专利名称：一种超抗原活性增强的sec2突变基因及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术，具体说是一种超抗原活性增强的SEC2突变 基因及其制备方法。
背景技术：
超抗原(superantigen, SAg)是一组由细菌或病毒编码的蛋白质分子, 其不需要抗原递呈细胞(APC)的加工，而以完整蛋白质形式直接与细胞膜上 的MHC II分子结合形成复合物，在极低浓度(l 10ng/ml)即可刺激大量 具有特异性V p的T细胞增殖，从而引发极强的机体免疫反应并产生一定的 抗肿瘤活性。因此，超抗原作为一种理想的免疫调节剂和增效剂，有望开 发成一种有效的新型抗肿瘤药物，用于肿瘤治疗。
金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一类 具有代表性的细菌外毒素。由于其极强的T细胞激活功能，成为一类典型 微生物超抗原，受到人们的广泛重视。近年来，人们对金黄色葡萄球菌肠 毒素(SE)在免疫学功能及抗肿瘤应用等方面进行了许多基础和临床研究 工作，得到了令人鼓舞的结果，但其主要集中于SEA、 SEB等。而SEC2作 为金黄色葡萄球菌肠毒素家族中的一员，国内外对其在抗肿瘤方面的研究 还比较少。我所首次对SEC2的基因进行了克隆、测序并在靶向融合蛋白研 究方面进行了有意义的尝试，为进一步开展肠毒素C2 (SEC2)分子改造及 其靶向融合蛋白的研发奠定了基础。
已有的研究表明，由于金黄色葡萄球菌肠毒素属于一种细菌内毒素， 因此在一定浓度条件下会引起食物中毒和毒素综合症，从而导致发烧、呕 吐、休克等症状，在一定程度上限制了金黄色葡萄球菌肠毒素在临床抗肿 瘤治疗中的剂量使用范围，影响了治疗效果。此外，近年的研究显示超抗 原SEA和SEB在体内和体外实验中均能产生免疫抑制效应，高剂量的使用 和重复给药均会导致T细胞的失活和凋亡。而最近的研究显示SEC也可以 诱导产生免疫抑制效应，且免疫抑制效应与剂量和时间呈一定的依赖关系， 高剂量的SEC会导致免疫抑制，引起T淋巴细胞无能，从而导致抗肿瘤活
性降低。总之，金葡菌肠毒素所具有的内毒素活性和免疫抑制效应在一定 程度上限制了其在临床抗肿瘤治疗中的剂量使用范围，影响了抗肿瘤免疫 治疗的效果。因此，很有必要通过基因工程手段从根本上提高肠毒素的超 抗原活性和抗肿瘤效应，使其在极低浓度条件下即可产生强大的抗肿瘤免 疫效应，在一定程度上弥补在临床抗肿瘤免疫治疗中由肠毒素本身所引起 的边缘效应。
由于超抗原诱导的免疫效应是通过与MHC II分子和TCR-V(3相互作用而实现的，因此通过改变超抗原与以上两者的亲和力而提高超抗原活性就 成为了可能。然而，由于人体某些正常组织也会表达MHC II分子，因此超 抗原诱导的细胞毒作用通常对这类正常细胞也会产生一定的损伤，所以通
过增强肠毒素与MHC II分子的亲和力而提高超抗原活性显然不是一条可行 的途径。而通过改变肠毒素超抗原与TCR的亲和力而提高超抗原活性，进 而增强抗肿瘤效应则是可能的。
发明内容
为了进一步提高金黄色葡萄球菌肠毒素的超抗原和抗肿瘤活性，在一 定程度上弥补其在临床抗肿瘤应用中所存在的缺陷，本发明提供一种超抗 原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为
超抗原活性增强的SEC2突变基因，具有序列表SEQ ID NO: 1中的碱基 序列。
超抗原活性增强的SEC2突变基因的编码蛋白，具有序列表SEQ ID NO: 2中的氨基酸序列。
超抗原活性增强的SEC2突变基因的制备方法
1) 制备超抗原活性增强的SEC2突变基因以重组质粒pET-28-7￥-sec2 为模板,分别釆用引物对1和引物对2进行左右重叠PCR扩增，而后以左右 重叠PCR产物为模板，以引物对3为引物进行重叠PCR;而后再以扩增产物 为模板，以引物对4为引物再进行PCR扩增，即得超抗原活性增强的突变基 因MC2(77虹/G2Z^;
引物对1为，R-Mutant， 5，—TATTTTCCATCAAACCAGTAAACTCACTTG-3，和 TM-F, 5， -CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3';
弓l物对2为F-Mutant, 5，-GTTTACTGGTTTGATGGAMATATGAAATAT-3，;和 SEC2-R，5' -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';
引物对3为TM-F, 5， -CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，和SEC2-R， 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，；
引物对4为SEC2—F， 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA - 3，和SEC2-R， 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';
2) 制备超抗原活性增强的SEC2突变蛋白将上述突变基因 (T2虹A Z2"克隆至pGEM-T载体，经￡coR I和X/]o I双酶切后亚克隆
