的糖可被附加到如上所述的碳水化物部分的端点上，或者其可以是处在肽核心和碳水化合物端点之间的中间体。
在示例性实施方案中，使用唾液酸酶从糖肽中除去已有唾液酸，从而使得所有的或大部分的基础半乳糖基残基去屏蔽。作为替代，肽或糖肽用半乳糖残基或以半乳糖单元作为终点的寡糖残基标记。在暴露或附加半乳糖残基之后，使用适当的唾液酸转移酶附加被修饰的唾液酸。
在另一个示例性实施方案中，采用将唾液酸转移到唾液酸上的酶。该方法可进行实践而不用唾液酸酶处理唾液酸化聚糖以将聚糖残基暴露在唾液酸之下。示例性的用聚合物修饰的唾液酸是用聚乙二醇修饰的唾液酸。将唾液酸和被修饰的唾液酸部分附加到聚糖(其包括唾液酸残基或者用聚糖上的已有唾液酸残基替换这些物质)的其它示例性酶包括ST3Gal3、CST-II、ST8Sia-II、ST8Sia-III和ST8Sia-IV。
在又一个方法中，被掩蔽的反应性官能度存在于唾液酸上。被掩蔽的反应性基团优选不受将被修饰的唾液酸连接于凝血因子VII/凝血因子VIIa肽所用的条件的影响。在被修饰的唾液酸与肽共价连接后，除去掩蔽并且肽与诸如PEG的试剂缀合。所述试剂以特定的方式通过其与被修饰的糖残基上的去屏蔽的活性基团的反应而缀合于肽。
任何被修饰的糖可与其适当的糖基转移酶使用，根据糖肽的寡糖侧链的末端糖的不同而异。如上文所讨论，引入PEG化结构所需的糖肽的末端糖可以在表达期间自然地被引入或者其可在表达后使用适当的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物产生。
在另一个示例性实施方案中，UDP-半乳糖-PEG与β1，4-半乳糖基转移酶反应，从而将被修饰的半乳糖转移到N-乙酰基葡糖胺结构的适当的末端上。糖肽上的末端GlcNAc残基可以在表达期间产生，这可发生在诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌的表达系统中，而且可以根据需要通过用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。
在另一个示例性实施方案中，GlcNAc转移酶诸如GNT1-5被用于将PEG化-GlcNAc转移到糖肽上的末端甘露糖残基上。在又一个示例性实施方案中，N-和/或O-连接的聚糖结构从糖肽上被酶促除去从而暴露出氨基酸或末端糖基残基，其随后缀合于被修饰的糖。例如，内切聚糖酶用于除去糖肽的N-连接结构以暴露出末端GlcNAc作为糖肽上的与GlcNAc连接的Asn。UDP-Gal-PEG和适当的半乳糖基转移酶用于引入PEG-半乳糖官能度到被暴露的GlcNAc上。
在可供选择的实施方案中，被修饰的糖被直接附加到肽骨架上，使用已知将糖残基转移到肽骨架上的糖基转移酶进行。可用于实践本发明的示例性的糖基转移酶包括但不限于GalNAc转移酶(GalNAcT1-14)、GlcNAc转移酶、藻岩糖基转移酶、葡糖基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶等等。使用这一方法允许直接附加被修饰的糖到缺乏任何碳水化合物的肽上，或者，作为替代，附加到已有肽上。在两种情况下，被修饰的糖的附加发生在肽骨架的特定位置上，所述位置由糖基转移酶的底物特异性进行定义，并且不以在使用化学方法对蛋白质的肽骨架进行修饰期间发生的随机方式进行。一系列试剂可被引入到通过将适当的氨基酸序列进行工程化成为多肽链而缺乏糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中。
在上述的每一示例性实施方案中，可在被修饰的糖缀合于肽之后采用一种或多种另外的化学或酶促修饰步骤。在示例性实施方案中，使用酶(例如岩藻糖基转移酶)将糖基单元(例如岩藻糖)作为侧基附加到与肽连接的末端被修饰的糖上。在另一个实施例中，使用酶促反应将没能缀合有被修饰的糖的位置“加帽”。作为替代，采用化学反应来改变已缀合的被修饰的糖的结构。例如，已缀合的被修饰的糖与使其与连接有被修饰的糖的肽组分的连接稳定或不稳定的试剂反应。在另一个实施例中，被修饰的糖的部分在其缀合于肽之后被脱保护。本领域技术人员可以理解的是，在被修饰的糖缀合于肽之后的某一阶段，存在一系列可用于本发明方法的酶促和化学规程。对被修饰的糖-肽缀合物的进一步的精心制作处在本发明的范围内。
用于制备本发明的缀合物的酶和反应条件详细地讨论在本申请的母申请中以及共同拥有的公开的PCT专利申请WO 03/031464、WO04/033651、WO 04/099231中。
在所选择的实施方案中，在昆虫细胞中表达的肽被重制从而使得在被重制的糖肽上的聚糖包括GlcNAc-Gal糖基残基。GlcNAc和Gal的附加可作为单独的反应和作为在单个容器中的单个反应发生。在这一实施例中，使用GlcNAc-转移酶I和Gal-转移酶I。使用ST3Gal-III附加被修饰的唾液酸基部分。
在另一个实施方案中，GlcNAc、Gal和被修饰的Sia的附加还可发生在单个反应容器中，使用如上所述的酶。每一酶促重制和糖PEG化步骤可分别进行。
当肽在哺乳动物细胞中表达时，使用不同的方法。在一个实施方案中，肽在缀合之前无需重制而进行缀合，通过使所述肽接触唾液酸转移酶，该唾液酸转移酶将被修饰的唾液酸直接转移到形成Sia-Sia-L-R1的肽上的唾液酸上进行，或者将肽上的唾液酸交换为被修饰的唾液酸，形成Sia-L-R1。用于该方法的示例性酶是CST-II。将唾液酸附加到唾液酸的其它酶是本领域技术人员已知的并且这种酶的实例在附图中阐述。
在制备本发明缀合物的又一个方法中，在哺乳动物系统中被表达的肽使用唾液酸酶进行脱唾液酸化。使用对于O-连接聚糖是特异性的唾液酸转移酶用被修饰的唾液酸将暴露出的Gal残基进行唾液酸化，提供了具有O-连接的被修饰的聚糖的肽。脱唾液酸化的被修饰的肽任选地通过使用唾液酸转移酶诸如ST3GalIII进行部分或全部的再唾液酸化。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明的PEG化肽缀合物的方法。所述方法包括(a)使得包括选自以下的糖基基团的肽

以及
与具有作为选自以下的成员的式的PEG-唾液酸供体
其中各变量如上所述，和将PEG-唾液酸从所述供体转移到选自所述糖基基团的GalNAc、Gal和Sia的成员上的酶，在适合于所述转移的条件下接触。示例性的被修饰的唾液酸供体是用聚合物例如线性或支化聚乙二醇部分通过连接体部分进行修饰的CMP-唾液酸。如本文的讨论，所述肽任选地在连接被修饰的糖之前用GalNAc和/或Gal和/或Sia进行糖基化(“重制”)。重制步骤可以在相同的容器中按照次序发生而无需在步骤之间进行糖基化肽的纯化。作为替代，在一个或多个重制步骤后，糖基化肽可以在使它经历下一个糖基化或糖PEG化步骤之前进行纯化。在示例性实施方案中，所述方法进一步包括在宿主中表达肽。在示例性实施方案中，宿主是哺乳动物细胞或昆虫细胞。在另一个示例性实施方案中，哺乳动物细胞是选自BHK细胞和CHO细胞的成员，并且昆虫细胞是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
正如实施例中说明的和以下所讨论的，用于PEG-糖的受体部分的设置以任何所需数目的步骤进行。例如，在一个实施方案中，GalNAc附加到肽上之后可以是第二步骤，在第二步骤中，PEG-糖在相同的反应容器中缀合于GalNAc上。作为替代，这两个步骤可以在单个的容器中大约同时进行。
在示例性实施方案中，PEG-唾液酸供体具有下式结构

其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，PEG-唾液酸供体具有下式结构
其中各变量如上所述。
