用于伤口愈合的改进方法和组合物的制作方法

专利名称：用于伤口愈合的改进方法和组合物的制作方法
技术领域：
本领域涉及伤口愈合和组织修复，并涉及连接蛋白、连接蛋白半通道和间隙连接， 包括具有一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、对伤口愈合有用的药剂、和/ 或间隙连接修饰剂的组合物，含有这种组合物的制品和试剂盒以及递送装置，和含有这种 组合物的制剂，以及治疗伤口和疾病、紊乱或病症的方法，该伤口和疾病、紊乱或病症的特 征在于其整体或部分是急性的、延迟的或不完全的伤口愈合或其会受益于改善的组织修复 或愈合。
背景技术：
以下包括可以用于理解本发明的信息。我们不承认本文中所提供的任何信息是先 有技术，或与所描述或要求的本发明相关，或明确或隐含地参考的任何出版物或文献是先 有技术。在人或其它哺乳动物中，伤口损伤会引发细胞和生化事件的组织的级联反应，这 在大多数情况下都会导致伤口愈合。理想的愈合伤口是恢复正常的解剖学结构、功能以及 细胞、组织、器官和生物体水平的外观。伤口愈合过程，无论是由于外伤、微生物还是外来物 质所引起，都是经由包括许多重叠阶段的复杂过程进行的，这些阶段包括炎症、上皮形成、 血管形成和基质沉积。一般而言，这些过程都会导致形成成熟的伤口和一定程度上的疤痕 形成。尽管炎症和修复主要沿着规定的过程发生，但是该过程的敏感性取决于各种愈伤分 子的平衡，包括例如调节细胞因子和生长因子的网络。间隙连接是有利于直接的细胞_细胞通信的细胞膜结构。间隙连接通道由两个连 接子(半通道)构成，每一个连接子由六个连接蛋白亚单元构成。每一个六聚体连接子与相 对膜中的一个连接子对接以形成单个间隙连接。据报道，在遍及整个机体内都能找到间隙 连接通道。例如，诸如角膜上皮的组织具有6至8层细胞，然而在不同的层中也表达不同的 间隙连接通道，在基底层中是连接蛋白43，而在基底层到中间翼细胞层为连接蛋白26。一 般而言，连接蛋白是一个蛋白家族，通常根据其分子量命名或基于系统发生的基础分成α、 β和Y亚类。已经确定了至少20种人类和19种鼠科动物的同种型。据报道，不同组织和 细胞类型具有连接蛋白表达的特征图谱，且已经证实在损伤或移植之后组织表现出改变连 接蛋白的表达(Qui, C. et al.，(2003)Current Biology, 13 1967-1703 ；Brander et al.， (2004)，J. Invest Dermatol. 122 1310-20)。反义技术已经提出用于调整病毒、真菌和代谢病中隐含的基因表达。参见例如美 国专利第 5，166，195 号(HIV 的寡核苷酸抑制剂(oligonucleotide inhibitors of HIV)) 和美国专利第5，004，810号(用于与单纯疱疹病毒Vmw65 mRNA杂交并抑制复制的低聚
7物(oligomers for hybridizing to herpes simplex virus Vmw65 mRNAand inhibiting replication)) ο也参见授予Becker和Green的美国专利第7,098，190号(连接蛋 白中包含反义核苷酸的配方〃 Formulationscomprising antisense nucleotides to connexin")。也已经有间隙连接和半通道的肽抑制剂的报道。例如参见Berthoud，V. Μ. et al. , Am J. Physiol. Lung Cell MoI. Physiol. 279 :L619-L622(2000) ；Evans, W. H. and Boitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29 606-612, 以 及 De Vriese Α.S. , et al. Kidney Int. 61 177-185 (2001)。还参见 Becker 和 Green 的 PCT/US06/04131 (抗连接蛋白混合物 及其应用〃 anti-connexincompounds and uses thereof" ) 已经研究了各种细胞因子和生长因子以确定其在伤口愈合中作为治疗性介入的 潜力。然而，除血小板源性生长因子(Regranex 中的活性成分)之外在美国都还没有被 批准销售。而且，尽管在理解伤口愈合过程进行的原理方面取得了进展，但是对于适用于伤 口护理以及改善和/或促进伤口愈合的治疗性选项还存在显著不足的需求，包括延迟的或 缺乏免疫力的伤口的愈合，如慢性伤口、与伤口有关的肿胀、炎症和疤痕形成、该伤口包括 急性和亚急性伤口。

发明内容
本文中所描述和要求保护的本发明具有许多属性和实施方式，包括但不限于在发 明内容部分中提出或描述或参照的那些。并不是意在所有都包括在内，但是本文中所描述 和要求保护的本发明并不限于发明内容部分中确定的特征或实施方式或者受到其限制，其 所包含的内容仅仅出于举例说明的目的而不是要进行限制。本发明大体上涉及一种或多种抗连接蛋白药剂(例如，连接蛋白抑制剂，如α-1 连接蛋白脱氧寡核苷酸和α-1抗连接蛋白肽或拟肽)，其与一种或多种治疗剂、用于伤口 愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂组合来进行伤口治疗的应用，这些伤口包括急性伤口、 亚急性伤口、延迟愈合伤口和慢性伤口。本发明通过使用一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、用于伤口愈合 的药剂和/或间隙连接修饰剂而增加了伤口愈合的速率、程度和/或质量。在一种优选实 施方式中，一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、用于伤口愈合的药剂和/或 间隙连接修饰剂的组合使用对于促进伤口愈合具有加性效应、协同效应或超加性效应。在 另一优选实施方式中，一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、用于伤口愈合的 药剂和/或间隙连接修饰剂的组合使用，与这些药剂单独给药时有效的剂量相比，可以降 低这些药剂使用的剂量。在另一优选实施方式中，一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多 种治疗剂、用于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂的组合使用，与这些药剂单独使用 时的给药频率相比，可以降低给药频率。本发明披露并要求保护采用抗连接蛋白药剂与其它治疗剂、用于伤口愈合的药 剂、和/或间隙连接修饰剂组合使用的组合物和方法。本发明包括含有(a)治疗有效量的抗连接蛋白药剂和(b)用于伤口治疗或促进伤 口愈合的治疗有效量的另一种治疗剂的药物组合物。本发明包括含有(a)治疗有效量的抗 连接蛋白药剂和(b)治疗有效量的间隙连接修饰剂的药物组合物。优选地，该药物组合物 进一步包含药用载体、稀释剂或赋形剂。
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本发明药物组合物以组合的、同时的、分别连续的或持续给药的方式来提供。在一 种实施方式中，含有一种或多种抗连接蛋白药剂的组合物与一种或多种治疗剂、用于伤口 愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂同时给药或大致同时给药。药物组合物也以组合制剂的形式提供，例如，作为一种或多种抗连接蛋白药剂与 一种或多种用于伤口愈合的其它药剂的混合物，这些其它药剂例如是有效促进或改善伤口 愈合的生长因子，例如血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(例如， FGF2)、血管内皮生长因子和转化生长因子β 3 ；和/或有效促进或改善伤口愈合的细胞因 子，例如IL-7和IL-10 ；和/或有效促进或改善伤口愈合的其它药剂，例如IGF(如，IGF-1) 和 IGFBP (例如，IGFBP-2)。术语“组合制剂”包括“套装试剂盒(kit of parts)”，其意思是如上文所限定的 组合配方(combination parner)成分能够独立给药或通过使用与不同于组合配方(a)和 (b)的用量的不同固定组合来给药，即同时给药、分别给药或连续给药。例如，然后试剂盒部 件就能同时或按时序错开，即对于试剂盒部件中任何组件在不同时间点并以相等的或不同 的时间间隔错开。在一种优选的实施方式中，组合制剂给药会由于使用这种组合而具有更少的给药 时间点和/或给药之间的时间间隔增加。一方面，本发明包括药物组合物，包括局部递送形式和制剂，该药物组合物含有药 用载体和治疗有效量的抗连接蛋白药剂和一种或多种本文中描述的药剂。抗连接蛋白药剂 的实例包括抗连接蛋白寡聚脱氧核苷酸(“0DN”)，包括反义(包括修饰的和未修饰骨架反 义)、RNAijP siRNA，以及抗连接蛋白肽类和拟肽类。适合的抗连接蛋白药剂包括例如，针 对连接蛋白43、26、37、30和31. 1以及32的反义0DN、肽和拟肽。在某些实施方式中，适合 的组合物包括多种抗连接蛋白药剂，包括例如连接蛋白43、26、30和31. 