专利名称：治疗耳蜗和前庭病症的方法
本申请依据35 U.S.C.119(e)，要求2006年10月27日提交的美国临时申请系列号60/863,144的权益。以上提到的相关美国专利申请的完全公开内容结合到本发明中作为参考。
背景技术：
发明领域 本发明一般涉及药理学和神经学领域，并涉及保护哺乳动物内耳和听神经细胞(包括耳蜗和前庭系统)免受伤害或退化的方法。更具体地讲，本发明提供使用某些氨基甲酸酯化合物治疗括耳蜗和前庭紊乱的方法。
相关领域的描述 听觉缺失和平衡障碍是影响数以百万人群的严重残疾。听力损害可归咎于很多原因，包括感染、机械性损伤、暴露于强声、老化和损伤外周听觉系统的神经元和/或毛细胞的化学诱导的耳毒性。
外周听觉系统由听觉感受器、螺旋器中的毛细胞、和初级听觉神经元、耳蜗中的螺旋神经节神经元构成。螺旋神经节神经元(“SGN”)是初级传入听觉神经元，其将来自外周听觉受体、螺旋器中的毛细胞的信号通过耳蜗神经传递到大脑。第八脑神经将螺旋神经节中的初级听觉神经元连接到脑干上。第八脑神经还连接前庭神经节神经元(“VGN”)，其是负责平衡的初级传入感觉神经元，并将来自内耳的椭圆囊、球状囊和坛状体的信号传递给脑，传递给脑干。螺旋神经节和毛细胞中的初级传入神经元的破坏一直是听觉损伤的主要原因。外周听觉系统的损伤是大多数听觉缺失的原因(Dublin，1976；Rybak，1986；Lim，1986；Pryor，1994)。
听觉缺失或损伤是人残疾的一种常见原因。沿从外耳道至中枢神经系统的听觉传导路无论何处的损伤均可导致听力丧失和平衡障碍。可将听觉感受器分为外耳和中耳、内耳和听神经及中央听觉传导路。虽然物种与物种之间具有某些变化，但所有哺乳动物的通用特征是相同的。听觉刺激被机械性地通过外耳道、鼓膜和听骨链传输到内耳。
中耳和乳突一般充满空气。外耳和中耳的疾病通过干扰这种机械性传导，通常产生传导性耳聋。传导性听觉缺失的常见原因包括外耳道阻塞，可能由于耳道闭锁或耳垢引起；鼓膜增厚或穿孔，可能由外伤或感染引起；听骨链组件的固定或吸收；以及因鼓管阻塞，导致流体充满中耳腔。
通过内耳中的神经上皮细胞(毛细胞)和SGN，将听觉信息从机械信号转导为神经性指导的电脉冲。SGN的所有中央纤维在脑桥脑干的耳蜗神经核中形成突触。从耳蜗神经核中的听觉发射是双侧性的，其主要核位于下丘、丘脑的内侧膝状体和颞叶的听觉皮层。涉及听觉的神经元数目从耳蜗到听觉脑干和听觉皮层显著地增加。所有听觉信息都通过有限数目的毛细胞转导，毛细胞是内耳的感觉感受器，被称之为内毛细胞，数目比较少，是十分关键重要的，原因是它们形成具有约90％初级听觉神经元的突触。
通过比较，在耳蜗神经核的水平上，所测定的有关神经单元的数目数十万计。这样，听觉末梢中的相对较少的细胞的损伤或疾病即可导致重大的听力丧失或平衡障碍。因此，感觉神经损失的很多原因都归因于内耳的损伤。这种听力损失和平衡障碍可能是进行性的。另外，由于随着动物的老化而引起的耳解剖学的变化，听力明显急剧变差。
在胚胎形成过程中，前庭神经节、螺旋神经节和听囊均源于相同的神经元外胚层、听板。因此，前庭和听觉系统共有很多特性，包括毛细胞的外周神经元神经分布和中央突起(central projections)至脑干核。这两种系统对耳毒素都是敏感的，耳毒素包括治疗性药物、抗肿瘤剂、食物或药物中的污染物以及环境和工业的污染物。毒性药物包括广泛使用的化学治疗剂顺铂及其类似物(Fleischman等，1975；Stadnicki等，1975；Nakai等，1982；Berggren等，1990；Dublin，1976；Hood和Berlin，1986)、治疗革兰氏阴性菌引起的感染的通常使用的氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素(Sera等，1987；Hinojosa和Lerner，1987；Bareggi等，1990)、奎宁及其类似物、水杨酸盐及其类似物和髓袢利尿剂。
这些药物对听细胞和螺旋神经节神经元的毒性作用通常是其治疗有效性的限制因素。例如，氨基糖苷类抗菌药，如庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素等已知具有严重的毒性，特别是耳毒性和肾毒性，其减少了这些抗菌剂的用途(参见Goodman and Gilman第六版的治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，A.Goodman Gilman等，eds；Macmillan Publishing Co.，Inc.，New York，pp.1169-71(1980)或最新版本)。氨基糖苷类抗菌药通常被用作广谱的抗菌药，其对例如革兰氏阳性、革兰氏阴性和抗酸性细菌均有效。
氨基糖苷类抗菌药主要用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染，并例如与青霉素类联合使用发挥协同作用。正如由该族通用名称中所隐含的，所有氨基糖苷类抗生素都在糖苷键上包含氨基糖。中耳炎是一种用于描述中耳感染的术语，其感染非常普遍，尤其是在儿童中。对中耳的感染，一般例如以应答性或预防性方式全身性给予抗生素。全身性给予抗生素对抗中耳感染一般在中耳中导致一种延长的滞后时间达到治疗水平，并且为达到这样的水平需要较高的初始剂量。这些缺点使得其获得治疗水平的能力复杂化，并可能妨碍一起使用的其它抗生素的用途。
当感染到达晚期，全身给药通常是最有效的，但在该时间点上，可能已经造成对中耳和内耳结构的永久损伤。明确地讲，耳毒性是抗生素用药的一种剂量限定型副作用。例如，每日给予2g链霉素60-120日的近75％的患者呈现出某些前庭损伤，而每日用药1g，发病率则降低到25％。在每日接受1g链霉素超过一周的约4-15％患者中，也可发现听力损失，发展成为可测定的听力缺失。这种听力损失可进一步发展，并且如果持续治疗，可导致完全永久的耳聋。
另外，耳毒性也是顺铂的一种严重的剂量限定型副作用，顺铂是一种铂配位络合物，已被证实对多种人癌有效，包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌和头颈癌。顺铂损伤听觉和前庭系统(Fleischman等，1975；Stadnicki等，1975；Nakai等，1982；Carenza等，1986；Sera等，1987；Bareggi等，1990)。水杨酸酯类，如阿司匹林，因其抗炎、镇痛、退热和抗凝血作用而成为最常用的治疗药物。不幸的事，它们具有耳毒性副作用。它们通常导致耳鸣(“耳中有响声”)和短暂性听力丧失(Myers和Bernstein，1965)。但是，如果长期高剂量使用该药物，这种听力损害则可能变成持续性的且不可逆的，如见临床报道(Jarvis，1966)。
除耳毒性药物外，很多种疾病和退行性病症都不利地影响内耳毛细胞和相关的神经元。例如，免疫介导的耳病，如免疫介导的耳蜗或前庭病症(IMCVD)，对耳鼻喉科专家来讲是一种持续存在的治疗挑战。这些疾病代表一种感觉神经性听力丧失的综合征，其通常与被确认为是由于自身免疫机制的眩晕、耳鸣和耳胀(aural fullness)有关。IMCVDs的后遗症包括破坏性残疾，如深度耳聋和严重的前庭功能障碍。可应用免疫抑制性药物(如环磷酰胺)和抗风湿剂(如甲氨蝶呤)治疗IMCVD，但是它们伴随着功效变化、起效慢和有时存在严重毒性问题(Rahman，MU等Curr.Opin.Rheumatol.，May；13(3)184-9，(2001))。
术语“免疫介导的耳紊乱”或“免疫介导的耳病”指通过诸如自身免疫或炎症响应的基于免疫的机制引起的耳功能损伤。耳的任何部位都可能受影响，但内耳通常是最易受到损伤的。免疫介导的耳病包括但不限于免疫介导的耳蜗或前庭病症(IMCVD)、免疫介导的梅尼尔氏病、自身免疫性耳病(AIED)、科根综合征和韦格纳氏肉芽肿病。涉及免疫介导的耳病的综合征包括听力损害(包括一侧或两侧耳的全部或部分听力损失)、眩晕、耳鸣、耳胀、耳痛、耳液溢/慢性中耳炎和TM穿孔。
影响内耳的另一种疾病包括梅尼尔氏病(Meniere’s disease)。梅尼尔氏病的典型发作之前是一只耳胀，听力波动或耳鸣也可能在该发作之前出现。其完全发作通常包括严重眩晕、不平衡、恶心和呕吐，并可能持续2-4小时。梅尼尔氏病可引起无警告下突然跌倒，这是由前庭反射突然激活所引起。这种疾病不是致命性的，但可使人极端失去能力，并引起渐进性听力缺失。梅尼尔氏病相当普遍，仅在美国约就有0.2％的人群或600,000人中出现过该病。其原因尚未清楚，但认为是由于病毒和/或免疫过程影响内耳，但最终的结果通常是耳蜗和/或前庭系统的退化。
耳鸣是患者听到的一种清脆铃声的、嘶嘶声的或吼声的声音，它并不是由环境中的任何声音引起。耳鸣非常普遍，影响约3千6百万美国人，其中大约6％的一般人群患有严重症状。耳鸣是一种症状而不是一种特定的疾病，其可能有很多原因，包括因暴露于高噪声的机械损伤、退行性疾病，包括梅尼尔氏病，但大多数耳鸣由耳蜗或前庭神经损伤所引起。很多种常见药物也可引起耳鸣，包括阿司匹林、NSAIDS、髓袢利尿剂(如呋塞米(Lasix))、抗生素、奎宁和很多种类的化学治疗剂，如以上所述的顺铂。
因此，目前对预防、降低或治疗内耳疾病的发作和/或严重性以及涉及内耳组织(尤其是内耳毛细胞)和相关的听力神经的听力损伤的方法，存在着需求。特别令人关注的是作为耳毒性治疗药物的一种不需要的副作用出现的这些病症，所述药物包括顺铂及其类似物、氨基糖苷类抗生素、水杨酸酯及其类似物或者髓袢利尿剂，以及涉及内耳毛细胞和相关神经元的退行性疾病，包括局部缺血。另外，目前对能允许使用较高且由此更有效的剂量的这些诱发耳毒性药物，而同时抑制或降低这些药物引起的耳毒性的方法，存在着需求。我们所需要的是一种方法，其能为预防或根治性治疗与内耳组织损伤、缺失或退化相关的听力障碍，尤其是耳毒性诱发的和涉及内耳毛细胞和相关神经元的退行性疾病，提供一种安全、有效且作用延长的方法。
因此，对听力和平衡障碍以及与毛细胞和/或其支持细胞(包括第八脑神经)相关的其它病症的治疗方法一直存在着强烈的需求。本发明提供保护这些区域免受毒性药物和很多种退行性疾病影响的组合物和方法。
对耳蜗或前庭系统或者包括初级听觉感受器、螺旋器内的毛细胞、初级听觉神经元和耳蜗中的螺旋神经节神经元、第八脑神经的神经元和前庭神经节神经元在内的听觉或者前庭神经的各种类型的损伤或外伤，可产生深度的且长期的听力损失或平衡问题或者失去能力的症状，如眩晕、恶心和呕吐。某些这些效应通过神经元或其它内耳的相关细胞的渐进性死亡，即神经退行性变或神经元变性所引起。
神经元死亡或异常的机制是变化的，并且尚未完全清楚，但是当损伤或局部缺血性损伤时，损伤的神经元释放出大量神经递质谷氨酸，其对周围神经元具有兴奋性神经毒性(excitotoxic)(Choi等，(1988)，Neuron 1623-634；Rothman等，(1984)，J.Neurosci.41884-1891；Choiend Rothman，(1990)，Ann.Rev.Neurosci.13171-182；David等，(1988)，Exp.Eye Res.46657-662；Drejer等，(1985)，J.Neurosci.45145-151)。谷氨酸是一种带负电荷的氨基酸，它是哺乳动物神经系统中的一种兴奋性突触递质。虽然在神经末梢中谷氨酸浓度可达到毫摩尔范围，但其细胞外浓度却保持在较低水平以防止神经毒性。已注意到如果谷氨酸以高浓度存在，其可对神经元产生毒性。使用术语“兴奋性神经毒性”来描述当高浓度应用谷氨酸(及其它兴奋性氨基酸)时，其可对神经元产生细胞毒性作用。
生理上过量释放、吸收抑制或者两者可产生高水平的谷氨酸。正常情况下，通过神经元和星细胞维持低浓度的细胞外谷氨酸。神经元储存细胞内保存的谷氨酸并且调节其释放。参见Reagan，R.F.，Excitotoxicity and Central Nervous System Trauma，in The Neurobiologyof Central Nervous Trauma，New York，Oxford University Press，1994，pp.173-181(Salzman SK，Faden Al，eds)。星细胞通过特定的转运蛋白吸收细胞外谷氨酸，并将谷氨酸转化为谷氨酰胺，然后释放供神经元摄取。参见Robinson，M.B.& Dowd LA，Adv Pharmacol，1997；3769-115。在兴奋性神经毒性过程中，谷氨酸以自身延续性(self-perpetuating)方式通过神经元释放，导致过量或延长谷氨酸受体的激活。
