专利名称：表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其 构建方法与应用。
背景技术：
鸡大肠杆菌病是由致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)所引起。本病有很多临 床表现，最常见的表现是气囊炎、心包炎、肝周炎和死亡。随着集约化养禽业的发展， 致病性大肠杆菌带来的危险性不断增长，使本病难以控制，以至世界范围内造成重大损 失。虽然抗生素的使用可获得暂时的保护，但细菌产生的耐药性反而成为一种潜在的危 害。因此，迫切需要一种安全、有效的免疫原作为疫苗。大肠杆菌1型菌毛是鸡大肠杆 菌病的一种重要的致病因子，是细菌表面的一种丝状蛋白质突起，兼有毒力因子及免疫 原的特点，因而菌毛一直是国内外科技工作者感兴趣的研究对象之一。l型菌毛主要起 粘附作用，它可与鸡气管粘膜及气囊上皮上的甘露糖受体结合，这种结合对大肠杆菌 在鸡呼吸道的定居起到至关重要的作用。大多数鸡致病性大肠杆菌带有1型菌毛。l型 菌毛由操纵子基因控制的，有fimB、 fimE、 fimA、 fiml、 fimC、 fimD、 fimF、 fimG和 fimH等基因组成，其中fimA和fimH为结构基因，菌毛蛋白99.99%为fimA所编码。1 型菌毛作为一种由蛋白主体装配而成的丝状物具有良好的免疫原性。近些年来亚单位菌 苗的研究越来越多，Gyimah等用鸡大肠杆菌01菌株天然菌毛制成油乳剂苗免疫雏鸡后 发现，免疫鸡能很强地耐受同源01菌株对气囊的攻击，用Ol、 02及078菌体菌毛制 成的多价疫苗则具有显著的交叉保护效果。我国学者也相继报道了鸡大肠杆菌菌毛疫苗 免疫的效果，但该类产品保护范围有限，对其它血清型的致病菌保护力有限。用天然菌 毛制成的疫苗虽然保护力高，但由于表达量不大，加上提取菌毛繁杂，增加了疫苗的成 本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌，以提高免疫的效果， 降低防治鸡大肠杆菌病疫苗的生产成本。
本发明的另一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌的构建方法。
本发明还有一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌在制备鸡大肠杆菌病 免疫疫苗中的应用。
本发明的再一目的是提供一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基 因重组质粒。
其中，受体菌株为TG1或HB101(fim")。
上述表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，包括如下步骤
1、 鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；
2、 能够呈现表达1型菌毛的重组质粒的构建。
其中，步骤1所述的鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤
a、 引物的设计与合成；
b、 染色体的提取；
c、 鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的分段扩增、连接、转化与表达。
其中，步骤2所述的重组质粒的构建方法包括如下步骤鸡大肠杆菌l型菌毛操纵 子基因的各个PCR扩增产物的连接、质粒构建和操纵子基因表达质粒的连接、构建与 鉴定、以及表达的1型菌毛的抗原制备、疫苗制备与免疫效果检验。
其中，步骤2中所使用的质粒为pUC18或pUCm-T。
通过上述方法构建的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌属于重组大肠杆菌(带1 型菌毛)，菌株保藏号为CCTCCM208033,日期2008年3月11日；保藏地点为武 汉，中国典型培养物保藏中心。
表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。
一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗，它是通过如下方法制得将表达鸡大肠杆 菌1型菌毛蛋白重组菌的表达菌毛产物与吐温-80按体积比94 : 6混匀作为水相，司本 -80与10号白油按体积比6:94加热溶解作为油相，油相与水相按体积比3:1的比例 乳化。
