专利名称：：软骨组织再生治疗用骨填充剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种对关节组织中的软骨组织的再生治疗很有用的骨填充剂。
背景技术：
：以膝关节或肩关节等为代表的关节组织中，由关节连接的骨的顶部，为了使骨头之间不直接摩擦而覆盖有软骨组织。随着年龄的增长或由于过大的负重负荷或负重的反复负荷等原因，该软骨组织受到损伤的话，在关节内产生炎症，即，自己可以意识到的关节疼。关节的软骨组织的损伤和关节疼，在从年轻人到老年人中广泛且高频率地见到，从提高患者的生活质量(QualityofLife)的观点出发，或从医疗经济学的角度出发，需要开发一种有效且合理的治疗方法。在受到损伤的软骨组织的治疗中，最重要的问题是软骨组织在生物体内不能自然再生，因此，通过投入药物等使受损的软骨组织再生是非常困难的。例如，在软骨下骨中施加多个小孔的微骨折法虽然可以形成纤维软骨，但是作为正常的关节软骨的透明软骨不再生。因此，受到损伤的软骨组织的治疗实际上是通过专门从生物体中取出的软骨组织的移植而进行的。利用从生物体中取出的软骨组织移植的治疗方法，可以大致分为自体骨软骨移植法(Mosaicplasty)和培养自体骨软骨移植法这两类。自体骨软骨移植法是指，安装骨塞物(boneplug)后从受到损伤的关节的正常健康部分或相反侧的关节组织选取自身的软骨组织，将其自体移植到缺损部的方法。但是，这个治疗方法有弄伤选取软骨的部位中正常软骨这样不可避免的问题，另外，软骨组织的损伤部位大时，有不能从生物体中选取移植所需量的软骨组织这样的问题。而另一方面，培养自体骨软骨移植法是选取患者的自体骨软骨(透明软骨)组织的一部分，通过将其在培养基和/或培养基材中培养，在试验管内使软骨组织再生，将其自体移植到患部的方法。但是，培养自体骨软骨移植法具有如下的问题由于软骨组织的无菌培养需要准备非常昂贵的设备；由于软骨组织的选取操作和移植这两次处置、患者的长期住院而引起的治疗成本的增力口；由培养时的污染而引起人兽共通疾病感染的危险；治疗效果不确定性。为了避开这样的问题，促进患者体内软骨组织的自然再生的治疗方法的开发成为重要的课题。现在也在试验性地研究将b-FGF或OP-l等细胞因子和载体一起局部投入到含有受到损伤的软骨组织的关节中的方法，或将自体骨间质干细胞或ES细胞投入到含有受到损伤的软骨组织的关节中的方法。但是，有关这些方法的效果或副作用等问题点的确认仍然是今后的大的课题，这种治疗方法也完全没有被实用化。
发明内容发明要解决的问题本发明提供一种医疗材料，其使得一种新的软骨组织再生治疗方法成为可能，该方法不同于移植自体软骨组织、软骨替代物或其他未分化细胞的治疗方法，是基于全新概念的方法。本发明人等发现，由具有交联网络结构的聚合物形成的水凝胶，可以作为通过特殊的外科处置而进行的软骨组织再生治疗用骨填充剂，从而完成了下述各发明。(1)一种软骨组织再生治疗用骨填充剂，其特征在于，由水凝胶构成，该水凝胶具有由2个以上的具有交联网络结构的聚合物形成的互穿网络结构(2)根据(1)所述的骨填充剂，其中，具有交联网络结构的聚合物或直链聚合物是具有电荷的不饱和单体和/或电中性的不饱和单体的聚合物。(3)根据(2)所述的骨填充剂，其中，具有电荷的不饱和单体为具有酸性基团和/或碱性基团的不饱和单体。(4)根据(3)所述的骨填充剂，其中，酸性基团为羧基、磷酸基或磺酸基或这些基团的盐。(5)根据(3)所述的骨填充剂，其中，具有酸性基团的不饱和单体为2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸或其盐。(6)根据(2)所述的骨填充剂，其中，电中性的不饱和单体为N,N-二曱基-丙烯酰胺。(7)根据(1)所述的软骨组织再生治疗用骨填充剂，其由水凝胶构成，该水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合物和以N，N-二曱基-丙烯酰胺为原料单体的具有交联网络结构的聚合物构成的互穿网络结构。