1，与一种或多种有 助于伤口愈合和/或组织修复的其它药剂的组合。优选的抗连接蛋白药剂是直接针对抗连 接蛋白43的。与一种或多种抗连接蛋白药剂组合以用于使伤口愈合的优选药剂包括某些 生长因子，例如包括血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子α、成纤维 细胞生长因子β、血管内皮生长因子和转化生长因子β 3，以及胰岛素样生长因子。与一种 或多种抗连接蛋白药剂组合以用于使伤口愈合的其它优选药剂包括某些细胞因子，包括例 如IL-7和IL-10。与一种或多种抗连接蛋白药剂组合以用于使伤口愈合的其它优选药剂包 括胸腺素β _4、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、β肾上腺素拮抗剂(例如，噻吗洛尔)、白细胞 介素-1受体拮抗剂(例如，阿那白滞素)、游离自由基清除剂(例如，N-乙酰半胱氨酸)， 以及含有用于促进或改善伤口愈合的蛋白编码序列的基因疗法载体(例如，包括编码血小 板源性生长因子-B序列的腺病毒载体)。与一种或多种抗连接蛋白药剂组合给药的优选治 疗剂包括例如，抗炎剂、抗微生物剂(例如，甲氧苄啶)、局部麻醉剂和表层麻醉剂、以及局 部阿片类药(例如，吗啡、氢吗啡酮和芬太尼)。另一方面，本发明包括向带有伤口受试者给予以延迟释放制剂、缓释制剂、持续释 放制剂、控释制剂和/或以重复作用制剂形式配制的治疗有效量的一种或多种药用抗连接 蛋白药剂和一种或多种治疗性药剂、用于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂的方法， 该伤口包括特征为整体上或部分延迟愈合或未完全伤口愈合的伤口。在某些其它方面，本发明还涉及利用这样的组合物治疗患有与创伤有关的各种疾
9病、紊乱和病症或者具有患病的危险的受试者的方法，其中的创伤包括急性的和亚急性的 伤口、以及延迟愈合的伤口或慢性伤口。另一方面，本发明包括用于治疗具有或疑似患病或易感染特征为整体或部分有伤 或需要修复组织的任何疾病、紊乱和/或病症或具有患病危险的受试者的方法。这样的组 合物包括例如局部递送形式和制剂。优选的方法包括连续给予或同时给予一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种 有助于伤口愈合的药剂，其中的一者或两者都按照低于(一种或多种)药剂单独给药时 (即当它们既不是物理组合也不是在治疗伤口的过程中组合给药时)所使用的剂量提供。 这种药剂的较小给药剂量典型地为药剂单独给药时剂量的约十二分之一至约十分之一，并 可以为单独给药时的约八分之一的剂量，约六分之一的剂量，约五分之一的剂量，约四分之 一的剂量，约三分之一的剂量和约一半的剂量。优选地，给药连续进行。优选地，药剂在彼 此间隔至少约半小时的时间内连续给药。药剂也可以在彼此间隔约1小时内、彼此间隔约 一天到约一周或者以其它认为合适的方式来给药。优选地，首先给予抗连接蛋白药剂。在 使用一种或多种抗连接蛋白药剂的情况下，优选在给予阻断或降低连接蛋白表达或半通道 或间隙连接形成的抗连接蛋白药剂(例如通过下调连接蛋白的蛋白质表达的抗连接蛋白 药剂)之前给予抗连接蛋白肽或抗连接蛋白拟肽，例如能够阻断或降低半通道开放的抗连 接蛋白药剂。优选地，该抗连接蛋白药剂是(一种或多种)抗连接蛋白43药剂。另一方面，本发明包括能够粘附或与受试者皮肤结合的透皮贴剂、敷料、衬垫、缠 绕带(wrap)、基质和绷带，所述的物品能够向受试者递送治疗有效量的一种或多种药用抗 连接蛋白药剂和一种或多种其他药用治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰 剂。另一方面，本发明包括一种制造的制品，其包括盛装治疗有效量的一种或多种药 用抗连接蛋白药剂和一种或多种促进伤口愈合的药用治疗剂的容器以及包括用于治疗受 试者用途的使用说明书。另一方面，本发明包括一种制造的制品，其包括盛装治疗有效量的一种或多种药 用抗连接蛋白药剂和一种或多种促进伤口愈合或有助于伤口愈合的药用治疗剂的容器以 及包括用于治疗受试者用途的使用说明书。另一方面，本发明包括一种制造的制品，其包括盛装治疗有效量的一种或多种药 用抗连接蛋白药剂和一种或多种药用间隙连接修饰剂的容器以及包括用于治疗受试者用 途的使用说明书。本发明包括一种制造的制品，其包括含有一种或多种剂量形式的一种或多种药用 抗连接蛋白药剂和一种或多种药用治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂 的包装材料，其中该包装材料具有标签，指明该剂量形式能够用于患有或疑似患有或有易 感本文所描述的或引用的任何疾病、紊乱和/或病症，包括整体上或部分地以急性、受损、 缓发或慢性伤口愈合为特征的疾病、紊乱和/或病症。这样的剂量形式包括，例如，局部递 送形式和制剂。本发明包括一种制剂，该制剂包含药用抗连接蛋白药剂和以治疗有效量促进受试 者伤口愈合或组织修复的有助于伤口愈合的药用药剂。本发明包括一种制剂，该制剂包含 药用抗连接蛋白药剂和以治疗有效量促进受试者伤口愈合的药用药剂。本发明包括一种制
10剂，该制剂包含药用抗连接蛋白药剂和以治疗有效量促进受试者伤口愈合的药用间隙连接 修饰剂。这样的制剂包括，例如，局部递送形式和制剂。优选的制剂包括一种或多种抗连接 蛋白药剂和一种或多种有助于伤口愈合的药剂，其中的一者或二者都以低于该药剂或该些 药剂单独使用时所用用量或剂量(即当它们既不进行物理组合也不在治疗伤口疗程中组 合给药时)来提供。这种以组合方式给予或提供较小剂量的药剂典型地为药剂单独给药时 剂量的约十二分之一到约十分之一的量，并可以为单独给药时的约八分之一的量，约六分 之一的量，约五分之一的量，约四分之一的量，约三分之一的量和约一半的量。本发明包括在药品的制造中使用治疗有效量的含有一种或多种药用抗连接蛋白 药剂和一种或多种药用治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂的组合物的 方法。这样的药品包括，例如局部递送的形式和制剂。这样的药品包括治疗如本文中所披 露的受试者的那些药品。正如本文中所提到的，这样的药品优选包括用量降低的一种或多 种药用抗连接蛋白药剂和一种或多种药用治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接 修饰剂。本发明包括在一种剂型的生产中使用治疗有效量的一种或多种药用抗连接蛋白 药剂和一种或多种药用治疗剂、对伤口愈合有用的和/或间隙连接修饰剂的方法。这样的 剂型包括，例如局部递送的形式和制剂。这样的剂型包括治疗本文中所公开的受试者的那 些剂型。正如本文中所提到的，这样的剂型优选包括用量降低的一种或多种药用抗连接蛋 白药剂和一种或多种药用治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂。另一方面，本发明提供了包括向受试者给予本发明的药物组合物而用于治疗伤口 例如包括急性的、亚急性的、缓发性的和慢性伤口的治疗方法。另一方面，本发明提供了抗连接蛋白药剂(例如，抗-α-lODN、肽或拟肽)和治疗 药剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂在生产用于促进需要治疗的患者的伤 口愈合的药物产品中的用途。另一方面，本发明提供了促进或增强伤口愈合或治疗，或者预防或改善纤维化或 其它纤维化病症的方法，该方法包括向需要治疗的患者给予一种或多种抗连接蛋白药剂和 一种或多种治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂。在某些其它方面，本发明提供了 (i)包含抗连接蛋白药剂和其与治疗剂、有助于 伤口愈合的药剂和/或促进(例如，缩短愈合时间，改善伤愈效果)伤口愈合的间隙连接修 饰剂组合的使用说明的包装；(ii)包含一种或多种治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或 间隙连接修饰剂以及它们与一种或多种促进伤口愈合的抗连接蛋白药剂组合的使用说明 的包装；和(iii)包含一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、有助于伤口愈合 的药剂和/或间隙连接修饰剂及其在促进伤口愈合或减少伤口相关的纤维化方面的使用 说明的包装。在一种实施方式中，本发明的药物产品与伤口敷料或伤愈促进基质组合提供。提 供伤口敷料或基质的适当形式包括含有分散于固体基底之上或之中的抗连接蛋白药剂和 一种或多种治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂的固体基底。抗连接蛋白药剂和治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂可以在 同一组合物中给予或者由分别的组合物给予。优选地，正如本文中所提到的，这些药剂以减 少用量的一种或多种药用抗连接蛋白药剂和一种或多种药用治疗剂、有助于伤口愈合的药