这种能量衰竭性神经元上过量谷氨酸刺激与神经支持性星细胞隔离细胞外谷氨酸的毒性水平的能力降低的结合，通过坏死和细胞凋亡而导致神经元死亡。目前正在考察各种干涉方法来降低与中枢神经系统损伤和疾病相关的神经元死亡。另外，在很多慢性神经变性病症中，炎症和氧化应激是病理学的关键部分。参见Kermer等的Cell TissueRes 298383-395，1999。这些疗法包括谷氨酸释放抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、Ca2+通道阻断剂、GABA受体激动剂、神经节苷脂、神经营养因子、钙激活中性蛋白酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、自由基清除剂、免疫和细胞代谢调节剂。
例如，几种研究已表明在以下病理学中涉及谷氨酸1)亨延顿氏舞蹈病(HD)(Coyle和Schwartz，(1976)，Nature 263244-246；2)阿耳茨海默氏病(AD)(Maragos等，(1987)，TINS 1065-68；3)癫痫(Nadler等，(1978)，Nature 271676-677)；4)山黧豆中毒(Spencer等，(1986)，Lancet 2391066-1067；5)肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和关岛帕金森氏痴呆病(Caine等，(1986)，Lancet 21067-1070)以及与休克、局部缺血和再灌注有关的神经病理学(参见Dykens等，(1987)，J.Neurochem.491222-1228)。
因此，神经元损伤可由包括谷氨酸和天冬氨酸的兴奋性氨基酸通过受体的过度刺激引起(参见Lipton等(1994)New Engl.J.Med.330613 621)。现的确认为谷氨酸受体的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)亚型在正常脑功能中具有很多重要的作用，包括突触传递、学习和记忆以及神经元发育(参见Lipston等(1994)同上；Meldrum等(1990)Trends Pharm.Sci.11379-387)。但是，谷氨酸受体的NMDA亚型的过度刺激导致自由基产生的增加和神经元细胞死亡，其可通过抗氧化剂调节(参见Herin等(2001)J.Neurochem.781307-1314；Rossato等(2002)Neurosci.Lett.318137-140)。
因此，在耳蜗或前庭系统或者包括初级听觉感受器、螺旋器内的毛细胞、初级听觉神经元和耳蜗中的螺旋神经节神经元、第八脑神经的神经元和前庭神经节神经元在内的听觉或者前庭神经中的神经元和支持细胞的死亡或异常，可在哺乳动物(包括人)中产生深度且持久的听力损失和/或前庭障碍。因此，目前需要研制能保护哺乳动物内耳的细胞免受这种退化，即具有耳保护性的方法和化合物。
发明既述 本发明一般涉及神经保护的方法，更具体地讲，本发明涉及预防由损伤、外伤、毒素或急慢性疾病过程导致的哺乳动物内耳的神经组织和细胞损伤的方法和化合物，所述细胞源于相同的神经原外胚层。
本发明的部分基础在于发现给予氨基甲酸酯化合物家族的一或多个成员能对哺乳动物的神经系统提供一种普遍的神经保护作用，并且这种保护作用还包括源于相同的神经原外胚层的哺乳动物内耳的组件。这包括但不限于耳蜗或前庭系统或在胚胎形成过程中源于相同的神经原外胚层的听觉或前庭神经中的那些神经元、支持和相关细胞、听板，包括前庭神经节、耳蜗中的螺旋神经节神经元、听囊、初级听觉感受器，即螺旋器中的毛细胞，以及初级听觉神经元和第八脑神经神经元。
本发明提供的神经保护作用包括防护由神经损伤或创伤以及由神经毒性或耳毒性药物引起的伤害。因此，本发明提供的神经保护或耳保护作用将可用于治疗耳毒性药物和急慢性退行性疾病带来的损害，所述退行性疾病包括那些影响包括毛细胞和第八脑神经的耳蜗或前庭系统的疾病。
本发明提供的耳保护作用可对损伤或患病的组织发挥作用，或者可在预期发生损伤的过程中或之前以预防的方式发挥作用。
本发明通过单独给予患者有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐或酯或者连同药学上可接受的赋形剂与另一种药物联合给予，在有需要的患者中提供进行耳保护的方法；抑制细胞退化或细胞死亡的方法；治疗或预防耳退行性疾病的方法；或者改善化合物耳毒性作用的方法，如毒素；或者发挥耳毒性副作用的治疗化合物，如抗生素或化学治疗剂。
在各实施方案中，患者(如人)可能患有内耳创伤或损伤；或者可患有选自以下的病症耳毒性药物暴露、外伤、耳鸣、梅尼尔氏病，包括免疫介导的梅尼尔氏病，免疫介导的耳蜗或前庭紊乱(IMCVD)、自身免疫性耳病(AIED)、科根综合征以及影响内耳的第八脑神经的局部缺血性事件。
因此，本发明提供进行耳保护的方法，其包括给予有需要的患者治疗有效量的组合物，其包含至少一种具有式1或式2的化合物
式1
式2 其中R1、R2、R3和R4独立是氢或C1-C4烷基；而X1、X2、X3、X4和X5独立是氢、氟、氯、溴或碘。所述式1或式2的C1-C4烷基可以是取代的或未取代的。在本发明的一方面，C1-C4烷基被苯基取代。该苯基可以是取代的或未取代的。在某些实施方案中，该苯基是未取代的或者被卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基或氰基取代。
在本发明中，X1、X2、X3、X4和X5可以是氢、氟、氯、溴或碘。在某些实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5独立是氢或氯。在本发明的优选实施方案中，X1是氟、氯、溴或碘。在一方面中，X1是氯，X2、X3、X4和X5独立是氢。在另一优选实施方案中，R1、R2、R3和R4独立是氢。
本发明提供用于在患者中提供耳保护作用的式1或式2的对映体。在某些实施方案中，式1或式2化合物以其单一对映体形式存在。在其它实施方案中，式1或式2化合物以对映体混合物形式存在，其中一种对映体相对于另一种对映体优势。在一方面中，该对映体占优势的程度达90％或以上或者占优势的程度达98％或以上。
本发明还提供包括给予患者耳保护作用量的组合物的方法，所述组合物包含至少一种具有式1或式2的化合物，其中R1、R2、R3和R4独立是氢或C1-C4烷基；而X1、X2、X3、X4和X5独立是氢、氟、氯、溴或碘。在一实施方案中，在给予患者组合物之前，要做出决定，患者是否患有由例如毒性药物引起的某种类型的急性或慢性耳退行性或内耳损伤。
本发明还提供方法，该方法包括鉴别处于发展成为急性或慢性耳退行或内耳系统损伤风险的患者或者需要用下文定义的耳保护药物(OPD)治疗的患者，以及给予患者包含至少一种具有式1或式2化合物的组合物。
在本发明的某些实施方案中，提供神经保护作用的具有式1或式2的化合物的治疗有效量约为0.01mg/Kg/每剂量-150mg/Kg/每剂量。
在某些实施方案中，给予需要用耳保护药物或OPD治疗的受治疗者或患者治疗有效量的提供耳保护作用的药用组合物，所述组合物包含一或多种本发明的对映体或其药学上可接受的盐或酯以及药学上可接受的载体或赋形剂。
可将含有至少一种具有式1或式2化合物的药用组合物给予有需要的患者。在某些实施方案中，需要用耳保护作用药物或OPD治疗的受治疗者或患者可以是已经历某种形式的内耳细胞衍生的神经急性创伤或损伤的患者，或者是具有某种急性或慢性耳退行性疾病的患者。在一方面，将确定受治疗者或患者在给药时处于发展为急性或慢性耳退行性疾病的风险中，即需要用耳保护性药物治疗的患者。在另一实施方案中，有需要的患者是在给药时患有对其内耳细胞的急性损伤或创伤的患者。
附图简述
图1.Li-Pilo SE之后14天增加试验化合物剂量对计数的海马不同区域内神经元数目的影响。评价以各关键区域内神经元细胞体的数目来表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，试验化合物和对照组大鼠之间存在统计学上的显著差别；#p＜0.05，*p＜0.01，试验化合物和DZP大鼠之间存在统计学上的显著差别。
图2.Li-Pilo SE之后14天增加试验化合物剂量对计数的大脑皮层不同区域内神经元数目的影响。评价以各关键区域内神经元细胞体的数目来表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，试验化合物和对照组大鼠之间存在统计学上的显著差别；#p＜0.05，*p＜0.01，试验化合物和DZP大鼠之间存在统计学上的显著差别。
缩写D背部，V腹部。
图3.Li-Pilo SE之后14天增加试验化合物剂量对计数的梨状(piriform)皮层中神经元数目的可变的神经保护作用影响。评价以各关键区域内神经元细胞体的数目来表示。
οp＜0.05，·p＜0.01，试验化合物和对照组大鼠之间存在统计学上的显著差别；#p＜0.05，*p＜0.01，试验化合物和DZP大鼠之间存在统计学上的显著差别。
θp＜0.05，∞p＜0.01，通过给定剂量的试验化合物治疗的两个亚组大鼠(A和B)之间存在统计学上的显著差别。
缩写D背部，V腹部。
图4.增加试验化合物剂量对首次SRS(A)的潜伏期以及对内嗅(entorhinal)皮质(B)的III/IV层中保留的神经元数目的影响。各组和亚组中动物的数量在各条柱上指明。
在用60、90和120mg/kg试验化合物治疗的各组中，有一个明确的亚类，其大约一半的动物呈现出对癫痫明显延长的潜伏期，这似乎与内嗅皮质的III/IV层中的存活的神经元数目有关。
发明详述 患有源于神经组织的内耳细胞的任何种类的损伤或伤害的患者可能受益于本发明的这些神经保护的方法，所述神经组织包括但不限于耳蜗或前庭系统中的那些神经元、支持和相关细胞或者在胚胎形成过程中源于相同的神经原外胚层、听板的听觉或前庭神经，包括前庭神经节、耳蜗中的螺旋神经节神经元、听囊、初级听觉感受器，螺旋器中的毛细胞，以及初级听觉神经元和第八脑神经神经元。这种神经系统损伤对这些细胞可采取突然损伤或急性损伤的形式，如急性耳退行性疾病和耳毒性药物、缺氧-局部缺血或者导致细胞死亡或危害的这些情况的组合。
损伤包括但不限于可由选自以下病症引起的对内耳的创伤或损伤耳毒性药物暴露、外伤、耳鸣、梅尼尔氏病，包括免疫介导的梅尼尔氏病，免疫介导的耳蜗或前庭紊乱(IMCVD)、自身免疫性耳病(AIED)、科根综合征以及影响内耳或第八脑神经局部缺血性事件、钝性或穿透性脑外伤。另外，剥夺氧气或血液供给一般可引起急性损伤，如低氧和/或局部缺血下，包括但不限于听神经或相关结构的局部缺血或梗塞。
在一优选实施方案中，可将本发明化合物用于在涉及对内耳的神经元和神经元衍生的细胞造成外伤和渐进性损伤的疾病中提供耳保护作用，所述疾病由服用包括但不限于抗生素和化学治疗剂的耳毒性药物所引起。
因此，本发明所用术语“耳保护作用”或“耳保护的”应指抑制、预防、缓解或减轻以下细胞的功能障碍、退化或死亡的严重性神经细胞；轴突或其支持性或相关细胞，包括源自胚胎形成过程中源于相同神经原性外胚层、听板的细胞，所述听板包括哺乳动物(包括人)的第八或听觉神经元，耳蜗；前庭系统，前庭神经；初级听觉感受器，螺旋器中的毛细胞；初级听觉神经元；耳蜗中的螺旋神经节神经元“SGN”以及前庭神经节神经元(“VGN”)。这包括治疗或预防外伤、退行性疾病以及防止药物或毒素(例如抗生素和化学治疗剂或者其它毒素)的耳毒性作用。
因此，本文所用术语“需要用耳保护的药物(OPD)治疗的患者”指目前患有或可能发展为任何上述综合征或疾病的任何患者，或者需要或者已经服用耳毒性药物的患者，或者患有其中患者出现的临床症状或预后将得益于提供耳保护作用的任何疾病的患者，所述耳保护作用是预防所治疗的任何疾病或病症的发展、延长、恶化或抗药性增加，其中所述任何疾病或病症涉及哺乳动物(包括人)的第八脑神经的神经元、耳蜗、前庭系统、初级听觉感受器、螺旋器中的毛细胞、初级听觉神经元、耳蜗中的螺旋神经节神经元“SGN”以及前庭神经节神经元(“VGN”)。
本发明所用术语“治疗”或“处置”指在预防或缓解损伤、病变或病症中任何成功的标志，包括任何客观或主观的参数，如减轻、缓和、减小症状，或者使得患者更能耐受损伤、病变或病症；减慢恶化或衰退的速率；使得退化终点衰弱降低；或者改善患者的身心健康。症状的治疗或缓解可取决于客观或主观参数；包括身体检查和/或神经系统检查的结果。因此，术语“治疗”或“处置”包括给予本发明化合物或药物提供耳保护作用。
本文所用术语“治疗作用”指对预防或降低患者内耳细胞的死亡或损害或功能障碍有效提供的耳保护作用。
本发明中所用的术语“治疗有效量”指在需要这种耳保护作用治疗的受治疗者或患者中，产生如上定义的治疗作用的一或多种本发明化合物的充足量。
本发明所用术语“受治疗者”或“患者”可交互使用，并如本文所用的指任何哺乳动物，包括但不限于人，包括可给予本发明组合物的人类患者或受治疗者。术语哺乳动物包括人患者或非-人灵长类，和诸如家兔、大鼠和小鼠的实验动物以及其它动物。
在某些实施方案中，本发明方法有利地用于治疗尚未患有或已知患有本领域已知用氨基甲酸酯化合物可有效治疗的病症的患者。在这些情况下，以确定患者是否是以上定义的术语“需要用耳保护的药物(OPD)治疗的患者”为基础，做出使用本发明方法和化合物的决定。
