从生物流体中去除传染性海绵状脑病病原体的正交方法

专利名称：：从生物流体中去除传染性海绵状脑病病原体的正交方法
技术领域：
：本公开内容涉及生物流体及其纯化方法。更具体地说，本公开内容涉及从生物流体中正交去除传染性海绵状脑病病原体的方法。站旦冃足传染性海绵状脑病(TSEs)也叫朊病毒病，是一类罕见的退行性脑病，其特征在于使脑部呈现出"海绵状"外观的微小空洞。Creutzfeldt-Jakob病(CJD)是最著名的人TSEs。这是一种罕见的痴呆，每年在每一百万人中有约一人感染。其它人TSEs包括库鲁病，致命性家族性失眠症(FFI)禾BGerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)。库鲁病发生在新几内亚巴布亚岛的与世隔绝部落的人中，现在几乎已经消失。FFI和GSS是极罕见的遗传性疾病，全世界仅有少数家族患有此病。被称为变异型CJD(vCJD)的新型CJD在1996年有描述，现已在英国及数个其它欧洲国家中出现。vCJD的始发症状与经典CJD不同，该病症通常发生在年轻的患者中。虽然TSEs的症状不同，但它们都通常包括人格改变，精神问题，如抑郁，缺乏协调，和/或不稳定步态。患者还可能经历被称作肌阵挛的无意识急跳运动，感觉异常，失眠，意识错乱，或记忆问题。在疾病后期，患者有严重的精神损害，并失去行动或说话的能力。TSEs倾向于进展迅速，通常在数月至数年内导致死亡。研究显示，vCJD可能起因于人类摄取了患有被叫作牛海绵状脑病(BSE)，也叫作"疯牛病"的TSE病的牛的牛肉。其它在动物中发现的TSEs包括感染绵羊和山羊的瘙痒病；感染麋鹿和鹿的慢性消耗性疾病；和传染性水貂脑病。在少数稀有情况下，TSEs发生在其它动物，如动物园动物中。也有证据显示，TSE可以经输血传播，然而，从感染到症状出现的时间可能很长。例如，人可能在感染5-20年之后出现症状。许多国家为预防TSE爆发采取了不同措施。美国食品药品监督管理局(FDA)禁止给反刍动物喂食动物蛋白，并对1980年以来在法国，葡萄牙和/或爱尔兰生活10年以上的人们的捐赠实施禁令。1980-1996年在英国生活6个月以上的人们已经被禁止在美国，加拿大，新西兰和澳大利亚供血。在美国，FDA成立了处理这一主题的TSE咨询委员会。此外，FDA还颁布了许多对医药产品中存在的TSE病原体进行管理的文件。朊病毒病，如TSEs伴有正常细胞Prpe向其同种型耐蛋白酶性病原性朊蛋白(Prpse)的转变。PrpSe被认为是导致TSE的病原体。感染TSE的风险取决于对象对TSE病原体的有效暴露。有效暴露是三个主要变量的函数被污染材料中的传染原的量；暴露途径；和具体的屏蔽效应。例如，肠胃外暴露途径在实现感染方面比通过消化道暴露更有效。因此，对于源于动物并用于人类的肠胃外用药物，更严格地采取了现有的去除PrpSe，也叫去除TSE病原体的方法。类似措施也被建议用于来源于人类组织的药物。从包括血红蛋白的血液制品中去除TSE病原体的一个挑战是血红蛋白易于降解。血红蛋白是一种独特的高度不稳定的分子，易于在纯化过程中被破坏。这种四聚血红素蛋白可以容易地离解成不稳定的二聚体和氧化；从而失去血液代用品的主要目的，即其运输氧的能力。无细胞血红蛋白的自发性自氧化产生超氧阴离子。氧化速率被氢离子(低pH)增大。超氧阴离子起催化剂的作用，促进血红蛋白的进一步自氧化，同时自发或经酶歧化成过氧化氢。过氧化氢与亚铁-血红蛋白或铁-血红蛋白反应，产生高铁-血红蛋白(ferryl-hemoglobin)。高铁-血红蛋白起自由基的作用，以与羟基自由基一样的程度引发脂质过氧化。红细胞外的血红蛋白氧化反应由于该环境中不含有使血红素维持在其功能性还原亚铁形式所需要的酶和非酶抗氧化系统，因此难以控制。因此，不可逆性血红素氧化是基于血红蛋白的血液代用品的开发者的一个难题。牛和人源性血红蛋白溶液要成为有效的携氧血浆增容剂，必须满足许多要求。除无毒，无免疫原性和无热原性，贮藏期长，携氧能力良好，以及胶体渗透压和粘度与血浆相似外，这些产品还应该无病原体，如TSE。尽管从血红蛋白溶液中去除其它病原体(例如，微生物)可以用如灭菌/超滤的技术，然后经鉴别培养来有效实现，但生产工艺的TSE清除率必须经过验证。朊病毒蛋白(例如，PrPSe)对常用灭活方法非常耐受。其在蒸煮甚至高压灭菌及暴露于高浓度酸或碱；对于纯化包括血红蛋白的流体而言攻击性太强的条件后仍可以存活。例如，仅有的用于去除含血红蛋白溶液中的TSE病原体的制药工艺方法以柱色谱技术为基础。根据FDA的要求，能够从血液制品，尤其是血红蛋白溶液中去除5logs的TSE病原体的方法似乎是可取的。然而，在这样的方法中，不同步骤的log去除率只有当清除步骤为正交关系(即，通过独立的机制去除病原体)时才认为可以累加。因此，存在着对降低含血红蛋白溶液中的病原性朊病毒蛋白的正交方法的需求。发明概述本文公开了一种方法，其包括使包含血红蛋白和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与纳米过滤装置接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，分离洗脱级分；使洗脱级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中生物流体包括等于或小于约65kDa的目的组分。