专利名称：抗-tsg101抗体及其用于治疗病毒感染的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合TSG101蛋白并抑制或减少病毒制造的抗体。本 发明还涉及使用TSG101抗体以治疗包括HIV感染在内的病毒感染的 方法。本发明进而还涉及使用TSG101抗体检测被病毒感染的细胞的 方法。
背景技术：
病原体与宿主细胞的相互作用在诸如AIDS等病毒性疾病的发病 机理中发挥关键作用。对于典型的病毒感染，病毒通过细胞表面受体 附着于宿主细胞，与宿主细胞膜融合，穿过细胞膜，病毒颗粒脱壳， 利用宿主蛋白合成机制合成并组装病毒蛋白，并通过宿主输出机制由 宿主细胞释》文。病毒与宿主细胞之间的相互作用决定了病毒发病机制 的后果，包括从消除病毒到寄生或致命感染。例如，HIV采用各种策 略富有成效地感染人类细胞。逆转录病毒，通过附着宿主开始其生命周期，初始靶是CD4+T协助细胞，并通过特定受体获得进入。在细胞 中，RNA基因组"反，，转录为其互补DNA,然后穿梭至细胞核以将其整 合到宿主基因组中。该整合的"前病毒"随后指导新的病毒RNA和蛋白 质的制造，这些物质自组装并随即作为成熟的、感染性的病毒体由细 胞"出芽"，包封在质膜中。同所有的病毒一样，HIV是寄生物，不能 催化驱动出芽过程的膜分裂事件。替代性地，新生病毒征用细胞的膜 分拣机制从而完成感染的该最后阶段。这种宿主和病毒的相互作用已 经在携带有具有缺陷的细胞表面受体(CCR5)并完全耐受HIV感染的个 体中得到良好证明，说明了宿主基因和遗传途径在病毒发病机制中的 重要作用。
肿瘤易感基因101(TSG101， Li等，1996,Cell 85,319-29)在细胞生 长(Zhong等，1998, Cancer Res. 58, 2669-702; Oh等，2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 5430-5; Krempler等，2002, J. Biol. Chem. 277, 43216-23; Wagner等，2003， Mol. Cell Biol. 23, 150-62; Li等，1996， Cell 85, 319-29)、细胞蛋白质交流(Babst等，2000， Tm伍c 1, 248-58; Bishop 等，2002, J. Cell Biol. 157， 91國101)和p53的降解(Li等，2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 1619-24; Ruland等，2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 1859-64; Moyret-Lalle等，2001, Cancer Res. 61， 486-8)中发挥重要作 用。TSG101在该最后阶段也是公认的关键角色，抑制细胞TSG101能 够阻挡HIV的出芽过程。TSG101与其他细胞因子一同作用，由此在 HIV病毒的出芽或传播中起到关键作用。先前显示协调病毒组装和出 芽的HIV Gag蛋白以高亲和性结合TSG101,该Gag/TSG101的相互作 用对于有效的HIV病毒组装和出芽是必需的，而破坏Gag/TSG101的 相互作用能够抑制HIV病毒出芽，并明显限制了 HIV病毒的传播。
包膜病毒组装的组装最终步骤需要使出芽颗粒与细胞膜分离。 Gag,20中的三个独特的功能域，即，HIV-1中的PTAP(Gottlinger等，1991:Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 3195-9; Huang等，1995, J. Virol, 69, 6810-8); RSV中的PPPY(Parent等，1995, J. Virol. 69， 5455-60), MuLV 中的PPPY(Yuan等，1999, Embo. J. 18,4700-10)和M-PMV中的 PPPY(Yasuda等，1998， J. Virol. 72， 4095-103);以及EIAV中的 YXXL(Puffer等，1997， J. Virol. 71, 6541-6)已经在不同的逆转录病毒中 被识别，它们是该功能所必需的且被称为后域(late domain)或L域(Wills 等，1991, Aids 5, 639-54)。在HIV-1中，L域包含PTAP基序,并且是 有效释放HIV-1所必需的(例如参见，Wills等，1994, J. Virol. 68, 6605-6618; Gottlinger等，1991, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88， 3195-3199; Huang等，1995, J. Virol. 69, 6810-6818)。 HIV-1 p6的L域，尤其是PTAP 基序，结合细胞蛋白TSG101,并使其进入病毒组装的位置以促进病毒 出芽(VerPlank等，2001， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 7724-7729; Garrus等，2001， Cell 107: 55-65; Martin-Serrano等，2001， Nature Medicine 7: 1313-19; Pomillos等，2002， EMBO J.21:2397-2406; Demirov 等，2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 955-960; PCT公开WO 02/072790;美国专利申请号US 2002/0177207)。 