在另一个示例性实施方案中，肽在进行糖PEG化或重制之前在适当的表达系统中被表达。示例性的表达系统包括Sf-9/杆状病毒和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在示例性实施方案中，本发明提供了制备包括糖基连接体的肽缀合物的方法，所述糖基连接体包括具有下式结构的被修饰的唾液酸基残基
其中D是选自-OH和R1-L-HN-的成员；G是选自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基-R1的成员；R1是包括选自直链聚乙二醇残基和支化聚乙二醇残基的成员的部分；M是选自H、金属和单个负电荷的成员；L是连接体，其是选自键、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基的成员，从而使得当D是OH时G是R1-L-，和当G是-C(O)(C1-C6)烷基时D是R1-L-NH-， 所述方法包括(a)使包括糖基部分的肽
与具有下式结构的PEG-唾液酸供体部分
其中各变量如上所述，以及将所述PEG-唾液酸转移到所述糖基部分的Gal上的酶，在适合于所述转移的条件下接触。
在示例性实施方案中，L-R1具有下式结构
其中a是选自0到20的整数。
在另一个示例性实施方案中，R1具有作为选自以下的成员的结构
其中e、f、m和n是独立地选自1到2500的整数；以及q是独立地选自0到20的整数。
通过本文所述的方法可以制备具有大规模或小规模的量的肽缀合物。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.5mg到约100kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.1kg到约1kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.5kg到约10kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.5kg到约3kg。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.1kg到约5kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.08kg到约0.2kg的成员。在示例性实施方案中，t肽的量是选自约0.05kg到约0.4kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.1kg到约0.7kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约0.3kg到约1.75kg的成员。在示例性实施方案中，肽的量是选自约25kg到约65kg的成员。
在本文所述反应中使用的肽的浓度是选自约0.5到约10mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约0.5到约1mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约0.8到约3mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约2到约6mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约4到约9mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约1.2到约7.8mg肽/mL反应混合物的成员。在示例性实施方案中，肽浓度是选自约6到约9.5mg肽/mL反应混合物的成员。
在本文所述反应中使用的PEG化核苷酸糖的浓度是选自约0.1到约1.0mM的成员。可增加或减少所述浓度的因素包括PEG的大小、培养时间、温度、缓冲剂组分、以及使用的糖基转移酶的类型和浓度。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.1到约1.0mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.1到约0.5mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.1到约0.3mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.2到约0.7mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.3到约0.5mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.4到约1.0mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.5到约0.7mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.8到约0.95mM的成员。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖浓度是选自约0.55到约1.0mM的成员。
可在本文所述反应中使用的PEG化核苷酸糖的摩尔当量基于可被附加到蛋白质上的PEG化糖的理论数。PEG化糖的理论数基于蛋白质上的糖位置的理论数以及当与MW比较时蛋白质的MW以及由此获得的PEG化核苷酸糖的摩尔数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自1到20的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自1到20的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自2到6的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自3到17的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自4到11的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自5到20的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自1到10的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自12到20的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自14到17的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自7到15的整数。在示例性实施方案中，PEG化核苷酸糖的摩尔当量是选自8到16的整数。
III.B.同时进行脱唾液酸化和糖PEG化 本发明提供了糖PEG化的“一锅烩”方法。一锅烩方法与其它制备肽缀合物的示例性方法不同，所述其它方法顺序地采用用唾液酸酶进行脱唾液酸化，然后在阴离子交换柱上进行唾液酸化肽的纯化，然后使用CMP-唾液酸-PEG和糖基转移酶(诸如ST3Gal3)、外切糖苷酶或内切糖苷酶进行糖PEG化。然后肽缀合物借助于阴离子交换然后借助于空间排阻色谱进行纯化，以得到经过纯化的肽缀合物。