在某些实施方案中，本发明提供耳保护的方法。在某些实施方案中，这些方法包括给予患者治疗有效量的本发明的氨基甲酸酯化合物，所述患者尚未有明显的内耳细胞损伤或损害的临床征兆或症状，但由于疾病、损伤或外伤、或者由于需要给予耳毒性药物、或者由于某些已知的生化性或遗传性的诱病因素或者发现一或多种这些疾病的证实的生物标记，患者可能为面临产生这种损伤的高危人群。
因此，在某些实施方案中，本发明的方法和组合物直接针对面临发展成为内耳损伤但尚未有临床迹象的患者的耳保护作用。该患者可能只是处于“较大的风险”之中，这是根据对患者的任何因素的识别、或其家族病史、身体检查或测定，表明其形成内耳损伤的风险大于平均值而确定的。因此，可使用通过任何现有途径确定患者可能处于“较大风险”的方法决定患者是否应该用本发明的方法治疗。
因此，在一示例性实施方案中，可采用已公认的确定内耳损伤风险因素的筛选方法，来鉴定可受益于通过本发明方法和化合物治疗的患者。这些筛选方法包括例如常规确定风险因素的步骤以及用耳毒性药物的治疗。
可根据多种“代用标记物”或“生物标记物”来确定在尚未有临床体征或症状的患者中，可受益于用OPD治疗的患者。
本发明所用术语“代用标记物”和“生物标记物”可交互使用，指可与现存或将来形成的神经或内耳损伤确切相关的任何解剖学的、生物化学的、结构的、电的、基因的或化学的指示剂或标记物。在某些情况下，可使用脑显像技术，如计算机X线层扫描术(CT)、核磁共振影像(MRI)或者正电子发射断层摄影术(PET)确定患者是否面临神经元损伤的危险。
预期将来将研制出更多的利用多种检测技术的这类生物标记物。预期任何这类现存的或可能将来形成的神经损伤的标记物或指示剂，如本发明中所用的后一术语，都可用于本发明方法中，用以测定用本发明化合物和方法治疗的需要。
受治疗者患有或可能面临发展成为内耳损伤的风险的确定法还包括例如医学评价，其包括完整的病史、身体检查和一系列的有关血液测试。其还可包括脑电图(EEG)、CT、MRI或PET扫描。
本发明的氨基甲酸酯化合物 本发明提供在有需要的患者中使用2-苯基-1，2-乙二醇单氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯提供耳保护作用的方法。
对于本领域技术人员来讲，用于本发明方法中的合成和纯化氨基甲酸酯化合物(包括氨基甲酸酯对映体)的适合的方法是熟知的。例如2-苯基-1，2-乙二醇单氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯的纯对映体形式和对映体混合物在美国专利号5,854,283、5,698,588和6,103,759中有描述，其公开内容全文结合到本发明中作为参考。
本发明代表性的氨基甲酸酯化合物包括那些具有式1或式2的化合物
式1
式2 其中R1、R2、R3和R4独立是氢或C1-C4烷基，X1、X2、X3、X4和X5独立是氢、氟、氯、溴或碘。
本文所用“C1-C4烷基”指取代或未取代的具有1-4个碳原子的脂肪族烃。具体地讲，包括在“烷基”定义中的是那些任选取代的脂肪族烃。在本发明优选实施方案中，C1-C4烷基或者是未取代的或者被苯基取代。
本文中所用术语“苯基”无论单独或作为另一基团的部分使用时，被定义为取代或未取代的带有6个碳原子的芳烃。具体地讲，包括在“苯基”定义中的是那些任选取代的苯基。例如，在本发明的一优选实施方案中，“苯基”或者是未取代的或者被卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基取代。
在本发明的一优选实施方案中，X1是氟、氯、溴或碘，而X2、X3、X4和X5是氢。
在本发明的另一优选实施方案中，X1、X2、X3、X4和X5独立是氯或氢。
在本发明的另一优选实施方案中，R1、R2、R3和R4都是氢。
应清楚的是本领域的普通技术人员可选择本发明化合物上的取代基和取代模式，以提供化学上稳定的并且易于通过本领域已知的技术以及本文提供的方法合成的化合物。
代表性的2-苯基-1，2-乙二醇单氨基甲酸酯和二氨基甲酸酯包括下列化合物
式3
式4
式5
式6
式7
式8 本发明包括使用分离的式1或式2的对映体。在一优选的实施方案中，可使用包含分离的式1的S-对映体的药用组合物在患者中提供神经保护作用。在另一优选的实施方案中，可使用包含分离的式2的R-对映体的药用组合物在患者中提供神经保护作用。在另一实施方案中，可使用包含分离的式1的S-对映体和分离的式2的R-对映体的药用组合物在患者中提供神经保护作用。
本发明还包括使用式1或式2的对映体的混合物。在本发明的一方面中，一种对映体将占优势。在混合物中占优势的对映体为在混合物中存在的量比在混合物中存在任一其它对映体的量大的对映体，例如其量大于50％。在一方面中，一种对映体占优势的程度达90％或91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％或以上的程度。在一优选实施方案中，在包含式1化合物的组合物中占优势的对映体是式1的S-对映体。在另一优选实施方案中，在包含式2化合物的组合物中占优势的对映体是式2的R-对映体。
在本发明的一优选实施方案中，以单一对映体或者以本发明组合物中占优势的对映体存在的对映体由式3或式5代表，其中X1、X2、X3、X4、X5、R1、R2、R3和R4定义同上，或者由式7或式8代表。
式3
式5
式7
式8 本发明提供使用式1和式2代表的化合物的对映体和对映体混合物的方法。式1或式2的氨基甲酸酯对映体在苄基位置含有不对称手性碳，其是与苯环邻近的脂肪族碳。
所分离的对映体是基本上不含对应的对映体的对映体。因此，所分离的对映体指通过拆分技术分离的或者制备的不含对应的对映体的化合物。此处所用术语“基本上不含”指该化合物由比例非常大的一种对映体组成。在优选实施方案中，所述化合物包括重量比至少为约90％的优选对映体。在本发明的其它实施方案中，该化合物包括重量比至少为约99％的优选对映体。优选的对映体可通过本领域技术人员已知的任何方法，由外消旋混合物中分离，包括高效液相色谱法(HPLC)和手性盐的形成和结晶法，或者可通过本发明所述的方法制备优选的对映体。
制备优选对映体的方法对于本领域技术人员是已知的，并在以下文献中有描述，例如Jacques等的Enantiomers，外消旋体和拆分(Wiley Interscience，New York，1981)；Wilen，S.H.等的Tetrahedron332725(1977)；Eliel，E.L.，碳化合物的立体化学(McGraw-Hill，NY，1962)；以及Wilen，S.H.拆分剂表和光学拆分(Tables of ResolvingAgents and Optical Resolutions)p.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of NotreDame Press，Notre Dame，IN 1972)。
另外，本发明化合物可按美国专利号3,265,728(其公开内容全文通过引用结合到本发明中作为参考)、3,313,692(其公开内容全文通过引用结合到本发明中作为参考)以及先前参考的美国专利号5,854,283、5,698,588和6,103,759(其公开内容全文通过引用结合到本发明中作为参考)中所述制备。
作为药物的氨基甲酸酯化合物 本发明提供作为药物的式1和/或式2的对映体混合物和分离的对映体。可将所述氨基甲酸酯化合物配制为在患者中提供神经保护作用的药物。
一般来讲，可通过本领域任何已知的给予治疗药物方法，将本发明的氨基甲酸酯化合物作为药用组合物给药，包括口服、颊下、局部、全身(如经皮、鼻内或通过栓剂)或非肠道(如肌内、皮下或静脉注射)。直接将化合物给予神经系统可包括例如给予大脑内、心室内、脑室内、鞘内、脑池内、椎管内或通过传递给予脊柱周围的途径，其通过带有或不带有泵装置的颅内或脊椎内注射针或导管进行。
组合物可采用片剂、丸剂、胶囊、半固体、散剂、缓释制剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、酏剂、气雾剂或者任何其它适合的组合物形式；并可含有至少一种本发明的化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂的组合。适合的赋形剂对于本领域普通技术人员来讲是是熟知的，并且它们以及制备所述组合物的方法可在此类标准参考书中发现，例如Alfonso ARRemington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton PA，1985，其公开内容全文通过引用结合到本发明中作为参考。适合的液体载体，尤其是注射溶液，包括水、盐水溶液、葡萄糖水溶液和二醇等。
可将氨基甲酸酯化合物作为含水混悬液提供。本发明的含水混悬液可含有氨基甲酸酯化合物并混有适合制备含水混悬液的赋形剂。这些赋形剂可包括例如悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶，以及分散剂或着湿剂，如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸的缩合产物(如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。
水性混悬剂也可包含一种或多种防腐剂，诸如对-羟基苯甲酸乙酯或正-丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖、阿司帕坦或糖精。可调节制剂的等渗性。
可通过将氨基甲酸酯化合物混悬于植物油，诸如落花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或于矿物油，诸如液体石蜡中；或以上这些的混合物中，配制用于本方法的油性混悬剂。油性混悬剂可包含增稠剂，诸如蜂蜡、固体石蜡或正十六醇。可加入甜味剂以提供可口的口服制剂，诸如丙三醇、山梨醇或蔗糖。这些制剂可通过加入抗氧化剂，诸如抗坏血酸进行防腐。可注射的油性媒介物的实例，参见Minto，J.Pharmacol.Exp.Ther.28193-102，1997。本发明的药用制剂也可呈现水包油乳剂的形式。油相可为如上描述的植物油或矿物油或这些的混合物。
适宜的乳化剂包括天然产生的树胶，诸如阿拉伯树胶和西黄蓍胶、天然产生的磷脂，诸如大豆卵磷脂、源自脂肪酸与己糖醇酐的酯或偏酯，诸如山梨聚糖单-油酸酯以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，诸如聚氧乙烯山梨聚糖单-油酸酯。如在糖浆剂和酏剂的制剂中的那样，乳剂也可包含甜味剂和矫味剂。这样的制剂也可包含缓和剂、防腐剂或着色剂。
可任选化合物单独或与其它适宜的成分被制成气雾制剂(即，可使它们成“喷雾状”)经由吸入给药。可将气雾制剂置于加压的可接受的抛射剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
本发明的适宜用于胃肠外，例如，通过关节内(在关节中)、静脉、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径给药的制剂，可包括水性和非-水性等渗灭菌注射溶液剂，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与意欲接受者的血液等渗的溶质，以及可包含助悬剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非-水性灭菌混悬剂。可使用的可接受的媒介物和溶剂为水和林格氏(Ringer′s)溶液、等渗氯化钠。另外，灭菌固定油可常规用作溶剂或混悬介质。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的单-或双甘油酯类。另外，脂肪酸类，诸如油酸可同样地用于可注射的制剂中。这些溶液剂为灭菌的且一般没有不合乎需要的物质。
当化合物充分溶解时，可将它们直接溶解于生理盐水中，使用或不用适宜的有机溶剂，诸如丙二醇或聚乙二醇。细粉碎的化合物的分散可在淀粉或羧基甲基纤维素钠水溶液中或在适宜的油，诸如落花生油中完成。这些制剂可经常规的、熟悉的消毒技术消毒。需要时，该制剂可包含药学上可接受的接近生理条件的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
在这些制剂中的氨基甲酸酯化合物的浓度可变化很大，并且将主要基于液体的体积、粘度、体重等，依据选择的特定给药模式和患者的需要进行选择。对于IV给药，制剂可为灭菌的可注射制剂，诸如灭菌的可注射水性或油性混悬剂。可依据已知技艺使用那些适宜的分散剂或湿润剂和助悬剂配制该混悬剂。灭菌的可注射制剂也可为在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，诸如1，3-丁烷二醇溶液中的灭菌的可注射溶液或混悬剂。所推荐的制剂可以单位-剂量或多-剂量密封容器，诸如安瓿和小瓶呈现。可自之前描述的各种灭菌的散剂、颗粒剂和片剂，制备注射溶液剂和混悬剂。