本文还公开了一种方法，其包括使包含高分子量组分和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与亲水膜接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，分离洗脱级分；使洗脱级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中高分子量组分具有大于约65kDa的分子量。本文还公开了一种方法，7其包括使包含血红蛋白和至少一种病原体的生物流体经历至少两个过滤步骤，从而降低与生物流体相关的病原体的量。本文进一步公开了一种方法，其包括通过将包括多个过滤步骤的正交分离方法用于人和/动物源性血红蛋白溶液，除去该血红蛋白溶液中的传染性海绵状脑病病原体。为了详细描述本公开内容的实施方案，现在将参照附图，在附图中图1是用于降低生物流体中的TSE病原体水平的方法的流程图。图2是包括纳米过滤装置，离子交换膜色谱和疏水溶剂的正交多步程序降低血红蛋白溶液中的TSE病原体的效率的图示。结果表示为各个纯化程序的LogH)降低量和整个多步方法的累计Log1Q降低量。发明详述本文公开了用于从生物流体中正交去除病原体，如去除被认为是传染性海绵状脑病(TSE)的病原体，以下简称TSE病原体的方法。本文中，生物流体是指任何具有源自天然源的组分，合成制备的组分，或其组合的可以向生物体给药以治疗病症的流体。在一实施方案中，生物流体是含血红蛋白溶液，其也可以称作包括血红蛋白的组合物或溶液。在一实施方案中，TSE病原体是朊病毒，或者是病原性朊病毒(Prpse)。朊病毒是蛋白质性感染颗粒的简称，其可以在机体细胞中发现的无害蛋白的正常形式，和导致疾病的感染性形式存在。在一实施方案中，TSE病原体可以用本文所公开的正交方法从含血红蛋白溶液中去除，本文所用术语正交是指该方法包括两个以上步骤，其中各步骤通过独立的机制导致了组分(例如，TSE病原体)的去除和/或灭活。例如，本文所述正交方法可以包括利用组分(例如，TSE病原体)的不同理化性质来实现所述组分的去除或清除的步骤。在一实施方案中，为了实现从生物流体中去除TSE病原体，本方法包括色谱技术，化学处理和纳米过滤。例如，正交多步程序可以包括高亲和力朊病毒降低过滤器，纳米过滤装置，亲水膜，离子交换膜色谱和疏水溶剂。在一实施方案中，去除TSE病原体的方法可以由使用者按任何顺序进行，或者，去除TSE病原体的方法可以按本文所公开的顺序进行。去除TSE病原体(即，去除Prpse)后所得的生物流体可适用于治疗需要施予生物流体，如含血红蛋白溶液的哺乳动物病症。图1中图示了从样品200中去除TSE病原体的方法的实施方案。在一实施方案中，样品包括生物流体，如含血红蛋白溶液。含血红蛋白溶液可以包括人和动物(例如，反刍动物，如牛)源性血红蛋白。在一实施方案中，含血红蛋白溶液是得自全血的含无细胞血红蛋白溶液。下文中用到的含无细胞血红蛋白溶液的pH除非另有说明，约为血红蛋白的pl(等电点)，或者为约6.6至约7.2，或者为约7.8至约8.2。在施用本文所公开的方法之前，溶液可以与一氧化碳接触，以将游离血红蛋白转化为一氧化碳的形式。一氧化碳形式是指结合了一氧化碳的血红蛋白。样品可以与一氧化碳接触足以使样品中的一氧化碳达到饱和的时间。本领域技术人员将了解到，达到饱和量一氧化碳所需要的时间取决于多种因素，如样品溶液的组份和一氧化碳源，并且可以调节到以实现使用者所预期的结果。尽管不希望受到理论的限制，但血红蛋白的一氧化碳形式比脱氧血红蛋白(即，未结合氧的血红蛋白)或氧血红蛋白(即，结合了氧的血红蛋白)更稳定。在一实施方案中，样品是包括一氧化碳血红蛋白的生物流体。这样的样品可以采用如框10，20，40和50中所述的方法。在一实施方案中，施用本公开方法后得到的最终组合物具有分子量小于约65kDa的目的组分(即，使用者所预期的组分)。参照图1，方法200可以从使样品与框IO高流速亲和朊病毒降低过滤器接触开始。这样的高流速亲和朊病毒降低过滤器可以包括一种或多种与惰性膜结合的降血小板和/或降白细胞剂组成，所述惰性膜包含例如聚合物材料，如聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)，聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯(PET)等。过滤器可以允许流体，例如但不限于生物流体以等于或小于约25分钟，或者，等于或小于约20分钟内约500至约1000mL的速率快速流过(即，高流速)。这样的过滤器在美国专利No.6,945,411中有描述，其以全文引入本文作为参考。适宜的高流速亲和朊病毒降低过滤器的例子有PALLLEUKOTRAP亲和朊病毒降低过滤系统；这是一种可以购自PallCorporation(AnnArbor，MI48103-9019，U.S.A.)的全血采集，过滤和忙藏系统。尽管不希望受到理论的限制，但高流速亲和朊病毒降低过滤器可以选择性地去除含PrpSe白细胞。因此，框IO提供了伴随白细胞的TSE病原体的降低，过滤器可以制成与俘获这些受染白细胞相应的大小。这种过滤可以称之为白细胞过滤(leukofiltration)。从红细胞中提取血红蛋白，以获得起始材料无细胞血红蛋白通常用破坏细胞组分的技术来进行。例如，可以通过低渗溶胞从红细胞悬浮液中提取血红蛋白。低渗溶胞可以使含PrpSe的白细胞破裂，从而向含血红蛋白溶液中释放出TSE病原体(即，PrPSe)。白细胞过滤，或通过过滤(例如，用高流速朊病毒亲和过滤器)去除白细胞的方法会降低使PrpSe从白细胞转移至游离血红蛋白溶液的可能性。