有益效果本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌通过基因重组的方法大量表达 1型菌毛，与别的表达不同的是，本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛重组菌表达具有天 然l型菌毛突起状蛋白，而不是包涵体表达蛋白，因而免疫原性很强，且其培养表达的 产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。
生物材料保藏情况日期2008年3月11日，单位中国典型培养物保藏中心 CCTCC,地址武汉大学，编号M208033。
图1为大肠杆菌1型菌毛基因结构及引物相对位置。
图2为片段BEA PCR扩增产物电泳，其中，1为X-Hindni digest DNA Marker, 2 为BEAPCR扩增产物约3300bp。
4图3为片段IC， D PCR扩增产物，其中，1为X-HindIII digest DN A Marker, 2为IC PCR扩增产物约2050bp， 3为D PCR扩增产物约2150bp。
图4为片段D',FGH PCR扩增产物，其中，1为X-HindIII digest DNAMarker, 2为D' PCR扩增产物约2150bp， 3为FGH PCR扩增产物约2300bp。
图5为SOE PCR扩增产物，其中，1为DFGH PCR扩增产物约4300bp，2为lKbpDNA Ladder Marker 。
图6为质粒pBEA酶切电泳，其中，1,2为pBEAEcoRl+Kpnl双酶切，3，4为pBEA EcoRl单酶切，5为X-HindIII digest DNAMarker。
图7为质粒pUCm-IC双酶切电泳，其中，l为X-HindIII digest DNA Marker, 2,3,4 为pUCm-IC/Kpnl+BamHl 。
图8为质粒pUCm-D双酶切电泳，其中，1为lKbpDNA Ladder Marker, 2,3为 pUCm-D/BamHl+Sall。
图9为pBC酶切电泳，其中，1为pBCBamHl单酶切，2为pBC Kpnl+BamHl双 酶切，3为人-HindIII digest DNA Marker 。
图10为pBD酶切电泳，其中，1为X-HindIII digest DNA Marker, 2为pBD BamHl 单酶切，3为pBD BamHl+Sall双酶切。
图11为pBH酶切电泳，其中，1为X-HindIII digest DNA Marker, 2为pBH BamHl 单酶切，3为pBH BamHl+Sall双酶切。
图12为表达的菌毛电镜，其中A为HB101(pBC)， B为HB101(pBH)。
具体实施例方式
以下实施例中使用的材料如下
1、 宿主菌受体菌株TGl和HBlOl(fmT)，由金陵科技学院动物医学系保存。
2、 质粒pUC18、 pUCm-T质粒载体由金陵科技学院动物医学系保存。 实施例l:鸡大肠杆菌l型菌毛操纵子基因的分段PCR扩增
1、引物设计
根据GenBank上发表的序列，运用Primer 5.0设计四对引物，送Invitrogen公司 合成。引物用超纯水稀释成20pmol/L，置于-20'C冻存。引物序列如下 PI: 5，-GGGAATTCAGTGACCAAAGCCATATTTACC-3， P2: 5 ，誦GGGGTACCTGGGTAGGTTATTGATACTG-3, P3: 5 ，-AAGGTACCGGGACGTCATTACGGGCAG-3' P4: 5 ，-GGGCCCCCAATCCGATTCTGTACACTA-3' P5: 5 ，-CTGACGATCCCTCAGGCATTTATGAG-3'
5P6: 5 ，-AAGTCGACACGCCCCCTTAACGACATTC-3' P7: 5，-AAGGTTTGTTTCTCATCACGCCCCC-3， P8: 5，-CGTCGATTTAGATAACGCGGTTGCTAACG-3' P9: 5 ， -ATGTCGACTGGCCTACAAAGGGCTAACGTG -3' 鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因结构及引物相对位置见图1。
2、 细菌模板的制备
① 细菌培养冻干保存的018菌株划LB平板，37'C培养过夜，挑取单个菌落接 种LB液体培养基，200rpm振荡培养16"18h，通过血凝及甘露糖敏感性血凝试验确定1 型菌毛生长，如无血凝继续培养，直至有血凝。
② 煮沸法制备PCR模板取适量细菌培养物离心，沉淀用l(KHil灭菌超纯水悬浮， 煮沸5min，冰上放置，冷却后4。C, 10000rpm离心2min，取上清-20'C保存备用。