一种软骨或软骨组织再生诱导剂，其特征在于，由水凝胶构成，该水凝胶交联网络结构的聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。根据权利要求8所述的软骨或软骨组织再生诱导剂，其由水凝胶构成，该水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合物和以N，N-二曱基-丙烯酰胺、丙烯酰胺或2-丙烯酰胺-2-曱基丙烷硫酸钠为原发明的效果本发明的骨填充剂正如后面详细所述，通过填充到设在位于受到损伤的软骨组织的正下方的下骨中的孔或沟中，从而可以促进软骨组织的再生或软骨组织和软骨下骨两者的再生。这样的治疗方法，完全不具有目前的自体骨移植法和培养自体骨软骨移植法所被指出的上述各种问题，是一种极为有效的治疗方法。图l是模式性的显示本发明的「互穿网络结构」(双网型)的图。图中A表示一方的交联网络聚合物，B为另一方的交联网络聚合物，l和2表示各交联网络聚合物的交联点。另外，该图是在网络结构中含有溶剂(水)的凝胶的概念图。图2是模式性的显示本发明的「半互穿网络结构」(双网型)的图。图中C表示交联网络聚合物，D表示直链聚合物，3表示交联网络聚合物的交联点。图3表示从骨缺损部的关节面到具有由以2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合物和以N,N-二曱基-丙烯酰胺为原料单体的具有交联网络结构的聚合物构成的互穿网络结构的水凝胶(以下，表示为PAMPS/PDMAAm凝胶)的表面的间隔为O.Omm时的组织学的染色图像(番红-0染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图4表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为0.0mm~0.6mm时的组织学的染色图像(番红-0染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图5表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为0.7mm-1.3mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。上下两种照片是关于接受同样条件手术的不同个体的染色图像。图6表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为1.4mm2.0mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。上下两种照片是关于接受同样条件手术的不同个体的染色图像。图7表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为2.1mm2.8mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图8表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔大于2.8mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图9表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为0.7mm-1.3mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图10表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为1.4mm2.0mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图11表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为2.1mm-2.7mm时的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图12表示从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔大于2.8mm时的组织学的染色图像(番红-0染色图像)。