如生物测定法和Western印迹分析法所测定的那样，使样品与高流速亲和朊病毒降低过滤器接触可以导致样品(例如，含血红蛋白溶液)中等于或大于约ilog,或者约40%至约60%(0.4-0.6对数减少)，或者约0.7至约1.9logs,或者约2至约3.7logs的TSE病原体的去除。经高流速朊病毒亲和过滤器处理后的样品(例如，含血红蛋白溶液)在下文中称之为滤过样品。滤过样品包括滤液或未被高流速朊病毒亲和降低过滤器截留的样品部分。再次参照图1，方法200接着进行到框20，滤过样品与第二过滤装置接触。过滤作为去除TSE的手段的潜在效率基于这样的事实，即，TSE病原体(即，PrPSe)可以质量高至约1000kDa的罕见丝状形态的形式存在。第二过滤装置可以包括纳米过滤装置，例如，中空纤维过滤器或包括尺寸选择性多孔膜的圆盘。这种纳米过滤装置可以由如醋酸纤维素，二醋酸纤维素，三醋酸纤维素，聚砜等的聚合物材料组成。过滤器可以允许流体，例如但不限于生物流体以约100mL至约500mL流体/分钟的速率快速通过。在一实施方案中，第二过滤装置具有约64.5kDa，或约65kDa，或约75kDa的截留分子量(意味着分子量等于或大于该特定量的分子被过滤器俘获，而分子量较小的分子则不被过滤器截留)。在一实施方案中，过滤器的截留分子量刚好稍大于血红蛋白分子(例如，64.5kDa)，这样便使得血红蛋白不被过滤器截留，但较大的分子，如TSE病原体(例如，病原性朊病毒)则被过滤器俘获。适宜的纳米过滤装置的例子包括但不限于可购自MinntechCorporation,Minneapolis,MN55447,U.S.A.的HEMOCOR高性能血液浓縮器HPH400,HPH700，HPH1000或HPH1400;其可以作为单一过滤单元使用，或者以结合的方式使用以增加过滤面积。在一实施方案中，这些纳米过滤装置导致了分子量等于或大于约65kDa，或等于或大于约75kDa的TSE病原体的进一步降低。经第二过滤装置过滤的滤过样品的TSE病原体的量与滤过样品相比降低了等于或大于约1log,或约1至约3.2logs,或约3.3至约3.7logs,或约3.8至约4.5logs，并被称为分级的滤过样品(sizedfilteredsample)。分级的滤过样品包括滤液或未被过滤装置截留的滤过样品的材料。在一实施方案中，如本文所述经过过滤装置过滤的样品对于初始生物流体而言是稀释的。稀释样品由于其可含有大量液体，因此可能不便于处理。另外，许多生物组分(例如，血红蛋白，蛋白质，等)在稀释溶液中保持低浓度时显示出稳定性降低。在一实施方案中，通过本文所公开的方法产生的溶液可以按照特定技术进行浓縮，以得到更浓的样品。适于浓縮这些样品的技术是已知的。例如，可以通过在样品与纳米过滤装置接触后将样品引入截留分子量为约10kDa，或约40kDa，或约50kDa的透析器中，浓縮滤过样品，使样品得到浓縮。或者，生物流体可以按照本公开方法中的各个步骤进行浓縮。样品的起始浓度和最终浓度将取决于所用装置的类型。因此，本领域技术人员可以将样品的最终浓度调节成使用者所预期的值。再参照图1，用于降低样品中的TSE病原体的方法然后进行到框40，分级的滤过样品与色谱材料或膜，例如，离子交换膜接触。在一实施方案中，色谱膜起到进一步降低样品中的TSE病原体(例如，PrPSe)水平的作用。在一实施方案中，色谱膜包括强阴离子交换剂。在其它实施方案中，色谱材料包括阴离子交换盘(anionexchangedisc)，或阴离子交换囊(anionexchangecapsule)，或阴离子交换模块(anionexchangemodule)。适用于本公开内容的色谱材料的例子包括但不限于形式为ASTRODISC色谱单元，MUSTANGQ—次性囊和MUSTANGQ模块，孔径为约0.8nm，膜床体积为约0.18mL至约1000mL，或大于约1000mL的MUSTANGQ强阴离子交换膜。MUSTANGQ膜可以购自PallCorporation.(AnnArbor,MI48103-卯19，U.S.A.)。包括MUSTANGQ强阴离子交换剂的膜的使用可以提供预期的低蛋白结合特性，宽的化学和温度耐受性，以及高流速的优点。例如，改性MUSTANGQ膜可以在允许高百分比蛋白，例如血红蛋白通过的同时降低TSE病原体水平。与色谱膜接触过的分级的滤过样品与滤过样品相比，其TSE病原体的量降低了等于或大于约llog,或约3.8至约4.3logs,或约1至约3.7logs,或约4.3至约5logs,并被称之为经的色谱的分级的滤过样品。经的色谱的分级的滤过样品包括组合物的洗脱级分，这样样品便包括未附着在阴离子交换剂上的材料。再参照图1，方法然后进行到框50，经的色谱的分级的滤过样品与疏水溶剂接触。在与疏水溶剂接触之前，样品的pH可以增加至约8.0，或约7.8，或约8.2。尽管不希望受到理论的限制，但增加经的色谱的分级的滤过样品(即，包括血红蛋白)的pH将使血红蛋白分子去质子化，从而产生带负电荷的分子，促进血红蛋白向亲水相分配。在一实施方案中，经的色谱的分级的滤过样品与疏水溶剂接触，搅拌，然后使其形成至少两相(例如，疏水相和亲水相)，这样，样品的至少一个组分变成与疏水相结合，样品的至少一个组分仍保持与亲水相结合。疏水溶剂可以是任何与色谱处理过的样品的组分相容的疏水溶剂；或者疏水溶剂包括氯仿，甲苯或其组合物。尽管不希望受到理论的限制，但TSE病原体(例如，PrPSe)的聚集形式在疏水溶剂中溶解度增加，因此可以优先分配入疏水溶剂，从而进一步降低了样品中存在的量。此外，TSE病原体向疏水溶剂的分配可以导致TSE病原体的降解。