适用于本发明实践的氨基甲酸酯化合物可以并优选通过口服给予。组合物中本发明化合物的量可根据组合物的类型、单位剂量的大小、赋形剂的种类以及本领域普通技术人员熟知的其它因素在很大范围内变化。最终的组合物一般可含有例如重量比为1.0％(％w)-95％w的氨基甲酸酯化合物，优选10.0％w-90％w，其余的为赋形剂。
可使用本领域熟悉的药学上可接受的载体、以适宜口服给药的剂量，配制适于口服给药的药用制剂。这样的载体能够使药用制剂配制成适于患者消化的单位剂型，如片剂、丸剂、散剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、菱形锭剂、凝胶剂、糖浆剂、浆状剂(slurries)、混悬剂等。
适于口服给药的制剂可包括(a)液体溶液，如有效量的药物制剂，其混悬于稀释剂，如水、盐水或PEG 400中，或者(b)胶囊剂、囊剂或片剂，其各自含有预定量的活性成分，作为液体、固体、颗粒或凝胶；(c)在适当液体中的混悬剂；以及(d)适合的乳剂。
可通过将本发明化合物与固体赋形剂组合，任选碾磨得到的混合物和加工颗粒的混合物，加入适宜的另外的化合物后，如果需要，得到片剂或糖衣丸的核心，获得用于口服的药用制剂。适宜的固体赋形剂为碳水化合物或蛋白质填充剂，并且包括、但不限于糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；得自玉米、小麦、稻米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，诸如甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素或羧基甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶和西黄蓍胶；以及蛋白质类，诸如明胶和胶原质。如果需要，可加入崩解剂或助溶剂，诸如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、褐藻酸或其盐，诸如藻酸钠。片剂形式可包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶态二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、矫味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体。菱形锭剂形式可包含在矫味剂，如蔗糖中的活性成分，以及包含在惰性基质，诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分的锭剂，以及除了活性成分外，还包含本领域已知载体的乳剂、凝胶剂等。
本发明化合物也可以栓剂形式直肠给药。可通过使药物与适宜的非刺激性赋形剂混合制备这些制剂，所述赋形剂在常温下是固体而在直肠温度下是液体，并且因此将在直肠融化以释放药物。这样的材料为可可脂和聚乙二醇。
本发明化合物也可经鼻腔内、眼内、阴道内和直肠内途径给药，包括栓剂、吸入剂、粉剂和气雾制剂(例如，类固醇吸入剂，参见，Rohatagi，J.Clin.Pharmacol.351187-1193，1995；Tjwa，Ann.AllergyAsthma Immunol.75107-111，1995)。
本发明化合物可经局部途径、透皮传递，配制为如敷药棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、油膏剂、糊剂、果酱、涂料、散剂和气雾剂。
封装材料也可与本发明化合物一起使用，且术语“组合物”可包括与作为配方的封装材料组合的活性成分，加或不加其它载体。例如，本发明化合物也可作为微球传递用于在体内缓慢释放。在一个实施方案中，微球可经由药物的透皮注射剂给药(如，含米非司酮的微球，其在皮下缓慢释放(参见Rao，J.Biomater Sci.Polym.Ed.7623-645，1995；如生物可降解的和可注射的凝胶制剂(见，如，Gao，Pharm.Res.12857-863，1995)；或作为用于口服给药的微球(参见，如，Eyles，J.Pharm.Pharmacol.49669-674，1997)。透皮和皮内途径均提供数周或数月的持续的传递。扁囊剂也可用于传递本发明化合物。
在另一实施方案中，可将本发明化合物通过使用质脂体转运，质脂体与细胞膜融合或者被细胞内吞，即使用配基连接质脂体，后者与细胞的表面膜蛋白受体结合，导致细胞内吞作用。通过使用质脂体，尤其是当质脂体表面带有对靶细胞特异性的载体，或者另外优先指向特定组织时，可集中将氨基甲酸酯化合物转运到体内的靶细胞上(参见例如Al-Muhammed，J.Microencapsul.13293-306，1996；Chonn，Curr.Opin.Biotechnol.6698-708，1995；Ostro，Am.J.Hosp.Pharm.461576-1587，1989)。
可将本发明的药物制剂以盐的形式提供，并且可用很多酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸等。盐在水性或其它质子溶剂中更易溶解，在其中它们是对应的游离碱形式。在其它情况下，优选的制剂可为冻干粉剂，其可包含，例如，任何或所有下列组分1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5，使用前与缓冲液混合。
药学上可接受的盐和酯指为药学上可接受的并具有所需药理特性的盐和酯。这样的盐包括当化合物中存在酸性质子时能与无机或有机碱反应而可形成的盐。适宜的无机盐包括与碱金属，如钠和钾、镁、钙以及铝形成的盐。适宜的有机盐包括与有机碱，诸如胺碱，如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等形成的盐。
药学上可接受的盐也可包括由母体化合物中的胺部分与无机酸(如盐酸和氢溴酸)和有机酸(如乙酸、柠檬酸、顺丁烯二酸和烷烃-和芳烃-磺酸，诸如甲烷磺酸和苯磺酸)反应形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺酰基氧基和膦基氧基(phosphonoxy)形成的酯。当存在两个酸性基团时，则药学上可接受的盐或酯可为单-酸-单-盐或酯或二-盐或酯；并且类似地，当存在多于两个酸性基团时，这样的基团中的某些或全部可被盐化或酯化。
在本发明中命名的化合物可以未盐化或未酯化的形式，或者以盐化和/或酯化的形式存在，并且这样的化合物的命名意欲均包括原型(未盐化和未酯化的)化合物及其药学上可接受的盐和酯。本发明包括式1和式2的药学上可接受的盐和酯的形式。可存在一种以上的式1或式2的对映体的结晶形式，并且这些也包括在本发明之内。
本发明的药用组合物除包含氨基甲酸酯化合物外，可任选包含至少一种用于治疗与提供神经保护作用相关的疾病或病症的其它治疗药物。
配制药用组合物的方法已在数个出版物，诸如药用剂型片剂(Pharmaceutical Dosage FormsTablets).第二版，修订和增订。第1-3卷，Lieberman等编著；药用剂型胃肠外药物(Pharmaceutical DosageFormsParenteral Medications).第1-2卷，Avis等编著；和药用剂型分散系统(Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems).第1-2卷，Lieberman等编著；Marcel Dekker，Inc出版中描述，这些文献的公开内容，通过引用全文结合于本文中并且用于所有目的。
通常将药用组合物配制成灭菌的、充分等渗的，并且完全依从美国食品与药品管理局的药品生产管理规范(Good ManufacturingPractice(GMP))规则。
给药方案 本发明提供在哺乳动物中使用氨基甲酸酯化合物提供神经保护的方法。需要提供神经保护作用的氨基甲酸酯化合物的量被定义为是治疗上或药学上有效的剂量。所述剂量日程表和该用途的有效量，即剂量或给药方案将取决于多种因素，包括疾病的阶段、患者的身体状况、年龄等。在计算患者的给药方案中，也要考虑给药的方式。
本领域普通技术人员在不进行过多试验下，根据其技能和本发明公开内容，将能够确定实施本发明的特定取代的氨基甲酸酯化合物的治疗有效剂量(参见如Lieberman，药物剂型(Vols.1-3，1992)；Lloyd，1999，The art，药物混合的科学技术(Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)；和Pickar，1999，Dosage Calculations)。治疗有效剂量也是其中在临床意义上讲，治疗上有益的作用优于活性药物的任何毒性或有害副作用的量。进一步指出的是对于每一特定的患者，其特定的给药方案应在一段时间内，根据个体需要和给予或监督该化合物用药的人员的专业判断进行评估和调整。
为治疗目的，可将本发明所公开的组合物或化合物以单次快速推注传递的方式，通过在一延长的时间期间或者以重复给药的方案给予患者(例如通过每小时、每日或每周，重复给药的方案)。可将本发明的药用制剂以例如每日一或多次、每周三次或每周一次给予。在本发明的一实施方案中，可将本发明的药用制剂每日一或二次口服给予。
使用本发明化合物的治疗方案可以在例如患者患有损害性损伤或其它最初的伤害之后，但在患者被诊断为内耳疾病或其它明显损伤之前开始实施。在一实施方案中，被鉴定为正处于发展为内耳损伤高风险下的患者或者患有与形成内耳损伤风险有关的疾病(如耳鸣、梅尼尔氏病或耳毒性药物暴露)的患者可开始采用本发明的氨基甲酸酯化合物的治疗方案。
在上下文中，所述生理活性剂的治疗有效剂量可包括在延长的治疗方案内的重复剂量，所述治疗方案将对提供神经保护作用产生明显临床效果。上下文中有效剂量的确定一般根据动物模型研究以及随后的人体临床试验，并通过确定的有效剂量和给药方案指导，所述有效剂量和给药方案能明显降低患者中定向暴露的病症或症状的出现或严重性。有关的合适模型包括例如小鼠、大鼠、猪、猫、非人灵长类动物。本领域已知的其它可接受的动物模型患者。另外，有效剂量可使用体外模型确定(例如免疫学和组织病理学测定)。使用这些模型，一般仅需普通的计算和调整来确定给予治疗有效量的所述生理活性剂的适当的浓度和剂量(例如为引起所需反应的鼻内给药有效量、经皮给药有效量、静脉给药有效量或者肌内给药有效量)。
在本发明的示例性实施方案中，可按标准给药方案，制备所述化合物的单位剂量形式。在该方法中，在主治医生指导下，很容易将组合物细分成较小的剂量。例如，可将单位剂量制成包装的粉末、小瓶或安瓿中，并优选制成胶囊或片剂形式。
以组合物的这些单位剂量形式呈现的活性化合物，其呈现的量为例如约10mg-1g或更多，根据患者的具体需要，以单剂量或多剂量每日给予。通过用大约1g的最小日剂量的治疗方案开始，可用氨基甲酸酯化合物的血液水平确定更大或更小的剂量是否为适应的。
例如可以以口服或非肠道给药量约每剂量0.1mg/kg至约50mg/kg的量，将本发明的氨基甲酸酯化合物的有效给药。优选给药量为约每剂量1.0/mg/kg至约25mg/kg，更优选每剂量约2.0-40mg/kg。因此，对于具有例如平均体重为70kg的患者来讲，本发明所述的每剂量单位所含有的活性组分的治疗有效量可以是例如约每日140mg-2800mg。
本发明方法还提供供神经保护作用使用的试剂盒。当在适当的载体中将含有一或多种本发明的氨基甲酸酯化合物与可能加入的一或多种具有治疗益处的其它化合物的药用组合物制成制剂后，可将其置于适当的容器内，并标记提供神经保护作用的标签。另外，也可将另一种包含至少一种用于提供神经保护作用、治疗致癫痫的、癫痫或与神经损伤有关的其它病症或疾病的治疗剂的药物置于容器内，并标记治疗所述指定疾病的标签。这些标签可包括例如有关各药物的给药量、给药频率和给药方法。
虽然为清楚了解的目的，已通过实例详述了上述发明，但技术人员应明了该公开内容包含某些改变和修饰，并且所述改变和修饰在所附权利要求书的范围内不进行过多试验下即可实施，其仅供非限制性例证说明。提供下列实施例以举例说明本发明的特定方面，但并不意味着构成限定。
实施例 提出下列实施例帮助理解本发明，但并不意味着且不应该以任何方式构成对随后权利要求书中提出的本发明的限定。用于提供神经保护作用的式(I)和式(II)化合物的活性在下列实验实施例中评价。在以下所有实施例中，即实施例1、2、3和4中，式1的分离的S-对映体(该化合物如以上式7中所示，并将在以下实施例中被称为试验化合物(或TC或tc)的活性，在诱发癫痫大鼠模型中评价，以确定化合物神经保护的功效，以及在大鼠的锂和毛果芸香碱诱发的颞叶性癫痫的模型中治疗癫痫发生的效能(实施例1和2)。另外，实施例3和4表明在大鼠的去血清模型和短暂性脑缺血模型中相同试验化合物提供神经保护的效能。这些实施例表明试验化合物保护神经元组织免受各种损伤事件的能力。这些实施例是一种通过示例性说明本发明的各实施方案的方式，并不以任何方式限定本发明。