11剂和/或间隙连接修饰剂来给药。抗连接蛋白药剂和治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂可以同 时、连续或分别地向患者给药。如果连续给药，则优选将抗连接蛋白药剂和治疗剂、有助于 伤口愈合的药剂和/或间隙连接修饰剂连续给药。优选地，这些药剂在彼此间隔至少约半 小时内连续给药。这些药剂也可以在彼此间隔约1小时内，在彼此间隔约1天到1周内或 者按照其它认为合适的方式给药。优选地，首先给予抗连接蛋白药剂。在使用一种或多种 抗连接蛋白药剂的情况下，优选在给予阻断或降低连接蛋白表达或半通道或间隙连接形成 的抗连接蛋白药剂(例如通过下调连接蛋白的蛋白质表达的抗连接蛋白药剂)之前给予抗 连接蛋白肽或抗连接蛋白拟肽，例如能够阻断或降低半通道开放的抗连接蛋白药剂。优选 地，该抗连接蛋白药剂是(一种或多种)抗连接蛋白43药剂。以下将提供本发明的这些和其它方面，但这都不应该限制发明内容部分中的信息 或受到发明内容部分中的信息的限制。


图IA至图II描述了伤口处的Cx43的表达。图IA描述了伤口处的Cx43基因表 达的实时PCR分析。图IA描述了用对照sODN(n = 4，开口柱)和Cx43as0DN(n = 4 ；填充 柱)治疗的伤口中在第1天和第7天Cx43对GAPDH的相对表达水平；数据表示为平均值士 标准误差*P < 0. 05。图IB至图IF描述了用双苯酰亚胺(bis-benzimide)核染色(蓝) 对用Cx43as0DN(图IB 1天，图2D 2天，图IF :7天)或对照治疗的伤口(图IC :1天，图 1E:2天和图1G:7天)实施的Cx43染色(绿)。图IH和图II描述了在伤口边缘中成像位 置的图示。(图1H)图像B-E。(图II)图像F和G。图2A至图2H描述了受伤后的细胞增殖。图2A至图2D描述了通过对对照ODN (图 2A 第2天，图2C 第7天)和Cx43as0DN(图2B 第2天，图2D 第7天)中的抗BrdU单克 隆抗体进行免疫组织化学染色而实施的伤口处的细胞增殖分析。箭头和箭分别指示伤口边 缘和前缘。图2E至图2H描述了 BrdU染色的细胞；⑴和表皮(图2E :n = 5)和新生表皮 (图2F:n = 5)中伤口边缘每个区域的BrdU阳性细胞的数目；(ii)在皮肤伤口边缘(图 2G:n = 5)和形成的肉芽组织(图2H:n = 5)中BrdU阳性细胞的数目。以平均值士标准 误差表示计数，*P < 0. 05。刻度条表示200 μ m。图3A至图3C描述了中性白细胞募集进入伤口位置。图3A和图3B描述了中性白 细胞募集到用对照sODN(图3A)处理和Cx43as0DN处理(图3B)并在第1天采用抗MPO抗 体进行分析的皮肤伤口中。图3C描述了用对照sODN(开口柱在第1天η = 4 ；在第2天η =5)和Cx43as0DN(填充柱在第一天η = 3 ；在第二天η = 4)治疗之后伤口位置MPO阳 性细胞的数目。数据表示为平均值士标准误差，*Ρ< 0.05。刻度条表示50 μ m。图4A至图4C描述了巨噬细胞募集到伤口位置。图4A和图4B描述了巨噬细胞募 集进入用对照sODN(图4A)和Cx43as0DN(图4B)治疗的皮肤伤口，采用抗F4/80抗体在 第7天进行分析。图4C描述了用对照sODN(开口柱在第2天η = 4 ；在第7天η = 7)和 Cx43as0DN(填充柱在第2天η = 34 ；在第7天η = 6)治疗之后在第2天和第7天巨噬细 胞募集到皮肤伤口中。数据表示为平均值士标准误差，*Ρ< 0.01。刻度条表示50 μ m。图5々至图58描述了(^12和1顺-(1在伤口位置的表达。图5A和图5B描述了 Ccl2
12和TNF-α在伤口位置基因表达的实时PCR分析。将用对照sODN(开口柱)或CX43as0DN(填 充柱)治疗后在第1、2和7天(对于每一个n = 5)Ccl2(图5A)和TNF-α (图5B)对GAPDH 的相对表达水平的定量化。数据表示为平均值士标准误差，*P < 0. 05。图6A至图6K描述了 TGF-β 1的表达。图6Α至图6J描述了用对照sODN(图6A 至图6E)和Cx43as0DN(图6F至图6J)治疗的伤口位置的TGF-β 1的免疫组织化学。刻 度条表示200 μ m(图6A和图6F)和50 μ m(图6B至图6E，以及6G至图6J)。黑箭头示出 了表皮的新生边缘。相对于对照sODN(图6D和图6E)处理的伤口表皮，Cx43as0DN处理 的伤口(图61和图6J)表皮中的TGF-β 1染色强得多。红箭头和黑箭头分别示出了典型 的TGF-β 1伸长的成纤维细胞样细胞和圆形的推定的白细胞(presumptive leukocyte)。 图6K描述了用对照sODN(开口柱)或CX43as0DN(填充柱)治疗的伤口位置的TGF-β 1的 mRNA在第1、2和7天(每一个η = 5)表达的实时PCR分析。数据表示为平均值士标准误 差，*Ρ < 0. 05。图7Α至图7F描述了肉芽组织的形成和成纤维细胞的迁移。图7Α和图7Β描述了 成纤维细胞样细胞募集进入用对照sODN(图7A)和CX43as0DN(图7B)治疗的皮肤伤口中， 采用TRITC-鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin)和DAPI核染色在第2天进行分析。图7C描述 了观察用对照sODN(开口柱n = 5)或CX43as0DN(填充柱n = 5)治疗的伤口时每个区域 内每一伤口位置处成纤维细胞样细胞的数目。图7D描述了显示用Cx43as0DN治疗后迁移 显著地更快的成纤维细胞迁移的伤愈分析结果。图7E和图7F描述了在成纤维细胞培养基 中的伤口图像；其为受伤时(图7E)和伤后4小时(图7F)的图像。数据表示为平均值士 标准误差，*P < 0. 02 **P < 0. 01。刻度条表示50 μ m。图8A至图8B描述了伤口位置中的胶原表达。图8A描述了在用对照sODN(开口 柱)和CX43as0DN(填充柱)治疗的伤口位置通过定量测定受伤后在第7、10和14天和未 受伤皮肤(η = 5)中的羟脯氨酸(HP)含量而评估的胶原含量。数据表示为平均值士标准 误差，P < 0. 05。图8B描述了用对照sODN(开口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治疗的伤口 位置在第1、2和7天(每一个n = 5)Colla 1的mRNA表达的实时PCR分析。数据表示为 平均值士标准误差，*P < 0. 05。图9A至图9C描述了肉芽组织浓度。图9A和图9B描述了在对照sODN治疗(图 9A)和asODN治疗(图9B)的伤口中第14天伤口肉芽组织H&E染色。图9C描述了用对照 sODN(开口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治疗之后的第5天(对照物n = 7，asODN :n = 6)、 第 7 天(对照物n = 5，asODN :n = 5)、第 10 天(对照n = 5，asODN :n = 6)和第 14 天 (对照n = 5, asODN :n = 6)分析的肉芽组织区域。在用asODN治疗之后肉芽组织区域在 第5天的测定已经显示出面积稍有减小，但是在第7、10和14天面积减小变得很显著(*P < 0. 05. < 0. 01)。数据表示为平均值士标准误差。刻度条表示1mm。图10A至图10C描述了伤口位置处的细胞凋亡。图10A和图10B描述了在第7天 以对照s0DN(图10A)和Cx43as0DN(图10B)治疗的伤口中肉芽组织的TUNEL染色。死亡 的细胞显示为亮绿色点、其中一些已用箭头加亮。刻度条表示50μπι。图10C描述了在第 5、7和10天(每一个η = 6)观察用对照sODN(开口柱)和Cx43as0DN(填充柱)治疗的 伤口位置中每个视野区域的死亡细胞数目。数据表示为平均值士标准误差。刻度条表示 50 μ m0
图IlA至图IlF描述了伤口位置处成肌纤维细胞的成熟。图IlA和图IlD描述了 第7天的伤口中用双苯酰亚胺核染色(蓝)对肉芽组织边缘(图IlA和图11B)和在10天 伤口中用双苯酰亚胺核染色(蓝)对肉芽组织中心(图IlC和图11D)进行的抗-α平滑肌 肌动蛋白(SMA)染色(绿)。图IlE描述了定量化染色水平，这表明，在第7天(P = 0. 004) Cx43as0DN治疗伤口中的SMA染色显著地多于对照，表明肌成纤维细胞的较早成熟和分化。 在第10天当大多数SMA染色和成肌纤维细胞在Cx43as0DN治疗伤口中消失时，仍然存在这 种较早的成熟，而在对照伤口中染色仍然十分强烈(P = 0. 000002)。图IlF描述了在肉芽 组织中成像位置的图示区域1(图IlA和图11B)和区域11(图IlC和图11D)。数据表示 为平均值士标准误差。刻度条表示25 μ m。图12A至图12H描述了伤口位置的血管形成。图12A至图12F描述了伤后第7天 (图12A和图12B)、第10天(图12C和图12D)第14天(图12E和图12F)用双苯酰亚胺核 染色(蓝)对肉芽组织新生血管的血管假性血友病因子的染色(绿)。在反义治疗的伤口 (图12A、图12C和图12E)中，血管在早期时间点(第7天图12A和图12B以及第10天图 12C和图12D)的形成更广泛且明显好于用对照ODN治疗的情况(图12B、图12D和图12F)， 与对照的情况相比对照ODN治疗导致染色显著减少(7天*P = 0. 0019 ；10天= 0. 