3、 PCR反应体系及各片段扩增程序 ①片段BEA (fimB+fimE+fimA)的扩增
整个反应体系如下(5(^1):
TaKaRa LA Taq (5U/pl) 0 1
10xLA PCR Buffer II (Mg2+free) 5^1
MgC12(25mM)" 5pl
dNTP Mixture (各25mM) 8fil
模板DNA 2pl
Pl 1^1
P2 lpl
ddH20 upto 5。nl
PCR循环参数模板DNA 94"变性lmin后，按94。C ( 30sec ) -59"(4036(0-72°(:(31111113086<;)共进行30个循环，然后72'C再延伸10min， 4'C保存。 ②片段IC (fiml+fimC)、 D (fimD)的扩增
整个反应体系如下(50^1):
TaKaRaExT叫(5U/pl) 0.5pl
10xLAPCR Buffer II (Mg2+free) 5pl
MgC12(25mM)*l 5pl
dNTP Mixture (各25mM) 6pl
模板DNA 2pl
P3orP5 lnlP4orP6 1^1 ddH20 upto 50pl
PCR循环参数模板DNA 94'C变性2min后，按94'C ( 20sec ) -59"€(3036(;)-72°(:(21^113086<0共进行30个循环，然后72匸再延伸10min， 4'C保存。 ③SOE PCR扩增片段DFGH (fimD+fimF+fimG+fimH)
1)片段D'、 FGH的PCR扩增 整个反应体系如下(20^1):
TaKaRaExTaq(5U/|Lil)0.2pl
10xLA PCR Buffer II (Mg2+free)2nl
MgC12(25mM)*l2pl
■P Mixture (各25mM)3pl
模板DNAlMl
P5orP8
P7orP90.5^1
ddH20 upto20^1
PCR循环参数模板DNA 94*C变性2min后，按94'C ( 20sec ) -58"(3036(;)-72'(:(21111113086<0共进行30个循环，然后72'C再延伸10min， 4'C保存。 2)片段DFGH扩增
以上述PCR产物为模版，P5, P9为引物，以SOE方式连接片段D'和片段FGH。 反应体系如下(20nl):
TaKaRa Ex T叫(5U/pl)0.2nl
10xLA PCR Buffer II (Mg2+free)2pl
MgC12(25mM)"2^1
dNTP Mixture (各25mM)3^1
片段D'0.5nl
片段FGH0.5pl
P50.5nl
P90.5nl
ddH20 upto20^1
PCR循环参数模板DNA 94"变性2min后，按94'C ( 30sec ) -56'。(1111111)-72°(:(41111111036<0共进行30个循环，然后72"再延伸10min， 4'C保存。 4、 PCR产物的电泳鉴定与纯化回收 '
7① 琼脂糖凝胶电泳
取PCR产物5pl， 与1^1 6xloading buffer(0.25% Bromophenol blue,0.25% Xylencyanol,15。/。Ficoll)混匀，1.0%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5pg/ml)电泳，电泳缓冲 液为0.5xTBE (5.5gTris-HCl，2.75g硼酸，2ml0.5MEDTA,加蒸馏水至1L)恒压100V, 卯min后，在凝胶成像系统中观察结果。
② DNA片段的纯化回收
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳之后，切下目的条带，按胶回收试剂盒说明书回收片 段，最后溶于40nlTE, -20'(:保存备用。
实施例2: PCR产物的克隆
① 感受态细胞的制备及转化
采用CaCl2法制备感受态细胞TGl，用于重组质粒的转化，实验操作如下。 将片段BEA的PCR产物用EcoR I 、 Kpn I酶切消化，电泳鉴定切胶回收，融于 30nlTE， -20"保存备用。pUC18经EcoR I 、 Kpn I酶切消化后，再经CIAP去磷酸化， 苯酚/氯仿等抽提后溶于2(HilTE， -20^保存备用。按3: 1的量将目的片段与酶切后的 载体混合，在16'C下用T4 DNA连接酶连接过夜，并转化感受态细胞TG1，通过氨苄 青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆。
② 片段IC、 D的T/A克隆