TSG101的UEV域结 合PTAP基序和单泛素(Pomillos等，2002, Embo J.21, 2397-406; Pomillos等，2002, Nat. Struct. Boil. 9, 812-7)，其也涉及HIV-1出芽 (Patnaik等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13069-74; Schubert等, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97， 13057-62; Strack等，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13063-8)。细胞TSG101的缺失(Garrus等，2001, Cell 107: 55-65)或TSG101的截短形式的过度表达抑制HIV-1的释放 (Demirov等，2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 955-960)。在一定环境 下，TSG101甚至可取代HIV-1的L域从而促进病毒释放(Martin-Serrano 等，2001, Nature Medicine 7: 1313-19)。
在酵母中，TsglOl直系同源Vps23已表现出与Vps28和Vps37相互作用并形成被命名为ESCRT-I的蛋白复合物，其对于胞内蛋白分拣 到多泡体途径中极为关键(Katzmann等，Cell 106, 145-55)。猜测该细胞 内的多泡体形成类似HIV-1在质膜的释放(Garrus等，2001， Cell 107: 55-65; Patnaik等，2000, Proc. Natl. Sci. USA 97, 13069-74)。在哺乳动物 细胞中，TSG101与Vps28相互作用以形成类似ESCRT-I的复合物(Babst 等，2000, Traffic 1, 248-58; Bishop等，2002， J. Cell Biol. 157, 91-101; Bishop等，2001， J. Biol. Chem. 276, 11735-42),不过Vps37的哺乳动物 同系物仍未^f皮确定。
近期的研究(Blower等，2003， AIDS Rev. 5: 113-25; Valdiserri等， 2003， Nat Med. 9: 881-6)估计世界上多达四千两百万人已经感染了 HIV。这种疾病已经夺去了超过3百万人的生命。尽管高度有效的具有 针对性的联合疗法的出现已经减緩了工业化国家的AIDS的进展，但 AIDS的流行在发展中国家导致"人类发展的大灾难"，尤其是在非洲， 已经有超过两千一百万的非洲人被感染。仅在南非，死亡人数预计到 2015年将达到1千万。相关统计预告了在亚太区域的类似危机，根据 美国的评估已经有超过7百万的HIV感染个体。AIDS流行的影响远远 超过临床，其缺乏资源来治疗增多的近期感染的患者(在南非接近20% 的成年人口^^皮感染)。HIV感染及身患重病的AIDS患者的治疗给非洲 和其他发展中国家已经负担过重的医疗保健系统不断施加压力。更为 糟糕的是，目前对于HIV的治疗尽管在减少病毒负荷量方面取得了初 期成功，但是这些治疗已经开始丧失其功效，因为耐药性HIV毒抹在 新感染的个体中正日益增多的被分离出来。HIV疾病诊治策略的进一 步复杂化对于目前的抗逆转录病毒治疗方案是有害的，其规模导致医 生对于作出开始和维持治疗的决定日益复杂。确定用于治疗fflV疾病 的新的治疗模式，尤其是那些具有有希望减緩耐药性发展的作用机制 的模式，确实是对于制药业的全球性挑战。许多病毒也是高度可变的。依赖于直接靶向这类病毒的方法和组 合物通常并不足以治疗由此类病毒造成的感染。例如，HIV-l就是这种
高度可变的病毒，在HIV-1感染期间，被感染个体中产生的抗体不能 提供永久的保护效果，部分原因在于快速出现的逃避中和变体(Thali 等，1992， J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 5: 591-599)。用于治 疗HIV-1感染个体的当前疗法主要关注于涉及HIV-1感染的两个独特 阶段的病毒酶，这两个阶段是病毒基因组的复制和病毒蛋白的成熟。 由于病毒频繁地变异，尽管药物取得了初期的治疗效果，耐受抗病毒 抑制剂的毒林仍发展迅速。在一个近期的研究中，新近感染耐药型HIV 毒抹的个体的百分比在五年的时间内增加了六倍(Little等，2002， N. Engl. J. Med. 347: 385-94)。此外，联合疗法，当前用逆转录酶和蛋白酶 的抑制剂攻击HIV的标准治疗导致发展出耐受多种药物的HIV毒抹。 针对新型HIV类目标的抗逆转录病毒药物尽管具有相当大的价值，但 仍没有解决该日益关键的问题。例如，耐受最新加入抗HIV医疗设备 的Fuzeoi^(enfovirtide)的HIV毒林已由患者分离出来。因此，尽管其 具有抗病毒效力和新型作用机制，但耐药性仍可能削弱类似Fuzeon 的病毒融合抑制剂的治疗潜能。因而需要开发新的疗法和预防措施以 抗击诸如HIV感染等病毒感染。