因此，生物流体与疏水溶剂的接触降低了TSE病原体的存在和感染性。在一实施方案中，框50还可以包括将与疏水溶剂接触的色谱处理过的样品进行离心，或高速超离心。离心的使用是为了促进色谱处理过的样品向疏水相和亲水相的分配。利用技术，如离心分离样品的方法和设备是本领域技术人员公知的。在一实施方案中，随后可以在本文公开方法的后续步骤中使用的经的色谱的分级的滤过样品的亲水相与色谱处理过的样品相比，其TSE病原体的量降低了等于或大于约1log，或约0.8至约1.2logs,或约0.1至约0.7logs,或约1.3至约3.5logs,并被称之为已处理样品。在一实施方案中，方法然后可以允许进一步处理已处理样品，以使样品处于适合引入生物体，例如，向患者给药的状态。或者，样品(例如，人或动物源性血红蛋白)可以在基于游离血红蛋白的血液代用品的生产中进一步加工后使用。在另一实施方案中，生物流体包括血浆或血清。血浆样品包括其级分，如白蛋白，凝固因子，免疫球蛋白或其组合物。对这样的样品可以进行框10，30，40和50中所述方法。在一实施方案中，将血浆或血清用本公开方法处理后得到的最终组合物具有分子量大于约65kDa，并且等于或小于150kDa的目的组分(g卩，使用者所预期的组分)。参照图1，降低样品中的TSE病原体水平的方法可以从框10开始，包括适用于具有高分子量组分，如免疫球蛋白(150kDa)的生物流体的高流速亲和朊病毒降低过滤系统。本文中的高分子量是指分子量大于约65kDa，包括所述高分子量组分的生物流体被称作高分子量样品(HMWS)。适用于从HMWS中去除TSE病原体的高流速朊病毒降低过滤器的例子包括但不限于可购自PallCorporation的LEUKOTRAPSCRC过滤系统。从这些HMWS中分离红细胞，血小板和白细胞需要侵入性技术，如离心力，其可以破坏含PrpSe白细胞，将TSE病原体(即，PrPSe)引入样品。HMWS与本文所述类型的高流速朊病毒降低过滤器接触时，目的组分组分可仍保持在溶液中(例如，IgG)，而TSE病原体则被过滤器俘获。通过滤器去除的溶液含有可以随后处理的目的组分，该样品在下文中称为滤过HMWS。滤过HMWS与HMSW相比，其TSE病原体的量降低了等于或大于约llog，或约0.7至约1.91ogs，或约2至约3.71ogs。参照图1，方法然后可以进行至框30，滤过HMWS可与亲水膜接触。亲水膜可以起到进一步降低HMWS中的TSE病原体(例如，PrpSe)水平的作用。在一实施方案中，膜包括聚偏氟乙烯(PVDF)或改性PVDF。包括PVDF的膜的使用可以提供预期的低蛋白结合特性，宽的化学和温度耐受性，以及高速率的优点。例如，改性PVDF膜可以在允许高百分比的蛋白，例如血红蛋白通过的条件下降低TSE病原体水平。适用于本公开内容的亲水PVDF膜的例子包括但不限于可购自PallCorporation的ULTIPORGradeDV50滤膜。适宜的PVDF膜的例子在美国专利No.5,736,051中公开，其以全文引入本文作为参考。与亲水膜接触过的滤过HMWS样品，以下称已处理HMWS与滤过HMWS相比，其TSE病原体的量降低了等于或大于约1log,或约3.3至约3.7logs,或约1至约3.2logs,或约3.8至约4.51ogs。然后通过亲水膜的滤液在本文所公开的方法的后续步骤(例如，框40和/或50)中使用。在一实施方案中，如本文前述含血红蛋白溶液那样，己处理HMSW然后与阴离子交换剂(例如，框40)接触，接着与疏水溶剂(例如，框50)接触。在HMSW与阴离子交换剂接触(例如，框40)后，样14品的TSE病原体的量与未经阴离子交换剂处理的HMSW相比，降低了等于或大于约1log,或约3.8至约4.3logs,或约1至约3.7logs,或约4.3至约5logs。HMSW与疏水溶剂(例如，框50)接触后，样品的TSE病原体的量与未经疏水溶剂处理的HMSW相比，降低了等于或大于1log，或约0.8至约1.2logs,或约0.1至约0.7logs,或约1.3至约3.51ogs。如前所述，方法然后可以允许进一步处理已处理样品，以使样品处于适合引入生物体，例如，向患者给药的状态。或者，样品可以未经进一步处理而使用。在一实施方案中，方法进一步包括在样品用本公开方法处理之前，期间或之后测定样品中的TSE病原体水平。例如，在样品与纳米过滤装置，图1框20接触之前，分析至少部分样品中TSE病原体(例如，PrPSe)的存在。或者，在样品与阴离子交换膜，图1框40接触之后，分析至少部分样品中TSE病原体的存在。或者，在样品与疏水溶剂，图l框50接触之后，分析至少部分样品中TSE病原体的存在。在一些实施方案中，方法进一步包括在本公开方法的每一步之后分析至少部分样品中TSE病原体的存在。对TSE病原体的存在的分析可以是定性的，定量的，或定性及定量的。这些分析是本领域技术人员公知的，可包括，例如，Western印迹分析，ELISA，动物感染性测定或其组合。在一实施方案中，经本文所公开的TSE病原体去除方法处理过的样品(例如，已分配色谱处理样品)可除去样品中存在的等于或大于约5logs，或等于或大于约61ogs，或等于或大于约71ogs的TSE病原体。在一实施方案中，经本文所公开的方法处理过的样品可能具有不可检出水平的TSE病原体，其中检测方法包括ELISA，动物感染性测定或其组合。对包括感染量的一种或多种TSE病原体的样品施用本文所公开的方法后，存在的TSE病原体的量的降低足以导致该样品失去感染性。本文所述方法可以手工进行，自动进行，或者可以手工和自动方法组合进行。