至表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，通过IPTG诱导表达， 获得可溶性的超抗原突变蛋白，并经分离纯化获得超抗原活性增强的SEC2 突变蛋白纯品。
所述的pET-28-7M-sec2重组质粒是以7￥序列为模板通过引物对1进 行左侧PCR扩增，在以sec2序列为模板通过引物对2进行右侧PCR扩增，而 后将左右PCR扩增产物为模板以引物对3进行重叠PCR扩增，产物经酶切后 克隆至pET-28a表达载体即得；引物对1为TM-F: 5，-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，，和TM—SEC2—R 5， -TGACTCTCGGATCCCATCGTGTACTTCCG-3;
引物对2为5， - ACACGATGGGATCCGAGAGTCAACCAGAC—3，，和SEC2— R, 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3，；
引物对3:TM-F,5'-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，和 SEC2-R， 5，-TCGCTCGA GTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
本发明具有如下优点
1. 本发明利用基因定点突变技术，首次构建了超抗原活性和抗肿瘤效 应显著增强的SEC2突变蛋白，并成功在大肠杆菌中实现可溶性表达。本发
明可提供直接用于生产该超抗原突变蛋白的基因工程菌株。
2. 本发明中超抗原突变蛋白活性的增强是通过提高野生SEC2蛋白对 TCR的亲和力而实现的，因此不会增加对某些表达MHC II分子的正常细胞 所造成的损伤。
3. 本发明中^C2O^0L/MZ^基因的异源表达提供了制备该超抗原突 变蛋白的一种新方法，具有产量高，纯化方便，且活性稳定的特点。
4. 本发明中的SEC2 (T20L/G22E)突变蛋白通过基因定点突变技术获得， 其在对SEC2蛋白中涉及T细胞受体(TCR)结合位点的20和22位氨基酸进 行替换，从而使20位的苏氨酸(Threonine, T )和22位的甘氨酸(Glycine, G)分别变为亮氨酸(Leucine， L)和谷氨酸(Glutamicacid， E),以期待 获得通过改变肠毒素与TCR亲和力而使超抗原活性提高的突变蛋白，从而 提高超抗原SEC2的临床抗肿瘤效果。
图l为本发明SEC2(T20L/G22E)突变蛋白基因的PCR扩增及相应重组质 粒的酶切验证图谱(其中1代表DL2000 marker; 2代表突变位点(T20L/G22E ) 左侧的PCR产物；3代表突变位点(T20L/G22E)右侧的PCR产物；4代表重叠 PCR扩增产物TM- S五C2 07M/G""; 5代表目的突变基因犯C2 (T7虹/G"^ 的PCR扩增产物；6代表重组pGEM-MC2(T2虹/G"^载体电泳图谱；7代表 重组pGEM- MC2(T20L/G""经丑coR I和I双酶切后的电泳图；8代表 重组pET-28-犯C2 (T7虹/G"a电泳图；9代表重组pET-28-犯C2 (TML/GW" 经五coR I和I/]( I双酶切后的电泳图；10代表入-五coT14 DNA marker)。
图2为本发明SEC2(T20L/G22E)突变蛋白的表达及纯化电泳图谱(其中1 代表经IPTG诱导的BL21(DE3)空菌对照；2代表经IPTG诱导表达后的含 pET-28a空载体的BL21(DE3)全蛋白对照；3代表目的蛋白经IPTG诱导表达 后的全蛋白图谱；4代表目的蛋白经IPTG诱导表达后的包涵体全蛋白图谱； 5代表目的蛋白经IPTG诱导表达后的可溶性上清；6和7代表经Ni亲和纯化 后的SEC2(T20L/G22E)纯蛋白；M代表蛋白分子量marker )。
图3为超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E)的超抗原活性检测实验(小鼠 脾淋巴细胞增殖实验)结果图(其中横坐标为SEC2野生蛋白对照和SEC2(T20L/G22E)的浓度使用范围及BSA阴性对照。纵坐标为相应的增值指 数)。
图4为本发明超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E)的抑瘤活性检测(以小 鼠纤维瘤细胞L929为靶细胞，脾淋巴细胞为效应细胞)结果图(其中A和 B图中纵坐标为阴性对照牛血清白蛋白(BSA)、 SEC2(T20L/G22E)和阳性对 照SEC2;横坐标为肿瘤细胞抑制率。A图代表加入脾淋巴细胞时各蛋白对 L929瘤细胞的间接抑制效果，B图代表不加脾淋巴细胞条件下(无效应细胞) 各蛋白对L929瘤细胞的直接抑制效果)。
具体实施例方式
实施例l
超抗原活性增强的SEC2突变基因，具有序列表SEQ ID NO: 1中的碱基 序列(参见序列表l)。其突变基因的编码蛋白，具有序列表SEQ ID NO: 2 中的氨基酸序列(参见序列表2)。
超抗原活性增强的SEC2突变基因
001 gagagtcaac
051 tactggtttg
101 cagcaactaa
151 tataacatta
201 gttattaaat
251 tgtatggatc
301 gtaggtaaag
351 acatgaagga
401 gagtttatga
451 aagaaaagtg
501 aattaataaa