本文中对参考的讨论或引用不应当被理解为认可该参考是本发明 的现有技术。
发明内容
本发明提供与人TSG101的终端区结合的抗体和使用该抗体治疗 病毒感染的方法。本发明还提供使用抗-TSGlOl抗体治疗病毒感染的 方法和组合物。
在一个方案中，本发明提供与由SEQIDNO:3构成的TSG101的
C端区结合的单克隆抗体。在一个实施方式中，所迷抗体是包括多肽的单克隆抗体，所述多肽包含在SEQIDNO: 19、 22、 25或28中所述 的氛基*列。
在另一个实施方式中，所述单克隆抗体是抗体D1和3G1。
在另一个实施方式中，所述抗体是包含选自SEQIDNO:30-41的 氨基酸序列的人源化抗体。
在优选的实施方式中，所述人源化抗体包含SEQIDNO: 31-35中 所述的氨基酸序列或SEQIDNOS: 36-41中所述的氨基酸序列。
本发明的另 一个方案涉及用于治疗受试对象包膜病毒感染的方 法。该方法包括向受试对象施用有效量的本发明的抗-TSG101抗体。
在一个实施方式中，包膜病毒是人体免疫缺陷病毒、马尔堡 (Marburg)病毒或埃博拉(Ebola)病毒。
本发明的又一个方案涉及用于治疗人体免疫缺陷病毒、马尔堡病 毒和埃博拉病毒感染的药物组合物。所述组合物包含有效量的本发明 的抗TSG101病毒；和药学上可接受的载体。
图1描述了人TSG101蛋白的390个氨基酸序列(SEQIDNO: 1)。 (GenBank登录号U82130.1/GI: 1772663)。
图2描述了抗TSG101抗体对MLV病毒制造的影响。左上图未 经抗体治疗的phoenix协助细胞(阳性对照)显示出有效的逆转录病毒的 制造，和N2A靶细胞的感染；左中图兔IgG无影响；左下图抗N 端TSG101的兔抗体具有小于20%的抑制的作用；右上图抗C端 TSG101的兔抗体显著抑制逆转录病毒的制造，和N2A靶细胞的感染 (50 % ~ 70 %的抑制率)；右中图抗C端抗体和抗N端抗体的混合物 给出了与单独的抗C端抗体相类似的结果；右下图未被病毒感染的 N2a细胞仅仅显示了最小的背景染色。
图3A E显示了病毒释放过程中GFP-TSG101定位至细胞表、面。 GFP-TSG101转染24小时后的具有活跃病毒释放的phoenix协助细胞 的活体共焦图像。图3A显示了四个细胞的亮视场图像；图3B E是 同一视场的不同区段的活体共焦焚光图像；白色箭头指向GFP-TSG101的细胞表面定位。
图4显示HIV出芽过程中的TSG101的细胞表面定位。H9ABgl 细胞(CD4+人T淋巴细胞，携带HIV病毒整合)活跃制造，并释放具有 带缺陷的包膜蛋白的HIV病毒粒子(该HIV病毒的非感染形式不会感 染其他细胞，因此特别用于研究病毒释放)。不携带HIV的亲代H9细 胞用作对照。H9ABgl和H9细胞均由2%的低聚曱醛于室温固定10分 钟(该表面固定不会穿透细胞)。抗-TSG101抗体用两种细胞系温育20 分钟，并用荧光标记的二抗检测。顶图荧光图像；底图亮视场图 像。
图5显示了 IV出芽过程中TSG101的细胞表面定位的FACS曲线 图。H9ABgl和H9细胞均由2 %的低聚曱醛于室温固定10分钟(该表面 固定不会穿透细胞)。抗-TSG101抗体用两种细胞系温育20分钟，并用 焚光标记的二抗;险测。顶图H9ABgl细胞，85%的染色细月包为表面 TSG101阳性；底图H9对照细胞，小于1%的染色细胞为表面TSG101 阳性。
图6显示了抗-TSGlOl抗体对HIV-1制造的抑制。道1和5，模 拟转染；道2和6， pNL4-3和对照抗体(兔IgG);道3和7， pNL4-3 和抗-TSGlOl抗体"B，，；道4和8， pNL4-3和抗-TSGlOl抗体"E"。
图7显示了抗体对HIV由H9ABgl细胞释放的抑制。HIV制造的 H9ABgl细胞用抗-TSGlOl抗体"E"在不同浓度下温育，48小时后，收 集病毒上清液，并用HIV p24 ELISA试剂盒分析。显示了三个独立试 验(每个试验均为三重测定)的平均值。在80 pg/ml时观察到抗体对病毒 释放的明显抑制C"P0.05)。
图8显示了抗体对HIV感染性的抑制。制造HIV的Jurkat细胞(由 野生型HIV-1感染)与40 pg/ml的抗-TSG101抗体"E，，温育。
图9A ~ B显示了埃博拉GP和VP40释放进入培养上清液。图9A 显示了 293T细胞由指示质粒转染，清除上清液的漂浮物，颗粒物通过 20%的蔗糖由超速离心法球粒化。通过免疫印迹(IB)在细胞裂解物中和 来自上清液的颗粒物中检测各种蛋白。图9B显示了来自单独由埃博拉 GP转染或GP+VP40转染的细胞的上清液用抗-GP mAb免疫沉淀，并通过免疫印迹分析。下部图显示VP40在全部细胞裂解物中的表达。
LgH:来自用于免疫沉淀的抗体的免疫球蛋白重链。
图10A ~ B显示了由EBOV GP和VP40产生的病毒样颗粒的电子 显微镜分析。通过对由埃博拉GP+VP40转染的293T细胞的上清液进 行超速离心法得到的颗粒用乙酸铀酰负染色以展示超樣i结构(图IOA)， 或由抗-Ebo-GPmAb染色随后用免疫金兔抗鼠Ab染色(图IOB)，并用 电子显微镜进行分析。