015)。 到第14天，asODN组中的血管尺寸已经显著增加，并与对照具有相似大小的尺寸(图12G)。 图12H描述了肉芽组织中成像位置的图示区域1(图12A和图12B)和区域11(图12C至 图12E)。数据表示为平均值士标准误差。刻度条表示25 μ m。图13A至图13B描述了与对照治疗相比，asODN治疗后伤口愈合的肉眼可见图像 (图13A)和在伤口区域中的相对变化(图13B)。图14描述了人角膜缘(Human Limbal rim)-脱落的猪间质基质嵌合体。图15描述了连接到用于检测120种不同生长因子和细胞因子的蛋白水平的抗体 芯片(antibody array)的生长因子和细胞因子的实例。每个两阵列膜上载有四个样品(每 个具有重复且具有阴性和阳性对照的膜有60种生长因子/细胞因子)。图16描述了在培养基中2周后，与异源嵌合体的角膜缘区域相比异源嵌合体间质 中的生长因子水平分析。这就是对照角膜(未经反义处理)。对两种生长因子特别感兴趣 (箭头)。在异源嵌合体基质中IGFBP-2的水平非常高，而在角膜缘中IGF-I的水平更高。 据报道，前者对于促进细胞迁移(其对于间质角膜细胞使切口(stoma)从角膜缘再增殖可 能很重要)很重要，而后者对于促进细胞增殖(其在可能对在角膜缘中提供增加切口的细 胞来源很重要)很重要。图17描述了在培养基中2周后与异源嵌合体的角膜缘区域相比异源嵌合体基质 中的生长因子水平分析(基于CX43as0DN治疗的角膜的数据)。对两种生长因子特别感 兴趣(箭头)。与未处理的对照物相比，在经反义处理的异源嵌合体间质中具有高水平的 IGF-7，而与未处理的对照物尤其是对照角膜缘相比，在角膜缘和间质中都具有更高水平的 IGFBP-2。据报道，前者对于促进上皮生长(其与在反义处理的异源嵌合体中所观察到的上 皮再生的增加一致)很重要，而后者对于促进细胞迁移(其与从反义处理的角膜缘的上皮 再增殖增加一致)很重要。图18图示说明了一组典型的细胞因子，其基于在相比于低炎性伤口模型的发炎 中它们的表达水平增加而进行识别。这些典型的细胞因子能够作为用于调节伤口愈合的适
14合靶标。图19图示说明了一组典型的细胞因子，其基于相比于炎性模型在低炎性伤口模 型中它们的表达水平增加而进行识别。这些典型的细胞因子能够作为用于调节伤口愈合的 适合靶标。
具体实施例方式本文中所使用的术语“紊乱”是受益于促进伤口愈合和/或减少肿胀、发炎和/或 疤痕形成的药剂的任何紊乱、疾病或病症。例如，包括外科手术或外伤所致的伤口，以及伴 有与神经性、局部缺血性、微脉管病理学、骨区(尾骨(骶骨)、髋(转子)、臀(坐骨)或脚 踵)上的压力相关的畸形有关的伤口、再灌注损伤和瓣回流病因和病症引起的伤口。本文中所用的术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括人类、家畜和农场动物，以及 动物园动物、体育运动动物、或宠物，如狗、马、猫、羊、猪、牛等。本文中优选的哺乳动物是 人，包括成年人、儿童和老年人。本文中所使用的“预防”是指整体上或部分地预防，或改善或控制。如本文中所使用的，关于本发明的化合物或组合物的“治疗有效量”是指足以产生 所需的生物的、药物的或治疗结果的用量。那些结果可以是疾病或紊乱或病症的征候、症状 或病因的减轻，或者生物系统的任何其它的期望变化。在优选的实施方式中，该结果会涉及 伤口愈合的促进作用以及整体或部分地减少肿胀、发炎和/或疤痕形成。如本文中所使用的，术语“治疗”既指治疗性处理也指预防性或防御性措施。需要 治疗的对象包括已经带有伤口或其它相关障碍的对象，以及易于具有伤口或相关紊乱或被 诊断患有该紊乱的对象或者在其中体内预防该紊乱的对象。如本文中所使用的，术语“抗连接蛋白药剂”是影响或调节连接蛋白、连接蛋白半 通道(连接子)、或间隙连接的活性、表达或形成的化合物。抗连接蛋白药剂包括但不限于 反义化合物(例如，反义多核苷酸)、RNAi和siRNA化合物、抗体及其连接片断，以及肽和多 肽，其包括“拟肽”和肽类似物。优选的抗连接蛋白药剂是抗连接蛋白43药剂。示例性的 抗连接蛋白药剂将在本文中更加详细地讨论。如本文中所使用的，术语“治疗”既指治疗性处理也指预防性或防御性措施。需要 治疗的对象包括已经患有紊乱的对象，以及易于患有给紊乱或被诊断患有该障碍的对象或 者在其体内预防该紊乱的对象。术语“拟肽”和“模拟物”包括可以与它们所模拟的蛋白区域具有基本相同的结构 和功能特征的天然存在的和人工合成化学化合物。在连接蛋白的情况下，可以模拟例如与 连接子_连接子分子对接和细胞_细胞通道形成有关的相对的连接蛋白的细胞外环。“肽类似物”是指具有类似于模板肽的特性的化合物，并且可以是非肽类药物。“拟 肽”(也称为“模拟肽”)包括肽基化合物，也包括非肽基化合物如肽类似物。在结构上类 似于治疗用肽的拟肽可以用于生产等价物或增强治疗或预防的效果。一般而言，拟肽在结 构上与模板多肽(即具有生物学或药学功能或活性的多肽)相同或相似，但也可具有一个 或多个肽键，该肽键可选地由选自例如-CH2NH-、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH-(顺式和反 式)、-coch2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-组成组中的键所替代。模拟物能够完全由天然氨基酸，或氨基酸的非天然类似物构成，或者是部分天然肽氨基酸与部分氨基酸的非天然类似 物的嵌合分子。该模拟物也可包含任意量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换也不会 实质上改变模拟物的活性即可。例如，如果模拟组合物能够下调连接蛋白或连接子的生物 行为或活性，例如阻止连接子对接而形成间隙_连接-介导的细胞_细胞通信，或者阻止连 接子打开而将细胞质暴露于细胞外环境，则该模拟组合物可被用作抗-链接蛋白药剂。拟 肽、模拟肽和连接蛋白修饰肽包括了本文中所提出描述的，以及本领域或许已知的这种拟 肽、模拟肽和连接蛋白修饰肽，无论是现在已知的还是未来开发的。本文中以其各种形式所使用的术语“调节子(modulator) ”和连接蛋白活性的“调 节(modulation) ”是指整体或部分地抑制连接蛋白或连接蛋白半通道的表达或行为或活 性，可以起到抗连接蛋白药剂的作用。一般而言，术语“蛋白”是指两个或多个单个氨基酸(无论是不是天然存在的)经 由肽键连接的任何聚合物，也就是当连接到一个氨基酸(或氨基酸残基)α碳的羧酸基团 的羧基碳原子共价连接至连接于相邻氨基酸α碳的氨基的氨基氮原子时就会形成肽键。 这些肽键连接，以及包含这些连接的原子(即α碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)， 和氨基氮原子(及其取代氢原子))形成了蛋白质的“多肽骨架”。另外，本文中所使用的术 语“蛋白质”应理解成包括术语“多肽”和“肽”(在本文中它们有时可以互换使用)。类似 地，在本文中蛋白片断、类似物、衍生物和变异体都可以被称为“蛋白质”，而且除非另外指 出都应该认为是“蛋白”。术语蛋白质的“片断”是指包含少于该蛋白质全部氨基酸残基的 多肽。蛋白质的“域”也是一个片断，且包含经常要求具备活性或功能的该蛋白质的氨基酸 残基。本文中所使用的术语“同时”用于意指本发明的一种或多种药剂同时进行给药，而 术语“组合”用于意指它们如果不是同时或物理组合给药时，那么就在利用它们都可以而起 到治疗作用的时间内“连续”给药。因此，“连续”给药可以容许一种药剂在其它药剂给药 之后在数分钟(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30分钟)或大约数小时、数天、数周或数月 给药，条件是一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种治疗剂、有助于伤口愈合的药剂和/ 或间隙连接修饰剂以有效量同时存在。组分的一次或多次给药之间的时间延迟会根据组分 的精确性质、彼此间的相互作用和其各自的半衰期而有所不同。术语“伤口”是指任何组织的创伤，包括例如急性的、亚急性的、延迟的或难以愈合 的伤口，以及慢性伤口。伤口的实例可以包括开放伤口和闭合伤口。伤口包括例如烧伤、切 口伤、切除伤、撕裂伤、擦伤、刺伤或贯通伤、外科手术伤口、挫伤、血肿、挤压伤和溃疡。如本文中所描述的，延迟愈合的伤口或难以愈合的伤口可以包括例如至少部分以 以下一种或多种情况为特征的伤口 1)发炎阶段延长，2)缓慢形成细胞外基质(ECM)，以及 3)上皮形成的速率停滞或降低。如本文中所使用的，慢性伤口可以是指例如至少部分以以下一种或多种情况为特 征的伤口 1)伤口发炎的慢性自身延续状态，2)缺乏性和缺陷性伤口 ECM，3)受伤细胞响应 差(衰老)，尤其是成纤维细胞，限制了 ECM的产生，以及4)部分由于缺少必要的ECM配合 作用且缺乏迁移的支架(scaffold)而不能发生上皮再生。慢性伤口包括静脉曲张性溃疡、 动脉溃疡、压迫性溃疡、血管炎性溃疡和糖尿病性溃疡。术语“敷料”是指用于向伤口局部施用且不包括适用于全身给药的组合物的敷料。
