专利名称：：用于杀灭爱滋病病毒和精子的阴道栓剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种外用药，尤其是用于杀灭爱滋病病毒和精子的阴道栓剂，属医药
技术领域：
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背景技术：
：生殖道感染、避孕套接受率不理想和未婚先孕等现象，严重地影响广大民众的生殖健康和社会安定。目前市场上销售的如含氯消毒剂、臭氧、过氧乙酸及过氧化氢等消毒能力较强的洗液及阴道栓剂，以及含单链季铵盐和草本类低效消毒剂，在人类生殖健康方面起了积极的作用。至于计划生育的避孕产品市场上成型的产品主要集中于以下几方面1、阻断妊娠通路避孕法如各种男用避孕套，阴道隔膜、子宫颈帽及女性避孕套等；2、给予激素类药物避孕法包括各种长效和短效的避孕药，其中女用激素类药物中短效口服避孕药应用最为广泛，长效避孕针及皮下埋植剂应用也愈来愈广泛，此外，还有阴道环等产品，男用激素避孕的研究十分活跃，但应用于临床尚需时日；3、排卵后生育调节法避孕这方面宫内节育器最为突出，中国夫妇所用避孕方法中40%是使用宫内节育器，避孕疫苗也是目前国际上避孕技术的重要研究领域；4、杀精避孕法通常为膏、胶冻、泡沫、栓剂及药膜等型式。随着科学的发展，市场上出现了一些兼具防治生殖道感染外用避孕产品。如国内的"三合一"康乐安全剂、女性用多功能栓剂和"得尔乐"多功能消炎避孕保健液。国外的有加利佛尼亚大学的Zaneveld等教授开发的高分子材料，用于该类产品的研制，以及，Myhling教授利用一种化合物作为杀精子及抗感染的成分，从事多功能产品的研究。但是存在精子杀伤率不够理想，而且会杀灭阴道内的的正常细菌，引起菌群失调症。针对以上问题，专利公告号CN1415307A消避灵阴道栓公开了一种兼具消毒与避孕为一体的栓剂，克服了上述缺陷，男女房事前使用一粒，既无性病传播，又不会怀孕。特别对广为传播的淋病、霉病等生殖道感染的病原体有良好的杀菌效果，而且能达到避孕效果。爱滋病相关病毒从上世纪八十年代开始引起人们的重视。1981年美国疾病控制中心(CDC)不断收到有关kaposi肉瘤的病例报告，由于新发现的病例与以往有所不同，死亡率高，而且发病率呈快速上升趋势，弓I起了CDC的高度重视，1982年9月，CDC正式提出了获得性免疫缺陷综合症(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS或爱滋病)的概念，随后的调査研究证明这是一种新的传染病。1986年，国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)将LAV/HTLV-III/ARV病毒统一命名为人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)，又称爱滋病毒。由HIV感染而引起的疾病称为爱滋病，该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+细胞数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的关注。近年HIV在亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者，至今已有6080万人发生了感染。国务院防治艾滋病工作委员会办公室、联合国艾滋病中国专题组2008年4月在北京发布了2007年《中国艾滋病防治联合评估报告》。《评估报告》估计我国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万。专家估计，如果不迅速采取有效的预防措施，按目前的年平均30%的增长速度，到2010年，我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家，HIV的感染率达总人口30%以上。因此，预防和治疗爱滋病，己不仅仅是挽救个人生命的问题，而是关系到民族存亡的大事。人和无症状HIV携带者为主要传染源。其传播途径1、性接触传播，目前男女之间异性传播已成为HIV传播的主要方式，而女性对HIV的易感性比男性高4倍；2、通过输血或血制品传播，主要为被HIV污染的注射用具、血液及血液制品；3、母婴传播，包括宫内、分娩过程及产后等。经性传播成为我国艾滋病传播主要途径《评估报告》还显示，在历年报告病例中，经异性性传播和男男性传播的百分比构成呈现逐年上升趋势。