图11显示了 VP40和TSG101在293T细胞中的结合。细月包由带 Myc标签的TSG101全长(FL)或指示截断与VP40 —同转染。48小时后， 细胞裂解，并用抗Myc进行免疫沉淀。
图12显示了埃博拉VP40和TSG101的UEV域之间的结合的 Far-Western分析。
图13显示了与TSG101相互作用的埃博拉VP40的SPR分析。
图14A B显示了 TSG101与埃博拉VLPs和灭活的埃博拉病毒的 结合。图14中，293细胞由指示质粒转染，上清液用抗-GPmAb免疫 沉淀，然后通过免疫印迹用右侧所示抗体分析。下部的三个图显示了 转染蛋白在全部细胞裂解物中的表达。图14B中，5吗灭活的埃博拉 病毒(正BOV)用兔抗-TSGlOl抗体进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。 分子量标记和TSG101的位置被示出。
图15显示了抗-TSGlOl抗体对埃博拉病毒在Hela细胞中的释放 的抑制结果。
图16是显示以来自腹水的纯化IgG形式的单克隆抗体池PE-8的 抗-HIV活性的图。
图17是显示以杂交瘤上清液形式的单克隆抗体池PE-8的具有代 表性的亚克隆的抗-HIV活性的图。
图18是显示以来自腹水的纯化IgG形式的单克隆抗体池PE-8的 亚克隆之一的抗-HIV活性的图。
图19是显示TSG101显性负突变体对耐药性HIV毒抹的抑制的图。
图20是显示单克隆抗体池PE-8对耐药性HIV毒林pL-10R的抑制的图。
图21是显示单克隆抗体池PE-8对耐药性HIV毒4朱pl617-l的抑
制的图。
图22A和22B分别是显示对感染后3天和7天的外周血单核细胞 中的HIV制造的抑制的图。
图23是克隆D1重链的可变区和小鼠IgG重链的可变区之间的比对。
图24是克隆D1轻链的可变区和小鼠IgG轻链的可变区之间的比对。
图25是克隆3G1重链的可变区和小鼠IgG重链的可变区之间的 比对。
图26是克隆3G1轻链的可变区和小鼠IgG轻链的可变区之间的 比对。
图27是显示抗-TSG101单克隆抗体保护小鼠免受EBOV感染的图。
图28是由该领域的其他研究者确定为依赖或涉及TSG101的一些
方面的病毒的部分清单。
图29是根据本发明的人抗TSG101抗体的制备的示意性描述。 图30用图表表现了由免疫荧光检测到的噬菌体候选物与感染细
胞的结合。
图31用图表表现了通过相同的TSGIOI抗体与被不同病毒感染的 不同细胞类型的结合。
图32展示了通过染色的TSG101抗体与RSV感染细胞的结合， 以及不存在与对照的结合。
图33以条线图的形式表现了本发明的TSG101抗体通过ADCC杀 死被感染细胞的能力。
图34以条线图的形式表现了本发明的TSG101抗体杀死病毒感染 的细胞并由此直接抑制病毒感染的能力，而与先天宿主防御机制无关。
具体实施方式
本发明提供使用与TSGIOI结合的抗体以抑制或减少病毒制造的方法。本发明还提供使用TSGIOI抗体以治疗病毒感染的方法。本发明还提供通过针对被感染细胞表面上的TSGIOI，例如输送治疗和/或诊断剂至这样的感染细胞来治疗病毒感染的方法和组合物。
治疗的合理设计需要对HIV发病机理的深入理解。近来的研究显示宿主蛋白，TSGIOI ，在诸如HIV和埃博拉病毒等各种病毒的发病机理中起到至关重要的作用。特别是，TSGIOI参与病毒体从被感染细胞中逃出或出芽的过程，因此代表了用于抗病毒药物发现的新目标。构成包膜RNA病毒由感染细胞的组装和释放的&出的是病毒与宿主蛋白之间的紧密协调(Perez等，2001， Immunity 15(5): 687-90; Freed, 2002，丄Virol. 76(10): 4679-87; Pomillos等，2002, Trends Cell Biol. 12(12):569-79)。尽管许多控制感染最后阶段的蛋白蛋白和蛋白膜的相互反应尚未确定，但是细胞TSGIOI蛋白已经出现成为关键角色(Garrus等，2001, Cell 1Q7: 55-65; Carter 2002; Pomillos等，2002, Trends CellBiol. 12(12): 569-79; Pomillos等，2002, Nat. Struct. Biol. 9， 812-7)。遗传、生物化学和微观分析显示TSGIOI与多种包膜RNA病毒(包括逆转录病毒、棒状病毒和丝状病毒族系的成员)相互作用。
尽管它们存在相当显著的进化趋异，不过许多包膜RNA病毒釆用相似的策略来完成感染的最后阶段(Martin-Serrano等，2001， NatureMedicine 7: 1313-19; Freed, 2002, J. Virol. 76(10): 4679-87)。对于人体免疫缺陷病毒类型1 (HIV-1)、泡状口炎病毒(Vesicular StomatitisVims)(VSV)、埃博拉病毒(Ebola)(EBOV)、马尔堡病毒(MarburgVirus)(MARV)和其他病毒特别重要的是后域或L域，唯一充当细胞途径以驱动病毒体组装和出芽的序列基序。具有L域活性的三个序列基序已经被表征为PPxY、 YxxL和PTAP(其中"x"表示任何氨基酸)。HIV-1出芽需要PTAP基序，存在于p6Gag蛋白的氨基端。棒状病毒，以VSV为典型代表，利用基质(M)蛋白中的PPxY基序。多个病毒家族的L域采用TSGIOI,对于内体膜筛分至关重要的细胞蛋白(VerPlank等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7724-7729; Po纖illos等，2002, Nat. StructBiol. 9, 821-7)。通过随机敲除筛选最初在哺乳动物细胞中浮皮确定，