551 gatatataaa
601 atgcctgcac
651 caacgacaat
701 ttacaacaaa
SEQ ID NO. 1的信虔 (a)序列特征
cagaccctac atggaaaata agttatgtct gtgataaaaa gaagatttag aaattactat ttacaggtgg aaccactttg aaataaaaga taacagctca aaaaatttgt atttattgaa caggcgataa aaaacggttg gaatgga
gccagatgag tgaaatattt gtagataaat
caaagaagta gtaaactgct taaaacttgt ataatgggaa aacacaattt agaactagac atgagtttaa aataacggca gtttgaccaa attctaaaag
长度 类型 链型
717个碱基对
核酸
双链
*拓扑结构线性
(b) 分子类型cDNA
(c) 假设否
(d) 反义否
t tgcacaaat atatgatgat ttttggcaca tatgacaaag caaagatgaa atttttcatc atgUtggag cttacaaaat cttttgaagt ataaaagcta cagttcacca atactttttg tctaaatat t tgtgaagata
caagtgagtt cattatgtat tgatttaatt tgaaaacaga gtagttgatg caaagataat gaataacaaa gtacttataa gcaaactgat ggaatttttt tatgaaacag gtatgatatg taatgatgta gaagtccacc(e)最初来源金黄色葡萄球菌(S一一coc譜aureus) 超抗原活性增强的SEC2突变基因的编码蛋白
超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E),具有序列表SEQ ID NO: 2中的氨 基酸系列
001 esqpdptpde lhksseftgl menmkylydd hyvsatkvms vdkflahdli 051 ynisdkklkn ydkvktelln edlakkykde vvdvygsnyy vncyfsskdn 101 vgkvtggktc myggitkheg nhfdngnlqn vlirvyenkr ntisfevqtd 151 kksvtaqeld ikarnflink knlyefnssp yetgyikfie nngntfwydm 201 mpapgdkfdq skylmmyndn ktvdsksvki evhlttkng SEQ ID NO. 2的信息(参见序列表)
(a) 序列特征
*长度239个氨基酸 *类型肽链 *链型单链
*结构二级结构主要由a螺旋和(3折叠构成，其中93位和110 位氨基酸构成一个典型的半胱氨酸环结构。
(b) 分子类型成熟肽链
(c) 假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源金黄色葡萄球菌(SMp/jyiococcus aureus) 实施例2
1) pET-28-7M-sec2质粒DNA模板的构建
设计合成PCR引物，通过重叠PCR法扩增7M-sec2序列
① 左侧TM序列的PCR扩增
PCR反应体系为10 x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液5iil、 dNTP 4 uL、 上下游引物各20 pmol、 pCVN/Her2 DNA模板100 ng、 pfuDNA聚合酶2U， 无菌超纯水补齐体积至50 nl。
PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C， 30秒；60 。C, 30秒；72°C， 30秒；共30个循环；第三阶段72。C， 5分钟。
扩增引物为TM-F: 5'-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，，和TM-SEC2-R 5, -TGACTCTCGGATCCCATCGTGTACTTCCG-3'。
② 右侧sec2序列的PCR扩增
PCR反应体系为10 x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液5jul、 dNTP 4 uL、 上下游引物各20 pmol、金葡菌基因组DNA模板100 ng、 pfu DNA聚合酶 2 U，无菌超纯水补齐体积至50|il。
PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C, 30秒；55 。C, 30秒；72°C, 60秒；共30个循环；第三阶段72。C, 5分钟。
扩增引物为5， - ACACGATGGGATCCGAGAGTCAACCAGAC-3，，和SEC2-R， 5'-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
③ 7M-SEC2基因的重叠PCR合成
以上述扩增得到的左侧7￥序列及右侧sec2序列为重叠PCR模板，以 TM-F和SEC2-R为引物对，通过重叠PCR扩增合成TM-MC2基因。