在一实施方案中，用于实施本文所述方法的装置可以手15动控制，自动化控制或手动与自动组合控制。在一实施方案中，方法通过能执行本文所公开方法的计算机化设备实施，其中本文所述方法在通用计算机或其它有处理器，用户界面，微处理器，存储器和其它相关硬件及操作软件的计算机化部件上用软件实施例。实施本方法的软件可以存储在有形介质中，和/或存在于存储器，例如，计算机上。同样，软件的输入和/或输出，例如，组分的量，比较和结果可以存储在有形介质，计算机存储器，硬拷贝，如纸质打印输出，或其它存储设备上。本文所公开的方法是PrpSe清除平台，其包括各自依赖于不同物理原理和针对PrpSe的典型特性的单独清除步骤。本文所公开的方法包括通过去除白细胞降低PrpSe;用纳米过滤器过滤PrpSe,用阴离子膜吸附剂吸附PrpSe和用疏水溶剂灭活PrPSe。实施例上文已经对实施方案进行了概括性描述，以下实施例作为具体实施方案列出，以证明其实施和优点。应该了解的是，实施例的列出是为了进行说明，其不希望以任何方式限制权利要求的范围。实施例1通过纳米过滤纯化牛血红蛋白溶液和通过PrPSt:抗原捕获酶免疫分析(EIA)和体内分析验证朊病毒去除方法本实施例中所用瘙痒病病原体为已经得到鉴定并被广泛接受为TSE感染性的代用标记仓鼠263K毒株。所用瘙痒病制剂为10%仓鼠脑匀浆，以下列稀释度进行加样实验前10Q，10"，l(T2，l(T3，l(T4，l(T5，l(T6禾Bl(T7，经超声，在10,000rpm离心10分钟，经孔径为0.45和0.22pm的级联过滤器过滤处理。牛血获自多个健康供体或者按照美国FDA的指导原则饲养的单个动物。在无菌条件下从颈外静脉穿刺抽取血液。从一个动物获取约2L血液，收集在4个500mL的含有75mLACD抗凝剂(TheMetrixCompany,Dubuque,IA52002,U.S.A.)的抽真空无菌无热原瓶中。不同动物的血液不相混合。在运输至血液代用品生产厂的过程中，将瓶放置在凝胶冰(gelice)上。然后血液通过LEUKOTRAP将红细胞与白细胞分离，通过离心将红细胞与血小板和血浆分离。这个步骤降低了非血红素蛋白及其它最后必须从其中纯化血红蛋白的物质的载量。所有白细胞的去除同时也除去了与这些细胞相关的任何病毒，如巨细胞病毒，人免疫缺陷病毒等。此外，白细胞的完全去除还清除了趋向存在于这些细胞中的TSE病原体。可能携带病毒和TSE病原体的白细胞的去除用PALLLEUKOTRAP亲和朊病毒降低过滤系统(PallCorporation,EastHills,NY11548,U.S.A.)降低。根据制造商的说明，降低朊病毒PrpSe的性能为2.9±0.7log。按照制造商的说明书，纯化在捐赠后8小时内用全血进行，或者用在4。C放置过夜的血液进行，体积为450mL/过滤器，血液温度在4-22'C的范围内。然后，在15'C以约170xg的速度离心20分钟，在无菌，无热原塑料容器(FenwalLaboratories,Deerfield，IL60015,U.S.A.)中采用标准血库程序，在无菌条件下用等渗盐水溶液(体积比为1:4的红细胞:盐水；760xg，4°C，10分钟)连续5次洗涤，5次离心，将红细胞从血小板和血浆中纯化出来。为了证明没有白细胞和血小板，用Coulter细胞计数器进行细胞计数，并通过常规化学方法，如分光光度法验证悬浮液中没有蛋白质。用孔径为0.45nm的高流速过滤模块通过低渗透析-超滤从红细胞中提取血红蛋白。为了使血红蛋白分离过程中的蛋白水解降至最低，该程序在4。C，用轻微低渗的介质(240-260mOsmkg)在小于10p.s.i的跨膜压下进行。提取得到的血红蛋白用0.2pm的过滤器，如PdlSSUPORDCF囊过滤器(PallCo卬oration)过滤，经一氧化碳饱和后转变为一氧化碳形式，贮藏在4。C的FENWAL转移包(transferpacks)中。本实施例中，约500mL添加有10%仓鼠脑匀浆的浓度为60±10g/L的牛血红蛋白在pH6.8士0.2的TRIS缓冲液中的溶液用市场上可以买到的带有可选配管的HEMOCORHPH1400(MinntechCorporation)高效血液浓縮器进行纳米过滤。这种基于聚砜的中空纤维透析膜具有20.9cm的有效纤维长度，1.31r^的膜过滤面积，86mL的预充量和65kDa的平均截留分子量。过滤在300mL/min的速率，30kPa的跨膜压下于2小时内完成。收集透析液，用市场上可以买到的带有可选配管的基于聚砜的低通量透析器OPTIFLUX(F認niusMedicalCare,Lexington,MA02420,U.S.A.)浓縮至几乎为55±8g/L的初始Hb水平。这种装置具有1.5m2的表面积，83mL的预充量和10kDa的平均截留分子量。根据制造商的说明书，程序在约1小时内完成，浓縮产物与透析前样品一起用牛海绵状脑病-瘙痒病抗原测试酶免疫测定试剂盒(IDEXXLaboratories,Inc.,Westbrook,Maine04092,U.S.A.)测量朊病毒蛋白水平，所述试剂盒能识别PrPSe。或者，根据制造商的说明书，用蛋白酶处理后，样品用SPI-BIO酶免疫测定试剂盒(CaymanChemicalCo.,AnnArbor,MI48108,U.S.A.)测试，所述试剂盒使用了两种抗来自受染仓鼠脑的变性羊瘙痒相关原纤维制剂(SAFs)的抗体。所有实验重复3次，用公式RT=log10(样品初始体积xPrpSe初始浓度)/(过滤后的样品体积xPrpSe最终浓度)计算对数减縮系数(RF)，表示Prpse的清除率。