14TSG101是涉及膜转运、细胞周期调控、微管组装和蛋白降解的43KDa多功能蛋白(Li等，1996， Cell 85, 319-29; Bishop等，2001, J. Biol. Chem.276: 11735-42; Kat薩nn等，2001， Cell 106, 145-55; Li等，2001, Pro"Natl. Acad. Sci. USA98, 1619-24)。 TSGIOI的C端具有巻曲螺旋域和自动调节其细胞水平的域；而TSGIOI的氨基端经由在结构上和功能上与WW和SH3域类似的结合袋与多个病毒L域相互作用，其与泛素缀合(UBC)E2酶具有明显的同源性(Pornillos等，2002, Nat. Struct. Biol. 9,812-7)。尽管TSGIOI的类似UBS的域强力结合泛素(核心为调节蛋白周转和分选的76个氨基酸蛋白),但其仍然缺乏涉及目标蛋白泛素化的催化半胱氨酸残基(Hicke, 2001， Cell 106, 527-30)。
在真核细胞中，TSGIOI是ESCRTI(转运必需的胞内分选复合物)的成分，该复合物是还包含Vps28和Vps37的350kDa细胞质复合物(Kat画nn等，2001， Cell 106, 145-55; Bishop等，2002， J. Cell Biol, 157,91-101)。目前正在研究这三种蛋白之间的相互作用，以及它们在膜转运中的各自的作用。TSGIOI的酵母同源物，Vp23,通过其对蛋白分选缺陷的功能互补而被鉴定(Babst等，2000, Traffic 1, 248-58)。具有减少的TSGIOI水平的纤维原细胞和酵母Vp23无效的20个突变体均显示了胞内/MVB途径的缺陷。例如，通常进入MVB系统用于溶酶体降解的受体反而再循环至表面，导致细胞信号中的深度混乱。基于Katzmann等,最近的试验分析，他们认为，TSG101Nps23在初级内体表面结合泛素蛋白，并有助于它们进入MVB泡嚢中(Katzmann等，2001, Cell 106，145-55)。
除了 TSGIOI ，具有WW域的细胞蛋白已经表现出域包膜RNA病毒的L域序列基序的相互作用(Harty等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97, 13871-6; Kikonyogo等，2001， Proc, Natl. Acad. Sci. USA 98，11199-204)。例如，Far-Western结合分析法已经证明了哺乳动物泛素连接酶Nedd4，及其酵母同源物Rsp5的WW域与EBOV的VP40 L域的特殊相互作用(Harty等，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA97, 13871-6;Kikonyogo, at al.， 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 11199-204)。确实，迄今的数据指出了泛素在病毒出芽中的重要作用(Patnaik等，2000, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97， 13069-74; Carter, 2002, Trends Microbiol. 10,203-5; Myers等，2002, J. Virol. 76, 11226-35)。在Nedd4和TSGlOl之间可能还存在构成相互作用。已经表明，fflV-1可能以完全不涉及胞内/MVB途径的方式利用Nedd4和TSGlOl从受感染细胞逃脱。毫无疑问，TSGlOl被广泛视为病毒所采用的用于驱动病毒释放的关键宿主因素。所提出的TSG101/MVB连接部分基于MVB形成的生物物理学过程，其已知包括胞内脂双层远离细胞质趋向内腔的内陷(Patnaik等，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13069-74;; Jasenosky等，2001， J. Virol. 75,5205-14)。包膜RNA病毒面对相似的拓朴参数病毒在膜的内叶上组装之后，双层必须朝向胞外环境外翻而再次远离细胞质。缺乏任何分裂其他的热力学稳定双层的催化能力，病毒显然采用胞内膜因子以进行辅助。TSGlOl与L域的相互作用由此可能提供新生病毒和驱动膜融合及出芽的胞内机制之间的重要关系。如上所述，TSGlOl是ESCRT-l的构成成分，其分选泛素化蛋白用于包含在MVB途径中。但是这种分选可能在受到HIV和相关的包膜RNA病毒感染的细胞中被^波坏。也就是说，并非指引泛素蛋白进入MVB途径，TSGlOl及其胞内对应物而是指引质膜与其相关联的病毒体外翻，形成从质膜夹断的包膜泡嚢。驱动病毒组装和释放的分子决定体仍然是活跃的研究领域，虽然已经形成了一些常用结论。首先，病毒成熟过程中对于质膜的TSGlOl的再次征用是绝对必须的。支持核心TSGlOl角色的数据极具说服力