试验化合物的结构如下
实施例1 颞叶性癫痫的锂-毛果芸香碱模型 通过与锂缔合(associated)的毛果芸香碱(Li-Pilo)诱发的大鼠模型再现人颞叶性癫痫的大多数临床和神经生理学特征(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci 1633-37)。在成年大鼠中，全身给予毛果云香碱导致癫痫持续状态(SE)。第一日内，致死率达到30-50％。在存活的动物中，神经元损伤主要出现在海马结构、梨状和内嗅皮质、丘脑、杏仁体、新皮质和黑质之内。这种急性发作期后接着是一段“安静”不发作期，平均持续时间14-25日，然后所有动物以通常每周2-5次的频率，显示出自发的再发性抽搐发作(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci1633-37；Dube等，2001，Exp Neurol 167227-241)。
锂-毛果芸香碱和试验化合物的治疗 将Janvier培育中心(Le Genest-St-lste，法国)提供的体重225-250g的雄性Wistar大鼠于控制的标准条件下(明/暗循环，7.00a.m.-7.00p.m.灯照)饲养，任意提供食物和饮水。所有动物的实验均遵从1986年11月24日欧洲公众理事会导则(86/609/EEC)和法国农业部(许可证N°67-97)的规定。对于电极的植入，通过腹腔注射2.5mg/kg地西泮(DZP，Valium，Roche，法国)和1mg/kg盐酸氯胺酮(ketamine chlorhydrate)(Imalgene 1000，Rhone Merrieux，法国)，将大鼠麻醉。将4个单触点记录电极置于两侧顶叶皮层之上的颅骨上，每侧2个。
癫痫持续状态诱导 试验化合物的治疗和自发性再发作(SRS)的出现 给所有大鼠服用氯化锂(3meq/kg，i.p.，Sigma，St Louis，Mo，美国)；约20小时后，将动物置于树脂玻璃箱中，目的是记录基础皮层EEG。给予甲基东莨菪碱溴化物(1mg/kg，s.c，Sigma)来限制该惊厥剂的末梢作用。给予甲基东莨菪碱之后30分钟，通过注射盐酸毛果芸香碱(25mg/kg，s.c，Sigma)诱发SE。记录整个SE期间双侧EEG皮层活性，并注意行为的变化。
研究增加试验化合物剂量对3组大鼠的影响。第一组动物在SE发作后1小时腹膜内接受10mg/kg的试验化合物(pilo-试验10组)，而第二组和第三组动物分别接受30和60mg/kg试验化合物(pilo-试验30组和pilo-试验60组)。
另一组在SE发作后1小时注射2mg/kg地西泮(DZP，i.m.)，这是SE后改善动物存活率的标准治疗方法(pilo-DZP组)。对照组接受盐水，用以代替毛果芸香碱和试验化合物(盐水-盐水组)。然后给pilo-试验化合物SE存活的大鼠在第一次注射试验化合物后约10小时，第二次腹腔注射相同剂量的试验化合物，并保持每日2次用试验化合物治疗，再进行6日。在第一次注射后约10小时，在SE日中，Pilo-DZP接受第二次注射1mg/kg DZP。然后，Pilo-DZP组和盐水-盐水组大鼠每日2次接受等体积的盐水。
通过每日10小时影像记录动物并且每周2次8小时记录动物电图活性，研究试验化合物对EEG和对SRS出现潜伏期的影响。
细胞密度的定量 SE后6日，对8只pilo-DZP、8只pilo-试验10、7只pilo-试验30、7只pilo-试验60和6只盐水-盐水大鼠进行细胞密度定量。SE后14日，将动物用1.8g/kg戊巴比妥(
Vetoquinol，Lure，法国)深度麻醉。然后取出大脑，冷冻。用恒冷切片机切成一系列20μm的薄片，空气干燥数日，然后用亚氨嗪(thionine)染色。
根据大鼠脑立体定位坐标图谱(Paxinos and Watson，1986，The Ratbrain in Stereotaxic Coordinates，2nd ed.Academic Press，San Diego)，用一个10x 10盒子1cm2精微网格对冠状缝切片进行细胞密度定量。细胞计数以盲法进行2次，并且它是从各个体动物的2个相邻切片中的至少三个值的平均值。仅对大于10μm的细胞计数，小的则认为是胶质细胞。
Timm染色 自发性复发癫痫发作开始后2个月，对长期接受试验化合物或DZP的大鼠或者3只盐水-盐水组大鼠检查萌发的苔状纤维。将动物深度麻醉，经颈动脉灌注盐水、接着是100ml的1.15％(w/v)Na2S的0.1M磷酸盐缓冲液溶液，以及100ml的4％(v/v)甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液溶液。从颅骨中取出大脑，后固定于4％甲醛中3-5小时，随后在滑行振动切片机上切成40μm切片，然后在明胶涂布的载玻片上制作标本。
次日，在暗处，将切片在26℃下的50％(w/v)阿拉伯树胶(160ml)、柠檬酸钠缓冲液(30ml)、5.7％(w/v)氢醌(80ml)和10％(w/v)硝酸银(2.5ml)的溶液中显色40-45分钟。然后将切片用40℃下的自来水漂洗至少45min，用蒸馏水快速漂洗，接着干燥。将它们在乙醇中脱水并盖上盖玻片。
根据前述标准，在背海马中评价苔状纤维的萌发(Cavazos等，1991，J Neurosci 112795-2803.)，如下评价0-在DG的顶端和嵴之间无颗粒；1-在DG的顶端和嵴之间细胞上颗粒(supragranular)区域以斑片状分布的稀疏颗粒；2-在DG的顶端和嵴之间连续分布的更多颗粒；3-在顶端和嵴之间连续式样的凸出颗粒，并在顶端和嵴之间偶有融合颗粒的斑；4-在顶端和嵴之间形成融合的密集叠片状环带的凸出颗粒；以及5-延伸到内分子层的颗粒的融合密集的叠片状环带。
数据分析 采用非成对Student′s t-检验，比较pilo-盐水组和pilo-试验化合物组动物中SE的特征。通过卡方检验进行两组中发作大鼠数目之间的比较。对于神经元损伤，各组之间的统计学分析先后采用ANOVA和Fisher′s检验，使用Statview软件进行多重比较(Fisher RA，1946a，Statistical Methods for Research Workers(第10版)Oliver & Boyd，Edinburgh；Fisher RA，1946b，The Design of Experiments(第4版)Oliver& Boyd，Edinburgh)。
锂-毛果芸香碱癫痫持续状态的行为和EEG特征 将重约250-330g的总量的Sprague-Dawley大鼠经历Li-pilo诱发的SE。pilo-盐水和pilo-试验化合物组中SE的行为和特征相同。注射毛果芸香碱5min后，大鼠出现腹泻、竖毛和其它胆碱能刺激的征象。在随后15-20min期间，大鼠呈现头上下摇动、搔抓、咀嚼和探索行为。给予毛果芸香碱大约15-20min后，开始再发作癫痫。给予毛果芸香碱大约35-40min后，伴随用后腿站起和跌倒有关的头和左右前肢肌阵挛的发作的这些癫痫发作发展成为SE，如前所述(Turski等，1983，Behav Brain Res 9315-335.)。
SE期间EEG模式 在SE的第一个小时期间，在不用药物治疗下，EEG的幅度渐进性增加，同时频率降低。在注射毛果芸香碱后的5min内，皮层中正常本底的EEG活性被低电压快速活性所代替，同时θ节律(5-7Hz)出现在海马区。经过15-20min，高电压快速活性重叠在海马的θ节律上，并仅在海马区记录到分离的高压棘波，同时皮层的活性基本上无变化。
经过注射毛果芸香碱后35-40min，动物发展成为典型的脑电图癫痫发作，伴有在海马区和皮层中都存在高压快速活性，在癫痫发作前首先出现的是活性爆发，接着是连续序列的高压棘波和多棘波，一直持续到给予DZP或试验化合物为止。在SE约3-4h，海马区EEG的特征为在pilo-DZP和pilo-10组的海马区和皮层中周期性的脑电图放电(PEDs，约1次/秒)。EEG本底活度的幅度在pilo-试验60动物中较低。在SE约6-7h，在DZP-和试验10-处理的大鼠中，棘波活性仍存在于皮层和海马区中，而在试验30大鼠的海马区和在试验60处理的大鼠的两个结构中，EEG的幅度降低并回到本底水平。在试验10、试验30和试验60组之间没有差别。SE后9h，在试验化合物处理的大鼠的海马以及偶尔在皮层中仍能记录到分离的棘波。在两个结构中，本底活性在实验时幅度非常低。
SE诱发的死亡率 在SE后的首个48小时期间，在pilo-DZP大鼠(23％，5/22)、pilo-试验10大鼠(26％，6/23)和pilo-试验30大鼠(20％，5/25)中，死亡率的程度是类似的。在pilo-试验60大鼠中，死亡率大大降低，仅达到4％(1/23)。这种差别具有统计学意义(p＜0.01)。
静止期EEG特征和自发性复发性癫痫发作的出现 静止期期间的EEG受治疗者与pilo-DZP和pilo-试验10、30或60组的大鼠类似。SE后24和48h，基线EEG的特征仍存在PEDs，其中大波或棘波可能重叠。在注射试验化合物或注射媒介物之后1-8h之间，pilo-DZP或pilo-试验10组无变化。在试验30和试验60大鼠中，注射10分钟后，PEDs的频率和幅度即降低，并被试验30组中较大振幅的棘波和试验60组中较低振幅的棘波代替。注射后4h，EEG返回到后两组中的基线水平。SE后6日，EEG仍处于比注射毛果芸香碱之前更低的幅度，并且在大多数组中仍可记录到棘波，偶尔也出现在pilo-DZP、-试验10和-试验30大鼠中。在pilo-试验60大鼠中，大振幅棘波的频率比所有其它组中的高。注射试验化合物或媒介物之后，在pilo-DZP和pilo-试验10组中，EEG记录不受注射的影响。在pilo-试验30大鼠中，注射诱导海马和皮层的EEG上的慢波出现，而在pilo-试验60大鼠中棘波频率降低。
研究用DZP、试验10和试验30处理的全部大鼠，直至慢性期发展成为具有相似潜伏期的SRS。pilo-DZP大鼠潜伏期为18.2±6.9日(n＝9)，pilo-试验10大鼠为15.4±5.1日(n＝7)，pilo-试验30大鼠为18.9±9.0日(n＝10)。在接受试验60处理的大鼠组中，一个亚组的大鼠变为癫痫的潜伏期与其它组类似，即17.6±8.7日(n＝7)，而另一组大鼠变为癫痫延迟的时间较长，在SE后109-191日(149.8±36.0日，n＝4)，并且一只大鼠在SE后9个月尚未变为癫痫。pilo-DZP、pilo-试验10、pilo-试验30与pilo-TPM60大鼠的第一亚组之间对SRS的潜伏期没有统计学上的显著差别。盐水-盐水组大鼠(n＝5)没有一只发展为SRS。
为计算接触毛果芸香碱的大鼠中SRS的频率，可将癫痫发作的严重程度和明显的III期(面肌和前肢的阵挛性发作)和IV-V期发作(用后腿站起和坠落)考虑在内。pilo-DZP和pilo-试验化合物组的大鼠每周III期SRS的频率在各组之间是变化的。在前3周期间，pilo-DZP和pilo-试验60(带有早期SRS发作)组中频率是低的，恒定的，在第4周期间，pilo-DZP组中已消失。III期SRS的频率在pilo-试验10组中较高，其中在3和4周期间比pilo-DZP组的值明显增加。更严重的IV-V期SRS频率在大多数组的第一周中都是最高的，除晚期癫痫发作的pilo-试验30和试验60组之外，其中在试验30组的整个4周中以及pilo-试验60组的前两周，SRS频率不变，pilo-试验60组具有没有IV-V期癫痫发作的晚期SRS发作，其中第二周后没记录到癫痫发作。在第一周中，与pilo-DZP组(每周11.3次SRS)相比，试验10、试验30和试验60(带有早期SRS发作)组(每周2.3-6.1次SRS)的IV-V期SRS频率明显降低。在第2-4周中，与第一周每周达到2-6次癫痫发作的值相比，所有组的IV-V期SRS频率都降低，除具有早期SRS发作的pilo-试验60组之外，其中与其SRS频率在3.3-5.5范围的pilo-DZP组别比较，其每周癫痫发作频率明显降低到0.6-0.9次。
海马、丘脑和皮层中的细胞密度 与盐水-盐水组大鼠比较，在pilo-DZP大鼠中，海马CA1区内细胞数量显著降低(在锥体细胞层70％细胞损失)，而CAS区降低较小(CA3a内为54％细胞损失，CA3b内为31％)。在齿状回中，pilo-DZP大鼠门中细胞损失较大(73％)，而粒细胞层没有显示明显的损失。在腹面海马中发现类似的损伤，但在该区未进行细胞计数。在丘脑核侧面也记录到广泛的损伤(91％细胞损失)，而丘脑核侧部损伤较为适度(56％)。在梨状皮质中，细胞损伤在III-IV层完全不再可见，pilo-DZP组大鼠中II层中达到53％。在背侧的内嗅皮质，II层和III-IV层损伤较小(分别为9和15％)。背侧内嗅皮质的II层完全被保护起来，而III-IV层细胞损伤为44％。