图中被染色成粉红色的部分表示软骨组织。图13模式性地表示使用本发明的骨填充剂的软骨再生治疗。图14是表示实施例1的4)的从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为1.4mm~2.0mm时，1~4周的经时变化的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。图15是实施例1的4)的从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为1.4mm2.0mm时，再生部位的2型M^原的免疫学的染色图<象。图16为表示测定试验例2的再生部位中的软骨组织细胞的II型胶原(图A)、聚集蛋白聚糖(图B)、Sox9(图C)的mRNA量的结果的图表。柱1和2表示正常软骨(阳性对照)，柱3和4为填充有本发明填充剂的样品，柱5和6为在骨缺损部中没有填充任何东西的样品，柱7和8表示在骨缺损部填充有超高分子量聚乙烯(以下表示为UHMPE)的样品。图17表示在骨缺损部填充有比较例的聚乙烯醇凝胶的样品、在骨缺损部填充有UHMPE的样品的组织学的染色图像(番红-O染色图像)。具体实施例方式本发明的骨填充剂由水凝胶构成，该水凝胶具有由2个以上的具有交联网络结构的聚合物(以下，将具有交联网络的聚合物表示为交联网络聚合物)形成的互穿网络结构或者由交联网络聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。本发明中所说的交联网络结构，例如，如国际专利申请公开WO2006/013612的图1(本说明书作为图1引用)所示，是指由具有多个交联点的聚合物而形成的网络结构。另外，本发明中所说的"互穿网络结构"是指2个以上的交联网络聚合物以进入;f皮此的网络结构中的方式缠绕，结果在内部形成有多个网络结构的结构或状态。例如，如图1所示，由具有多个交联点1的交联网络聚合物A和具有多个交联点2的交联网络聚合物B构成，两交联网络聚合物进入彼此的网络中相互物理性缠绕的结构或状态。本发明中所说的"半互穿网络结构"，是指直链聚合物以进入交联网络聚合物的网络中的方式缠绕在交联网络聚合物中，结果在内部形成有多个网络结构的水凝胶的结构或状态。例如，如国际专利申请公开WO2006/013612(图2)(本说明书作为图2引用)所示，由具有多个交联点3的交联网络聚合物C和直链聚合物D构成，直链聚合物D进入交联网络聚合物的网络中相互物理性缠绕的水凝胶的结构或状态。具有本发明的"互穿网络结构"的水凝胶还可以部分地进一步含有直链聚合物缠绕而成的上述半互穿网络结构，另外，本发明的"半互穿网络结构"还可以部分地进一步含有其它的交联网络聚合物缠绕而成的"互穿网络结构"。即，一个水凝胶可以同时具有互穿网络结构和半互穿网络结构。另外，虽然在图1和图2中第一网络结构A和C描绘成比第二网络结构B和直链聚合物D粗，但这只是为了方便而改变了粗度描绘出的。另外，"互穿网络结构，，和"半互穿网络结构"的概念是，不仅是由2个聚合物形成的结构(双网型)，也包括由三个或三个以上的聚合物形成的形态。另外，"2个以上，，意味着形成"互穿网络结构，，或"半互穿网络结构"的聚合物为2个以上，网络结构的情况，也包括作为化学物质为相同种类的2个以上的聚合物形成网络结构的情况。本发明中，构成交联网络结构的2个以上的聚合物优选为，由具有能够荷正电或负电的基团的不饱和单体形成的聚合物和由具有电中性的基团的不饱和单体形成的聚合物的组合。