(i) TSG101 UBC域的过度表达反式显性地妨碍HIV-1 Gag表达细胞中VLP的形成(Demirov等，2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 955-960);
(ii) 经由RNA干涉的削弱TSGlOl表达减弱了 fflV-1的出芽(Garrus等,2001, Cell 107,55-65);和(iii)在上面两种情况中，电子显微分析证明病毒体通过膜柄而束缚于质膜，结构上类似于细胞表达L域缺陷病毒中存在的那些。如Martin-Serrano等,所示，防止TSGlOl结合丝状病毒VP40或HIV-1 p6Gag的L域点突变显著地减少病毒体由人细胞的释放，该效果与TSGlOl不能与病毒蛋白共同定位于脂质双层相一致(Martin-Serrano等，2001 ， Nature Medicine 7,1313-19)。相关试-验证明，EBOV的L域能够取代p6Gag的L域，对于VLP的释放没有可辨別的影响，强调了包膜RNA病毒出芽机制的保守性。明显地， 一旦TSG101定向地融合至HIV-1 Gag，则HIV-1的L域不是必要的。因此L域的首要责任是征用TSG101至质膜。TSG101与病毒的L域之间的这种相互作用代表了用于预防和治疗HIV、 EBOV和MARV感染的新目标(Luban, 2001, Nat. Med. 7, 1278-80; Senior, 2001， Drug Discov. Today 6，1184-1186)。
发明人已经发现，抗-TSG101抗体可用于抑制或减少病毒感染。抗-TSG101抗体
本发明包括含有特异性结合TSG101蛋白的结合位的抗体抑制或减少病毒感染的用途。该抗-TSG101抗体因而可用作广谱抗病毒剂。此处使用的术语"抗体"是指免疫球蛋白分子。在一个实施方式中，抗体结合TSG101蛋白的C端区。在优选的实施方式中，抗体结合包含在氨基酸区域QLRALMQKARKTAGLSDLY(SEQ ID NO: 3)中的表位。在另一个优选的实施方式中，抗体是包含多肽的单克隆抗体，该多肽包含在SEQIDNO: 19、 22、 25或28中所述的氨基酸序列。在更为优选的实施方式中，单克隆抗体是D1和3G1。在另一个优选的实施方式中，抗体是包含选自SEQIDNO: 30-41的氨基酸序列的人源化抗体。在更为优选的实施方式中，人源化抗体包含SEQIDNO: 31-35中所述的氨基酸序列或SEQIDNO: 36-41中所述的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，抗体结合TSG101蛋白的N端区。在优选的实施方式中，抗体结合包含在氨基酸区VRETVNVITLYKDLKPVL(SEQ ID NO:2)中的表位。
正如本文所使用的，"表位"是指抗原决定簇，即，在宿主中引起免疫应答或通过抗体连接的分子的区域。该区域可以但不必包括连续的氨基酸。术语表位在本领域中也称之为"抗原决定簇"。表位可包含具有空间构象的少至三个氨基酸，所述空间构象对于宿主的免疫系统而言是唯一的。通常，表位由至少五个这样的氨基酸构成，更常见由至少8-10个这样的氨基酸构成。确定这些氨基酸的空间构象的方法在本领域中是公知的。
本发明还预想了包含特异性结合TSG101蛋白的结合位的抗体片段的用途。免疫球蛋白分子的免疫活性片段的实例包括F(ab)和F(ab') 片段，其可通过用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶处理抗体而产生。 产生并表达抗体的免疫活性片段的方法的实例可在美国专利第 5648237号中找到,其内容以引用的方式在此引入。
免疫玉求蛋白分子可由包4舌kappa、 lambda、 alpha、 gamma、 delta、 epsilon和mu恒定区，以及无数免疫球蛋白可变区的基因编码。轻链 分为kappa或lambda。轻链包括可变轻(VO区和恒定轻(QJ区。重链分 为gamma、 mu、 alpha、 delta或epsilon，其依次分别定义免疫王求蛋白 类IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。重链包括可变重(Vw)区、恒定重l(CHl) 区、铰链区、恒定重2(CH2)区和恒定重3(CH3)区。IgG重链基于其序 列变异进一步细分类，亚类被指定为IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。
抗体可进一步分解为两对轻区和重区。 一对Vl和Vh区各自包括 一系列七个子区域框架区l(FRl)、互补决定区l(CDRl)、框架区 2(FR2)、互补决定区2(CDR2)、框架区3(FR3)、互补决定区3(CDR3)、 框架区4(FR4)，它们构成抗体-抗原识别域。
嵌合抗体可通过使来自具有适宜的抗原特异性的单克隆抗体的基 因与来自具有适宜的生物活性的第二人抗体接合在 一起而生成。更具
体地，嵌合抗体可通过使编码抗体可变区的基因与来自第二抗体分子 的恒定区基因结合在一起而生成。该方法用于产生人源化单克隆抗体， 其中互补决定区是小鼠的，框架区是人的，从而减少用该抗体治疗的 人类患者的免疫应答的可能性(美国专利第4816567号、4816397号、 5693762号、5585089号、5565332号和5821337号，其内容以引用的 方式在此引入)。