一锅烩方法是制造肽缀合物的改进方法。在该方法中，脱唾液酸化和糖PEG化反应在一锅烩反应中合并进行，其避免了在前述方法中使用第一阴离子交换色谱步骤来纯化唾液酸化肽。这一工艺步骤的减少带来若干优点。第一，制备肽缀合物所需的工艺步骤数目减少了，这又降低了该方法的操作复杂性。第二，制备肽缀合物所用的加工时间被减少例如4到2天。这使得减少了与加工过程中的控制有关的原材料需要和质量控制成本。第三，相对于所述方法本发明采用更少的唾液酸酶，例如，使用最多二十分之一的唾液酸酶，例如需要500mU/L来制备肽缀合物。这一唾液酸酶使用的减少显著减少了反应混合物中的杂质诸如唾液酸酶的量。
在示例性实施方案中，肽缀合物通过以下方法制备。在第一步骤中，将肽与唾液酸酶、本发明的被修饰的糖和能够催化糖基连接基团从被修饰的糖转移到肽的酶合并，从而制备肽缀合物。在该方法中可使用任何唾液酸酶。可用于本发明的示例性的唾液酸酶可在CAZY数据库中找到(参见afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html和www.cazy.org/CAZY)。示例性的唾液酸酶可以购自许多来源(QA-Bio，Calbiochem，Marukin，Prozyme等等)。在示例性实施方案中，唾液酸酶是选自胞浆唾液酸酶、溶酶体唾液酸酶、外切α唾液酸酶和内切唾液酸酶。在另一个示例性实施方案中，使用的唾液酸酶从细菌诸如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)或肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)产生。或从病毒诸如腺病毒产生。在示例性实施方案中能够催化糖基连接基团从被修饰的糖转移到肽的酶是选自糖基转移酶，诸如唾液酸转移酶和藻岩糖基转移酶以及内切糖苷酶和外切糖苷酶的成员。在示例性实施方案中，所述酶是糖基转移酶，其是ST3Gal3。在另一个示例性实施方案中，使用的酶从细菌诸如大肠埃希杆菌(Escherichia Coli)或真菌诸如黑曲霉(Aspergillus niger)产生。在另一个示例性实施方案中，唾液酸酶在糖基转移酶之前被加入到肽中达特定时间，允许唾液酸酶反应在添加PEG-唾液酸试剂和糖基转移酶开始糖PEG化反应之前进行。这些实施例中有许多在本文中被讨论。最后，本文所述的任何被修饰的糖可用在这一反应中。
在另一个示例性实施方案中，所述方法另外包括“加帽”步骤。在这一步骤中，另外的非PEG化唾液酸被添加到反应混合物中。在示例性实施方案中，该唾液酸被附加到肽或肽缀合物上从而防止另外地附加PEG-唾液酸。在另一个示例性实施方案中，该唾液酸阻止了糖基转移酶在反应混合物中发挥作用，有效地停止了糖基连接基团对肽或肽缀合物的附加。最重要地是，被添加到反应混合物中的唾液酸将非糖PEG化聚糖进行加帽，从而提供了具有改善的药代动力学的肽缀合物。另外，当需要PEG化程度达到某一量时，该唾液酸酶无需事先纯化可被直接添加到糖PEG化反应混合物中。
在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的低于约50％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的低于约40％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的低于约30％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的低于约20％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的低于约10％的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，肽或肽缀合物上的约20％到约5％之间的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，肽或肽缀合物上的约25％到约10％之间的唾液酸化部位不包括唾液酸基部分。在示例性实施方案中，在加帽步骤后，肽或肽缀合物上的基本上所有的唾液酸化部位包括唾液酸基部分。
III.C.肽的脱唾液酸化和选择性修饰 在另一个示例性实施方案中，本发明提供了肽的脱唾液酸化的方法。所述方法优选提供了肽，该肽的至少约40％，优选45％，优选约50％，优选约55％，优选约60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少92％，优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％和更优选100％被脱唾液酸化。
所述方法包括使肽接触唾液酸酶优选达一定时间段。预先选定的时段足够使肽脱唾液酸化到所需程度。在优选方案中，当实现所需的脱唾液酸化程度时将脱唾液酸化的肽与唾液酸酶分离。示例性的脱唾液酸化反应和纯化循环如本文所述。
本领域技术人员能够确定进行脱唾液酸化反应的适当的预先选定的时段。在示例性实施方案中，所述时段低于24小时，优选低于8小时，更优选低于6小时，更优选低于4小时，更优选低于2小时，更优选低于1小时。
在另一个示例性实施方案中，在脱唾液酸化反应的结尾，在肽缀合物制备物中，肽群体中的成员的至少10％仅具有连接其的单个唾液酸，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％和更优选至少60％和更优选完全被脱唾液酸化。
在又一个示例性实施方案中，在脱唾液酸化反应的结尾，在制备物中，肽群体的成员的至少10％完全被脱唾液酸化，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％和更优选至少60％完全被脱唾液酸化。
在另一个示例性实施方案中，在脱唾液酸化反应的结尾，在制备物中，肽群体的成员的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％仅具有单个唾液酸，并且肽的至少10％、20％、30％、40％、50％或60％完全被脱唾液酸化。
在优选方案中，在脱唾液酸化反应的结尾，在制备物中，肽群体的至少50％完全被脱唾液酸化并且肽群体的成员的至少40％仅携带单个唾液酸部分。
在脱唾液酸化之后，所述肽任选地与被修饰的糖缀合。示例性的被修饰的糖包括与支化或线性聚乙二醇部分结合的糖基部分。所述缀合通过将被修饰的糖从被修饰的糖供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上的酶催化。示例性的被修饰的糖供体是携带支化或线性聚乙二醇部分的CMP-唾液酸。示例性的聚乙二醇部分的分子量为至少约2kD，更优选至少约5kD，更优选至少约10kD，优选至少约20kD，更优选至少约30kD和更优选至少约40kD。
在示例性实施方案中，用于将被修饰的糖部分从被修饰的糖供体转移的酶是糖基转移酶，例如唾液酸转换酶。在本发明方法中使用的示例性唾液酸转换酶是ST3Gal3。
本发明的示例性方法得到了携带至少一个，优选至少两个，优选至少三个修饰基团的被修饰的肽。在一个实施方案中，得到的肽在肽的轻链上携带单个修饰基团。在另一个实施方案中，所述方法提供了在重链上携带单个修饰基团的被修饰的肽。在又一个实施方案中，所述方法提供了在轻链上携带单个修饰基团和在重链上携带单个修饰基团的被修饰的肽。
在另一个方面，本发明提供了制备被修饰的肽的方法。所述方法包括使得肽与携带修饰基团的被修饰的糖供体以及能够将被修饰的糖部分从被修饰的糖供体转移到肽的氨基酸或糖基残基上的酶接触。
在示例性实施方案中，所述方法提供了被修饰的肽的群体，其中群体成员的至少40％，优选至少50％，优选至少60％，更优选至少70％和甚至更优选至少80％单缀合于肽的轻链。