男男性传播已从2005年的0.4%上升到2007年的3.3%，异性性传播已从2005年的10.7%上升到2007年的37.9%。总体上，我国估计的现存70万艾滋病病毒感染者和病人中，经性传播感染艾滋病的超过50%。HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(lentivirus)，目前已发现两种HIV，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部，在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到。其毒力和传播力都低于HIV-1，引起的爱滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。因HIV为逆转录病毒，而逆转录酶缺乏校正修复功能，因而HIV的变异频率非常高，每一轮复制都会引入约10个碱基的错误。高的变异频率使世界不同地区甚至同一感染个体不同时期HIV的基因组都有较大差异。HIV主要侵犯人体的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸附、侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。HIV的致病机理在HIV感染人体的初期会有病毒血症的出现，并有轻度的发热及淋巴结肿大等症状，随后病毒血症大幅降低至难以检测的水平，抗核心蛋白及包膜蛋白的抗体陆续出现，病程进入无症状带毒期，即潜伏感染期(latentinfection)，病毒可潜伏存在长达数年甚至十多年，其潜伏机制目前尚不清楚。在某些因素的作用下，病毒大量复制，机体再次出现病毒血症并出现爱滋病症状，体内大量的辅助性T细胞被病毒破坏，造成机体细胞及体液免疫功能降低，无法抵御外界病原微生物的侵袭而发生免疫缺陷综合症。有关HIV的致病机理，目前还不十分清楚，一般认为，8^感染004+T细胞后，病毒通过基因组整合，以前病毒形式存在于CD4+细胞，在感染的早期，通过Thl细胞分泌细胞因子IL-2等，在IL-2刺激下CD8+T淋巴细胞对CD4+细胞产生强大的免疫抑制作用，从而使病毒处于被抑制的潜伏状态。在感染的晚期，Th2细胞的分泌占优势，通过分泌IL-10等细胞因子，使CD8+T细胞失去对CD4+细胞的抑制，病毒增殖并释放出新的病毒颗粒去感染更多CD4+细胞，从而造成004+细胞的大量死亡，最后耗竭而失去其免疫功能。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于杀灭爱滋病病毒和精子的阴道栓剂。该阴道栓用于杀灭爱滋病病毒和精子，以壬苯醇醚(NP-9)和聚维酮碘(PVP-I)两种主要药物的复方制剂，辅以适量的聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸等，其中，壬苯醇醚1一3%、聚烯酮碘3—5%、其他为聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸等适量制成的栓剂。其中，壬苯醇醚l、1.5、2、2.5、3%和聚烯酮碘3、3.5、4、4.5、5%之一。在上述方案基础上，所述栓剂中壬苯醇醚与聚维酮碘的剂量比为l:2。杀灭爱滋病毒的使用剂量为壬苯醇醚64mg/粒，聚维酮碘128mg/粒。本发明提供了所述药物在杀灭爱滋病病毒和杀死人精子方面的用途。效果显著。具体实施方式实施例1消避灵阴道栓用于杀灭爱滋病病毒。消避灵阴道栓，各成份重量百分含量为壬苯醇醚1一3%、聚烯酮碘3~57。、其他为聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸制成的栓剂。材料和方法一、测定药物和化合物待测样品本发明消避灵阴道栓，阳性对照化合物次氯酸钠购自昆明恒信力邦经贸有限公司。二、试剂和溶液1、试剂HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N'-(2-ethanesufonicadd)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte什azoliumbromide)、DMF(N，N'-Dimethylformamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(S什eptomycinsulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自Sigma公司；2—巯基乙醇(2-ME,2-Mercaptoethanol)为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。