作为上述的具有能够荷正电或负电的基团的不饱和单体，适宜的为具有酸性基团(例如，羧基、磷酸基和磺酸基)、碱性基(例如氨基)的不饱和单体，例如可以举出2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸(AMPS)、丙烯酸(AA)、曱基丙烯酸或它们的盐。另外，作为具有电中性基团的不饱和单体，例如可以举出二曱基硅氧烷、苯乙烯(St)、丙烯酰胺(AAm)、N-异丙基丙烯酰胺、N,N-二甲基-丙烯酰胺、乙烯基吡啶、苯乙烯、曱基丙烯酸曱酯(MMA)、含氟不饱和单体(例如，丙烯酸三氟乙酯(TFE))、丙烯酸羟乙酯或醋酸乙烯酯。本发明中可利用的水凝胶的情况为，通过先使具有能够荷正电或负电的基团的不饱和单体聚合而形成第一网络结构，然后，使该网络部分中含有具有电中性基团的不饱和单体后，将具有电中性基团的不饱和单体聚合或聚合并交联，从而可以形成"互穿网络结构"或"半互穿网络结构"。"互穿网络结构"和"半互穿网络结构"中任一情况下，就交联网络聚合物的交联度来说，第一交联网络可以在大约0.1摩尔％~20摩尔％的范围内任意设定，第二交联网络可以在大约0摩尔％~20摩尔％的范围内任意设定。优选第一交联网络在大约80.5摩尔％~10摩尔％的范围内任意设定，第二交联网络在大约0摩尔°/。~5摩尔％的范围内任意设定。进一步优选第一交联网络在大约2摩尔％~6摩尔%的范围内任意设定，第二交联网络在大约0摩尔％~2摩尔的范围内任意设定。这里，"交联度"是指交联剂的摩尔浓度与单体的投料摩尔浓度的比以百分数表示的值。另外，"互穿网络结构"中的2个以上的交联网络聚合物的交联度可以各自独立地设定。例如，可以设定为具有能够荷电的基团的交联网络聚合物的交联度比具有电中性基团的交联网络聚合物的交联度大，或者反之也可以。交联剂可以根据单体成分适宜地选择而使用。关的国际专利申请公开WO2003/093337、国际专利申请公开WO2006/013612、曰本特开2006-42795、国际专利申请公开WO2006/001313、日本特开2006/213868、进而J.P.Gong等人(AdvancedMaterials(先进材料)，2003年，第15巻，第1155-1158页)等中详细公开。本发明可以利用这些现有技术中记载的任何一种凝胶。另外，本发明的骨填充剂由于不特别需要在国际专利申请公开WO2006/013612中公开的作为人工半月板所期望的机械强度，因此，对于本发明的骨填充剂或其制造方法来说，不一定需要在国际专利申请公开WO2006/013612中记载的用于提高水凝胶强度的种种条件。本发明优选的骨填充剂是由以2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸(AMPS)为原料单体的交联网络聚合物(PAMPS)和以N,N-二甲基-丙烯酰胺(DMAA)为原料单体的交联网络聚合物(PDMAAm)构成的、具有互穿网络结构的水凝胶(以下称为PAMPS/PDMAAm凝胶)。该PAMPS/PDMAAm凝胶为按国际专利申请公开WO2006/013612的实施例23中所记载的方法而制造的水凝胶。PAMPS/PDMAAm凝胶具有以下特征摩擦系数大约为l(T3，与软骨大致相同，6周的皮下植入试验中的物理特性几乎没有变化，另外，颗粒埋植试验中l周后的炎症反应虽然显著高于阴性对照而显著少于阳性对照，但是4周后和6周后，炎症反应比阴性对照少。另外，由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)为原料单体的交联网络聚合物(PAMPS)和以丙烯酰胺形成原料单体的交联网络聚合物(PAAm)构成的、具有互穿网络结构的水凝胶(PAMPS/PAAm凝胶)，或由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷石危酸钠(Sodium2画acrylamido-2-methylpropanesulfate,NaAMPS)为原料单体的交联网络聚合物(PNaAMPS)和以N,N-二曱基-丙烯酰胺(DMAA)为原料单体的交联网络聚合物(PDMAAm)构成的、具有互穿网络结构的水凝胶(PNaAMPS/PDMAAm凝胶)也具有和PAMPS/PDMAAm水凝胶同样的促进软骨组织再生的功能。