适用于本发明的抗体可以由天然来源获得，或者通过杂交瘤、重 组体或化学合成法制得，包括通过基因工程技术修饰恒定区的功能(美 国专利第5624821号)。本发明的抗体可以是任何同工型，不过优选人 IgGl。
抗体例如作为完整的免疫^l蛋白存在，或者分裂为许多通过各种 肽酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而生成的良好表征的片段。在铰链 区的二硫键以下，胃蛋白酶消化抗体从而生成抗体的F(ab)，2片段，其是由通过二辟i/建连接至VH-CHI的轻链从而构成的Fab的二聚物。 F(ab)'2可在温和的条件下被还原以使4交链区中的二石克4定断裂，由此将 F(ab)'2 二聚物转换为Fab，单体。Fab，单体基本上是具有部分铰链区的 Fab。 参见Paul, ed.， 1993， Fundamental Immunology, Third Edition (New York: Raven Press),对于表位、抗体和抗体片段的详细描述。本领域的 技术人员将认识到这样的Fab，片段可以通过化学方法或使用重组RNA 技术而重新合成。因此，此处使用的术语抗体片段包括通过修饰整个 抗体而产生的抗体片段或是重新合成的抗体片段。
本文使用的抗体还可以是单链抗体(scFv)，其通常包括由通过多肽 连接融合至重链的可变区的轻链的可变区构成的融合多肽。
本发明还包括抗-TSG 101抗体的多克隆族群抑制或减少病毒感染 的用途。正如本文使用的，本发明的抗-TSG101抗体的多克隆族群是 指抗-TSG101抗体的族群，其包括多种不同的各自具有不同的结合特 异性的抗-TSG101抗体。在一个实施方式中，抗-TSG101抗体的族群 包括与TSG101蛋白的C端区结合的抗体。在优选的实施方式中，抗 -TSG101抗体的族群包括与一个或更多个包含在氨基酸区 QLRALMQKARKTAGLSDLY(SEQ ID NO: 3)中的表位结合的抗体。在 另一个实施方式中，抗-TSG101抗体的族群包括与TSG101蛋白的N 端区结合的抗体。在具体的实施方式中，抗-TSG101抗体的族群包括 与一个或更多个包含在氨基酸区VRETVNVITLYKDLKPVL(SEQ ID NO:2)中的表位结合的抗体。
优选地，多种多克隆族群的抗-TSG101抗体包括针对不同的 TSG101蛋白的表位的特异性。在优选的实施方式中，多克隆族群中的 至少90 % 、 75 % 、 50 % 、 20 % 、 10 % 、 5 %或1 %的抗-TSG101抗体靶 向所需表位。在其他优选的实施方式中，多克隆族群中的任何单抗 -TSG101抗体的比例不超过该族群的90%、 50%或10%。多克隆族群 包括至少2种不同的具有不同特异性的抗-TSG101抗体。更优选地， 多克隆族群包括至少10种不同的抗-TSG101抗体。最优选地，包括至 少100种不同的具有不同特异性的抗-TSG101抗体。
抗-TSG101抗体的制造TSG101蛋白或其片段可用于培育结合TSGIOI蛋白的抗体。这样 的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表 达库。在优选的实施方式中，使用合适的TSG101蛋白的C端片段培 育抗C端TSG101抗体。这样的抗体可用于抑制病毒感染。
单克隆抗-TSG101抗体的制造
抗体可通过用TSG101蛋白或其片段作为免疫原使得合适的对象 免疫来制备。通过标准技术可随时间监测免疫对象中的抗体效价，例 如使用免疫多肽的酶联免疫吸附试验(ELISA)。需要时，抗体分子可由 哺乳动物分离(例如来自血液)，并通过蛋白A色谱法等公知技术进一 步纯化以获得IgG部分。在一个实施方式中，使用人TSG101蛋白的N 端片段VRETVNVITLYKDLKPVL(SEQ ID NO:2)培育多克隆抗-N端 TSG101抗体(也称为抗-TSG101抗体"C")。在另一个实施方式中，使用 人TSG101蛋白的C端片段QLRALMQKARKTAGLSDLY(SEQ ID NO: 3)培育多克隆抗-C端TSGIOI抗体(也称为抗-TSG101抗体"E，，)。在又 一个实施方式中，使用人TSGIOI蛋白的C端片段(SEQ ID NO: 3)培育 单克隆抗-C端TSGIOI抗体(例如，池PE-8、 mab Dl和mab 3G1)。
在免疫后的合适的时间，例如，特异性抗体效价最高时，产生抗 体的细胞可由受试对象获得，并通过标准技术制备单克隆抗体，例如 最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤细胞技术(1975， Nature 256: 495-497), Cole等,的EBV-杂交瘤技术(1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therpy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)或三体杂交瘤技术。用于产 生杂交瘤的4支术是7>知的(参见Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。制造本发明的单克隆抗体的杂 交瘤细胞通过例如使用标准的ELISA试验筛选用于与所关注的多肽结 合的抗体的杂交瘤培养上清液而检测。