结果表明，在血红蛋白与中空纤维表面积的比为400mL/m2时，HEMOCORHPH1400在2小时后滤过了大于90%的血红蛋白，如表1所示，纳米过滤可以使PrpSe水平平均降低3.47±0.14lOgSc表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>还通过体内测定评价了滤液(1)添加了瘙痒病病原体，但未经过纳米过滤的牛血红蛋白溶液和(2)添加了Prpse，并且经过纳米过滤的牛血红蛋白溶液，两种样品均在以下稀释度10Q，10"，l(T2，l(T3，l(T4，l(T5，10"和10-7进行评价。体内测定瘙痒病感染性涉及向仓鼠(约6-8周龄断奶仓鼠)脑内(i.e.)接种等份感兴趣的溶液。添加了未纯化血红蛋白溶液和添加了纯化血红蛋白溶液的各稀释组各分配5只仓鼠(每个稀释度5只动物，每次滴定7个稀释度)。对照仓鼠仅接种血红蛋白。每天观察动物，共观察200天，并监测瘙痒病感染的典型临床体征(共济失调，慢性消耗性和神经学特征，如循环游走)和存活率。200天的观察期的选择基于这样的事实，即，牛朊病毒向转基因小鼠的传染表现出约200天的潜伏期。因此，200天后，通过过量麻醉处死所有存活动物，用电子显微镜观察其脑部的瘙痒病感染的特征性小管，瘙痒病相关原纤维。死亡动物和因瘙痒病感染的临床体征而结束生命的动物的脑部也通过电子显微镜观察SAF。存活率和SAF阳性率见表2。结果显示，添加了未纯化牛血红蛋白的制剂具有约10VmL的瘙痒病感染性滴度。纳米过滤后，瘙痒病感染性降低了约1035。这些结果与通过ELIA研究得到的结果一致。因此，单独的纳米过滤不能完全清除PrpSe的感染性，稀释度为1()G和10"的组中一些动物没有存活。此外，结果还显示，当瘙痒病感染性滴度为约10"mL时，纳米过滤，即使通过孔径约65kDa的中空纤维也不能作为独立的用于从血红蛋白溶液中完全清除PrpSe的方法。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例2通过阴离子交换膜色谱纯化牛血红蛋白溶液和通过PrPSe抗原捕获酶免疫测定法(EIA)验证朊病毒去除方法本实施例中使用的瘙痒病病原体也是仓鼠263K毒株。所用瘙痒病制剂为10%仓鼠脑匀浆，以下列稀释度进行加样实验前10°,10"，l(T2，10-3,l(T4，IO-5，l(T6和10-7，经超声，在10，000rpm离心IO分钟，经孔径为0.45和0.22pm的级联过滤器过滤处理。本实施例中，如实施例1中方法制备的100mL添有10%仓鼠脑匀浆的浓度为60±10g/L的牛血红蛋白在pH6.8±2的TRIS缓冲液中的溶液用市场上可以买到的配有MUSTANGQ膜的PallACRODISC单元(PallCorporation,AnnArbor,MI48103-9019,U.S.A.)进行阴离子交换膜色谱分离。孔径0.8的MUSTANGQ聚醚砜膜是有效结合质粒DNA，带负电荷蛋白质和病毒颗粒的强阴离子交换剂。每20mL血红蛋白用一个一次性PallACRODISC单元进行色谱分离。进行色谱法前，ACRODISC单元先用4mL1MNaOH，然后用4mL1MNaCl预处理，再用pH6.8±0.2的20mMTRIS缓冲液平衡。一氧化碳形式的加样血红蛋白溶液(pH6.8±0.2)以4mL/min的流量进行色谱分离。pH6.8时，血红蛋白不带电荷。消除血红蛋白的电荷是为了预防其与已经pH6.8±0.2的20mMTRIS缓冲液平衡的强阴离子交换膜的结合。同时本色谱方法不希望影响DNA和病毒颗粒与该膜的结合。用独立的ACRODISC单元完成5次色谱运行后，将收集的级分合并在一起，测定最终体积。根据制造商的说明书，用牛海绵状脑病-瘙痒病抗原测试酶免疫测定试剂盒(IDEXXLaboratories,Inc.,Westbrook，Maine04092,U.S.A.)测量如下稀释度的色谱分离前及色谱分离后样品的朊病毒蛋白水平10°，10"，l(T2，l(T3，l(T4，l(T5，icy6和l(T7，所述试剂盒识别PrPSe。另外，根据制造商的说明书，用蛋白酶处理后，样品用SPI-BIO酶免疫测定试剂盒(CaymanChemicalCo.,AnnArbor，MI48108，U.S.A.)测试，所述试剂盒使用了两种抗来自受染仓鼠脑的变性SAFs制剂的抗体。所有实验重复3次。用公式RT=log10(样品初始体积xPrpSe初始浓度)/(过滤后的样品体积xPrpSe最终浓度)计算对数减縮系数(RF)，表示Prpse的清除率。结果表明，血红蛋白与交换剂膜表面积的比为约5mL/cm2时，与MUSTANGQ膜阴离子交换剂接触的样品未显示出血红蛋白水平降低。然而，如表3所示，MUSTANGQ的阴离子交换膜色谱能使样品中的Prpse水平降低4.01±0.24logs。表3LogK)縮减系数No.l操作3.81No.2操作3.94No.3操作4.27最小值3.81最大值4.27范围0.46中间值3.94均值4.01标准误差0.14方差0.06标准偏差0.24变异系数5.92实施例3通过疏水溶剂纯化牛血红蛋白溶液和通过PrPSe抗原捕获酶免疫测定法(EIA)验证朊病毒去除方法本实施例中使用的瘙痒病病原体也是仓鼠263K毒株。所用瘙痒病制剂为10%仓鼠脑匀浆，以下列稀释度进行加样实验之前10Q，IO'1，l(T2，IO-3，l(T4，10-5，10-6和l(T7，经超声，在10,000rpm离心10分钟，经孔径为0.45和0.22pm的级联过滤器过滤处理。