本发明的骨填充剂虽然不特别要求具有人工软骨程度的强度，但是考虑到填充到骨时的操作性或软骨组织的再生促进能力等，优选具有某种程度的强的机械强度可以如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>接下来，说明有关本发明的骨填充剂的使用方法。本发明的骨填充剂是用于以软骨组织的再生治疗为目的的外科处置中使用的骨填充剂。该外科处置是指将位于受到损伤的软骨组织的正下方的软骨下骨和软骨组织一起进行切削，设置具有适当深度的孔或沟(以下，称为骨缺损部)，在其中填充本发明的骨填充剂至残存有适当深度的骨缺损部。在图13中模式性的表示了使用本发明的骨填充剂的上述外科处置。以往存在的治疗理念的人工软骨不是希望软骨的再生，而是将作为替代材料的人工材料以不留有骨缺损的方式对合填充到软骨面上，但是本发明的人工材料的使用方法与此完全不同。就通过利用本发明的骨填充剂的外科处置而进行的软骨组织的再生治疗来说，从生物体中选取的软骨组织的移植和促进软骨的再生的特别的体液因子的投入都不是必须的，而是通过将凝胶材料填充到软骨组织的自然再生的至今为止没有先例的软骨组织的再生治疗方法。特别是用该治疗方法，除了可以使软骨组织再生之外，还可以使软骨下骨组织再生成覆盖住埋在骨缺损部的骨填充剂，以进一步覆盖该再生的软骨下骨组织的方式使软骨组织再生。以往，在生物体内再生软骨组织被认为是不可能的，因此通过利用本发明的骨填充剂不仅可以再生软骨组织，而且可以共同再生软骨下骨和软骨组织，这是史无前例令人吃惊的结果。使用本发明的骨填充剂的外科处置，如前所述，将位于受到损伤的软骨组织的正下方的软骨下骨与软骨组织一起切削，设置骨缺损部，在其中填充本发明的骨填充剂至残存有适当深度的骨缺损部。在该外科处置中，优选调节水凝胶的填充量使残存有从骨缺损部周围的软骨组织的关节面(与软骨下骨接触的面的相反侧的面，筒称为关节面)到朝向该关节面侧的水凝胶的表面(以下简单表示为水凝胶表面)的间隔。例如，就实施例中所示的日本白色家兔来说，从骨缺损面的关节面到水凝胶表面的间隔希望为5mm以下，优选为0.7mm~2.8mm,进一步优选为0.7mm~2.1mm。优选根据作为对象的生物种类或软骨部位周围的力学环境来适宜地调整该间隔。另外，本发明的骨填充剂在填充到骨中这样的使用方式中，对于生物体是无毒的，在软骨组织或软骨组织和软骨下骨组织再生后，不一定非要从骨缺损部中除去。因此，接受用本发明的骨填充剂的外科处置的患者，由于只要接受一次设置骨缺损部来填充骨填充剂这样的处置就可以了，因此与需要多次处置的以往的治疗方法相比，可以减轻患者的负担。像这样，本发明的骨填充剂通过如上所述埋入骨缺损部中，可以诱导软骨下骨组织、软骨组织的再生，因此，本发明也是一种意图将上述水凝胶作为软骨和/或软骨组织再生诱导剂，或软骨和/或软骨组织再生促进剂来利用的发明。以下，例示本发明的骨填充剂的制造例和使用例，进一步详细地说明本发明，但是这些例子不能限定性地解释本发明。实施例实施例1准备纵80mmx横80mmx厚5mm，宽度为5mm的硅板框，在板框的一边上由框的外侧向内側挖一个3mm的沟。将该硅板框夹在2张纵100mmx横100mmx厚3mm的玻璃板中，装配成重合容器。混合25mL的2mol/L的2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸(AMPS)水溶液、lmL的作为交联剂的2mol/L的N,N'-亚曱基双丙烯酰胺(MBAA)水溶液、0.5mL的O.lmol/L的2-氧代戊二酸水溶液和水，调制成50mL的水溶液。