2、培养基RPM卜1640完全培养基，含有10%新生小牛血清，2mML-谷氨酰胺，10mMHEPES，50ixM2-巯基乙醇，100，OOOIU青霉素，100|jg/mL链霉素。三、细胞和病毒人T淋巴细胞系C8166与HIV-1实验株HIV-1加均由英国MedicalResearchCouncil,ADSReagentProject惠赠。所有细胞和病毒均以含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-lniB，滴定并计算出病毒的TCIDso。病毒贮存液分装后，置-70'C保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。四、HIV-1感染性滴定HIV-1fflB按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6L。每孔加入C8166细胞50)jl(4xl05/mL)，每孔终体积为200|jL。37°C，5%0)2培养。第三天补加新鲜RPMI-1640完全培养基lOOpL，第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(CytopathJcEffect,CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID5o(50%TissueCultureInfectionDose)。五、消避灵阴道栓对C8166细胞的毒性试验4X105/mLC8166细胞悬液lOOuL与不同的待测药物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含药物的对照孔，37°C，5%。02培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CCso值(50%CytotoxicConcentration),即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时药物浓度。六、消避灵阴道栓的直接杀病毒作用将不同稀释度的药物100uL与100uLHIV上清混合，同时设置阳性药物次氯酸钠、阴性对照及阳性对照孔，室温孵育5min、10min、30min和60min，吸1uL上述混合液到已加好4X104/孔的C8166细胞的96孔板中。37°C，5%002培养三天，倒置显微镜下(100x)计数合胞体个数。计算ECso值(50%EffectiveConcen什ation)即抑制合胞体形成50%时的药物浓度。七、计算公式根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出药物抑制病毒的50X有效浓度(EC5C))，50%抑制细胞生长浓度(CC50)1、细胞生长存活率(^)-实验孔OD值/对照孔OD值X1002、HIV-1致细胞病变的抑制率(％)=(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)X100结果一、消避灵阴道栓对人T淋巴细胞系C8166细胞的毒性作用见表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>消避灵阴道栓(A)和次氯酸钠(B)对C8166细胞的毒性作用，其中，CC50(消避灵)0.025%;CC50(次氯酸钠)0.040%。二、消避灵阴道栓直接杀病毒作用实验数据，见表2。不同时间和浓度的消避灵阴道栓和次氯酸钠作用HIV-lmB后诱导C8166细胞病变作用，其中，5秒、10秒、30秒和60秒计，抑制合胞体形成50%时的药物浓度时分别为ECso(消避灵5，)0.15%，EC50(消避灵10，):0.147%，EC50(消避灵30，)0.156%，ECso(消避灵60，)0.171%,EC5o(次氯酸钠5，)0.072%，EC50(次氯酸钠10，)0.113%，EC50(次氯酸钠30，):0.056%，ECso(次氯酸钠60'):0.035%。表3为本发明消避灵阴道栓细胞毒性和直接杀病毒活性结果汇总表。