PCR反应体系为:10 x PfuDNA聚合酶反应缓冲液10jul、 dNTP 8 uL、 上下游引物各40 pmol、左右侧重叠PCR产物分别50 ng、 Pfu DNA聚合酶 4 U，无菌超纯水补齐体积至100jul。
PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94'C, 30秒；55 。C, 30秒；72°C， 120秒；共30个循环；第三阶段72。C, 10分钟；4 。C 保存。
扩增引物为 TM-F， 5，-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，和 SEC2-R， 5，-TCGCTCGA GTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
④ pET-28-7M-sec2质粒DNA的构建
将上述扩增得到的，-MC7基因产物以五coRI、 XAoI双酶切，酶切产 物经PCR产物纯化试剂盒回收，后连接入经同样双酶切的pET-28a表达载 体，构建成表达载体pET-28-n^CZ转化co]i DH5a感受态细胞，通 过酶切验证及DNA测序鉴定正确重组克隆。
2) pET-28-TM-sec2质粒DNA模板的提取
挑取上述含质粒pET-28-7￥-sec2的大肠杆菌DH5a菌落接种于5ml液 体LB培养基中，37'C摇床过夜培养，取3 ml的培养物离心收集菌体。提 取质粒pET-28-7￥-sec二并于-2(TC冷冻保存。(质粒DNA的提取操作按F. 奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密 斯，L斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons 出版社1995年第三版P39-40 )。
3 ) S￡C2 (77化/G""基因的扩增
设计合成PCR引物，通过重叠PCR法扩增^C7O70L/G""的基因片
① 左侧重叠PCR扩增产物
PCR反应体系为10 x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液5jul、 dNTP 4 uL、 上下游引物各20 pmol、 pET-28-7M-sec2 100 ng、 Pfu DNA聚合酶2 U，无 菌超纯水补齐体积至50 pl。
PCR反应条件为第一阶段95°C， 5分钟；第二阶段94。C, 30秒；50 。C， 30秒；72°C, 60秒；共30个循环；第三阶段72。C， 10分钟。
扩增引物为R-Mutant, 5， - TATTTTCCATCAAACCAGTAAACTCACTTG-3，， 和TM-F， 5， -CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，。
② 右侧重叠PCR扩增产物
PCR反应体系为10 x Pfu DNA聚合酶反应缓冲液5jil、 dNTP 4 uL、 上下游引物各20 pmol、 pET-28-7￥—sec2 100 ng、 Pfu DNA聚合酶2 U,无菌超纯水补齐体积至50 jal。
PCR反应条件为第一阶段95°C, 5分钟；第二阶段94'C, 30秒；55 °C, 30秒；72°C， 90秒；共30个循环；第三阶段72。C, IO分钟。
扩增引物为F-Mutant, 5， -GTTTACTGGTTTGATGGAAAATATGAAATAT—3，；和 SEC2-R, 5'-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
③7M-MC2 (77儿/G""基因的重叠PCR合成
以上述左侧及右恻重叠PCR产物为模板，以TM-F和SEC2-R为引物对， 通过重叠PCR扩增合成7M-MC2(7^zyG""基因。
PCR反应体系为10 x PfuDNA聚合酶反应缓冲液10iil、 dNTP8uL、 上下游引物各40 pmol、左右侧重叠PCR产物分别50 ng、 Pfu DNA聚合酶 4 U，无菌超纯水补齐体积至100jil。
PCR反应条件为第一阶段95°C, 5分钟；第二阶段94'C, 30秒；55 。C, 30秒；72°C， 120秒；共30个循环；第三阶段72。C, 10分钟；4 。C 保存。
扩增引物为 TM-F, 5，-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，和 SEC2-R， 5,-TCGCTCGA GTTATCCATTCTTTGTTG-3"。 ④MC7 (T7虹/G"^)基因的PCR扩增
以上述7M-犯C2O70L/G"^基因产物为模板，以SEC2-F和SEC2-R为 引物对，通过PCR扩增合成^C7 0^L/G2Z^全基因。
PCR反应体系为10 x PfuDNA聚合酶反应缓冲液10jal、 dNTP 8 uL、 上下游引物各40 pmol、 rM-MC2(T2儿/G""产物50 ng、 Pfu DNA聚合酶 4 U,无菌超纯水补齐体积至100jal。
PCR反应条件为第一阶段95°C, 5分钟；第二阶段94。C， 30秒； 55°C, 30秒；72°C， 90秒；共30个循环；第三阶段72。C， IO分钟；扩增
产物即为超抗原活性增强的突变基因^"rn此/^z^,参见序列表1。