从上述重合容器的沟流入用氮气脱氧的水溶液，密封沟部分后，用波长为365nm的UV灯(22W,0.34A)在常温下照射6小时的紫外线使其聚合，从而制成交联度为4mol。/。的PAMPS凝胶(第一网络结构)。然后，混合100mL的6mol/L的N,N-二曱基-丙烯酰胺(DMAA)水溶液、2mL的0.1mol/L的N，N'-亚曱基双丙烯酰胺(MBAA)水溶液、2mL的0.1mol/L的过硫酸钾水溶液和水，制成200mL的水溶液(浸渍溶液)。该浸渍溶液用氮气进行30分钟的脱氧。将从重合容器中取出的上述PAMPS凝胶浸泡在移入适当盆中的浸渍溶液中，在4。C水箱中一边不时轻轻振荡，一边放置2天，使上述浸渍溶液在所述PAMPS凝胶中扩散浸透。然后，从所述浸渍液中取出凝胶，裁剪成适当大小后，在不混入气泡的状态下将该凝胶夹持在纵100mmx横100mmx厚3mm的两张玻璃板之间。通过密封该2张玻璃板周围的4边后，在60°C的水浴中进行6小时的DMAA聚合，从而制成作为双网型水凝胶的骨填充剂(PAMPS/PDMAAm凝胶)。试验例1使用实施例中制造的本发明的骨填充剂，如下所述进行用于软骨组织再生的外科处置。在成熟的日本白色家兔(3.0~4.2kg,20只)的两膝大腿骨/膝盖骨关节的大腿骨侧，垂直地制作直径为4.3mmx9.0mm的骨缺损部，在右膝的骨缺损中通过嵌压填充实施例中制造的PAMPS/PDMAAm凝胶(直径4.5mmx9.0mm)。这时，调节从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔为0.0~5.0mm来填充PAMPS/PDMAAm凝胶。这里，间隔0.0mm是指以关节面和PAMPS/PDMAAm凝胶表面一致的方式填充有PAMPS/PDMAAm凝胶的状态或处置组，间隔5.0mm是指以在关节面和PAMPS/PDMAAm凝胶表面之间设置5.0mm的缝隙的方式填充有PAMPS/PDMAAm凝胶的状态或处置组。手术后在笼内伺养4周后将其杀死，用肉眼观察膝关节后，分别对左右膝进行组织学(番红-O染色，广谷等人，临床整形外科，1976,第ll巻，第12号，40-44页)的评价。在进行组织学的评价时，大腿骨以通过圆形损伤部位12中心的矢状面做切片，膝盖骨以正中矢状面做切片。另外，从骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔(mm)的测定，是对填充有PAMPS/PDMAAm凝胶的中心部、以及与夹持该中心部而相对的位置的水凝胶的两个端点共计三个点进行的，该实际测定值的平均作为^^人骨缺损部的关节面到PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔。另夕卜，在成熟的日本白色家兔(3.04.2kg，20只)的两膝大腿骨/膝盖骨的大腿骨侧，垂直地制作骨缺损部(直径为4.3mm,深度随机设定为lmm、2mm、3mm、4mm、5mm)，然后在不填充任何东西的状态下，在笼内饲养4周后作为无处置对照组。其结果为，无处置对照组在任何深度的骨缺损部中，几乎所有膝盖的骨缺损部都填充有新生骨，但是该表层在存在有高低差的状态下被纤维组织覆盖，完全没有发现软骨组织。在几个膝盖中虽然新生骨的表层的纤维组织和纤维软骨样组织混合存在，但是在这些膝盖上没有发现透明软骨的再生。与此相对，在骨缺损部填充有实施例中制造的PAMPS/PDMAAm凝胶的组中，根据关节面和PAMPS/PDMAAm凝胶表面的间隔观察到如下的结果。1)间隔为O.Omm时(图3)在骨缺损部周围，与无处置对照组相比没有观察到特别的变化，也没有观察到关节浮肿。骨缺损部被PAMPS/PDMAAm凝胶填充，与填充时没有变化。在PAMPS/PDMAAm凝胶和骨缺损部的交界部确认围绕有由新生骨而成的骨壁，在其中一部分中确认有软骨组织的再生。2)间隔为0.0mm~0.6mm时(图4)PAMPS/PDMAAm凝胶表面覆盖有薄的纤维组织，另夕卜，在PAMPS/PDMAAm凝胶和骨缺损部的交界部确认有软骨样组织。