本实施例中，如实施例1中方法制备的200mL添有10%仓鼠脑匀浆的浓度为60±10g/L的一氧化碳形式牛血红蛋白在pH8.0±2的TRIS缓冲液中的溶液用氯仿(色谱级，FisherScientific)进行疏水溶剂处理。22按以下方法进行一系列3次先用氯仿处理，后用Sorvall离心机(型号RC5C，带SS-34转子)离心的步骤(1)将与氯仿以15:1的体积比混合的血红蛋白涡旋15分钟，然后在4°C以760xg的速度离心30分钟；(2)将上清液倒入第二系列支管中，与氯仿以16:l的体积比混合，涡旋10分钟，在4。C以1,600xg的速度离心15分钟，再以3,800xg的速度离心15分钟；(3)将上清液移入第三系列支管中，不加氯仿，在4。C以48,400xg的速度离心90分钟。第三次离心后，向血红蛋白溶液中吹氮气，以除去剩余的微量氯仿，然后吹入一氧化碳，以确保其完全转化为一氧化碳形式。根据制造商的说明书，用牛海绵状脑病-瘙痒病抗原测试酶免疫测定试剂盒(IDEXXLaboratories,Inc.,Westbrook,Maine04092,U.S.A.)测量如下稀释度的氯仿处理前及氯仿处理后样品的朊病毒蛋白水平100，10"，l(T2，l(T3，l(T4，IO-5，If)-6和IO-7，所述试剂盒识别PrP"。另外，用蛋白酶处理后，根据制造商的说明书，样品用SPI-BIO酶免疫测定试齐U盒(CaymanChemicalCo.，AnnArbor，MI48108，U.S.A.)测试，所述试剂盒使用了两种抗来自受染仓鼠脑的变性SAFs制剂的抗体。所有实验重复3次。用公式RT=log10(样品初始体积xPrpSe初始浓度)/(过滤后的样品体积xPrpSe最终浓度)计算对数减縮系数(RF)，表示Prpse的清除率。如表4所示，氯仿处理使Prpse水平降低1.15±0.14logs。该数据表明，可以将氯仿处理看作是从Prpse纯化血红蛋白溶液的灭活步骤。23表4<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例4通过纳米过滤，阴离子交换膜色谱和疏水溶剂纯化牛血红蛋白溶液以及通过体内测定验证朊病毒去除方法本实施例中使用的瘙痒病病原体也是仓鼠263K毒株。所用瘙痒病制剂为10%仓鼠脑匀浆，以下列稀释度进行加样实验前10Q，10—、l(T2，l(T3，10"，l(T5，10-6和l(T7，经超声，在10,000rpm离心10分钟，经孔径为0.45和0.22|im的级联过滤器过滤处理。通过体内测定评价的溶液是(1)添加了瘙痒病病原体，但未经过朊病毒纯化过程的稀释度为10°，10"，l(T2，10—3，l(T4，l(T5，10-6和10—7的牛血红蛋白溶液，及(2)添加了瘙痒病病原体，并且经过基于纳米过滤，阴离子交换膜色谱和疏水处理的级联朊病毒纯化过程的稀释度为100，10"，l(T2，IO-3，10-4，l(T5，10-6和10-7的牛血红蛋白溶液。本实施例的起始材料是按实施例1中方法制备，并如前述方法加样的一氧化碳形式的牛血红蛋白溶液。TSE纯化过程包括分别如实施例1，2和3中所述的(1)纳米过滤，(2)阴离子交换膜色谱及(3)氯仿的疏水溶剂处理。为了使纳米过滤和阴离子膜交换装置对血红蛋白的吸附保持在较低水平，将血红蛋白溶解在消除其电荷，从而消除其静电作用的缓冲系统中。这样的缓冲系统在实施例1和2中有描述。此外，为了保护血红素免受氧化，将血红素氧完全用一氧化碳代替，从而形成对氧化攻击高度耐受的一氧化碳血红蛋白。通过评价血红蛋白浓度校正样品体积的任何改变。纯化前样品的平均血红蛋白浓度为约60±10g/L，纯化后为约55±8g/L。体内测定瘙痒病感染性涉及向仓鼠(约6-8周龄断奶仓鼠)脑内(i.e.)接种等份感兴趣的溶液。添加了未纯化血红蛋白溶液和添加了纯化血红蛋白溶液的各稀释组各分配5只仓鼠(每个稀释度5只动物，每次滴定7个稀释度)。对照仓鼠仅接种血红蛋白。每天观察动物，共观察200天，并监测瘙痒病感染的典型临床体征(共济失调，慢性消耗性和神经学特征，如循环游走)和存活率。200天后，通过过量麻醉处死所有存活动物，用电子显微镜观察其脑部的瘙痒病感染的特征性小管(瘙痒病相关原纤维因子-SAF)。死亡动物和因瘙痒病感染的临床体征而结束生命的动物的脑部也通过电子显微镜观察SAF。存活率和SAF阳性率见表5。结果显示，加样未纯化牛血红蛋白制剂的瘙痒病感染性滴度为约105/mL。经过瘙痒病病原体的多步纯化程序后的加样牛血红蛋白样品未检出瘙痒病感染性。仅接种血红蛋白的动物未观察到任何临床及形态学变化。这些数据表明，通过连续逐步采用纳米过滤，阴离子交换膜色谱和疏水溶剂处理对牛血红蛋白溶液进行TSE病原体的纯化可以有效消除瘙痒病感染性。这种清除PrpSe的多步牛血红蛋白纯化程序被认为是正交的，因为其包含去除(纳米过滤和阴离子交换膜色谱)及灭活(疏水溶剂)TSE病原体的元素。表5不同稀释度的死亡动物数/符合瘙痒病病理的动物数样品/稀释度10。10110210-310-410510-7纯化前5/55/54/55/51/20/10/00/0纯化后0/00/00/00/00/00/00/00/0未添加血红蛋白的对照0/00/00/00/00/00/00/00/0尽管已经显示和描述了实施方案，但本领域技术人员可以在不偏离本发明的精神和教导的条件下对其进行修改。本文所述实施方案只是示例性的，其并不希望是限制性的。许多变更和修改都是可能的，并且都在本公开内容的范围内。