16例如，可将一种或多种抗连接蛋白药剂和/或一种或多种有助于伤口愈合的药剂、治疗剂 和/或间隙连接修饰剂分散于伤口接触材料的固体片材之上或之内，该固体片材例如是纺 织织物或无纺织物材料，或者可以分散于泡沫层(如聚氨酯泡沫)内，或分散于水凝胶内， 该水凝胶例如是聚氨酯水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶、明胶、羧甲基纤维素、果胶、藻酸盐和/ 或透明质酸水凝胶，例如分散在凝胶剂或软膏剂中。在某些实施方式中，抗连接蛋白药剂和 /或所述一种或多种有助于伤口愈合的药剂、治疗剂和/或间隙连接修饰剂分散于向伤口 中提供持续释放活性成分的可生物降解固体片材之上或之内，例如冻干胶原片、冻干胶原/ 藻酸盐混合物片(可以注册商标FIBRAC0L从Johnson & Johnson Medical Limited获得) 或冻干胶原/氧化再生纤维素片(可以注册商标PR0M0GRAN从Johnson & Johnson Medical Limited 获得)。如本文中所使用的，“基质”包括例如基质如胶原、无细胞基质、交联的生物学支架 分子、基于组织的生物工程结构框架、生物制造的生物假体和其它移植结构例如适用于促 进伤口愈合的细胞浸润和增殖作用的人造血管。其它合适的生物基质材料可以包括化学修 饰的胶原组织以降低抗原性和免疫原性。其它合适的实例包括用于伤口敷料的胶原薄膜、 无抗原或减少抗原的无细胞基质(Wilson etal.，Trans Am Soc Artif Intern 1990 ；36 340-343)或其它设计用于降低对异种移植物质产生抗原应答的生物基质。其它用于促进伤 口愈合的基质可以包括例如含有不溶胶原和弹性蛋白的经过处理的牛心包蛋白(Courtman et al.，J Biomed Mater Res 1994;28:655-666)以及其他可以用于为宿主细胞迁移提 供天然微环境从而加速组织再生的无细胞组织(Malone et al. , J Vase Surg 1984 ；1 181-91)。在某些实施方式中，可以用有助于伤口愈合的药剂如生长因子或其他位置特异性 释放的伤口愈合促进剂、治疗剂和/或间隙连接修饰剂来补充基质物质。伤口和伤口分类除了前文所提供的定义之外，术语“伤口”也可以包括例如由不同方式引起的皮肤 和皮下组织的损伤(例如由长期卧床休息产生的褥疮和由于外伤引起的伤口)且具有各种 不同的特征。伤口可以根据伤口的深度而分成1到4级i)I级限于上皮组织的伤口 ；ii) II级延伸到真皮的伤口 ；iii) III级延伸到皮下组织的伤口 ；和iv)IV级(或全厚度伤 口)暴露出骨头的伤口(例如，诸如大转子或骶骨的骨压觉点)。术语“部分皮层厚度伤 口 (partial thicknesswound) ”是指包括I III级的伤口 ；部分皮层厚度伤口的实例包 括烧伤创面、褥疮、静脉瘀滞溃疡和糖尿病性溃疡。术语“深度伤口 ”是指既包括III级伤 口又包括IV级伤口。本发明的组合物和方法意图治疗所有伤口类型，包括深度伤口和慢性 伤口。术语“慢性伤口”是指未愈合的伤口。优选地，慢性伤口选自由静脉曲张性溃疡、压 迫性溃疡、血管炎性溃疡、糖尿病性溃疡和褥疮性溃疡组成的组。慢性皮肤伤口包括例如压 迫性溃疡、糖尿病性溃疡、静脉曲张性溃疡、血管炎性溃疡、动脉溃疡，以及混合性溃疡。慢 性伤口可以是动脉溃疡，其包括由完全或部分动脉阻塞所致的溃疡。慢性伤口可以是静脉 淤滞性溃疡，其包括由于静脉瓣失灵和有关血管疾病而导致的溃疡。慢性伤口可以是外伤 引发的溃疡、糖尿病性溃疡或血管炎性溃疡。压迫性溃荡压迫性溃疡可以基于美国卫生保健政策研究所((AHCPR，Agency for Health Care Policy and Research)，美国卫生及公共服务部(U. S. D^artment of Health and Human Services))指南分成4个阶段阶段1 阶段I压迫性溃疡是一种可见的与压力相关的未受损皮肤的变化，其与身体上邻近或相对区域相比的指征可以包括在一种或多种 以下指征的变化皮肤温度(发热或发冷)、组织连贯性(强健感(firm)或泥软感(boggy)) 和/或感觉(疼痛、发痒)。溃疡表现为在轻度变色皮肤中持续发红的限定区域，而在肤色 较深的皮肤中，溃疡可以表现出持续发红、发蓝或发紫。阶段1的溃疡可以包括未受损皮肤 的不可变白的红斑和皮肤溃疡的先兆性损伤。在肤色更深的个体中，皮肤的变色、发热、水 肿、硬结或硬化也可以是阶段1溃疡的指征。阶段2 阶段2溃疡的特征为涉及表皮、真皮或 这两者的部分厚度的皮肤缺失。这种溃疡是浅表性的而临床表现为擦伤、水疱或浅的溃疡 龛(crater)。阶段3 阶段3的溃疡的特征为涉及到皮下组织损伤或坏死的全厚度皮肤缺 失，其可以延伸到但不贯穿底层筋膜。这种溃疡临床表现为与邻近组织剥离或不与邻近组 织剥离的深的溃疡龛。阶段4 阶段4溃疡的特征为大面积破损、组织坏死或对肌肉、骨骼 或支持结构(例如腱、关节囊)产生损坏的全厚度皮肤缺失。在某些实施方式中，提供了治 疗慢性伤口的组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为压迫性溃疡的以下AHCPR阶段阶 段1、阶段2、阶段3和/或阶段4中的一个或多个。褥疮件溃疡褥疮性溃疡是由于长期和不变姿势地压迫骨突起部从而导致局部缺 血而引起的。那些不能自己翻身以卸载体重的患者(如瘫痪、昏迷或严重衰弱的人)易于 出现这种伤口。根据美国卫生及公共服务部的定义，主要预防性措施包括确证高危患者；经 常性地进行评估；以及预防措施，如定期翻身、合适的卸压寝具、防潮垫和充足的营养状态。 治疗选择可以包括例如，卸压、手术清创和酶清创、潮湿伤口护理和控制细菌负荷量。在某 些实施方式中，提供了治疗慢性伤口的组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为褥疮性溃 疡或由于长期压迫骨突出部而导致局部缺血引起的溃疡。动脉溃疡动脉溃疡的特征为可导致组织坏死和/或溃疡的完全或部分动脉阻 塞。动脉溃疡的征兆可以包括例如肢体末端无脉；疼痛性溃疡；通常为界限分明的小斑点 状溃疡；冷却或冷冻皮肤；毛细血管复原时间延迟(短暂地推压在脚趾末端并释放，脚趾应 该在约3秒或更短的时间内回复正常的颜色)；皮肤出现萎缩(例如，发亮、变薄、变干)；以 及手指和脚趾以及足部毛发脱落。在某些实施方式中，提供了治疗慢性伤口的组合物和方 法，其中该慢性伤口的特征为动脉溃疡或由于完全或部分动脉瘀滞所致的溃疡。静脉曲张件溃疡静脉曲张件溃疡是最常见的影响下肢的溃疡类型，其特征为静 脉瓣功能障碍。正常的静脉具有能够阻止血液回流的瓣膜。当这些瓣膜功能不健全时，静 脉血的回流就会引起静脉充血。血红蛋白从红血细胞逸出并泄漏到血管外空间，导致通常 所见的呈褐色的变色。人们已经证明，静脉曲张性溃疡周围皮肤的经皮氧分压下降，这暗示 了存在阻塞该区域正常血管形成的力。淋巴引流和流动也对这些溃疡起作用。静脉曲张性 溃疡可以出现在脚踝内侧附近，并且通常伴有下肢水肿和硬结；其可以是浅表的，并不太疼 痛并且表现为从患处排出渗液。在某些实施方式中，提供了治疗慢性伤口的组合物和方法， 其中慢性伤口的特征为静脉曲张性溃疡或由于静脉瓣功能障碍和相关的静脉疾病所致的 溃疡。静脉瘀滞性溃疡静脉瘀滞性溃疡的特征为下肢慢性被动静脉充血导致局部缺 氧。这种伤口的发病机理一种可能机制包括氧跨过厚的血管周纤维蛋白套(perivascular fibrin cuff)扩散到组织中受阻。另一种机理是大分子渗漏到血管周组织中捕获维持皮肤 完整性所需的生长因子。另外，由于静脉充血而使大的白细胞的流动变慢从而易于形成溃
18疡，静脉充血会使毛细管闭塞、活化、并使静脉内皮组织受损。因此，在某些实施方式中，提 供了治疗慢性伤口的组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为静脉瘀滞溃疡或由于下肢慢 性被动静脉充血和/或引起局部缺氧所致的溃疡。糖尿病件溃荡糖尿病患者易于发生由神经性和脉管并发症产生的足部溃疡和其 他溃疡。外周神经病能够导致足部和/或腿部的知觉变化或完全丧失。之前就患有神经病 的糖尿病患者由于分辨力急剧变差而丧失了全部能力。或许几天或几周都完全不会注意到 患有神经病的患者脚部的任何切口或外伤。之前就患有老年性神经病的患者丧失了感知持 续压力损伤的能力，因此，就可能发生导致例如足底溃疡的组织局部缺血和坏死。微血管疾 病是糖尿病显著并发症之一，其也会导致溃疡。在某些实施方式中，提供了治疗慢性伤口的 组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为糖尿病足部溃疡和/或由于糖尿病的神经性和/ 或血管并发症所致的溃疡。外伤件溃荡外伤性溃疡的形成可以是由于身体受伤而引起的。这些创伤包括例 如，动脉、静脉或淋巴系统的损伤；骨骼的骨架结构发生的变化；组织层-上皮、真皮、皮下 软组织、肌肉或骨骼的丧失；身体部分或器官的损伤以及身体部分或组织的丧失。在某些实 施方式中，提供了治疗慢性伤口的组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为与身体外部伤 害相关的溃疡。