在pilo-试验化合物动物的海马中，与pilo-DZP大鼠相比，CA1锥体细胞层中细胞损失降低，其中pilo-DZP组中细胞损失达到75％，pilo-试验30或pilo-试验60动物中细胞损失分别为35和16％。两个试验化合物剂量的差异在统计学上是明显的。在CAS锥体细胞层中，试验化合物在CA3a区域中没有提供任何保护作用，而60mg/kg的试验化合物的剂量在CA3b中具有明显的神经保护作用。在齿状回中，门中细胞损失在pilo-试验化合物(69-72％)和pilo-DZP动物(73％)中类似。在两侧丘脑核中，60mg/kg剂量也有降低神经损伤的保护作用，在侧面和内侧背核分别降低65和42％。在大脑皮层中，与DZP相比，仅在高剂量60mg/kg下，用试验化合物治疗提供神经保护作用。在两个最低剂量10和30mg/kg下，pilo-DZP大鼠和pilo-试验化合物大鼠中，在梨状皮质的III-IV层中观察到的总细胞损失和组织破坏相同，但在任何组中并未进行任何计数。在梨状皮质的II和III-IV层中，试验60治疗组在pilo-DZP大鼠中记录的降低神经损害分别为41和44％。在腹侧内嗅皮质，给予试验60可在III-IV层中引发神经保护作用，与pilo-DZP大鼠相比，达到31％。在内嗅皮层中，与pilo-DZP大鼠的背侧内嗅皮质的III-IV层(28％以上损伤)以及腹侧内嗅皮质的III-IV层(35％以上损伤)相比，pilo-试验10大鼠细胞损伤稍重。在试验化合物的其它剂量下，内嗅皮层中的细胞损伤与pilo-DZP大鼠中记录的类似。
海马中苔状纤维的萌生 pilo-DZP和pilo-TPM组中呈现SRS的所有大鼠都在齿状回的内分子层中表现出类似的Timm染色强度(评分为2-4)。在齿状回的上下片都显示出Timm染色。上片中Timm评分的平均值在pilo-DZP大鼠(n＝9)达到2.8±0.8，pilo-试验10(n＝7)大鼠达到1.5±0.6，pilo-试验30大鼠(n＝10)达到2.6±1.0，pilo-试验60大鼠的所有组(n＝11)中达到1.5±0.7。当根据SRS潜伏期将pilo-试验60组细分时，伴有早期SRS发作的亚组表示的Timm分值为1.8±0.6(n＝6)，而伴有迟发或不出现SRS的亚组的Timm分值为1.2±0.6(n＝5)。pilo-DZP大鼠中记录的值与pilo-试验10(p＝0.032)和具有迟发或无癫痫发作的pilo-试验60亚组(p＝0.016)中的值具有统计学上的明显差异。
讨论和结论 该研究结果表明在SE发作后1小时起用试验化合物的7-日疗法能保护大脑的某些区域免受神经元损伤，例如在CA1和CA3b区域的锥体细胞层、丘脑的背中部、梨状皮质的II和I1MV层以及腹侧内嗅皮质的III-IV层，但是仅出现在试验化合物的最高剂量，即60mg/kg时。试验化合物的后一剂量也能延迟SRS的出现，至少在比其它组动物具有长约9倍的平均延迟期的癫痫发作的亚组动物中，但有一只动物在SE后9个月的延迟期内也未有癫痫发作。
这些结果表明具有抗发作性质的化合物，这是大多数市售的抗癫痫药物的典型的特性，也能延迟癫痫发作，即具有抗癫痫作用。本研究数据还表明无论使用何种剂量的试验化合物治疗都能降低癫痫的严重程度，原因是它降低IV-V期癫痫发作的次数，主要是在发作的第一周期间，以及在用试验60治疗的整个4周的观察期间。另外，在试验10组中，存在严重性较弱的III期发作出现增加的变化，其比pilo-DZP组发作次数更多。
实施例2 锂-毛果芸香碱诱发大鼠癫痫模型中增加试验化合物剂量对神经保护作用和抗癫痫作用的可能影响 本项目的目的是继续进行对颞叶性癫痫的锂-毛果芸香碱(Li-Pilo)模型中试验化合物对潜在的神经保护作用和抗癫痫作用的研究。本研究接着第一个实验进行(以上实施例1)，其中已表明试验化合物能够保护海马的CA1和CA3区域、梨状皮质和腹侧内嗅皮质免受Li-Pilo癫痫持续状态(SE)诱导的神经元损伤。大多数这些神经保护特性都出现在所研究的最高剂量60mg/kg时，并且这种治疗能延迟36％大鼠(11只中4只)出现自发性癫痫发作。在本研究中，我们计划研究试验化合物对神经元损伤、癫痫发作、神经元兴奋性和行为的治疗效果。
颞叶性癫痫的锂-毛果芸香碱模型 通过与锂缔合的毛果芸香碱(Li-Pilo)诱发的大鼠模型再现人颞叶性癫痫的大多数临床和神经生理学特征(Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci 1633-37)。在成年大鼠中，全身性给予毛果云香碱导致可持续长达24小时的SE。第一日内，致死率达到30-50％。在存活的动物中，神经元损伤主要出现在海马结构、梨状和内嗅皮质、丘脑、杏仁体、新皮质和黑质之内。这种急性发作期后接着是一段“安静”的不发作期，平均持续时间14-25日，然后所有动物以通常每周2-5次的频率，显示出自发的再发性抽搐发作(见Turski等，1989，Synapse 3154-171；Cavalheiro，1995，Ital J Neurol Sci1633-37；Dubé等，2001，Exp Neurol 167227-241)。目前的抗癫痫药物不能阻止该癫痫发生，并且仅对复发性发作具有短暂性效果。
在我们的前期研究中，我们研究在单一疗法中增加所给予的试验化合物的剂量对神经保护作用和抗癫痫发作作用的可能影响，并与大多数约定的抑制高死亡率的标准地西泮疗法相比较。这些数据表明在SE发作后1小时开始用10、30或60mg/kg(RWJ10、RWJ 30、RWJ 60)剂量的试验化合物的7-日疗法能保护大脑的某些区域免受神经元损伤。这些作用在CA1和CA3b区域的锥体细胞层、丘脑的背中部、梨状皮质的II和III-IV层以及腹侧内嗅皮质的III-IV层中具有明显的统计学意义，但是仅在试验化合物的最高剂量下，即60mg/kg(RWJ60)有意义。另外，结果显示试验化合物的最大剂量也是唯一能延迟自发性复发性癫痫发作(SRS)的出现的剂量，至少在比其它组动物具有长约9倍的平均延迟期的癫痫发作的亚组动物中，但有一只动物在SE后9个月的延迟期内也未癫痫发作。
在本研究中，我们使用与前期研究相同的实验设计，测试了各种不同剂量试验化合物的作用，即30、60、90和120mg/kg(在此称为RWJ30、RWJ60、RWJ90和RWJ120)。治疗在癫痫持续状态(SE)发作后1小时开始，经第二次注射相同剂量的药物来处理动物。SE的这种早期治疗接着为6日试验化合物的治疗。该报告涉及四个不同剂量的试验化合物对海马和海马回皮层中神经元损伤的影响。有关癫痫发作的潜伏期的研究尚不完善，但我们仍展现出我们目前对有限组动物进行的试验所得到的数据。相同大鼠中自发性癫痫发作的潜伏期与发作周期中涉及的区域内保留的神经元数目相关。
将Janvier培育中心(Janvier Breeding Center)(Le Genest-St-Iste，法国)提供的成年雄性Sprague-Dawley大鼠饲养于控制的、不拥挤的20-22℃标准条件下(明/暗循环，7.00a.m.-7.00p.m.灯照)，任意提供食物和饮水。所有动物实验均遵从1986年11月24日欧洲共同体理事会导则(86/609/EEC)和法国农业部(许可证N°67-97)的规定。
癫痫持续状态的诱发、试验化合物治疗以及SRS发作 给所有大鼠服用氯化锂(3meq/kg，i.p.，Sigma，St Louis，Mo，美国)，约20小时后，再给予所有动物甲基东莨菪碱溴化物(1mg/kg，s.c，Sigma)来限制该惊厥剂的末梢作用。给予甲基东莨菪碱之后30分钟，通过注射盐酸毛果芸香碱(25mg/kg，s.c，Sigma)诱发SE。研究增加试验化合物(RWJ)剂量对5组大鼠的影响。在SE发作后1小时，动物或者接受肌内注射2.5mg/kg地西泮(DZP)，或者腹膜内接受30、60、90或120mg/kg试验化合物(RWJ30、RWJ60、RWJ90、RWJ120)。对照组接受介质，用以代替毛果芸香碱和试验化合物。然后给SE存活的大鼠在第一次注射试验化合物后10小时，对DZP组第二次腹腔注射1.25mg/kg DZP或与试验化合物相同剂量(在早晨)，并每日2次用试验化合物维持治疗，再进行6日(s.c.)，同时DZP大鼠接受溶媒注射。通过每日10小时影像记录动物，研究4种剂量的试验化合物对自发性复发性癫痫发作(SRS)出现的潜伏期的影响。
细胞密度的定量 细胞密度的定量在SE后两个时间进行第一组在SE后14日研究，其由7DZP、8RWJ30、11RWJ60、10RWJ90、8RWJ 120和8只未经历SE的对照大鼠组成。将在第一次SRS后8周或者在延迟期内未发现SRS的5个月，将用于进行对SRS延迟期研究的第二组大鼠处死，其由7DZP、2RWJ30、3RWJ60、3RWJ90、4RWJ 120大鼠组成。将动物用1.8g/kg戊巴比妥(
Vétoquinol，Lure，法国)深度麻醉。然后取出大脑，冷冻。用恒冷切片机切成一系列20μm的薄片，空气干燥数日，然后用亚氨嗪染色。根据大鼠脑立体定位坐标图谱(Paxinos and Watson，1986，The Rat brain in StereotaxicCoordinates，2nd ed.Academic Press，San Diego)，用一个10x 10盒子1cm2精微网格对冠状缝切片进行细胞密度定量。将计数的网格置于所涉及的大脑结构的明确的区域内，然后用确定的200-或400-倍放大显微镜对各单个的大脑结构进行计数。由一名不知道所述动物治疗法的观察者对每个区域的三个邻近切片的各侧进行计数2次。将各大脑结构中12个计数区域内得到的细胞数进行平均。用该程序将由双倍计数可导致过高评价细胞数的的可能误差降到最小。不计接触到网格下方及右缘的神经元。仅对大于10μm的细胞体神经元计数。小细胞体细胞被认为是胶质细胞而不计数。
数据分析 对于神经元损伤，通过单向方差分析法，接着使用Statview软件的Scheffe′s检验，对各组之间进行统计分析。
结果 锂-毛果芸香碱癫痫持续状态的行为特征 将总数101只体重为250-330g的Sprague-Dawley大鼠经历锂-毛果芸香碱(Li-pilo)-诱发的SE。在该总数中，2只未发展为SE，而99只大鼠发生全特征的Li-pilo SE。lipilo-DZP和lipilo-RWJ两组中的SE行为特征相同。注射毛果芸香碱后5min内，大鼠出现腹泻、竖毛和其它类胆碱能药物刺激的体征。在随后15-20min期间，大鼠呈现头上下摇动、擦伤、咀嚼和探索行为。给予毛果芸香碱大约15-20min后，开始复发癫痫。给予毛果芸香碱大约35-40min后，伴随用后腿站起和跌倒有关的头和左右前肢肌阵挛的发作的这些癫痫发作发展成为SE，如前所述(参见Turski等，1989；Synapse 3154-171；Dubé等，2001，Exp Neurol 167227-241和André等，2003，Epilepsia 44893-903)。
在进行早期细胞计数的动物组中，SE后首个48小时期间，死亡率的程度在各治疗组间是变化的DZP大鼠死亡47％(7/15)、RWJ30大鼠死亡43％(6/14)、RWJ60大鼠死亡0％(0/11)，RWJ90大鼠死亡0％(0/10)和RWJ120大鼠死亡47％(7/15)。在DZP组中，在首个24小时，4/7大鼠死亡，24-48小时期间，3只死亡。在RWJ30大鼠组中，在首个24小时，4/6大鼠死亡，24-48小时期间，2只死亡。在RWJ120大鼠组中，在首个24小时，6/7大鼠死亡，24-48小时期间，1只死亡。遭受SE且接受锂和盐水的对照组由10只大鼠组成。
在进行SRS潜伏期和最后细胞计数的研究的动物组中，死亡率的程度如下DZP大鼠30％(3/10)、RWJ30大鼠50％(2/4)、RWJ60大鼠0％(0/3)、RWJ90大鼠0％(0/3)和RWJ120大鼠0％(0/4)死亡。在DZP大鼠组别中，在首个24h内3/3大鼠死亡。在RWJ30组别中，在首个24h内1/2大鼠死亡，24-48h期间1只大鼠死亡。
早期海马和皮质中的细胞密度(SE后14日) 在将DZP大鼠与对照大鼠的比较中，海马CA1区内细胞数量大量降低(在锥体细胞层85％细胞损失)，而CA3区降低较小(CA3中细胞损失40％)(参见表1和图1)。在齿状回中，DZP大鼠门中细胞损失较大(66％)，而粒细胞层通常没有显示明显的损失。在腹面海马区发现类似的损伤，但在该区未进行细胞计数。在DZP大鼠的梨状皮质中，细胞损伤在几乎都在III层中(94％)，其实际不再可见，在背部和腹侧II层中分别达到66和89％。在背侧的内嗅皮质，II层和III-IV层损伤较小(分别为18和24％)，而在腹部II和III/IV层中，损伤分别达到22和74％(表1和图2)。