3)间隔为0.7~1.3mm时(图5)设置在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上的间隔完全被再生的软骨组织埋住。该再生的软骨组织被番红-O很好地染色。软骨细胞存在与PAMPS/PDMAAm凝胶表面近的部分致密，与关节面近的部分疏松，显示与正常软骨接近的分布。另外，在再生的软骨组织的最表层确认有菲薄的光亮层(LaminaSplendensde)样结构。4)间隔为1.4mm~2.0mm时(图6)与3)同样地，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上设置的间隔完全被软骨组织埋住。进而，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面和再生的软骨组织之间确认有软骨下骨的骨新生。5)间隔为2.1mm~2.8mm时(图7)确认有在PAMPS/PDMAAm凝胶表面的软骨下骨的骨新生，以及在其上的软骨组织的再生。并且，在与再生的软骨组织的关节面近的部位，确认有混合存在有纤维组织和软骨组织的软骨样组织的再生。在该软骨样组织内分散存在有新生骨。6)间隔大于2.8mm时(图8)与无处置对照组类似的结果，在PAMPS/PDMAAm凝胶表面上设置的间隔中填充有新生骨，其表面部在残存有高低差的状态下被纤维组织覆盖，没有发现软骨组织的再生。在几个膝盖中虽然发现在新生骨的表面混合存在有纤维组织和纤维软骨样组织，但是没有确认出软骨细胞的排列结构，还发现了纤维软骨样组织内部骨化的膝盖。试验例2对试验例1的4)的间隔为1.4mm2.0mm的样品反复进行实验，通过番红-O染色来确认每周的软骨组织再生的状态。试验例3参考Kumagai等人的方法(Kumagai等人，J.Anat.,1994年,第185巻，第279-284页)确认出试验例2样品的再生部位中2型胶原的出现。具体为，切片用蛋白酶K(ProteinaseK)在室温下进行6分钟的处理后，用PBS洗净，1%的过氧化氢/曱醇中浸渍30分钟。用PBS洗净后，使用稀释50倍的一次抗体(小鼠抗人II型胶原抗体，富士药品工业)在室温下孵育60分钟。用PBS再次洗净后，使用二次抗体(抗小鼠IgG抗体，Envision)在室温下孵育30分钟。然后，用DABDAKO(DAB显色试剂盒)使其生色，最后用苏木精将核染色。其染色图像表示在图15中。试验例4从试验例2的再生部位和对照试验后的处置周围部位回收组织，使用瑞博普试剂盒(RiboPureKit)(Ambion公司)提取RNA。相对于l吗的RNA,用PrimeScriptRT反应试剂盒(ReagentKitX宝生物工程有卩艮公司(TAKARA))进行反转录反应，合成单链的cDNA。进而，对于已知作为软骨细胞的标志的II型胶原、聚集蛋白聚糖、Sox9，使用基于编码各自的蛋白质的核酸的碱基序列信息而设计的引物DNA,使用SYBR(注册商标)PremixExxTaq(宝生物工程有卩艮公司)在梯度PCR扩增仪ThermalCyclerDice(注册商标)TP800(宝生物工程有限公司)中进行实时聚合酶链反应(95°C5秒和60。C30秒进行40个循环)，用扩增仪软件(ThermalCyclerDiceRealTimeSystemSoftware)来解析这3种类型的蛋白质的mRNA量。就引物DNA的碱基序列来说，聚集蛋白聚糖为GCTACGACGCCATCTGCTAC(正向)，GTCTGGACCGTGATGTCCTC(反向)，II型胶原为GACCATCAATGGCGGCTTC(正向)，CACGCTGTTCTTGCAGTGGTAG(反向)，Sox9为AACGCCGAGCTCAGCAAGA(正向)，TGGTACTTGTAGTCCGGGTGGTC(反向)。其结果示于图16中。在发现了软骨组织再生的组织中，确认有上述三种标志蛋白质的mRNA的出现。