在示例性实施方案中，所述方法提供了被修饰的肽的群体，其中群体成员的至少40％，优选至少50％，优选至少60％，更优选至少70％和甚至更优选至少80％二缀合于肽的轻链。
在这一方面的示例性实施方案中，所述方法提供了被修饰的肽的群体，其中群体成员的至多50％，优选至多30％，优选至多20％，更优选至多10％单缀合于肽的重链。
在这一方面的示例性实施方案中，所述方法提供了被修饰的肽的群体，其中群体成员的至多50％，优选至多30％，优选至多20％，更优选至多10％二缀合于肽的重链。
所述肽可以在接触步骤之前经历唾液酸酶的作用，或者所述肽可以无需事先脱唾液酸化即可使用。当所述肽接触唾液酸酶时，其可以基本上完全地脱唾液酸化或仅仅部分地脱唾液酸化。在优选方案中，所述肽在接触步骤之前至少被部分地脱唾液酸化。肽可基本上完全地脱唾液酸化(基本上脱唾液酸)或仅仅部分地脱唾液酸化。在优选方案中，脱唾液酸化肽是如上文所述的脱唾液酸化实施方案中的一种。
III.D.在肽缀合物合成中被添加的另外等分部分试剂 在本文所述的肽缀合物的合成的示例性实施方案中，在被选择时间段后将一个或多个另外等分部分的反应组分/试剂添加到反应混合物中。在示例性实施方案中，所述肽缀合物是肽缀合物。在另一个示例性实施方案中，被添加的反应组分/试剂是被修饰的糖核苷酸。向反应中引入被修饰的糖核苷酸将增加驱动糖PEG化反应达到完成的可能性。在示例性实施方案中，核苷酸糖是本文所述的CMP-SA-PEG。在一示例性实施方案中，被添加的反应组分/试剂是唾液酸酶。在一示例性实施方案中，被添加的反应组分/试剂是糖基转移酶。在一示例性实施方案中，被添加的反应组分/试剂是镁。在示例性实施方案中，被添加的另外等分部分表示在反应开始时被添加的初始量的约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％。在示例性实施方案中，反应组分/试剂在反应开始后的约3小时或6小时或8小时或10小时或12小时或18小时或24小时或30小时或36小时被添加到反应中。
III.E.肽缀合物的纯化 通过上述方法制备的产品可无需纯化直接使用。然而，通常优选回收产物和一种或多种中间体，例如核苷酸糖、支化和线性PEG物质、被修饰的糖和被修饰的核苷酸糖。用于回收糖基化肽的标准的公知技术如薄层或厚层色谱法、柱色谱法、离子交换色谱法或膜滤法可被使用。优选使用膜滤法，更优选使用反向渗透膜，或如下文和本文所引述文献中讨论的用于回收的一种或多种柱色谱技术。例如，可以使用其中膜的分子量截断值为约3000到约10,000的膜滤法来除去诸如糖基转移酶的蛋白质。在某些情况中，在杂质和产物之间的分子量截断值差异将被利用以确保产物纯化。例如，为了从未反应的CMP-SA-PEG-40kD纯化产物肽-SA-PEG-40kD，必需选择允许例如肽-SA-PEG-40kD保留在滞留物中并同时允许CMP-SA-PEG-40kD流入滤液中的过滤器。然后可使用纳米过滤或反渗透以除去盐和/或纯化产物糖类(例如，参见，WO 98/15581)。纳米过滤膜是一类反渗透膜，其根据所用的膜而异，使一价盐通过但保留多价盐和大于约100到约2,000道尔顿的不带电的溶质。因此，在典型的应用中，通过本发明方法制备的糖类将保留在膜中而污染性盐将流过该膜。
如果所述肽在细胞内被制备，作为第一步，除去微粒碎片，其是宿主细胞片段或细胞裂解片段。在糖PEG化之后，PEG化肽通过本领域认可的方法进行纯化，所述方法为例如，离心作用或超滤作用；任选地，所述蛋白质可使用市售的蛋白浓缩过滤器进行浓缩，然后通过选自以下的一个或多个步骤将多肽变体与其它杂质分离免疫亲和色谱法，离子交换柱分馏法(例如在二乙氨基乙基(DEAE)上或包含羧甲基或磺丙基基团的基质上)，在蓝色-琼脂糖上的色谱法，CM蓝色-琼脂糖，MONO-Q，MONO-S，扁豆外源凝集素-琼脂糖，WGA-琼脂糖，Con A-琼脂糖，醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl或蛋白A琼脂糖，SDS-PAGE色谱法，二氧化硅色谱法，层析聚焦法，反相HPLC(例如具有附加脂族基的硅胶)，使用例如Sephadex分子筛或尺寸排阻色谱的凝胶过滤法，在选择性结合多肽的柱上的色谱法，和乙醇或硫酸铵沉淀法。可使用纯化过程将以系列的凝血因子VII/凝血因子VIIa肽缀合物与另外的分离，这在本节中的后面进一步有所描述。
在培养基中产生的被修饰的糖肽通常通过最初从细胞、酶等中分离出，然后进行一种或多种浓缩、盐析、水溶离子交换或尺寸排阻色谱步骤。另外，被修饰的糖蛋白可通过亲和色谱法纯化。最后，可采用HPLC用于最终的纯化步骤。
可将蛋白酶抑制剂包括在任何上述步骤中以抑制蛋白水解作用，并且可包括抗生素或防腐剂以防止外来污染物的生长。用于上述步骤中的蛋白酶抑制剂可以是低分子量抑制剂，包括抗痛素、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、亮肽素、阿吗他定、抑凝乳蛋白酶素、苄脒(banzamidin)、以及其它丝氨酸蛋白醇抑制剂(即serpin)。通常，丝氨酸蛋白酶抑制剂的使用浓度应为0.5-100μM，尽管在细胞培养中抑凝乳蛋白酶素可以高达200μM的浓度被使用。其它丝氨酸蛋白酶抑制剂将包括对糜蛋白酶样水解酶、枯草杆菌蛋白酶样水解酶、α/β水解酶或丝氨酸蛋白酶类的信号肽酶超家族是特异性的抑制剂。除了丝氨酸蛋白酶类之外，还可使用其它类型的蛋白酶抑制剂，包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂(1-10μM)和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(1-5μM)，以及非特异性蛋白酶抑制剂诸如胃酶抑素(.1-5μM)。用于本发明的蛋白酶抑制剂还可包括天然蛋白酶抑制剂，诸如从水蛭中分离出的水蛭素(hirustasin)抑制剂。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂将包括能够特异性结合到蛋白酶催化部位以使凝血因子VII/凝血因子VIIa稳定而不干扰糖PEG化反应的合成肽或抗体。
在另一个实施方案中，将从产生本发明的被修饰的糖肽的系统中获得的上清液首先使用市售的蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元进行浓缩。在浓缩步骤之后，将浓缩物加载到适当的纯化基质上。例如，适当的亲合性基质可包括结合于适当载体的肽、外源凝集素或抗体分子的配体。作为替代，可采用阴离子交换树脂，例如，具有DEAE侧基的基质或底物。适当的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白纯化领域中常用的其它类型。作为替代，可采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换剂包括各种包括磺丙基或羧甲基基团的非水溶性基质。磺丙基基团是特别优选的。
用于纯化的其它方法包括空间排阻色谱法(SEC)，羟磷灰石色谱法，疏水作用色谱法和蓝色琼脂糖色谱法。这些方法和其它有用的方法在共同转让的美国临时专利(代理号40853-01-5168-P1，2005年5月6日提交)中有所说明。
可采用一种或多种RP-HPLC步骤，该步骤采用疏水性RP-HPLC介质，例如具有甲基或其它脂族基侧基的硅胶，以另外纯化多肽缀合物组合物。上述纯化步骤中的一些或全部，以不同组合，还可被使用以提供均匀的或基本上均匀的被修饰的糖蛋白。