扩增引物为SEC2-F, 5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和SEC2-R， 5，-TCGC TCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
4 )犯C7 (T2化/G2Z^基因的鉴定取上述PCR扩增得到的 MC2 07化/G""基因产物经1. 5%琼脂糖凝胶在120 V电压条件下进行电泳 分析并分离，切下相应大小的目的带，按北京博大泰克生物技术公司DNA 胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；回收产物与PGEM-T克隆载体连接， 构建成重组克隆载体pGEM-T-犯C2 07M/GW"。连接反应按Promega公司 产品pGEM-T试剂盒使用说明书。连接产物转化大肠杆菌DH5cx感受态细胞， (转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞 德曼，J.A.史密斯，L斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 ),通过PCR扩增筛选阳性克隆 并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。MC2 (T2虹/C""基因的合 成及重组质粒的构建结果参见图1。如图l所示，通过重叠PCR方法成功扩增得到了全长MC2 07虹/G2ZB〕 基因，大小与理论值相符。构建的重组克隆载体及表达载体经酶切验证均 正确。
实施例3
超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E)的表达
1) 超抗原突变蛋白表达载体的构建将基因克隆载体pGEM-T-SU(77化/G"^质粒DNA以5coRI、 I双酶切，相应的酶切基因产物 用DNA胶回收试剂盒回收。在以T4 DNA连接酶将上述回收产物连接入经同 样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28-(77虹/G2Ze〕。 转化￡. coh' BL21(DE3)感受态细胞，通过酶切验证及DNA测序鉴定正确重 组克隆。
2) 超抗原突变蛋白的诱导表达和纯化接种转化了重组表达载体 pET-28-MC7 0^此/G22^的BL21 (DE3)单菌落于含50 pg/ml卡那霉素的液 体LB培养基中，过夜活化培养，以1:100(体积比)的接种量转接下一级， 37。C摇床培养至0D鋼为0. 6,加入终浓度1. Ommol/L的IPTG， 3(TC诱导表 达5小时。而后以5000 rpm/min的速度离心收集菌体，重悬于l/5体积的 平衡缓冲液(50 mM NaH2P04， 0. 5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH8. 0)，以 0. 5 ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲和层析柱；以含40 mM咪唑的 平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓 冲液(50 mM NaH2P04， 0.5 M NaCl, 250 mM咪唑，pH8. 0 )进行洗脱，收 集紫外条件下在480腿的吸收峰时洗脱产物，即为超抗原突变蛋白 SEC2(T20L/G22E),并对洗脱产物用PBS透析除盐。通过SDS-PAGE电泳鉴 定目的蛋白的表达及纯化效果(参见图2)。如图2所示，目的蛋白 SEC2(T20L/G22E)经IPTG诱导表达后主要以可溶性形式存在，通过亲和层 析获得了较高纯度的突变蛋白，可用于进一步的生物学活性实验。
实施例3
刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测取SPF级纯系小鼠BALB/c,通过 颈推处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻压碎后过200目筛网。然后将过 筛网后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min收集细胞沉淀，用5mL 红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min离心5min。再以不含 血清的RPMI-1640培养基清洗细胞1-2次，最后用含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液调节细胞浓度，以8xl()5cells/孔加到96孔板中。将经 纯化的本发明超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E)及SEC2野生蛋白分别以 1 、 10、 100、 1000、 10000 ng/mL的终浓度加入各孔，每个浓度做三个重 复。设淋巴细胞自然增殖孔，并以牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。培 养72h后，加入20ili1/孔的MTT液。继续培养4h, 1500r/min离心5分钟 后弃上清培养液，收集细胞，加入二甲基亚砜(DMSO)120ul/孔，溶解15min 后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。T细胞增殖能力以增殖指数(Proliferation Index, PI)表示，P卜实验孔吸光值淋巴细胞自然增 殖孔吸光值(参见图3)。如图3所示，从lng/ml到10000ng/ml,与SEC2 野生蛋白相比，SEC2 (T20L/G22E)突变蛋白的超抗原活性有显著提高，而BSA 阴性对照对小鼠脾淋巴细胞无明显的刺激作用。