片段IC、 D各6^1分别与lpl pUCm-T载体混合，在16'C下用T4 DNA连接酶连接 过夜，并转化感受态细胞TGl,通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定 阳性克隆，以构建质粒pUCm-IC、 pUCm-D。
结果显示，利用设计的引物以018菌株基因组DNA为模版，成功地扩增出了特异 性的目的条带，其大小均与预计大小一致。
实施例3:鸡大肠杆菌的1型菌毛操纵子基因表达载体的构建
①pBC的构建
将质粒pBEA与pUCm-IC经Kpnl和BamHl双酶切，电泳鉴定切胶回收，分别溶 于30[UTE， -20'(:保存备用。取回收的pBEA3nl，回收的片段IC8nl，加入T4 DNALigase lpl， T4 DNALigase Buffer 2.5^1，加去离子水至25^U, 16卩连接过夜。取连接产物10-15pl 转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克 隆，构建载体pBC。
② pBD的构建
8将质粒pBC与pUCm-D经BamHl和Sail双酶切，电泳鉴定切胶回收，分别溶于 30tilTE,-2(TC保存备用。取回收的pBC3nl，回收的片段D8nl，加入T4 DNALigase 1^1， T4 DNALigase Buffer 2.5^1，加去离子水至25^1， 16。C连接过夜。取连接产物10-15^1 转化感受态细胞TG1，通过氨苄青霉素抗性和限制性内切酶酶切分析筛选鉴定阳性克 隆，构建载体pBD。
③ pBH的构建(即l型菌毛操纵子基因表达载体构建)
将质粒pBC或pBD与SOE PCR产物片段DFGH经BamHl和Sail双酶切，电泳 鉴定切胶回收目的片段，分别溶于30nlTE， -2(TC保存备用。取回收的pBC3nl，回收的 片段D8pl，加入T4 DNALigase lpl， T4 DNALigase Buffer 2.5^1，加去离子水至25^il， 16°C 连接过夜。取连接产物10-15^1转化感受态细胞TGI，通过氨苄青霉素抗性和限制性内 切酶酶切分析筛选鉴定阳性克隆，构建载体pBH。
④ 重组质粒酶切鉴定
从转化的平板上挑取单个菌落，接种4mlLB (Amp+)液体培养基，37'C， 230rpm 振荡培养过夜，用碱裂解法小提质粒。用25^1体系进行酶切，质粒各6pl， 10xbuffer2.5nl， 限制性内切酶各0.5^1，添加超纯水至25pl， 37'C消化3h后经1.0%琼脂糖电泳鉴定阳性 克隆。
重组质粒pBC、 pBD、 pBH酶切鉴定证实扩增片断正确。
本试验根据国内外已发表的人源大肠杆菌1型菌毛操纵子基因序列和GenBank中 fim基因簇的部分片段序列信息，利用DNAstar和Primer 5.0软件分析设计了九条引物， 利用PCR技术以YR10(O18)菌株基因组DNA为模板，分段扩增出包含fim基因簇的各 片段BEA、 IC、 D、 D，和FGH，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，各PCR产物均与预期大小相 符，并将编码大肠杆菌1型菌毛表达的必需序列的片段BEA、IC和D分别克隆到pUC18 或pUCm-T载体，经酶切鉴定，成功地构建了质粒pBEA、 pUCm-IC禾B pUCm-D。然后 利用相应的限制性内切酶切下pUCm-IC和pUCm-D中的fim基因片段，依次连接到 pBEA中，构建了质粒pBC和pBD，其中pBD编码禽大肠杆菌1型菌毛表达的必需序 列。最后通过SOE PCR将片段D'和FGH连接起来，并克隆到质粒pBC中以构建包含 鸡大肠杆菌l菌毛完整操纵子基因的质粒pBH (所有构建质粒见表l)。
采用PCR方法从基因组DNA直接扩增目的片段并定向克隆到相应的载体中与构建 文库相比更具目的性，避免了盲目而繁琐的筛选工作，可以很快地得到目的基因，继续 下一步工作，节省了大量的时间和精力。
本试验所构建的质粒包含了禽大肠杆菌1型菌毛不同fim基因簇，是研究禽大肠杆 菌1型菌毛fim基因所编码的各亚单位的功能及相互关系的基础。表l鸡大肠杆菌1菌毛基因的质粒PlasmidsRelevant genotype
pBEAfimB+fimE+fimA
pUCm-ICfiml+fimC
pUCm-DfimD
pBCfimB+fimE+fimA+fiml+fimC
pBDfimB+fimE+fimA+fiml+fimC+f皿D
pBHfimB+fimE+fimA+fiml+fimC+fimD+fimF+fimG+fimH
实施例4:禽大肠杆菌1型菌毛表达及亚单位功能探究
1、 感受态细胞的制备与转化
采用CaC12法制备感受态细胞HB101,用于重组转化。具体操作按文献[7]实验步 骤进行。