在明确规定数字范围或限度的地方，这些表达范围或限度应被理解为包括如落入该明确规定的范围或限度内的量值的累接(iterative)范围或限度(例如，约1至约10包括2，3，4等；大于0.10包括0.11，0.12，0.13等)。对于权利要求的任何元素，术语"任选"的使用意指该主题元素是需要的，或者是不需要的。两种选择都在权利要求的范围内。较宽的术语，如包括，包含，具有等的使用应被理解成为较窄的术语，如由......组成，主要由......组成，基本上由......组成等提供支持。因此，保护范围不受上述说明的限制，而只受所附权利要求书的限制，所述范围包括权利要求主题的所有等同体。每项权利要求都作为本发明的实施方案并入说明书中。因此，权利要求是对本发明的进一步描述及对本发明实施方案的补充。本文中对参考文献的讨论并不是承认该参考文献为本发明的现有技术，尤其是任何出版日期在本申26请的优先权日之后的参考文献。在为本文所述内容补充提供例示性的程序或其它方面细节的意义上，本文引用的所有专利，专利申请和出版物的公开内容因此引入本文作为参考。权利要求1.一种方法，包括使含有血红蛋白和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与纳米过滤装置接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，并分离洗脱的级分；使洗脱的级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中生物流体包括等于或小于约65kDa的目的组分。2.权利要求1的方法，还包括与第一过滤器接触之前，将含有血红蛋白的生物流体用一氧化碳饱和。3.权利要求l的方法，其中生物流体含有人源性血红蛋白，动物源性血红蛋白，或其组合物。4.权利要求l的方法，其中病原体包括蛋白质性朊病毒，传染性海绵状脑病病原体，或其组合物。5.权利要求1的方法，其中第一过滤器包括高流速亲和朊病毒降低过滤器。6.权利要求5的方法，其中过滤器具有等于或小于约25分钟内约500ml至约1000ml的流速。7.权利要求l的方法，其中第一滤液中的病原体的量与生物流体中的病原体的量相比降低了等于或大于约1对数。8.权利要求1的方法，其中纳米过滤装置包括中空纤维过滤器或圆盘。9.权利要求8的方法，其中纳米过滤装置具有约65kDa.的截留分子量。10.权利要求1的方法，其中第二滤液中的病原体的量与第一滤液中的病原体的量相比降低了等于或大于约1对数。11.权利要求l的方法，其中色谱材料包括强阴离子交换剂。12.权利要求1的方法，其中洗脱的级分中的病原体的量与第二滤液中的病原体的量相比降低了等于或大于约1对数。13.权利要求1的方法，其中疏水溶剂包括氯仿，甲苯，或其组合物。14.权利要求1的方法，其中亲水相中病原体的量与生物流体中病原体的量相比降低了等于或大于约5对数。15.权利要求1的方法，其中亲水相无传染性。16.权利要求l的方法，还包括测定病原体的量。17.权利要求16的方法，其中组合物中病原体的量的测定通过Western印迹分析，ELISA，动物感染性测定，或其组合进行。18.—种方法，包括使含有高分子量组分和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与亲水膜接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，并分离洗脱的级分；使洗脱的级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中高分子量组分具有大于约65kDa的分子量。19.权利要求18的方法，其中亲水膜包含聚偏氟乙烯。20.—种方法，包括使含有血红蛋白和至少一种病原体的生物流体进行至少两个过滤步骤，从而降低与生物流体相关的病原体的量。21.权利要求20的方法，其中病原体包括传染性海绵状脑病病原体，病原体的量的降低等于或大于约5对数。22.—种方法，包括通过将人和/动物源性血红蛋白溶液进行包括多个过滤步骤的正交分离方法，除去该血红蛋白溶液中的传染性海绵状脑病病原体。全文摘要本申请提供了一种方法，包括使包含血红蛋白和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与纳米过滤装置接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，分离洗脱级分；使洗脱级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中生物流体包括等于或小于约65kDa的目的组分。本申请还提供了一种方法，包括使包含高分子量组分和至少一种病原体的生物流体与第一过滤器接触，产生第一滤液；使第一滤液与亲水膜接触，产生第二滤液；使第二滤液与色谱材料接触，分离洗脱级分；使洗脱级分与疏水溶剂接触，产生疏水相和亲水相；以及分离亲水相，其中高分子量组分具有大于约65kDa的分子量。本申请还提供了一种方法，包括使包含血红蛋白和至少一种病原体的生物流体经历至少两个过滤步骤，从而降低与生物流体相关的病原体的量。本申请还提供了一种方法，包括通过将包括多个过滤步骤的正交分离方法用于人和/动物来源的血红蛋白溶液，除去该血红蛋白溶液中的传染性海绵状脑病病原体。文档编号A61L2/00GK101588822SQ200780048822公开日2009年11月25日申请日期2007年12月27日优先权日2006年12月29日发明者格雷斯·西莫尼,约翰·F·莫勒,让·S·西莫尼申请人:德克萨斯理工大学