所述RPMI-164G培养液为用于人或动物细胞株生长的常用营养液，由 美国Gibco公司生产；MTT液为虔唑蓝(MTT)以5mg/ml的浓度溶于磷酸盐缓 冲液(NaCl 8. Og， Na2HP04 1. 44g, KH2P04 0. 24g， KC1 0. 2g，溶于1000ml去 离子水，pH 7. 4)配制形成，并经0. 22)im的微孔滤膜过滤后4'C保存。
实施例4
SEC2(T20L/G22E)蛋白的抗肿瘤活性检测将小鼠纤维瘤细胞L929传 代培养后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%FBS的1640培养基稀释成 浓度为2xl()5cells/mL的单细胞悬液，然后以1 x 104cel 1 s/孔培养在96孔 板。将按实施例3中方法分离获得的小鼠脾淋巴细胞以2xl()5cells/孔加 入到上述含有L929细胞的96孔板中，使效靶比达到20: 1 (细胞数量比)。 然后将本发明纯化的超抗原突变蛋白SEC2(T20L/G22E)分别以100、 1000、 10000 ng/mL的终浓度加入各孔。以BSA作为阴性对照，SEC2野生蛋白作
为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔、空白对照孔及 调零孔，每个浓度设3个复孔，按常规条件培养72h，加入20ul/孔的MTT 液。继续培养4h, l画r/min离心收集细胞，加入二甲基亚砜(DMSO ) 120u1/ 孔，溶解15min后，酶标仪上以570nm测定各孔的吸光值。肿瘤抑制瘤计 算公式如下100 [(蛋白实验孔吸光值淋巴细胞自然释放孔吸光值) (肿瘤细胞对照孔吸光值空白对照孔吸光值)]x 100% (参见图4)。如4B 图所示，在不加效应细胞(脾淋巴细胞)的情况下，SEC2阳性对照蛋白和 SEC2(T20L/G22E)突变蛋白均不能产生抑瘤效果,与阴性对照BSA无明显区 别，证明SEC2及SEC2(T20L/G22E)均在T细胞介导下产生抑瘤作用。如4A 图所示，在以脾淋巴细胞作为效应细胞的情况下，与SEC2野生蛋白相比， 从l ng/ml到10000 ng/ml, SEC2 (T20L/G22E)突变蛋白均表现出了显著增 强的抗肿瘤效果。显示SEC2(T20L/G22E)突变蛋白可替代SEC2用于进一步 的临床抗肿瘤研究。SEQUENCE LISTING
<110〉中国争f学院沈阳应用生态研究所
<120〉一种超抗原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法
〈130〉
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 717
<212〉 DNA
<213〉 Staphylococcus aureus
<220>
<m〉 cds
〈'222〉 (1).. (717) 〈223〉
<400〉 1
gag agt caa cca gac Glu Ser Gin Pro人sp 1 5
cct Pro
acg Thr
cca gat Pro Asp
gag Glu 10
ttg Leu
His
aaa tea agt Lys Ser Ser ' 15
gag Glu
48
ttt act ggt ttg atg gaa aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat Phe Thr Glv Leu Met Glu Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr 20 2b 30
96
gta tea gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lvs Phe Leu Ala His ZVsp 35 40 45
144
tta att tat aac att agt gat aaa aaa eta aaa犯t tat gac aaa gtg Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp b/s Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val 50 55 60
192
aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa Lvs Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu 65 70 75 80
240
gta gtt gat gtg tat gga tea aat tac tat gta aac tgc tat ttt tea Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser & 9b 95