2、 大肠杆菌1型菌毛的表达
① 大肠杆菌1型菌毛抗血清的制备
② 野生型大肠杆菌1型菌毛的提取
鸡大肠杆菌018， 078， TK3菌株第三代LB培养物经血凝及甘露糖敏感性血凝试 验证实已大量表达1型菌毛后，分别取4000ml培养物于4°C， 3600rpm离心30min，沉淀 悬浮于冰水预冷的100mll0mmol/L Tris-C1(PH7.5),该悬浮液至磁力搅拌器上冰浴搅拌 15min，所得菌液于4'C， 3600rpm离心30min，收获上清，沉淀再同样处理2-3次，收 集上清。向该上清液中加入等量饱和硫酸铵，4'C过夜。于4'C， 14000rpm离心lh，取 沉淀，用2mlPBS洗涤透析过夜，4'C保存备用。
③ 抗血清的制备
常规制备3种提纯的菌毛的菌毛油乳苗。抗菌毛血清用新西兰大白兔制备，每种血 清型用两只，免疫前各采5ml血，析出血清置-2(TC保存。兔子每周注射1次，背部皮 下多点注射，共免疫三次，每次免疫剂量各500吗。末次免疫后IO天从耳静脉采血测琼 扩效价，达l: 64以上后心脏采血，收集血清，置-20'C保存。由于菌毛在18'C不表达， 因此，每种血清型样品取5ml于56'C处理30min后，加入相应血清型的18。C培养的细 菌沉淀，混合物于4'C强烈振荡过夜，离心后去除菌体沉淀，再重复吸收l次，上清于 -20°。保存备用。正常兔血清亦作同样处理。
重组菌毛的表达鉴定 1)阳性质粒转化HB101 (fim-)
10将酶切鉴定的阳性质粒pBEA、 pBC、 pBD和pBH分别转化HB101(fim-)，用氨苄 抗性及酶切鉴定筛选阳性克隆。
2) 重组菌的血凝(HA)及血凝抑制(HI)反应
将鉴定后的HB101(含pBC， pBD或pBH)阳性克隆接种5mlLB (Amp+)培养基， 37°C， 230rpm培养8-10小时，取菌液50^1，与等量的1%鸡红细胞混合，轻轻振荡， 进行玻板凝集反应，观察血凝情况，筛选血凝阳性菌。
取血凝阳性菌菌液50^1，与等量抗血清混合，室温静置5-10min，再加1%鸡 红细胞混匀，观察血凝抑制情况。
3) 重组菌的抗体凝集反应 用菌毛抗血清鉴定重组菌毛的表达情况。将鉴定后的HB101(含pBC， pBD或pBH)
阳性克隆接种5mlLB (Amp+)培养基，37'C， 230rpm培养8-10小时，分别取菌液 与等量的菌毛抗血清混合，通过抗体凝集反应鉴定菌毛的表达。
4) 重组菌的甘露糖敏感性血凝(MSHA)
取HA阳性菌50pl，与等体积含D-甘露糖混合，室温作用10min，再加入5(^1红 细胞混匀，轻轻摇晃玻片3-10min观察结果，以确定甘露糖能否抑制血凝。
5) 细菌与酵母菌的吸附及甘露糖抑制吸附试验
取重组菌HB101(pBH)和TK3各50nl与玻片上，再分别加入50^1酵母菌混匀，轻轻摇 晃玻片3-10min观察结果；
取重组菌HB101(pBH)和TK3各50^1与玻片上，分别加入50nl D-甘露糖混匀，室温静 置5-10min，再分别加入50til酵母菌混匀，轻轻摇晃玻片3-10min观察结果。
6) 显微镜下观察凝集结果
为了更加清楚直观地判断凝集效果，将凝集试验的玻片置于倒置显微镜下观察，并 拍照保存。
7) SDS-PAGE电泳鉴定
将分别含质粒pBEA, pBC, pBD和pBH的重组菌进行SDS-PAGE电泳。按照产品 说明安装电泳装置，制备15%分离胶，5%浓縮胶。将细菌沉淀用PBS悬浮，与2xSDS 加样缓冲液混匀，沸水煮沸5min变性蛋白，10000rpm离心10min，取上清，每孔上样 量10pl。另设YR10(018)、 TK3作为阳性对照，以同样方法处理，同时以小分子量标准 蛋白作分子量对照。先80V, 40min;然后120V， lh。电泳结束后取下凝胶，考马斯兰 R250室温染色2h，用脱色液脱色至背景清晰，拍照保存。
8) 重组菌毛的电镜观察
将重组菌HB101(pBC)、 HB101(pBD)、 HB101(pBH)分别接种于LB(Amp+)， 37°C，200rpm振荡培养过夜，10000rpm离心2min，沉淀用PBS洗涤悬浮。吸取少量菌液滴 于玻板上，将铜网正面向下浮于菌液表面，约10min后取出铜网，用磷钨酸负染5min， 白炽灯下烘干，电镜下观察并拍照保存；阳性对照TK3亦作同样处理。
实施例5:重组表达菌毛油乳剂疫苗制备
将纯化的重组菌毛作为抗原液，抗原液与吐温-80按体积比94 : 6混匀作为水相， 司本-80与10号白油按体积比6 : 94加热溶解作为油相。油相水相按体积比3 : 1的 比例乳化。乳化时，先加入油相，低速搅拌，缓慢加入水相后，再高速乳化2min，置4°。 备用。疫苗中最后的重组蛋白含量为400iag/ml。