得自大规模发酵的本发明的被修饰的糖肽可以通过类似于Urdal等人J.Chromatog.296171(1984)所公开的那些方法进行纯化。该文献描述了两个顺序进行的RP-HPLC步骤用于在制备性HPLC柱上纯化重组人IL-2。作为替代，可采用诸如亲和色谱法的技术以纯化被修饰的糖蛋白。
在示例性实施方案中，所述纯化通过在共同拥有、共同转让的美国临时专利No.60/665,588(2005年3月24日提交)中所述的方法实现。
根据本发明，借助于顺序进行的脱唾液酸化或同时进行的唾液酸化制备的PEG化肽或肽缀合物可以使用氯化镁梯度进行纯化或拆分。
IV.药物组合物 在另一个方面，本发明提供了药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的稀释剂和在非天然存在PEG部分、治疗性部分或生物分子与糖基化的或非糖基化的肽之间的共价缀合物。所述聚合物、治疗性部分或生物分子借助于完整的糖基连接基团缀合于肽，所述完整的糖基连接基团插入到肽与聚合物、治疗性部分或生物分子之间并且与之共价连接。
本发明的药物组合物适合用在许多药物递送系统中。用于本发明的适当的制剂在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中发现。关于药物递送方法的简述，参见，Langer，Science 2491527-1533(1990)。
在示例性实施方案中，药物制剂包括肽缀合物和药学上可接受的稀释剂，所述药学上可接受的稀释剂是选自以下的成员氯化钠、二水合氯化钙、甘氨酰甘氨酸、聚山梨酸酯80和甘露醇。在另一个示例性实施方案中，药学上可接受的稀释剂是氯化钠和甘氨酰甘氨酸。在另一个示例性实施方案中，药学上可接受的稀释剂是二水合氯化钙和聚山梨酯80。在另一个示例性实施方案中，药学上可接受的稀释剂是甘露醇。
药物组合物可被配制成用于任何适当的给药方式，包括例如，局部，经口，经鼻，静脉内，颅内，腹膜内，皮下或肌肉内给药。对于肠胃外给药，诸如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂类、蜡或缓冲液。对于口服给药，可使用上述的任何载体或固体载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解型微球(例如聚乳酸酯，聚乙醇酸酯)也可用作本发明的药物组合物的载体。适当的生物可降解型微球公开在例如美国专利Nos.4,897,268和5,075,109中。
通常，药物组合物通过肠胃外给药，例如静脉内给药。因此，本发明提供了用于肠胃外给药的组合物，其包括被溶解或悬浮在可接受的载体中的化合物，所述可接受的载体优选是水性载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等等。组合物可包括根据需要以接近生理学条件的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂，张力调节剂，润湿剂，洗涤剂等等。
这些组合物可通过常规灭菌技术进行杀菌，或者可进行无菌过滤。所得的水性溶液可被包装以直接使用，或者被冻干，该冻干制剂与无菌水性载体在给药前被合并。制剂的pH代表性地为3-11，更优选为5-9，和最优选为7-8。
在一些实施方案中，本发明的糖肽可被并入到由标准的形成囊泡的脂质所形成的脂质体内。用于制备脂质体的可获得方法描述于，例如，Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美国专利Nos.4,235,871，4,501,728和4,837,028。使用多种靶向剂(例如本发明的唾液酸基半乳糖苷)的脂质体的靶向是本领域公知的(例如，参见，美国专利Nos.4,957,773和4,603,044)。
可使用将靶向剂与脂质体结合的标准方法。这些方法通常包括并入脂质组分到脂质体中，所述脂质组分是诸如可被活化用于连接靶向剂的磷脂酰乙醇胺或者是诸如本发明的用脂质进行衍生化的糖肽的衍生化亲脂性化合物。
靶向机制通常要求靶向剂被布置到脂质体的表面上，布置方式为使得靶标部分可被获得以用于与靶标例如细胞表面受体相互作用。本发明的碳水化合物可以在采用本领域技术人员已知方法形成脂质体之前连接于脂质分子上(例如，分别使用长链烷基卤或使用脂肪酸分别将碳水化合物上的羟基进行烷基化或酰基化)。作为替代，脂质体的形成方式为首先在膜形成时将连接体部分引入到膜中。连接体部分必需具有亲脂性部分，其被稳固地包埋和锚定在膜中。其还必须具有反应性部分，该反应性部分在脂质体的水性表面上可被化学利用。该反应性部分经过选择从而使得其在化学上适合与随后要附加的靶向剂或碳水化合物形成稳定的化学键。在一些情况下，有可能将靶向剂直接附加到连接体分子上，但是在大多数情况下，更适合使用第三分子来担当化学桥，从而将处于膜内的连接体分子与在囊泡表面上三维延伸的靶向剂或碳水化合物连接。
通过本发明方法制备的化合物还可用作诊断试剂。例如，可使用标记化合物定位被怀疑罹患炎症的患者内的炎症或肿瘤转移区域。对于这一用途，化合物可以用125I、14C或氚标记。
可用于制备在本发明组合物的制备中使用的物质的方法通常描述于各种专利公开中，例如，US 20040137557；WO 04/083258；以及WO 04/033651。提供以下实施例用于说明本发明的缀合物和方法，但是其不限制本发明权利要求书的保护范围。

具体实施例方式 实施例1 凝血因子VIIa的制备 在无血清培养基中表达的凝血因子VIIa，在含血清培养基中产生的凝血因子VIIa，加上三个凝血因子VIIa突变体N145Q、N322Q和类似物DVQ(V158D/E296V/M298Q)。
在酶促脱唾液酸化的制备中，凝血因子VIIa被透析进入位于具有10kD MWCO的Snakeskin透析管内的在4℃下过夜的MES，150mMNaCl、5mM CaCl2、50mM MES(pH 6)。凝血因子VIIa(1mg/mL)的脱唾液酸化使用得自产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)(Calbioehem)的10U/L可溶性唾液酸酶在32℃下在交换的缓冲液中进行18小时。
实施例2 凝血因子VIIa的唾液酸-PEG化。
使用100U/L的ST3Gal-III和200μM的CMP-唾液酸-PEG(40kD、20kD、10kD、5kD和2kD)在32℃在脱唾液酸化缓冲液中进行脱唾液酸-凝血因子VIIa(1mg/mL)的唾液酸-PEG化(“糖PEG化”)达2-6小时。在适当的反应时间已经届满时，立刻将PEG化样品进行纯化以使得另外发生糖PEG化的程度最小化。
为了使用用唾液酸加帽的样品对糖PEG化凝血因子VII/凝血因子VIIa进行加帽，首先通过如下所示的阴离子交换色谱法从脱唾液酸-凝血因子VIIa除去唾液酸酶。添加过量的CMP-唾液酸(5mM)并且在32℃培养2小时，用唾液酸对糖PEG化凝血因子VIIa进行加帽。凝血因子VIIa的唾液酸-PEG化形式通过如Invitrogen所述的非还原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝胶和/或NuPAGE凝胶)和胶质蓝色染色试剂盒进行分析。
实施例3 PEG化凝血因子VIIa的纯化。
凝血因子VIIa的糖PEG化样品使用改进的阴离子交换方法进行纯化。样品在5℃进行处理。在即将装柱之前，将每10mL凝血因子VIIa溶液为1克Chelex 100(BioRad)添加到重制样品中。在搅拌10分钟后，将悬浮液在醋酸纤维膜(0.2μm)上使用真空系统进行过滤。保持在滤波器上的螯合剂树脂用每10mL体积为1-2mL水洗涤。滤液的电导率被调节为在5℃下为10mS/cm，并且，如有必要，调节到pH 8.6。