单克隆抗体由基本上同种的抗体族群获得，即，包括该族群的各 抗体是相同的，除了存在于少量中的可能自然发生的突变之外。因此， 修饰语"单克隆，，表示抗体的特征为不是不同抗体混合物。例如，单克 隆抗体可^f吏用首先由Kohler等，描述的杂交瘤方法(1975， Nature 256: 495-497)制得，或通过重组DNA法(美国专利第4816567号)制得。本文使用的术语"单克隆抗体"还表示该抗体是免疫球蛋白。
在产生单克隆抗体的杂交瘤方法中，小鼠或其他适宜的宿主动物 如仓鼠如上所述被免疫从而产生制造或能够制造将能特异性结合免疫
用蛋白的抗体的淋巴细胞(例如参见美国专利第5914112号，其内容以 引用的方式在此引入)。
另外一种方式，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用合适的融合 剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞 (Goding, Monoclonal Anitibodies: Principles and Practice, pp. 59-103(Academic Press, 1986))。由此制得的杂交瘤细胞接种并生长于合 适的培养基中，该培养基优选含有一种或更多种抑制未融合的亲代骨 髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶-次黄嘌呤鸟噪呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的 培养基通常将包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物 质抑制缺乏HGPRT的细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效的融合，通过所选的产生抗体的细胞支 持稳定高水平的制造抗体，并且对诸如HAT培养基等培养基敏感的那 些细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠科的骨髓瘤系，诸如得自可 由Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif USA 4寻到的 MOPC-21和MPC-11小鼠肺瘤，和可由American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA得到的SP-2细胞。
人骨髓瘤细胞和小鼠-人异源骨髓瘤细胞细也被描述用于制造人 单克隆抗体(Kozbor， 1984, J. Immunol" 133: 3001; Brodeur等， Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, pp. 51-63(Marcel Dekker， Inc., New York, 1987))。其中生长有杂交瘤细胞的 培养基经检测用于针对抗原的单克隆抗体的制造。优选地，通过杂交 瘤细胞制造的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合 试验，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)确定。单 克隆抗体的结合亲和力例如可通过Munson等，1980， Anal. Biochem., 107, 220的斯卡查德(Scatchard)分析确定。
杂交瘤细胞被确定产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体之后，克隆物可以通过有限稀释程序被亚克隆，并通过标准方法生长
(Goding, Monoclonal Anitibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)。用于该目的的合适的培养基例如包括D-MEM 或PRMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物的体 内生长。亚克隆分泌的单克隆抗体通过蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石 色语法、凝胶电泳、渗析或亲合色镨法等传统的免疫球蛋白纯化过程 适宜地与培养基、腹水或血清分离。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的另一种选择，针对TSG101 蛋白或其片段的单克隆抗体可以通过以TSG101蛋白或片段筛选重组 体组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示库)而确定并分离。用于产 生并筛选噬菌体展示库的试剂盒是市售品(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 和the Stratagene antigen SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612)。另 外，特别是经检验可用于产生和筛查抗体展示库的方法和试剂的实例 例如可在下列文献中找到美国专利第5223409号和5514548号；PCT
发明者李利民, 罗克珊·杜安, 迈克尔·戈德布拉特, 迈克尔·金科 申请人:功能遗传学股份有限公司