而另一个方面，对照组中几乎没有发现任何标志蛋白质的出现。实施例2除了将实施例1的6mol/L的N,N-二曱基-丙烯酰胺(DMAA)变成同摩尔的丙烯酰胺(AAm)之外，在完全相同的条件下进行操作，制成作为双网型水凝胶的骨填充剂(PAMPS/PAAm凝胶)。试验例5使用实施例2中制造的本发明的骨填充剂，用与试验例1所述的同样的方法进行用于软骨组织再生的外科处置。在骨缺损部中填充有实施例2中制造的PAMPS/PDMAAm凝胶的组中，根据关节面和PAMPS/PAAm凝胶表面的间隔观察到如下的结果。1)间隔为0.0mm~0.6mm时没有发现软骨组织的再生。2)间隔为0.7mm~1.3mm时(图9)在设置在PAMPS/PAAm凝胶表面上的间隔发现了局部的软骨组织的再生。3)间隔为1.4~2.0mm时(图10)在骨表面的附近存在少量的软骨再生组织。4)间隔为2.1mm~2.8mm时(图11)虽然在PAMPS/PAAm凝胶表面发现了被认为是脂肪变性样坏死的组织图像，但是在与关节面接近的部位发现了与关节面平行的软骨样组织的再生。5)间隔比2.8mm大时(图12)虽然在PAMPS/PAAm凝胶表面发现了被认为是脂肪变性样坏死的组织图像，但是在与关节面接近的部位发现了与关节面平行的软骨样组织的再生。比较例在与试验例1同样的条件下，对于骨缺损部填充有替代本发明的骨填充剂的聚乙烯醇凝胶的样品和骨缺损部填充有用作为人工关节材料的超高分子量聚乙烯(UHMPE)的样品，都没有观察到软骨组织的再生(图17)。权利要求1.一种软骨组织再生治疗用骨填充剂，其特征在于，由水凝胶构成，所述水凝胶具有由2个以上的具有交联网络结构的聚合物形成的互穿网络结构或由具有交联网络的聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。2.根据权利要求1所述的骨填充剂，其中，具有交联网络结构的聚合物或直链聚合物是具有电荷的不饱和单体和/或电中性的不饱和单体的聚合物。3.根据权利要求2所述的骨填充剂，其中，具有电荷的不饱和单体为具有酸性基团和/或>威性基团的不饱和单体。4.根据权利要求3所述的骨填充剂，其中，酸性基团为羧基、磷酸基或磺酸基或者这些基团的盐。5.根据权利要求3所述的骨填充剂，其中，具有酸性基团的不饱和单体为2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸或其盐。6.根据权利要求2所述的骨填充剂，其中，电中性的不饱和单体为N，N-二曱基-丙烯酰胺。7.根据权利要求1所述的软骨组织再生治疗用骨填充剂，其由水凝胶构成，该水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合物和以N，N-二曱基-丙烯酰胺为原料单体的具有交联网络结构的聚合物构成的互穿网络结构。8.—种软骨或软骨组织再生诱导剂，其特征在于，由水凝胶构成，该水凝胶具有由2个。9.根据权利要求8所述的软骨或软骨组织再生诱导剂，其由水凝胶构成，该水凝胶具有由以2-丙烯酰胺-2-曱基丙磺酸为单体的具有交联网络结构的聚合物和以N,N-二曱基-丙烯酰胺、丙烯酰胺或2-丙烯酰胺-2-曱基丙烷硫酸钠为全文摘要本发明提供一种医疗材料，其使得一种新的软骨组织再生治疗方法成为可能，该方法不同于移植自体软骨组织、软骨替代物或其他未分化细胞的治疗方法，是基于全新概念的方法。本发明提供一种软骨组织再生用骨填充剂，其由水凝胶构成，所述水凝胶具有由2个以上的交联网络聚合物形成的互穿网络结构，或由交联网络聚合物和直链聚合物形成的半互穿网络结构。通过将本发明的骨填充剂填充到设在位于受伤的软骨组织正下方的软骨下骨的孔或沟中，从而可以促进软骨组织的再生或软骨组织和软骨下骨两者的再生。文档编号A61L27/00GK101557839SQ20078004378公开日2009年10月14日申请日期2007年11月29日优先权日2006年11月29日发明者北村信人,安田和则,长田义仁,龚剑萍申请人:国立大学法人北海道大学