在8-10℃进行阴离子交换。在装柱前通过用1M NaOH(10个柱体积)、水(5个柱体积)、2M NaCl、50mM HOAc，pH 3(10个柱体积)洗涤，并用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(10个柱体积)平衡来制备包含Q琼脂糖FF的柱。对于每个PEG化反应，将15-20mg凝血因子VIIa以100cm/h的流速装载到具有10mL的Q琼脂糖FF(每毫升树脂最多2毫克蛋白)的XK16柱上(Amersham Biosciences)。对于2kD的线性PEG，将20mg凝血因子VIIa以100cm/h的流速装载到具有40mL的Q琼脂糖FF(每毫升树脂0.5毫克蛋白)的XK26柱上(Amersham Biosciences)。
在装载后，将柱用175mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(10个柱体积)和50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(2个柱体积)洗涤。通过使用50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2，pH 8.6(5个柱体积)进行15mM CaCl2的阶段梯度洗脱。然后将柱用1MNaCl、10mM甘氨酰甘氨酸，pH 8.6(5个柱体积)洗涤。流出物通过在280nm下的吸光度进行监控。在流过柱子期间和在两次洗涤期间收集级分(5mL)；在用CaCl2和1M盐洗脱期间收集2.5mL级分。包含凝血因子VIIa的级分通过非还原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝胶和/或NUPAGE凝胶)和胶质蓝色染色试剂盒进行分析。包含凝血因子VIIa的适当的级分被汇集，并且用4M HCl调节pH到7.2。
凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD如上所述进行纯化，除去具有以下变化之外。将EDTA(10mM)加入到PEG化的凝血因子VIIa溶液中，调节pH到6，然后调节电导率在5℃下为5mS/cm。将约20mg的凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD以100cm/h的流速装载到具有10mL Poros 50Micron HQ树脂(每毫升树脂至多2毫克蛋白)的XK16柱(AmershamBiosciences)上。在装载后，将柱用175mM NaCl、10mM组氨酸，pH6(10个柱体积)和50mM NaCl、10mM组氨酸，pH 6(2个柱体积)洗涤。使用在50mM NaCl、10mM组氨酸(pH 6)中的20mM CaCl2(5个柱体积)进行阶段梯度洗脱。然后将柱用1M NaCl、10mM组氨酸，pH 6(5个柱体积)洗涤。
包含凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD(25mL)的阴离子交换洗脱物通过使用Amicon Ultra-15 10K离心滤器装置，根据该厂家的指导(Millipore)被浓缩到5-7mL。在浓缩后，进行空间排阻色谱。将样品(5-7mL)装载到对于大部分PEG化变体而言在50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM CaCl2(pH 7.2)中进行平衡的包含Superdex 200的柱上(HiLoad 16/60，制备级；Amersham Biosciences)。以1mL/分钟的流速并在280nm下监控吸光度而将凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD与未经修饰的脱唾液酸-凝血因子VIIa分离。包含凝血因子VIIa的级分(1mL)被收集并通过非还原性SDS-PAGE(Tris-甘氨酸凝胶和/或NuPAGE凝胶)和胶质蓝色染色试剂盒进行分析。包含被靶向的PEG化同工型并缺乏未经修饰的脱唾液酸-凝血因子VIIa的级分被汇集并使用Amicon Ultra-1510K离心滤器装置被浓缩到1mg/mL。使用1.37(mg/mL)-1cm-1的消光系数在280纳米的吸光度读数测定蛋白浓度。
实施例4 通过反相HPLC分析测定PEG化同工型 PEG化凝血因子VIIa通过在反相柱(Zorbax 300SB-C3，5μm粒度，2.1×150mm)上进行HPLC进行分析。洗提液是A)0.1TFA，在水中，和B)0.09％TFA，在乙腈中。在214nm下进行检测。梯度、流速和柱温因PEG长度的不同而异(40kD、20kD和10kD PEG35-65％B，在30分钟内，0.5mL/min，45℃；10kD PEG35-60％B，在30分钟内，0.5mL/min，45℃；5kD40-50％B，在40分钟内，0.5mL/min，45℃；2kD38-43％B，在67分钟内，0.6mL/min，55℃)。基于以下的四类不同证据中的两种或更多种对每个峰值进行归属天然凝血因子VIIa的已知保留时间，分离峰的SDS-PAGE移动，分离峰的MALDI-TOF质谱，和每个增加数目的附加PEG的峰的保留时间的顺序级数。
实施例5 通过反相HPLC测定PEG的连接部位。
凝血因子VIIa和PEG化凝血因子VIIa变体通过将样品(10μL，在1mg/mL浓度下)与还原缓冲液(40μL，50mM NaCl、10mM甘氨酰甘氨酸、15mM EDTA、8M脲、20mM DTT，pH8.6)混合在室温下进行还原15分钟。加入水(50μL)并将样品冷却到4℃直到注射到HPLC之前(＜12小时)。HPLC柱、洗提液和检测上述关于非还原性样品那样进行。流速是0.5mL/min并且梯度是在90分钟内为30-55％B，然后是短暂的洗涤循环直到90％B。如实施例4所述对每个峰进行归属。
实施例6 凝血因子VIIa凝固试验。
PEG化样品和标准样品以一式两份进行试验，并在100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)50mM Tris，pH 7.4中被稀释。标准样品和样品在0.1到10ng/mL的范围内进行检测。将相等体积的被稀释的标准样品和样品与缺乏凝血因子VIIa的血浆(Diagnostica Stago)混合，并在冰上保存不大于4小时，然后对其进行检测。
凝血时间使用STart4血凝度计(Diagnostica Stago)进行测量。血凝度计测量直到体外血液凝固之前所消释的时间，由在样品池中磁性球的温和的往复运动的停止来显示。
向每个池中，沉淀有一个磁性球，加上100μL凝血因子VIIa样品/缺乏凝血因子VIIa的血浆和100μL的被稀释的大鼠脑脑磷脂溶液(在冰上保存不大于4小时)。每个试剂在每孔之间在5秒内被添加，并且最终的混合物在37℃培养300秒。被稀释的大鼠脑脑磷脂(RBC)溶液由以下组成制成2mL RBC储备溶液(1小瓶RBC储备溶液，得自Haemachem，加上10mL的150mM NaCl)和4mL 100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH 7.4。
在300秒，通过加入可溶性组织因子(2μg/mL；氨基酸1-209)在100mM NaCl、12.5mM CaCl2、0.1％BSA(wt/vol)、50mM Tris，pH 7.4中的100μL的预热(37℃)溶液开始试验。再次，在样品之前以5秒为间隔添加下一次该溶液。