在RWJ动物的海马中，与DZP大鼠相比，RWJ30、60或90大鼠中的CA1锥体细胞层中细胞损失有些降低(36-57％细胞损失)，在RWJ120中明显降低(13％细胞损失)。所有RWJ剂量存在统计学上的明显差异(表1和图1)。在CAS锥体细胞层中，RWJ仅在120mg/kg剂量下具有诱导轻微神经保护的作用，但与DZP组没有显著差别。在齿状回中，门中细胞损失在DZP和RWJ30、60以及90组中类似(62-66％损伤)，与DZP动物(66％细胞损伤)相比，RWJ120组显示轻微降低损伤的趋势(54％损伤)。这些差别不具统计学意义。
在大脑皮层中，与DZP治疗组相比，用试验化合物治疗能保护几乎所有的皮质区域。在梨状皮质中，RWJ30剂量没有保护任何层。相反地，60-120mg/kg剂量的试验化合物能在III层中提供某些神经保护作用(在两个较低剂量细胞损伤53-64％，而在120mg/kg RWJ细胞中损伤为21％)。仅在最高剂量下具有统计学上的明显差异。在背侧层II中，与DZP-台疗的大鼠相比(66％损伤)，60-120mg/kg诱发统计学上明显的神经保护作用(4-21％损伤)。在腹侧II层中，与DZP大鼠(89％损伤)相比，60和120mg/kg RWJ剂量稍具保护作用(分别为56和45％损伤)，而120mg/kg能大部分保护梨状皮质的这一层(9％损伤)。在所有的背侧内嗅皮质中，所研究的试验化合物的两个最低剂量30和60mg/kg并未提供任何神经保护作用。所试验的试验化合物的两个最高剂量90和120mg/kg保护背侧和腹侧内嗅皮质的II和III/IV层，与DZP组的18-24％损伤相比，背侧II和III/IV层和腹侧II层中保留4-14％损伤，与DZP组74％细胞损失相比，腹侧III/IV层细胞损失为18-21％。但是，这种差别仅在内嗅皮质的腹侧部具有统计学意义。
早期梨状皮质中的细胞密度(SE后14日) 在经受SE并用DZP或30mg/kg试验化合物治疗的大鼠中，所研究的不同区域内的细胞群处于所有动物中的相同范围。相反地，在试验化合物的三个最高剂量下，根据梨状皮质中存活的神经元数目，一个亚组几乎完全被保护，而另一亚组如DZP组一样被广泛损伤，可将两个亚组大鼠区别开来。在60和90mg/kg试验化合物剂量下的腹侧梨状皮质的II层，以及在60、90和120mg/kg试验化合物的三组下的相同皮质的III层，两个亚组中神经元数目之间的差异具有统计学意义(图3)。内嗅皮质中存在类似的趋势，但并不明显，可能是因为该皮质中损伤并不广泛，差别未达到显著意义(未显示数据)。
复发性癫痫发作的潜伏期 在这个试验中我们有的唯一数据就是其中我们开始研究癫痫发作的各亚组中的潜伏期。DZP组(7只大鼠)中，自发性癫痫发作的潜伏期达到平均值为18±8日，而30mg/kg(RWJ30)试验化合物组的两只大鼠的值为8和9日。在DZP的三个其它剂量下，存在小的分类，即潜伏期类似于DZP和RWJ30的亚组群和具有比首次SRS延长的潜伏期的亚组群。在RWJ60组中，2/3大鼠分别在SE的7和8日之后出现首次自发性癫痫发作，而一只大鼠在SE的38日之后出现其首次癫痫发作。在90mg/kg试验化合物的剂量下，2/3大鼠分别在SE的9和10日之后出现其首次自发性癫痫发作，而一只大鼠在SE的51日之后出现其首次癫痫发作。最后，在120mg/kg试验化合物的剂量下，2/4大鼠具有延长的潜伏期，分别在44和79日之后出现其首次自发性癫痫发作。而其它两只大鼠在SE后记录的5个月中未发生任何癫痫发作(图4A)。
复发性癫痫发作潜伏期和基底皮质中存活的神经元数目之间的关系 当将已在各种潜伏期后变成癫痫病或尚未变成癫痫病的动物皮质区内存活的神经元数根据首次SRS潜伏期作图时，似乎看来潜伏期的持续时间与这些区域内存活的神经元数相关。这在图4B的腹侧内嗅皮质的III/IV层中显示，但在背侧内嗅皮质的III/IV层和梨状皮质的II层情况也似乎如此。但是，此时各组中大鼠的数目还很低，以至于不能使我们得出腹侧皮质中试验化合物治疗后SE存活的神经元百分数与所述药物抗癫痫作用之间直接相关的结论。
结果与讨论 本研究结果表明在海马的CA1锥体细胞层以及在梨状皮质和腹侧和背侧内嗅皮质的所有层中，Li-pilo-诱导SE发作后1小时开始用试验化合物的治疗法具有神经保护特性。但是，在该模型中，试验化合物在30mg/kg剂量下不具保护性，从60mg/kg剂量下开始呈现神经保护性质。在较后的剂量以及在两个较高剂量90和120mg/kg下，所述药物也能延迟首次自发性癫痫发作的出现的潜伏期，但仅在各剂量的亚组动物中。另外，这种癫痫出现的延迟似乎与相同动物基部皮质中SE存活的神经元数目相关。但是，在该研究部分中，动物的数量仍不足以断然作出相关的结论。
本研究中得到的数据与我们组前期研究结果一致，前期研究报告60mg/kg剂量的试验化合物保护海马和基底皮质免受神经元损伤，并能延迟再发性癫痫发作的出现(见以上实施例1)。他们还确证基底皮质的保护似乎是在癫痫的锂-毛果芸香碱模型中诱导疾病改善作用的关键因素，在120mg/kg剂量下，其或者延长潜伏的无癫痫发作期甚或其抑制期。在锂-毛果芸香碱模型组中，我们先前已证明了作为癫痫过程启动剂的基部皮质的关键作用(参见André等的2003，Epilepsia 44893-903，Roch等的2002，Epilepsia 43325-335和Epilepsia 431129-1136)。
因此，试验化合物在该模型中显示出非常有希望的抗癫痫和神经保护作用，且据我们所知，第一种分子能够展现这些性质。见下表1 表1.增加试验化合物剂量对经历Li-Pilo SE大鼠的海马和大脑皮质中神经元细胞体数目的影响。RWJ30＝30mg/kg试验化合物，RWJ60＝60mg/kg试验化合物，RWJ90＝90mg/kg试验化合物和RWJ120＝120mg/kg试验化合物。
表示为各研究区域内神经元细胞体数目的值代表平均值±括弧内动物数的S.E.M. *p＜0.05，**p＜0.01表示与对照组具有统计学上明显差异 °p＜0.05，°°p＜0.01表示与DZP组具有统计学上明显差异， 实施例3 PC12细胞去血清模型 去血清是一种细胞毒性环境攻击，其导致培养的细胞系中以及各种组织起源的初级细胞(包括神经细胞)中的细胞死亡。尤其是，嗜铬细胞瘤(PC)12细胞已被广泛用作各种神经变性和细胞死亡相关疾病的体外神经元细胞模型(Muriel等，神经酰胺依赖性细胞死亡过程中神经元分化的PC12细胞中线粒体的游离钙水平(Rhod-2荧光)和超微结构的改变(Mitochondrial free calcium levels(Rhod-2 fluorescence)andultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells duringceramide-dependent cell death)，J.Comp.Neurol.，2000，426(2)，297-315；Dermitzaki等，短期去血清后阿片短暂性抑制细胞凋亡机制的激活(Opioids transiently prevent activation of apoptotic mechanisms followingshort periods of serum withdrawal)，J.Neurochem.，2000，74(3)，960-969；Carlile等，去神经生长因子和血清后细胞凋亡的降低四聚体甘油醛-3-磷酸脱氢酶转变为二聚体(Reduced apoptosis after nerve growthfactor and serum withdrawalconversion of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to a dimmer)，Mol Pharmacol.，2000，57(1)，2-12)。
将PC12细胞培养于补充有10％热灭活马血清和5％胎牛血清(FBS)的无菌培养基(RPMI 1640)中。该培养基还包含抗生素青霉素-链霉素-新霉素(分别为50.mu.g、50.mu.g、100.mu.g)。每隔一日更换培养基，细胞通过对数期接近融合。
将对照细胞培养于无任何处理的常规培养基中。将式7或式8的对映体(10.mu.M)在培养基中充分混合，然后施加于细胞中。对于2日的试验，仅在去血清时立即将式7或式8的对映体(10.mu.M)施加于细胞中。对于7日的试验，在去血清时和每48小时用新鲜新的无血清培养基更换细胞时，将式7或式8的对映体(10.mu.M)施加于细胞中。在去血清组中，将细胞在无血清培养基中培养，不另外加入式7或式8的对映体。在去血清后2或7日，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓内盐(MTS)测定法测定细胞存活率。
在实验结束时，将细胞用新鲜培养基洗涤，并在潮湿37℃下5％CO2培养箱中与MTS溶液一起培养1.5小时。培养期之后，用Softmax程序(Molecular Devices)，立即对细胞进行分析。MTS测定法是一种测定给定试验环境下活细胞数的量热法。该测定法的基础是四唑鎓盐MTS的细胞转化为甲
(formazan)，将甲
溶解于组织培养基中，在96孔测定板中在490nm处直接测定。吸光度与培养物中活细胞数直接成比例。将对照细胞中读取的随机吸光度表示为100％存活率。表2列出表明在PC12细胞去血清模型中口服给予式7和式8对映体对细胞存活率影响的数据(.sup.1p值-0.01；.sup.2p值-＜0.01)。
表2(％细胞存活率) 实施例4 大鼠暂时性脑缺血模型 使用雄性Wistar大鼠，运用短暂脑缺血中脑动脉闭塞(MCAO)大鼠模型(见Nagasawa H和Kogure K.，Stroke，1989，20，1037；和ZeaLonga E.，Weinstein P.R.，Carlson S和Cummins R.，Stroke，1989，20，84中所述)，研究10和100mg/kg(i.v.)式7的对映体。采用MK 801(马来酸地佐环平；CAS登记号77086-22-7，市售获得的神经保护化合物)作为阳性对照(3mg/kg，i.p.)。
将大鼠(n＝12)随机分配为四个试验组之一中，然后麻醉。通过该操作阻断血液从颈内动脉、大脑前动脉和大脑后动脉流向大脑中动脉。阻断1小时后，在一小时内，将动物用介质(在1小时内静脉注射给予)、对照药物(在该1小时期间开始时一次性腹腔注射给予)和2个剂量的式7的对映体(在该1小时内静脉注射给予)处理。阻断2小时后，进行再灌注。
将动物处死，制备20mm厚的各脑的冠状缝切片。用将从前至枕叶皮质每40个切片(即每800nM)的一个来定量大脑损伤的程度。使用甲酚紫染色(根据Nissl程序)的切片制备载玻片，然后在光显微镜下检查。
根据出现的形态学变化的细胞确定各个大鼠冠状缝切片中局部缺血的表面积。测定神经元损伤或梗塞的面积，然后相加。计算各动物皮层和纹状体体积(总缺血面积乘以0.8mm(厚度))。
MCAO模型分析 先后采用单向ANOVA(单向ANOVA是一种比较三个或三个以上不匹配组别的统计方法)和Dunnett′s t-检验(两种方法均装载于Statview 512+软件中，BahnPower，Calabasas，Calif.，USA)，比较随机安排的四个实验组的各动物的平均体积(.+-.S.E.M.)。
如下表3中所示，当与介质组比较，p值＜0.05(1p＜0.01；2p＜0.05)时，认为结果具有统计学意义。
表3
参考文献 本发明所引用的所有参考文献均全文结合到本发明中作为参考，且如同各个申请或专利或专利申请各自特别地且分别被指明通过引用全文结合到本发明中作为参考的程度一样。
本文中参考文献的讨论意指仅仅概述其作者所作出的主张，并未对任何参考文献构成的现有技术做出认可。申请人保留对所引用的参考文献的准确性和适合性质疑的权力。
本发明并不受本申请中所述的具体实施方案的限定，这些实施方案仅是对本发明各方面的简单说明。本领域技术人员将清楚，在不背离本发明精神和范围下，可对本发明作出很多修饰和改变。本领域技术人员从以上说明书和附图中将清楚，除本文所列举的之外，功能上等同的方法和仪器也在本发明范围之内。这些修饰和改变意欲落入所附权利要求书的范围之内。本发明仅受限于所附的权利要求书，以及该权利要求书所要求的等同物的全部范围。
参考文献
Dublin W B(1976)感觉神经听觉病理学的基本原理(Fundamentals ofsensorineural auditory pathology).Springfield，III.C.C.Thomas.
Rybak L P(1986)耳毒性机制(Ototoxic mechanisms).听觉神经生物学(InNeurobiology of Hearing).Altschuler R A，Bobbin R P，Hoffman DW，Eds.Raven Press(New York)PP441-454.