实施例6:免疫试验
将3周龄健康罗曼小公鸡分成4组，第1组和第2组每雏分别皮下注射0.5ml的018 天然菌毛疫苗和重组菌毛疫苗；第3组不免疫作为攻毒对照；和第4组不免疫也不攻毒 作为阴性对照组。各组隔离饲养至7周龄。分别用同源菌株018经后胸气囊攻毒，每只 鸡的剂量是4.3X1()SCFU。持续观察一周，记录发病死亡情况。对死亡的和未死亡的鸡 均予解剖，观察气囊、肝脏和心包的病变，根据病变程度打等级分，并作记录、统计。 实验结果见表2。
表2鸡大肠杆菌重组与野生1型菌毛疫苗免疫保护试验结果
组免疫处理攻毒攻毒剂量死亡率(％)病理变化
别菌株(CFU/只)肝脏心包气囊
1野生菌毛苗0184.5 X10813 (2/15)0.8660.7330.933
2重组菌毛苗0184.5 X10813 (2/15)0.9330.8660細
3不免疫0184.5 X10893 (14/15)3.6663.5333.400
4不免疫/00/12000
注病变结果判定标准
0=无病变；1=轻度气囊炎、心包炎、性肝炎；2=中度气囊炎、心包炎、肝炎；3=两侧性气囊炎、 广泛心包炎、肝炎；4=严重广泛性纤维性气囊炎、心包炎、肝炎。
从试验结果看，重组表达菌毛与天然菌毛在免疫攻毒保护衰及病理表现方面均无明 显差异，保护率均在90%以上。
权利要求
1、一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其特征在于所述菌株导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因重组质粒。
2、 根据权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其特征在于所述 的菌株为TG1或HB101(finO。
3、 权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特征在 于它包括如下步骤(1) 鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；(2) 能够呈现表达1型菌毛的重组质粒的构建。
4、 根据权利要求3所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特 征在于步骤(1)所述的鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤(a) 引物的设计与合成；(b) 染色体的提取；(c) 鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的分段扩增、连接、转化与表达。
5、 根据权利要求3所述的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌的构建方法，其特 征在于步骤(2)中所使用的质粒为pUC18或pUCm-T。
6、 表达鸡大肠杆菌l型菌毛蛋白重组菌，在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。
7、 一种鸡大肠杆菌1型菌毛基因工程疫苗，其特征在于它是通过如下方法制得 将表达鸡大肠杆菌l型菌毛蛋白重组菌的表达菌毛产物与吐温-80按体积比94 : 6混匀 作为水相，司本-80与10号白油按体积比6:94加热溶解作为油相，油相与水相按体积 比3:1的比例乳化。
全文摘要
本发明公开了一种表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌及其构建方法与应用。该菌株导入了鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因重组质粒，通过如下步骤构建1.鸡大肠杆菌1型菌毛结构基因及各功能性基因的PCR扩增；2.重组质粒的构建。此外，本发明还公开了一种鸡大肠杆菌重组菌毛基因工程疫苗。本发明的表达鸡大肠杆菌1型菌毛蛋白重组菌，其表达产物为菌毛突起形态，具有良好的免疫原性，且其培养表达的产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。
文档编号A61P31/00GK101434928SQ20081001976
公开日2009年5月20日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者张志成, 张玉红, 戴鼎震, 方光远, 王国相, 甘黎明, 蒋加进, 陈钟鸣 申请人:金陵科技学院