288
tec aaa gat aat gta ggt aaa gt1: aca ggt ggt aaa act tgt atg tat Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Us Thr Cys Met Tyr 100 105 iio
336
gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta Glv Gly lie Thr Lys His Glu Glv Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu 115 12b 125
384caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432
Gin Asn Val Leu lie Arg寸al Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser 130 135 140
ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get caa gaa eta gac 480
Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
ata aaa get agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt 528
lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lvs Lvs Asn Leu Tvr Glu Phe
165 170 175
aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac 576
Asn Ser Ser Pro Tvr Glu Thr Glv Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn
180 185 190
ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt
Glv Asn Thr Phe Trp Tvr Asp Met Met Pro Ala Pro Glv Asp Lys Phe '195 200 205
gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat 672
Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met, Met, Tyr Asn Asp Asn Lys Thr卩al Asp 210 215 220
tct, aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga 717
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu甘al His Leu Thr Thr Lys Asn Gly 225 ' '230 235
<210> 2
<211〉 239
<212〉 PRT
〈213〉 Staphylococcus aureus
<400> 2
Glu Ser Gin Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser
1
5
10
Ser Glu 15
Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr
20
25
30
Val Ser Ala Thr Us Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp 35 40 45
Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu lys Asn Tyr Asp Lys Val
50
55
60
Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu
65
70
780
Val Val Asp Val Tyr Glv Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cvs Tyr Phe Ser 85 90 95
Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr
100
105
110
Gly G1y lie Thr Lys His Glu Glv Asn His Phe Asp Asn Glv Asn Leu 115 12b 125
Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr lie Ser
130
135
140Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lvs Ser Val Thr Ala Gin Glu Leu Asp 145 150 155 160
lie Lvs Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu Tvr Glu Phe 165 170 175
Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Glv Tyr lie Lys Phe lie Glu Asn Asn 180 ' &5 190
Gly Asn Thr Phe Trp Tvr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe 195 200 20^ '
Asp Gin Ser Lvs Tvr Leu Met Met Tvr Asn Asp Asn Lvs Thr Val Asp 210 ' ' 215 220
Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Glv 225 '230 23权利要求
1.一种超抗原活性增强的SEC2突变基因，其特征在于具有序列表SEQID NO1中的碱基序列。
2. —种超抗原活性增强的SEC2突变基因的编码蛋白，其特征在于具有 序列表SEQ ID NO: 2中的氨基酸序列。
3. —种按权利要求1所述的超抗原活性增强的SEC2突变基因的制备方 法，其特征在于1) 制备超抗原活性增强的SEC2突变基因以重组质粒pET-28-7￥-sec2 为模板,分别釆用引物对1和引物对2进行左右重叠PCR扩增，而后以左右 重叠PCR产物为模板，以引物对3为引物进行重叠PCR;而后再以扩增产物 为模板，以引物对4为引物再进行PCR扩增，即得超抗原活性增强的突变基 因MC2(TML/G"^);引物对1为，R-Mutant, 5'-TATTTTCCATCAAACCAGTAAACTCACTTG-3，和 TM-F， 5， -CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3， j引物对2为F-Mutant, 5，-GTTTACTGGTTTGATGGAAAATATGAAATAT-3，;和 SEC2-R,5' -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';引物对3为TM—F, 5， —CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC—3，和SEC2-R， 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';引物对4为SEC2-F， 5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA - 3，和SEC2-R, 5， -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';2) 制备超抗原活性增强的SEC2突变蛋白将上述突变基因 07M/G""克隆至pGEM-T载体，经￡coR I和I力o I双酶切后亚克隆至表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌BL21 (DE3),通过IPTG诱导表达， 获得可溶性的超抗原突变蛋白，并经分离纯化获得超抗原活性增强的SEC2 突变蛋白纯品。
4. 按权利要求3所述的超抗原活性增强的SEC2突变基因的制备方法， 其特征在于所述的pET-28-7￥-sec2重组质粒是以B/序列为模板通过引 物对1进行左侧PCR扩增，在以sec2序列为模板通过引物对2进行右侧PCR 扩增，而后将左右PCR扩增产物为模板以引物对3进行重叠PCR扩增，产物 经酶切后克隆至pET-28a表达载体即得；引物对1为TM-F: 5'-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，，和TM-SEC2-R 5， -TGACTCTCGGATCCCATCGTGTACTTCCG-3;引物对2为5' - ACACGATGGGATCCGAGAGTCAACCAGAC-3,，和SEC2-R， 5，-TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3';引物对 3:TM-F, 5'-CGGAATTCGCCGAGCAGAGAGC-3，和 SEC2-R， 5，-TCGCTCGA GTTATCCATTCTTTGTTG-3'。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术，具体说是一种超抗原活性增强的SEC2突变基因及其制备方法。具体为具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列并具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。本发明利用基因定点突变技术，首次构建了超抗原活性和抗肿瘤效应显著增强的SEC2突变蛋白，并成功在大肠杆菌中实现可溶性表达。本发明可提供直接用于生产该超抗原突变蛋白的基因工程菌株。
文档编号A61P37/04GK101597612SQ200810011709
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者张惠文, 张成刚, 徐明恺, 王小刚 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所