Lim D J(1986)细胞水平噪音和耳毒性药物对耳蜗的影响综述(Effects of noise and ototoxic drugs at the cellular level in the cochleaAreview).Am J Otolaryngol 773-99.
Pryor G (1994)听觉机能障碍的判定(Assessment of auditorydysfunction).神经毒性机理(In Principle of Neurotoxicology).Chang LW，ed.，Marcel Dekker，Inc.PP345-371.
Fleischman，R.W.，Stadnicki，S.W.，Ethier，M.F和Schaeppi，U.(1975).顺-二氯二氨络铂(II)在豚鼠中的耳毒性(Ototoxicity ofcis-dichlorodiammine platinum(II)in the guinea pig).Toxicol Appl.Pharmacol.33320-332.
Stadnicki，S.W.，Fleischman，R.W.，Schaeppi，U和Merriam，P.(1975).顺-二氯二氨络铂(II)对猕猴听力缺失和其它毒性作用(Cis-dichlorodiammineplatinum(II)(NSC-119875)Hearing loss andother toxic effects in rhesus monkeys.)Cancer Chemother.Rep.59467-480.
Nakai，Y.，Konishi，K.，Chang，K.C，Ohashi，K.，Mohsaki，N.，Minowa，Y和Morimoto，A.(1982).抗癌药物顺铂的耳毒性(Ototoxicity of theanticancer drug cisplatin).Acta Otolaryngol 93227-232.
Berggren，D，Anniko，M，Thornell，L.-E.，Ramaekers，F.C.S和Virtanem，I.(1990).正常状态和暴露耳毒性药物后小鼠胚胎内耳中的中间丝蛋白(Intermediate filament proteins in the embryonic inner ear of miceunder normal conditions and after exposure to ototoxic drugs).ActaOtolaryngol.(Stockh)10957-65.
]Hood J L，Berlin C I，Ed.，神经生物学在人听力评估中的同时应用(Contemporary applications of neurobiology in human hearing assessment)(Raven Press，New York，1986).
Sera，K.，Harada，Y.，Tagashira，N.，Suzuki，M.，Hirakawa，K和Ohya，T.(1987).耳毒性药物诱导的前庭上皮和神经节中的形态学变化(Morphological changes in the vestibular epithelia and ganglion inducedby ototoxic drug).Scanning Microsc.11191-1197.
Hinojosa，R和Lerner，S.A.(1987).两名患有氨基糖苷耳毒性患者无毛细胞消亡性的耳蜗神经退化(Cochlear neural degeration without hair cellloss in two patients with aminoglycoside ototoxicity).J.Infect Dis.156449-455
Bareggi，R.，Grill，V.，Narducci，P.，Zweyer，M.，Tesei，L和Russolo，M.(1990).庆大霉素耳毒性经中耳给药后组织学和超微结构改变(Genetamicin ototoxicityHistological and ulstructural alterations aftertranstympanic administration).Pharmacol.Res.22635-644.
Carenza，L.，Villani，C，Framarino dei Malatesta，M.L.，Prosperi Porta，R.，Millefiorine，M.，Antonini，G.，Bolasco，P.，Bandiera，G和Marzetti，L.(1986).二氯二氨络铂的外周神经病变和耳毒性仪器评价(Peripheralneuropathy and ototoxicity of dichlorodiamineplatinuminstrumentalevaluation).Gynecol.Oncol.25244-249.
Myers E N，Berstaein J M(1965)水杨酸盐的耳毒性临床和实验研究(Salicylate ototoxicityA clinical and experimental study).ArchOtolaryngl Head Neck Surg 82483-493.
Jarvis J F(1966)一例服用乙酰水杨酸后单侧永久性耳聋(A case ofunilateral permanent deafness following acetyl salicylic acid).J Laryngol80318-320.
Rahman，MU等Curr.Opin.Rheumatol.，May；13(3)184-9，(2001))
Choi等，(1988)，Neuron 1623-634；
Rothman等，(1984)，J.Neurosci.41884-1891；
Choi和Rothman，(1990)，Ann.Rev.Neurosci.13171-182；
David等，(1988)，Exp.Eye Res.46657-662；
Drejer等，(1985)，J.Neurosci.45145-151.
Reagan，R.F.，兴奋性神经毒性和中枢神经系统外伤(Excitotoxicity andCentral Nervous System Trauma)in The Neurobiology of CentralNervous Trauma，New York，Oxford University Press，1994，pp.173-181(Salzman SK，Faden Al，eds)
Robinson，M.B.& Dowd LA，Adv Pharmacol，1997；3769-115
Kermer等，Cell Tissue Res 298383-395，1999
Coyle和Schwartz，(1976)，Nature 263244-246；
阿尔茨海默氏病(AD)(Maragos等，(1987)，TINS 1065-68；
癫痫症(Epilepsy)(Nadler等，(1978)，Nature 271676-677)
山黧豆中毒(Lathyrism)(Spencer等，(1986)，Lancet 2391066-1067；5)
Caine等，(1986)，Lancet 21067-1070
Dykens等，(1987)，J.Neurochem.491222-1228).
Lipton等(1994)New Engl.J.Med.330613621)
Meldrum等(1990)Trends Pharm.Sci.11379-387).
Herin等(2001)J.Neurochem.781307-1314
Rossato等(2002)Neurosci.Lett.318137-140).
Jacques，等，对映体、外消旋化合物和拆分(Enantiomers，Racemates andResolutions)(Wiley Interscience，New York，1981)；
Wilen，S.H.，等，Tetrahedron 332725(1977)；
Eliel，E.L.碳化合物的立体化学(Stereochemistry of CarbonCompounds)(McGraw-Hill，NY，1962)；
Wilen，S.H.拆分剂和光学分辨率表(Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions)p.268(E.L.Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，IN 1972).
Alfonso ARRemington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，MackPublishing Company，Easton PA，1985
Minto，J.Pharmacol.Exp.Ther.28193-102，1997.
Rohatagi，J.CNn.Pharmacol.351187-1193，1995；Tjwa，Ann.AllergyAsthma Immunol.75107-111，1995).
Rao，J.Biomater Sci.Polym.Ed.7623-645，1995；
Gao，Pharm.Res.12857-863，1995)；
Eyles，J.Pharm.Pharmacol.49669-674，1997)
Al-Muhammed，J.Microencapsul.13293-306，1996；
Chonn，Curr.Opin.Biotechnol.6698-708，1995；
Ostro，Am.J.Hosp.Pharm.461576-1587，1989).
药物剂型片剂(Pharmaceutical Dosage FormsTablets).Second Edition.Revised and Expanded.Volumes 1-3，edited by Lieberman等；
药物剂型非肠道给药方法(Pharmaceutical Dosage FormsParenteralMedications).Volumes 1-2，edited by Avis等；
药物剂型分散系统(Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems).Volumes 1-2，edited by Lieberman等；published by Marcel Dekker，Inc，Lieberman，药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)(Vols.1-3，1992)；Lloyd，1999，
药物制剂的工艺、科学和技术(The art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)；and Pickar，1999，Dosage CalculationsTurski等，1989，Synapse 3154-171；
Cavalheiro，1995，ItalJ Neurol Sci1633-37)
Dube等，2001，Exp Neurol 167227-241).
Paxinos和Watson，1986，向异物性配位中的大鼠大脑(The Rat brain inStereotaxic Coordinates)，2nd ed.Academic Press，San Diego)
Cavazos等，1991，J Neurosci 112795-2803.)
Fisher RA，1946a，研究工作者的统计方法(Statistical Methods forResearch Workers)(10th edition)Oliver & Boyd，Edinburgh
Fisher RA，1946b，实验设计(The Design of Experiments)(4th edition)Oliver & Boyd，Edinburgh)
Turski等，1983，Behav Brain Res 9315-335.
André等，2003，Epilepsia 44893-903
Roch等，2002，Epilepsia 43325-335
Roch等，2002，Epilepsia 431129-1136
Muriel等，神经酰胺依赖性细胞死亡过程中神经元分化PC12细胞中线粒体游离钙水平(Rhod-2荧光)和超微结构改变(Mitochondrial freecalcium levels(Rhod-2fluorescence)and ultrastructural alterations inneuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent celldeath)，J.Comp.Neurol.，2000，426(2)，297-315
Dermitzaki等，短期去血清后阿片短暂性抑制细胞凋亡机制的激活(Opioids transiently prevent activation of apoptotic mechanisms followingshort periods of serum withdrawal)，J.Neurochem.，2000，74(3)，960-969；
Carlile等，去神经生长因子和血清后细胞凋亡的降低四聚体甘油醛-3-磷酸脱氢酶转变为二聚体(Reduced apoptosis after nerve growthfactor and serum withdrawalconversion of tetrameric glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to a dimmer)，Mol Pharmacol.，2000，57(1)，2-12).
Nagasawa H和Kogure K.，Stroke，1989，20，1037；
Zea Longa E.，Weinstein P.R.，Carlson S和Cummins R.，Stroke，1989，20，84)
权利要求
1.一种提供耳保护的方法，其包括给予需要用耳保护药物(OPD)治疗的患者治疗有效量的选自式(I)和式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或酯，
其中
苯基在X上被1-5个选自氟、氯、溴和碘的卤原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6独立选自氢和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任选被苯基取代(其中苯基任选被独立选自下列的取代基取代卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
2.权利要求1的方法，其中X是取代在苯环邻位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6选自氢。
3.一种提供耳保护的方法，其包括给予需要用耳保护药物(OPD)治疗的患者治疗有效量的选自式(I)和式(II)的对映体或其药学上可接受的盐或酯或对映体混合物，其中选自式(I)和式(II)的一种对映体占优势
其中
苯基在X上被1-5个选自氟、氯、溴和碘的卤原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6独立选自氢和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任选被苯基取代(其中苯基任选被独立选自下列的取代基取代卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
4.权利要求3的方法，其中X是取代在苯环邻位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6选自氢。
5.权利要求3的方法，其中选自式(I)和式(II)的一种对映体占优势的程度达到约90％或以上。
6.权利要求3的方法，其中选自式(I)和式(II)的对映体是选自式(Ia)和式(IIa)的对映体
其中苯基在X上被1-5个选自氟、氯、溴和碘的卤原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6独立选自氢和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任选被苯基取代(其中苯基任选被独立选自下列的取代基取代卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
7.权利要求6的方法，其中X是取代在苯环邻位上的氯，且其中R1、R2、R3、R4、R5和R6选自氢。
8.权利要求6的方法，其中选自式(Ia)和式(IIa)的一种对映体占优势的程度达到约90％或以上。
9.权利要求3的方法，其中选自式(I)和式(II)的对映体是选自式(Ib)和式(IIb)的对映体
10.权利要求9的方法，其中选自式(Ib)和式(IIb)的一种对映体占优势的程度达到约90％或以上。
11.权利要求1或3要求的方法，其中在需要耳保护的患者中表现的耳损伤的可能原因选自以下病症耳毒性药物暴露；外伤；耳鸣；梅尼尔氏病，包括免疫介导的梅尼尔氏病、免疫介导的耳蜗或前庭紊乱(IMCVD)；自身免疫性耳病(AIED)；科根综合征；影响内耳或第八脑神经的局部缺血性事件以及钝性或穿透性脑外伤。
12.权利要求11的方法，其中在需要耳保护的患者中表现的诱病因素选自耳鸣、梅尼尔氏病和耳毒性药物暴露。
13.权利要求12的方法，其中所述诱病因素是耳鸣。
14.权利要求12的方法，其中所述诱病因素是耳毒性药物暴露。
15.权利要求14的方法，其中所述耳毒性药物是抗生素。
16.权利要求14的方法，其中所述耳毒性药物是化学治疗剂。
17.权利要求1或3的方法，其中所述化合物(或对映体)或其药学上可接受的盐或酯与一或多种其它化合物或治疗剂联合给予。
18.权利要求17的方法，其中所述一或多种其它化合物或治疗剂选自抗生素和化学治疗药物；以便抑制患者的耳毒性。
19.一种提供耳保护作用的药用组合物，其包含药用有效量的选自式(Ib)和式(IIb)的对映体，或其药学上可接受的盐或酯，或其对映体混合物，其中一种对映体选自式(Ib)和式(IIb)
20.权利要求1或3的方法，其中治疗有效量约为每剂量0.1mg/kg-50mg/kg。
21.权利要求1或3的方法，其中治疗有效量约为每剂量1.0mg/kg-25mg/kg。
22.权利要求1或3的方法，其中治疗有效量约为每剂量2.0mg/kg-40mg/kg。
23.权利要求1或3的方法，其中对于平均体重为70kg的患者，治疗有效量约为140mg/天-2800mg/天。
全文摘要
本发明涉及提供耳保护的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的选自式(I)和式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或酯，其中苯基在X上被1-5个选自氟、氯、溴和碘的卤原子取代；而R1、R2、R3、R4、R5和R6独立选自氢和C1-C4烷基；其中C1-C4烷基任选被苯基取代(其中苯基任选被独立选自下列的取代基取代卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基、硝基和氰基)。
文档编号A61P27/00GK101568335SQ200780048306
公开日2009年10月28日 申请日期2007年10月11日 优先权日2006年10月27日
发明者M·哈斯 申请人:詹森药业有限公司