从被稀释的标准样品获得的凝血时间用于产生标准曲线(log凝血时间log凝血因子VIIa浓度)。从该曲线获得的线性回归用于测定PEG化变体的相对凝血活性。PEG化凝血因子VIIa变体相对于凝血因子VIIa的等分部分储备溶液进行比较。
实施例7 在BHK细胞中产生的重组凝血因子VIIa的糖PEG化。
这一实施例阐述了在BHK细胞中产生的重组凝血因子VIIa的PEG化。
脱唾液酸-凝血因子VIIa的制备。在BHK细胞(小仓鼠肾细胞)中产生重组凝血因子VIIa。将凝血因子VIIa(14.2mg)以1mg/mL溶解在缓冲溶液中(pH 7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.001M CaCl2、0.05％NaN3)并且与300mU/mL唾液酸酶(霍乱弧菌(Vibriocholera))-琼脂糖缀合物在32℃培养3天。为了监控反应，将等分部分反应物用适当的缓冲液稀释，并根据Invitrogen程序(图157)进行IEF凝胶法。将混合物在3,500rpm下离心并收集上清液。将树脂用以上所述的缓冲溶液(pH 7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05％NaN3)洗涤三次(3×2ml)，并将合并的洗液在Centricon-Plus-20中进行浓缩。剩余的溶液用0.05M Tris(pH 7.4)、0.15M NaCl、0.05％NaN3进行缓冲液交换到14.4mL的最终体积。
凝血因子VIIa-SA-PEG-1kD和凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD的制备。将凝血因子VIIa溶液的脱唾液酸化物分成两份相等的7.2mL样品。向每个样品中加入CMP-SA-PEG-1kD(7.4mg)或CMP-SA-PEG-10kD(7.4mg)。ST3Gal3(1.58U)被加入到两个试管中并将反应混合物在32℃培养96小时。通过SDS-PAGE凝胶并使用Invitrogen所述的试剂和条件监控反应。当反应完成时，使用TosoHaas TSK-Gel-3000制备柱，使用PBS缓冲液(pH 7.1)并基于UV吸收收集级分对反应混合物进行纯化。被合并的包含产物的级分在4℃下在Centricon-Plus-20离心滤器(Millipore，Bedford，MA)中被浓缩，并且将被浓缩的溶液进行重新配制以获得1.97mg(双喹啉甲酸蛋白试验，BCA试验，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)的凝血因子VIIa-SA-PEG。该反应产物使用SDS-PAGE和IEF分析并根据Invitrogen提供的程序和试剂进行分析。样品相对于水进行透析并通过MALDI-TOF进行分析。
实施例8 凝血因子VIIa-SA-PEG-10kD一锅烩方法 将凝血因子VIIa(5mg，在产物制剂缓冲液中被稀释到1mg/mL的最终浓度)、CMP-SA-PEG-10kD(10mM，60μL)和黑曲霉酶ST3Gal3(33U/L)以及10mM组氨酸、50mM NaCl、20mM CaCl2与10U/L、1U/L、0.5U/L或0.1U/L的唾液酸酶(CalBiochem)一起合并到反应容器中。将各成分混合并在32℃培养。反应进展通过以30分钟为间隔在前4小时内对等分部分反应物进行分析来测量。然后在20小时的时间点取出等分部分反应物并进行SDS-PAGE。通过在1.5、2.5和3.5小时时间点取出1mL并将样品在Poros 50HQ柱上进行纯化来测定PEG化程度。
对于包含10U/L的唾液酸酶的反应条件而言，没有形成明显量的凝血因子VIIa-SA-PEG产物。对于包含1U/L的唾液酸酶的反应条件而言，在反应混合物中约17.6％的凝血因子VIIa在1.5小时后被单PEG化或双PEG化。这在2.5小时后增加到29％，和在3.5小时后增加到40.3％。对于包含0.5U/L的唾液酸酶的反应条件而言，在反应混合物中约44.5％的凝血因子VIIa在3小时后被单PEG化或双PEG化，并且0.8％被三PEG化或更高PEG化。在20小时后，69.4％被单PEG化或双PEG化，并且18.3％被三PEG化或更高PEG化。
对于包含0.1U/L的唾液酸酶的反应条件而言，在反应混合物中约29.6％的凝血因子VIIa在3小时后被单PEG化或双PEG化。在20小时后，71.3％被单PEG化或双PEG化，并且15.1％被三PEG化或更高PEG化。
实施例9 半胱氨酸-PEG2(2)的制备
a.化合物1的合成 氢氧化钾(84.2mg，1.5mmol，作为粉末)在氩气下被加入到L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在无水甲醇(20L)中的溶液中。混合物在室温下搅拌30分钟，然后在2小时内分几部分加入分子量为20千道尔顿的mPEG-O-甲苯磺酸酯(Ts；1.0g，0.05mmol)，混合物在室温下搅拌5天，并通过旋转蒸发进行浓缩，残余物用水(30mL)稀释，并在室温下搅拌2天以破坏任何过量的20千道尔顿的mPEG-O-甲苯磺酸酯。然后溶液用乙酸中和，调节pH到pH 5.0并装载到反相色谱(C-18二氧化硅)柱上。该柱用甲醇/水梯度洗脱(产物在约70％甲醇处被洗脱)，通过蒸发光散射监控产物洗脱液，并且收集适当的级分并用水(500mL)稀释。该溶液进行色谱分离(离子交换，XK 50Q，BIG珠，300mL，氢氧化物形式；水到水/乙酸-0.75N的梯度)，并且用乙酸将适当的级分的pH降低到6.0，然后该溶液被装载到反相柱(C-18二氧化硅)上并用甲醇/水的梯度如上所述进行洗脱，产物级分被汇集，浓缩，并再溶解在水中并冷冻干燥，得到453mg(44％)的白色固体(1)。
化合物的结构数据如下所示1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。产物的纯度通过SDS PAGE证实。
b.半胱氨酸-PEG2(2)的合成 将三乙胺(～0.5mL)滴加到溶解在无水CH2Cl2(30mL)中的化合物1(440mg，22μmol)的溶液中，直到溶液呈碱性。在1小时内在室温下分几个部分加入20千道尔顿的mPEG-O-对硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液，反应混合物在室温下搅拌24小时，然后通过旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶解在水(100mL)中，并用1.0N NaOH调节pH到9.5，将碱性溶液在室温下搅拌2小时然后用乙酸中和到pH 7.0。然后将溶液装载到反相色谱(C-18二氧化硅)柱上，将该柱用甲醇/水梯度洗脱(产物在约70％甲醇处被洗脱)，通过蒸发光散射监控产物洗脱液，并且收集适当的级分并用水(500mL)稀释，该溶液进行色谱分离(离子交换，XK 50 Q，BIG珠，300mL，氢氧化物形式；从水到水/乙酸-0.75N梯度)，并且用乙酸将适当的级分的pH降低到6.0，然后将该溶液装载到反相柱(C-18二氧化硅)上并用甲醇/水如上所述进行梯度洗脱。将产物级分汇集，浓缩，再溶解在水中并冷冻干燥，得到575mg(70％)的白色固体(2)。
化合物的结构数据如下所示1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3H CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。产物的纯度通过SDSPAGE证实。