表3"消避灵"阴道栓细胞毒性和直接杀病毒活性结果汇总表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结论消避灵阴道栓对C8166细胞的毒性大，CCso为O.025消避灵阴道栓有直接杀HIV病毒的作用，作用5、10、30、60分钟下的ECso分别为0.15X、0.147%、0.156%、0.171%。消避灵阴道栓在0.4%浓度下，与HIV孵育30分钟可完全杀死病毒，抑制率达100%。表2."消避灵"阴道栓直接杀病毒作用实验数据<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例2本发明消避灵阴道栓用于灭杀精子一、供试品1、名称消避灵阴道栓2、供试品号P2006-10;3、性状栓剂；4、提供单位上海明月光生物科技发展有限公司5、批号200608086、含量共12组，壬苯醇醚(NP-9)、聚烯酮碘(PVP-1)其含量分别为实验1组NP-9(100mg/粒)+PVP--I〈20.0mg/粒〉实验2组NP-9(80mg/粒)+PVP-I〈20.0mg/粒〉实验3组NP-9(64mg/粒)+PVP-I〈20.0mg/粒〉实验4组NP國9(100mg/粒)+PVP-I〈16.0mg/粒〉实验5组NP-9(80mg/粒)+PVP--I〈16.0mg/粒〉实验6组NP-9(64mg/粒)+PVP--I〈16.0mg/粒〉实验7组NP-9(100mg/粒)+PVP--I〈12.8mg/粒〉实验8组NP-9(80mg/粒)+PVP--I〈12.8mg/粒〉实验9组NP-9(100mg/粒)+PVP--I〈12.8mg/粒〉主药1组NP-9(100mg/粒)+PVP--I〈0mg/粒〉主药2组NP-9(0mg/粒)+PVP--I〈20.0mg/粒〉赋形剂组NP画9(0mg/粒)+PVP-I〈0mg/粒〉;7、保存条件干燥、室温保存二、剂量设置1、设置依据依据委托单位提供的供试品NP-9分别为100、80和64mg/kg;PVP-I分别为20、16和12.8mg/kg;交叉为9组，另设NP-9100mg/kg组(主药1组)、PVP-I20mg/kg组(主药2组)、赋形剂组、阳性对照组0.25mg/ml和阴性对照组(生理盐水)。2、剂量，见表4消避灵阴道栓体外杀精子试验剂量表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>三、实验试剂和配制1、精子稀释液取NaCOB3g,甲醛lml，加蒸馏水水100ml配制而成备用；2、精子营养液(Tyrode液)称取NaCI4.0g，KCI0.10g，CaCI20.10g，MgCI2*6H2〇Q.05g，NaH2P〇4'2H2〇Q.025g，NaHC〇30.50、，Glucose0.50g，用二次蒸馏水分次溶解，配至l000ml，溶液配好后密闭，置4'C冰箱保存，实验前一天配好，备用；3、待测药物的配制方法将各种不同配伍的消避灵阴道栓放置于37'C水浴箱中使之自溶，待用。四、观察指标1、精子活力及活率(1)直线运动速度(VSL，iim/s):精子头的起始位置与另一位置间画一条直线，单位时间内通过这一直线的距离；(2)曲线运动速度(VCL，um/s):单位时间内精子实际运动轨迹的线性距离；(3)平均路径速度(VAP，ixm/s):精子沿其平均路径运动的速度；(4)精子头侧摆幅度(ALH，urn):精子头运动的实际轨迹偏离平均路径的幅度；(5)鞭打频率(BCF，HZ):精子头实际运动轨迹跨越其平均路径轨迹的平均次数；(6)直线性(LIN，％):表示曲线轨迹的直线性(VSL/VCL);(7)前向性(STR，％):表示平均路径的前向性(VSL/VAP);(8)平匀移动角度(MAD):精于曲线运动轨迹的平均角度变化；(9)精子活率(Motile,%):活动精子占所有精子的百分率。其中，VCL、VAP和BCF是表示精子运动活力(速度)的参数，L1N、STR和ALH是表示精子运动方式的参数。2、以全部精子失活为终点，测出药物在20秒至3分钟内的最低有效杀精子浓度。五、试验方法1、人精子数计数选择健康育龄男性，禁欲7天后手淫法收集新鲜精液，其中要求精子活率》60%，前向运动精子》70%,畸形精子率《20%，液化时间《30min，精子计数应在60-150X106ml，共3例。符合条件后吸取0.lml加入装有1.9ml精子稀释液的小试管中，混匀，静置3分种，取一滴于计数板中，高倍镜(40X)下计娄(方法:4小格精子数X4X稀释倍数<20倍>X104)，根据计数所测得的密度，加Tyrode液将精液稀释到107ml，置37。C水浴中待用。