烧伤件溃荡溃疡也可以是由于烧伤所致，包括1级烧伤(即，皮肤浅表性的发红 区域)；2级烧伤(在水疱流体除去后可以自然痊愈的起疱受伤位置)；3级烧伤(贯穿整个 皮肤的烧伤，且通常需要手术干预才能伤愈)；烫伤(可以是由于热水、热油或辐射流体烫 伤所致)；热致烧伤(由于火焰烧炙所致，通常是深度烧伤)；化学灼伤(可以由于酸、碱所 致烧伤，通常是深度烧伤)；电致烧伤(住宅低压所致或工业高压所致)；爆炸突燃(通常 是浅表伤)；和接触性烧伤(通常是深度烧伤，可以是由于消声器尾管、热铁和炉子所致)。 在某些实施方式中，提供了治疗慢性伤口的组合物和方法，其中该慢性伤口的特征为与身 体烧伤有关的溃疡。抗连接蛋白药剂本文中所描述的本发明抗连接蛋白药剂能够调节或影响的分子运输进入或运输 出细胞(例如，阻断或抑制或下调)。因此，本文中描述的某些抗连接蛋白药剂调节细胞通 信(例如细胞对细胞)。某些抗连接蛋白药剂调节或影响分子在细胞质和周质空间或胞外 空间之间的分子传递。这种抗连接蛋白药剂一般靶向连接蛋白和/或连接蛋白半通道(连 接子)。含有连接蛋白的半通道以及所产生的间隙连接，在半通道开放的情况下，独立地涉 及与细胞质和胞外空间或组织之间的小分子释放或交换，而在间隙连接开放的情况下，独 立地涉及与邻接细胞的细胞质之间的小分子释放或交换。因此，本文中所提供的抗连接蛋 白药剂可以直接地或间接地降低细胞之间的耦合和通信或者降低或阻断细胞与胞外空间 或组织之间的通信(或分子传递)，而对细胞向胞外空间或组织(或者从细胞外空间或组织 向细胞内)或者邻接细胞之间分子传递的调节也属于本发明抗连接蛋白药剂和实施方式 的作用范围内。能够对分子通过(例如传递)间隙连接或连接蛋白半通道产生所需抑制作用的任 何抗连接蛋白药剂都可以用于本发明的实施方式中。特定的实施方式还提供了调节分子通 过间隙连接或连接蛋白半通道的任何抗连接蛋白药剂(例如调节、阻断或减少分子从细胞细胞质向胞外空间或邻接细胞的细胞质之间通过的那些药剂)。无论是否存在间隙连接解 偶联(阻断分子运输通过间隙连接)，这种抗连接蛋白药剂都可以调节分子通过间隙连接 或连接蛋白半通道。这样的化合物包括例如，蛋白质和多肽、多核苷酸和其它有机化合物， 它们可以例如整体上或部分地阻断间隙连接或半通道的功能或表达，或者整体上或部分地 下调连接蛋白的产生。Evans, W. H. andBoitano, S. Biochem. Soc. Trans. 29 :606_612 (2001) 中列出了某些间隙连接抑制剂。某些抗连接蛋白药剂提供连接蛋白表达的下调作用(例如通过下调mRNA的转录 或翻译)或者降低或抑制连接蛋白、连接蛋白半通道或间隙连接的活性。在下调作用的情 况下，这会具有在连接蛋白表达下调的位置通过间隙连接降低直接细胞-细胞通信的作 用，或者通过半通将细胞细胞质暴露于胞外空间的作用。抗连接蛋白药剂的实例包括降低或抑制连接蛋白mRNA和/或蛋白表达或功能或 者降低连接蛋白、连接蛋白半通道或间隙连接的活性、表达或形成的药剂。抗连接蛋白药剂 包括抗连接蛋白多核苷酸，如反义多核苷酸和其它多核苷酸(如具有siRNA或核糖核酸酶 功能的多聚核苷酸)，以及抗体及其连接片断，以及肽和多肽，包括调节半通道或间隙连接 活性或功能的拟肽和肽类似物。抗连接蛋白多核苷酸抗连接蛋白多核苷酸包括连接蛋白反义多核苷酸以及具有使之能够下调连接蛋 白表达功能的多核苷酸。其它合适的抗连接蛋白多核苷酸包括RNAi多核苷酸和siRNA多 核苷酸。反义多核苷酸和其它抗连接蛋白多核苷酸如RNAi、siRNA和核糖核酸酶多核 苷酸，以及具有修饰的和混合骨架的多核苷酸的合成，对于本领内技术人员来说是已知 的。参见例如 Stein CA. andKrieg A. M. (eds), Applied Antisense Oligonucleotide Techno 1 ogy，1998 (Wi 1 ey-Li ss)。合成抗体和连接片断以及肽和多肽，包括拟肽和肽 类似物的方法对于本领内技术人员来说是已知的。参见例如Lihu Yanget al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 1 ；95 (18) 10836-10841 (1998 年 9 月 1 日)；Harlow and Lane(1988)“ Antibodies :A Laboratory Manuel" Cold Spring Harbor Publications, New York ；Harlow and Lane(1999)" Using Antibodies" A Laboratory Manuel, Cold Spring HarborPub1ications, New York。根据一个方面，下调连接蛋白表达可以一般基于采用反义多核苷酸的(如DNA或 RNA多核苷酸)的反义方法，且更具体而言是基于反义脱氧寡核苷酸(ODN)的使用。这些多 核苷酸(例如0DN)靶向将要被下调的连接蛋白。典型地多核苷酸是单链的，但也可以是双 链的。反义多核苷酸可以抑制连接蛋白的转录和/或翻译。优选多核苷酸是从连接蛋白 基因或mRNA转录和/或翻译的特异性抑制剂，而不会抑制从其它基因或mRNA的转录和/ 或翻译。产物可以连接到连接蛋白基因或mRNA的(i)5'编码序列，和/或(ii)编码序列， 和/或(iii)3'编码序列。反义多核苷酸一般是与连接蛋白mRNA反义的。这样的多核苷酸或许能够杂交 到连接蛋白mRNA，并由此可以通过干扰连接蛋白mRNA代谢的一个或多个方面，包括转录、 mRNA合成调控、从细胞核运输mRNA、翻译或mRNA降解，而抑制连接蛋白的表达。反义多核
20苷酸典型地杂交到连接蛋白mRNA而形成双链体，能够产生对mRNA的翻译和/或去稳定化 (destabilization)的直接抑制。这种双链体可以通过核酸酶易于降解。反义多核苷酸可以杂交到所有的或部分的连接蛋白mRNA。典型地，反义多核苷酸 杂交到连接蛋白mRNA的核糖体结合区域或编码区域。多核苷酸与所有连接蛋白mRNA或局 部连接蛋白mRNA是互补的。例如，多核苷酸可以是所有或部分连接蛋白mRNA的精确补体。 然而，绝对的互补性是不需要的，而对于形成在生理条件下熔点超过约20°C、30°C或40°C 的双链体具有足够互补性的多核苷酸尤其适用于本发明。因此，多核苷酸一般是与mRNA互补的序列的同源物。多核苷酸可以是在中等到高 严格度条件下(如0. 03M氯化钠和0. 03M柠檬酸钠在约50°C到约60°C )杂交到连接蛋白 mRNA的多核苷酸。对于某些方面，合适的多核苷酸的长度典型地为约6至40核苷酸。优选多核苷酸 的长度可以为约12至约35个核苷酸，或可替代地长度为约12至约20个核苷酸或更优选 长度为约18至约32个核苷酸。根据一个可替代方面，多核苷酸的长度可以为至少约40，例 如至少约60或至少约80个核苷酸以及长度为高达约100、约200、约300、约400、约500、约 1000、约2000或约3000或更多的核苷酸。连接蛋白或多核苷酸靶向的蛋白质将依赖于将会发生下调作用的位置。这根据连 接蛋白亚单位组成反映了身体不同位置的间隙连接的非均勻结构(non-uniform makeup)。 连接蛋白一方面是在人体或动物体内天然存在的连接蛋白，或者是在连接蛋白表达或活性 将会降低的组织中天然存在的连接蛋白。连接蛋白基因(包括编码序列)一般与本文中提 及的一种或多种特异性连接蛋白的编码序列具有同源性，如与表8中所示的连接蛋白43编 码序列具有同源性。连接蛋白典型地是一种α或β连接蛋白。优选连接蛋白是一种α 连接蛋白且在待治疗的组织中表达。然而，一些连接蛋白比其它的连接蛋白在组织中的分布更为普遍。最普遍的一种 是连接蛋白43。靶向连接蛋白43的多核苷酸特别适合在本发明中使用。在其它方面，其它 连接蛋白被靶向。抗连接蛋白多核苷酸包括连接蛋白反义多核苷酸以及具有能够下调连接蛋白表 达功能的多核苷酸。其它合适的抗连接蛋白多核苷酸包括RNAi多核苷酸和SiRNA多核苷酸。在一个优选方面，反义多核苷酸仅仅靶向一种连接蛋白的mRNA。最优选地，该连接 蛋白是连接蛋白43。在另一方面，该连接蛋白是连接蛋白26、30、31. 1、32、36、37、40或45。 在其它方面，该连接蛋白是连接蛋白30.3、31、40.1或46.6。还应该理解，靶向单独连接蛋白的多核苷酸可以组合使用(例如可以靶向1、2、3、 4或多种不同的连接蛋白)。例如，靶向连接蛋白43的多核苷酸和连接蛋白家族的一个或 多个其它成员(例如连接蛋白26、30、30· 3、31· 1、32、36、37、40、40. 1、45和46. 6)能够组合使用。可替代地，反义多核苷酸可以是组合物的部分，该组合物可以含有指向超过一种 连接蛋白的多核苷酸。优选多核苷酸指向的连接蛋白之一是连接蛋白43。脱氧寡核苷酸指 向的其它连接蛋白可以包括，例如，连接蛋白26、30、30· 3、31· 1、32、36、37、40、40. 1、45和 46.6。指向各种连接蛋白的适合的示例性多核苷酸(和0DN)列于表1中。