实施例10 凝血因子VIIa-SA-PEG-40kD 凝血因子VIIa的糖PEG化(带有加帽的一锅烩方法)。凝血因子VIIa的糖PEG化以一锅烩反应完成，其中脱唾液酸化和PEG化同时进行，然后用唾液酸进行加帽。反应在通过再循环水浴锅被控制在32℃的夹套式玻璃容器中进行。首先，将浓缩的经0.2μm-过滤的凝血因子VIIa引入到容器中并通过与搅动棒混合被加热到32℃达20分钟。唾液酸酶的溶液由在10mM组氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2，pH 6.0中的在4,000U/L浓度下的干粉组成。当凝血因子VIIa达到32℃时，将唾液酸酶加入到凝血因子VIIa中，反应混合约5分钟以确保之后停止混合后是均匀的溶液。在32℃进行脱唾液酸化1.0小时，在脱唾液酸化反应期间，将CMP-SA-PEG-40kD溶解在10mM组氨酸/50mM NaCl/20mM CaCl2，pH 6.0的缓冲液中，通过在271nm的UV吸光度测定浓度。在CMP-SA-PEG-40kD溶解后，将CMP-SA-PEG-40kD以及ST3Gal3加入到反应中，并且用搅动棒将反应混合约15分钟以确保获得均匀的溶液。加入另外85mL体积的缓冲液使反应达1.0升。在无搅拌条件下允许反应进行24小时，然后加入CMP-SA到4.3mM的浓度以将反应淬灭，并且用唾液酸将剩余的末端半乳糖残基进行加帽。允许淬灭在32℃下混合30分钟得以继续进行。在淬灭前总的反应体积是1.0升。在0、4.5、7.5和24小时取得时间点样品(1毫升)，用CMP-SA淬灭，并通过RP-HPLC和SDS-PAGE进行分析。
凝血因子VIIa-SA-PEG-40kD的纯化。在加帽后，将溶液用2.0L的10mM组氨酸(pH 6.0)稀释，其已经在4℃下保存过夜，并将样品通过0.2μm Millipak 60过滤器过滤。得到的装载体积是3.1升。在20-25℃(周围室温下)在Akta Pilot系统上进行AEX2色谱分离。在装柱后，进行10个柱体积的平衡缓冲液洗涤，使用10个柱体积梯度的MgCl2将产物从柱上洗脱，其从未PEG化凝血因子VIIa中拆分出PEG化-凝血因子VIIa物质。对于该柱装载量有意地被保持较低，目标是＜2mg凝血因子VIIa/mL树脂。对所选择的级分进行SDS-PAGE凝胶法加上RP-HPLC分析，并且汇集级分以获得散装产物汇集物。将汇集的级分用1M NaOH调节到pH 6.0并在2-8℃的冷室中保存过夜。
最终浓缩/透析、无菌过滤和分等分部分。将汇集的级分过滤通过Millipak 200.2μm过滤器并在2-80℃下保存过夜。为了进行浓缩/透析，在装有蠕动泵和硅氧烷管的系统中使用Millipore 0.1m2 30kD再生纤维素膜，该系统被装配并用水齐平，然后用0.1M NaOH消毒至少1小时，然后保存在0.1M NaOH中直到到10mM组氨酸/5mMCaCl2/100 mM NaCl(pH 6.0)透析缓冲液在即将使用前进行平衡。将产物浓缩到约400mL然后在恒定体积下用约5透析体积的缓冲液进行透析。产物然后被浓缩到约300mL并且在低压再循环中恢复5分钟，将膜用200mL的透析缓冲液通过再循环5分钟进行漂洗。收集洗涤液的产物，并将另外50mL的缓冲液再循环达另外5分钟用于最后一次洗涤。所得体积为约510 mL，将其过滤通过装有0.2μm PES膜(Millipore)的1L真空过滤器，然后将经过无菌过滤的体积在50mL无菌falcon管中分成25mL等分部分并在-80℃下冷冻。
通过HPLC分析PEG化反应(实施例10)
在24小时后，大批产物PEG-状态分布如下0.7％未PEG化，85.3％单PEG化，11.5％二PEG化，和0.3％三PEG化。柱色谱法在主要通过从单PEG化和二PEG化物质中除去未PEG化物质而获得产物分布的过程中是主要步骤。
可以理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于示例说明的目的并且根据其进行的各种修改或改变将暗示于本领域技术人员并且被包含在本申请的精神和范围权利要求书的保护范围内。本说明书中引述的所有的公开、专利和专利申请全文并入本文用于所有目的。
权利要求
1.肽缀合物，其包含
a)肽，其共价连接于作为选自以下的成员的部分
其中R2是选自H、CH2OR7、COOR7和OR7的成员，
其中R7是选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基的成员；
R3、R4、R5和R6是独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、OR8和NHC(O)R9的成员；
其中R8和R9独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、唾液酸和多聚唾液酸；
并且其中R3、R4、R5、R6中的至少一个包括作为选自以下的成员的部分
其中下标m和n是独立地选自1到1000的整数；
A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成员；
其中
A12和A13是独立地选自被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基的成员。
2.权利要求1的肽缀合物，其中所述R3、R4、R5、R6中的至少一个包括作为选自以下的成员的部分
3.权利要求1的肽缀合物，其中所述部分是选自以下的成员
4.权利要求1的肽缀合物，其中肽缀合物中的所述肽是选自以下的成员骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、骨形态发生蛋白-15(BMP-15)、神经营养蛋白-3(NT-3)、冯·维勒布兰德氏因子(vWF)蛋白酶、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、B-结构域缺失的因子VIII、具有全长因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、具有B-结构域缺失的因子VIII的vWF-因子VIII融合蛋白、红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、α1-抗胰蛋白酶(ATT，或α-1蛋白酶抑制剂)、葡糖脑苷脂酶、组织型纤溶酶原激活物(TPA)、白细胞介素-2(IL-2)、尿激酶、人脱氧核糖核酸酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人生长激素、TNF受体-IgG Fc区域融合蛋白(EnbrelTM)、抗-HER2单克隆抗体(HerceptinTM)、呼吸道合胞病毒的蛋白F的单克隆抗体(SynagisTM)、TNF-α的单克隆抗体(RemicadeTM)、糖蛋白IIb/IIIa的单克隆抗体(ReoproTM)、CD20的单克隆抗体(RituxanTM)、抗凝血酶III(AT III)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)、α-艾杜糖醛酸酶(AldurazymeTM)、促卵泡激素、β-葡糖苷酶、抗-TNF-α单克隆抗体(MLB5075)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A和成纤维细胞生长因子。
全文摘要
本发明提供了在肽和PEG部分之间通过甘油连接体形成的缀合物。
文档编号A61K38/16GK101600448SQ200780042865
公开日2009年12月9日 申请日期2007年10月4日 优先权日2006年10月4日
发明者S·德弗里斯, 曾孝农 申请人:诺和诺德公司