2、杀精实验将各组不同本伍的消避灵阴道栓溶液(lml熔解液+2ml生理盐水)、阳性对照组和阴性对照组各lml分装于Eppendorf管并置于37。C水浴中保温待用，对人精液进行体外杀精试验。参照Sander-Cramer法，取上述选定精液0.2ml加入上述不同计量的消避灵、阳性对照、阴性对照组溶液中，立即置震荡器上混匀5秒种，迅速取一滴于载玻片上，室温(22°C)下观察10个高倍镜(40X)，以全部精子失活为终点，测出药物在20秒-30分钟内的最低杀精浓度，最后确定出消避灵中NP-9和PVP-1的最佳配伍。3、精子活力及活率检测每组分别加入等体积于精悬液的生理盐水，主药2和赋形剂溶液(lml消避灵熔解液+2ml生理盐水)，混匀后，保存于隔水式恒温培养箱中，分别于20秒、40秒、1分钟和3分钟内借助伟力彩色精子质量分析仪进行录像分析，其分析过程为吸取5Ul精子悬液至预温的血球计数板样品槽中(深度100um)，将血球计数板置于37。C的显微镜载物台上，摄像机和录像机记录精子运动图象，于iox物镜下分析精子的运动轨迹。每个样品分析10-12个视野，每个视野10-15s，共记录200个精子。六、统计分析精子活力及活率数据处理先进行ANOVA分析，然后采用student-t检验比较两组间的差异；而杀精作用计算出各组不同配伍的消避灵在20秒-3分钟内杀灭所有精子的需药物的最低浓度平均值，所得数据t检验进行组间比较。七、结果1、杀精实验实验1-9组、主药l组和阳性对照组均在20秒内杀灭所有精子；2、精子活力及活率检测与阴性对照组相比，主药2组于20秒、40秒和1分钟时，MOT均明显低于阴性对照组，有极显著性差异((P〈0.01)，且1分钟时BCF也低于阴性对照组，有显著性差异(P<0.05)，而赋形剂组于20秒和40秒时MOT低于阴性对照组，有显著性差异(P〈0.05);与赋形剂组相比，主药2组于40秒和lmin时，MOT明显低于赋形剂组，有极显著性差异(P<0.01)，而3min时，MOT也低于赋形剂组，有显著性差异(P<0.05)。根据重复测量方差分析结果显示，各组的VCL指标均随时间变化；但时间与组别无交互作用，说明三组间的时间效应相同。各组的VSL指标不随时间变化；且时间与组别无交互作用。各组的M0T指标均随时间变化；且时间与组别间存在交互作用(P〈0.05)，说明三组间的时间效应有所不同。各组的VAP指标不随时间变化；且时间与组别无交互作用。见表5、消避灵阴道栓剂对精子的作用(x±SD)结论消避灵阴道栓实验1-9组(NP-9〈64-100mg/粒〉+PVP-I〈12.8-20.0mg/粒〉)和主药l组(NP-9〈100mg/粒〉+PVP-I〈0mg/粒〉)均能在20秒内杀灭精子，与阳性对照组(NP-90.05mg/ml)效果相当；而主药2组与赋形剂组与阴性对照组(生理盐水)相比，也能部分抑制精子的活动，增加精子的死亡率。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1、一种阴道栓剂组合物，以壬苯醇醚(NP-9)和聚维酮碘(PVP-I)两种主要药物的复方制剂，辅以适量的聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸，其中，各组份按重量百分比计壬苯醇醚1—3％、聚烯酮碘3—5％、其他为聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸等适量制成的栓剂。2、根据权利要求1所述的阴道栓组合物，其特征在于所述壬苯醇醚与聚维酮碘的剂量比为1:2。3、针对权利要求1或2所述的阴道栓组合物的剂型，为栓剂。4、针对权利要求1或2所述的阴道栓组合物的用途，用于杀灭爱滋病病毒和杀精子。5、针对权利要求1或2所述的消避灵阴道栓组合物的使用方法，直接塞入阴道。全文摘要本发明用于杀灭爱滋病病毒和精子的阴道栓剂涉及一种外用药物，属医药
技术领域：
。一种阴道栓剂组合物，以壬苯醇醚(NP-9)和聚维酮碘(PVP-I)两种主要药物的复方制剂，辅以适量的聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸，其中，各组份按重量百分比计壬苯醇醚1-3％、聚烯酮碘3-5％、其他为聚乙二醇、碳酸氢钠和无水柠檬酸等适量制成的栓剂。所述阴道栓组合物的剂型为栓剂。用于杀灭爱滋病病毒和杀精子效果显著。文档编号A61P15/00GK101361707SQ20081003723公开日2009年2月11日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者孙祖越申请人:孙祖越