单个反义多核苷酸对特定的连接蛋白可以是特异性的，或可以靶向1、2、3或多种 不同连接蛋白。特异性多核苷酸一般会靶向于连接蛋白之间不保守的连接蛋白基因或mRNA 中的序列，而非特异性多核苷酸则会靶向于各种连接蛋白的保守序列。用于本发明中的多核苷酸可以合适地是未修饰的磷酸二酯寡聚体。这样的脱氧寡 核苷酸的长度可以是不同的。已经发现30聚体多核苷酸是特别合适的。本发明的许多方面参照脱氧寡核苷酸进行描述。然而，应该理解，其它合适的多核 苷酸(如RNA多核苷酸)可以用于这些方面。反义多核苷酸可以进行化学修饰。这可以增强其对核酸酶的抗性，并且可以增强 其进入细胞的能力。例如，可以使用硫代磷酸寡核苷酸。其它脱氧核苷酸类似物包括甲基磷 酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、二硫代磷酸酯、N3' P5'-氨基磷酸酯和寡核糖核 苷酸硫代磷酸酯以及它们的2' -0-烷基类似物和2' -0-甲基核糖核苷甲基磷酸酯。可 替代地，可以使用混合骨架寡核苷酸(“MBO”)。MBO含有硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸的片断 且适合代替修饰的脱氧寡_或寡核糖核苷酸。MBO含有硫代磷酸酯键的片断和其他修饰寡 核苷酸的其它片段，如非离子性的甲基磷酸酯，其对核酸酶或2' -0-烷基寡核糖核苷酸具 有非常高的耐性。制备修饰骨架和混合骨架寡核苷酸的方法在本领域是已知的。本发明中使用的反义多核苷酸的精确序列取决于靶连接蛋白。在一种实施方式 中，合适的连接蛋白反义多核苷酸能够包括如选自以表1中所列以下序列的脱氧寡核苷酸 的多核苷酸表权利要求
一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给予一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的抗连接蛋白43药剂和有效促进或改善伤口愈合的蛋白或肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽选自由有效促进或改善伤口愈合 的生长因子和有效促进或改善伤口愈合的细胞因子组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述生长因子选自由血小板源性生长因子、表皮 生长因子、成纤维细胞生长因子、结缔组织生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因 子、或转化生长因子β 3组成的组。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞因子是IL-7或IL-10。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽是胰岛素样生长因子连接蛋白或 分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽是胸腺素β4。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白或肽在载体中递送。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述载体包含编码血小板源性生长因子-B的序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述载体是腺病毒载体。
10.一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给予一种包含治疗有效量的第一伤口愈 合化合物和第二伤口愈合化合物的组合物，其中，所述第一化合物是抗连接蛋白43药剂而 所述第二化合物选自由β肾上腺素拮抗剂、白细胞介素-ι受体拮抗剂、和游离自由基清除 剂组成的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述β肾上腺素拮抗剂是噻吗洛尔。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述白细胞介素-1受体拮抗剂是阿那白滞素。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述游离自由基清除剂是N-乙酰半胱氨酸。
14.一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给药一种包含治疗有效量的第一伤口愈 合化合物和第二伤口愈合化合物的组合物，其中，所述第一化合物是抗连接蛋白43药剂而 所述第二化合物选自由抗炎剂和抗微生物剂组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗微生物剂是杆菌肽、新霉素、多粘菌素、 短杆菌肽或甲氧苄啶。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含麻醉剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述麻醉剂是普莫卡因。
18.一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给予包含治疗有效量的第一伤口愈合化 合物和第二伤口愈合化合物的组合物，其中，所述第一化合物是抗连接蛋白43药剂而所述 第二化合物是阿片类药。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述阿片类药是吗啡、氢吗啡酮或芬太尼。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述阿片类药是氢吗啡酮。
21.一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给予包含治疗有效量的第一伤口愈合化 合物和第二伤口愈合化合物的组合物，其中，所述第一化合物是抗连接蛋白43药剂而所述 第二化合物是连接蛋白磷酸化剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连接蛋白磷酸化剂是一种能够使连接蛋 白43的至少一个酪氨酸残基磷酸化的化合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连接蛋白磷酸化剂是一种能够使连接蛋 白43的至少一个苏氨酸残基磷酸化的化合物。
24.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述抗连接蛋白43药 剂是多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多核苷酸是反义多核苷酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述反义多核苷酸包含选自SEQ.ID.N0:1至 SEQ. ID. NO 12 的序列。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述反义多核苷酸选自GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 1)；GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 2)；和GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT(SEQ ID NO :3)。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述反义多核苷酸具有约15至约35个核苷 酸，并且足以与连接蛋白43mRNA互补而形成在生理条件下熔点超过20°C的双链体。
29.根据权利要求25所述的方法，其中，所述反义多核苷酸具有约15至约35个核苷 酸，并且与连接蛋白43mRNA的反义序列具有至少约70%的同源性。
30.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述组合物包含约 0. 1至约1000微克的所述抗连接蛋白43药剂，所述抗连接蛋白43药剂是反义多核苷酸。
31.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述抗连接蛋白43药 剂是肽或拟肽。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述组合物包含约0.01至约100毫克的所述 抗连接蛋白43肽或抗连接蛋白43拟肽。
33.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述抗连接蛋白43药 剂是RNAi或siRNA多核苷酸。
34.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述哺乳动物选自由家畜、农场动物、动物园 动物、体育运动动物和宠物组成的组。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述动物是马。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述动物是狗或猫。
39.根据权利要求1、10、14、18或21中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有伤口。
40.一种治疗方法，包括向需要治疗的受试者给予第一伤口愈合组合物和第二伤口愈 合组合物，所述第一伤口愈合组合物包含治疗有效量的抗连接蛋白43药剂，而所述第二种 伤口愈合组合物包含治疗有效量的有效促进或改善伤口愈合的蛋白或肽。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第一和第二伤口愈合组合物彼此间隔至 少约半小时给药。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第一和第二伤口愈合组合物彼此间隔至 少约1小时给药，在约1天内或彼此间隔约1天给药，或彼此间隔约1周给药。
43.根据权利要求40所述的方法，其中，首先给药予所述第一伤口愈合组合物。
44.根据权利要求40所述的方法，进一步包括给予第三伤口愈合组合物，其中所述第 三伤口愈合组合物包含抗连接蛋白43肽或拟肽。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，首先给予所述第三伤口愈合组合物。
46.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽选自表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、结缔组织生长因子、IL-7、分泌性白细胞蛋白 酶抑制剂、胰岛素样生长因子和胰岛素样生长因子连接蛋白。
47.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是血小板源性生长因子。
48.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是血管内皮生长因子。
49.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是转化生长因子β 3。
50.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是IL-10。
51.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是胸腺素β 4。
52.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或 肽是在载体中递送的。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述载体包含编码血小板源性生长因子-B的 序列。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述载体是腺病毒载体。
55.一种药物组合物，包含根据权利要求1 15、18 22或23中任一项所述的组合物 的组分。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中，所述抗连接蛋白43药剂是肽或拟肽。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中，所述组合物包含约0.01至约100毫克 的所述抗连接蛋白肽或抗连接蛋白拟肽。
58.根据权利要求55所述的药物组合物，其中，所述抗连接蛋白43药剂是多核苷酸。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中，所述多核苷酸是反义多核苷酸。
60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸包含选自SEQ. ID. NO :1 至 SEQ. ID. NO 12 的序列。
61.根据权利要求59所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸选自GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 1)；GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT GTC(SEQ ID NO 2)；和GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT (SEQ ID NO :3)。
62.根据权利要求59所述的药物组合物，其中，所述反义多核苷酸具有约15至约35个 核苷酸，并且足以与连接蛋白43mRNA互补以形成在生理条件下熔点超过20°C的双链体。
63.根据权利要求59所述的药物组合物，其中，所述连接蛋白43多核苷酸具有约15至 约35个核苷酸，并且与连接蛋白43mRNA的反义序列具有至少约70%的同源性。
64.根据权利要求55所述的药物组合物，其中，所述组合物包含约0.1至约1000微克的所述抗连接蛋白药剂，且所述抗连接蛋白药剂是反义多核苷酸。
65.根据权利要求55所述的药物组合物，其中，所述抗连接蛋白药剂是RNAi或siRNA 多核苷酸。
66.一种用于促进或改善伤口愈合的药物组合物，其包含治疗有效量的抗连接蛋白43 药剂和对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或肽。
67.根据权利要求66所述的药物组合物，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的 蛋白或肽是PDGF。
68.根据权利要求67所述的药物组合物，其中，所述PDGF蛋白或肽是以载体的形式提 供的。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其中，所述载体是腺病毒载体。
70.根据权利要求66所述的药物组合物，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的 蛋白或肽是血管内皮生长因子。
71.根据权利要求66所述的药物组合物，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的 蛋白或肽是胸腺素β 4。
72.根据权利要求66所述的药物组合物，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的 蛋白或肽是TGF-β 3。
73.根据权利要求66所述的药物组合物，其中，所述对于促进或改善伤口愈合有效的 蛋白或肽是IL-10。
74.根据权利要求66 72或73中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被 配制成用于局部给药。
75.根据权利要求74所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被配制成凝胶。
76.根据权利要求75所述的药物组合物，其中，所述凝胶是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 基凝胶或羧甲基纤维素基凝胶。
77.根据权利要求76所述的药物组合物，其中，所述凝胶是普流尼克凝胶。
78.一种治疗慢性伤口的方法，包括向需要治疗的受试者给予治疗有效量的根据权利 要求67 70或71中任一项所述的药物组合物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述慢性伤口是糖尿病性溃疡。
80.根据权利要求78所述的方法，其中，所述慢性伤口是静脉曲张性溃疡。
81.根据权利要求78所述的方法，其中，所述慢性伤口是压迫性溃疡、血管炎性溃疡或 动脉溃疡。
82.一种用于减少需要治疗的受试者中疤痕形成的方法，包括向所述受试者给予治疗 有效量的根据权利要求72或73中任一项所述的药物组合物。
83.根据权利要求78所述的方法，其中，所述药物组合物是局部给药的。
84.根据权利要求82所述的方法，其中，所述药物组合物是局部给药的。
85.一种制备用于治疗伤口的药物的方法，包括将一定用量的第一伤口愈合组合物和 第二伤口愈合组合物组合到一起，其中，所述第一伤口愈合组合物含有有效量的抗连接蛋 白药剂，而所述第二伤口愈合组合物含有有效量的对于促进或改善受试者伤口愈合有效的 蛋白或肽。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述抗连接蛋白药剂包含反义多核苷酸。
87.根据权利要求85所述的方法，其中，所述药物被配制成用于局部给药。
88.根据权利要求51所述的方法，其中，所述药物配制成用于缓释。
89.一种制品，包含容纳有根据权利要求55、66 72和73中任一项所述的用于促进或 改善伤口愈合或组织修复的药物组合物的包装材料以及在受试者体内或体表使用的说明 书。
90.一种伤口敷料，包含抗连接蛋白药剂和对于促进或改善伤口愈合有效的蛋白或肽。
全文摘要
本发明提供了含有一种或多种抗连接蛋白药剂和一种或多种用于促进和/或改善伤口愈合和/或组织修复的其它药剂的组合的方法和组合物。
文档编号A61K31/711GK101965193SQ200780049832
公开日2011年2月2日 申请日期2007年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者布拉德福德·J·杜夫特, 戴维·L·贝克尔, 科林·R·格林 申请人:科达治疗公司