专利名称：一类活性化合物在杀灭日本血吸虫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域。更具体地涉及一类活性化合物在杀灭日本血吸虫中的应用。
背景技术：
化疗是控制血吸虫病患病率的重要措施之一。自高效低毒的抗血吸虫药物吡喹酮广泛应用以来，血吸虫病的化疗有了突破性进展，实施周期性群体化疗已成为血吸虫病控制的重要手段。然而，目前对五种感染人体的血吸虫均有效的药物仅吡喹酮一种，长期反复使用同一化学药物控制寄生虫感染，有可能导致抗药性的产生。此外，吡喹酮是一个对血吸虫成虫有效而对童虫无效的治疗药物，虽可降低人群的感染率，但不能防止重复感染。WHO/TDR于2002年提出要发展一个治疗血吸虫病(抗血吸虫成虫)的新药，而且最好是既具有杀灭成虫又有杀童虫的效果的新药。
目前，虽然国内外已有部分实验室开始进行抗血吸虫新药的研究，但尚无理想的二线侯选药物的报道。专家认为抗日本血吸虫新药的研究需要技术创新，新的药物靶点的发掘将有助于抗日本血吸虫新药的开发。
adenine nucleotide transporter(ANT)又被称作ADP/ATP carrier(AAC)，它属于线粒体载体家族，由核基因编码，在胞浆中合成，然后运输到线粒体内膜。ANT的分子量为32kDa，其主要序列大约有300左右个氨基酸残基，组成3个重复的结构域，每个结构域都有两个跨膜螺旋，螺旋间的亲水肽链突出到线粒体基质内，而相邻结构域两个跨膜螺旋间的亲水肽链突出到内膜的胞浆侧。牛ANT的晶体结构显示，六个跨膜螺旋的轴向均与膜的垂直方向相交形成一定角度，且螺旋间也相互倾斜，它们共同形成了一个桶状结构；桶状结构的中心是一个圆锥体样的深坑，形成了ADP的结合位点，向外敞开。ANT的抑制剂carboxyatractyloside(羧基苍术苷，简称CATR)就竞争性结合在桶状结构的底部，从而抑制ADP/ATP的交换。
ANT是一个具有双重功能的蛋白质，不仅对线粒体正常功能的维持有重要作用，而且能在一些相关蛋白质的作用下诱导凋亡的发生。它参与ADP/ATP的交换，还参与PTP的形成，与细胞调亡有关。
因此，本领域迫切需要提供将ANT作为靶点的一类化合物，从而预防或治疗日本血吸虫感染。
发明内容
本发明旨在提供一类可预防或治疗日本血吸虫感染的化合物和其类似物。
本发明提供了一种如式I所示化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
其中，R1、R3、R4是氢键受体基团；R2是脂肪烃基团。
在另一优选例中，R1＝选自氢或羟基，R2选自氢、乙基或环丙基，R3选自氢、羟基或羟甲基，R4选自氢或羟基。
在另一优选例中，R3选自羟基或羟甲基。
在另一优选例中，所述的化合物特异性与SjANT结合。
在另一优选例中，所述的化合物如式IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII或XIII所示
在另一优选例中，所述的组合物中含有如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种如式II的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
本发明还提供了一种如式III的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
据此，本发明提供了将ANT作为靶点的一类化合物，从而预防或治疗日本血吸虫感染。
图1显示了合理的ANT序列联配结果。
图2是有关ANT的Ramachandran图。
图3是ANT模建结构。
图4是利用模建ANT靶标蛋白结构进行化合物虚拟筛选的流程图。
图5显示了使用式IV化合物(B22)后雌虫情况。
图6显示了使用式IV化合物(B22)后雄虫情况。
图7显示了使用式IV化合物(B22)后虫体死亡情况。
具体实施例方式 发明人经过广泛深入的研究，发现以腺苷酸转运蛋白(ANT)为靶点，以SjANT蛋白序列为提问序列，对蛋白库进行搜索，选取模板进行结构模建；通过序列联配、结构评价获得合理的靶标蛋白结构；再根据这个靶标蛋白结构进行高通量的化合物虚拟筛选，通过体外试验和结构优化，获得了一系列可以有效预防或治疗日本血吸虫感染的化合物。
本发明提供的化合物可以有效地作用于腺苷酸转运蛋白(ANT)，引起日本血吸虫的死亡。
本发明提供的化合物如式I所示
其中， R1、R3是氢键受体基团；R2是脂肪烃基团；R4是氢键受体基团。
较佳地，所述的化合物中R1选自氢、C1-4的烷基、氧、或硫；R3选自氢、氧、或C1-4的烷氧基；R4是脂肪烃基团；R2选自氢、C1-4的烷基、C1-8的环烷基。
更佳地，所述的化合物中R4选自氢、氧、或硫。
最佳地，所述化合物如式IV-XIII所示
本发明提供的具有上述功能的化合物还包括如式II或式III所示的
本发明提供的如式I所示的化合物、如式II或III所示的化合物或其药学上可接受的盐或水合物可以特异性地与SjANT结合，有效抑制SjANT与其底物(ADP)的结合，具有较明显的抑制日本血吸虫感染的保护活性，具有用于治疗和/或预防日本血吸虫感染的用途。
本发明提供的用于筛选治疗和/或预防日本血吸虫感染药物的药物作用靶标是在日本血吸虫细胞生理活动中起关键作用的、具有双重功能的蛋白SjANT，SjANT的氨基酸序列为如下(如图5所示) MGEGGKEIKGLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQNQDEMIKQGRLDKPYTGVIDCTMRTFRHEGILPFWRGNLPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAFKQNKDDPYLVSFYKNVVSGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLANDNKSAKKGGTREFNGLIDVYAKTFKSDGIVGLYRGFVISCFGIIVYRGFYFGLYDTLKPIFLGPDAGVAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRRRMMMTSGQAVKYKSSIHCAAQIMKNEGPMSFMKGAGANILRGVAGAGVLAGFDKFKELYADFRLPKKPTP* 在本发明的一个优选例中，本发明提供的化合物是将在SjANT/ADP三维复合物结构中，SjANT和ADP相互作用的SjANT蛋白功能区域作为药物作用靶标筛选获得的，所述的功能区域选自以下的一个或多个 10 GLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQN 81 LPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAF 113 YLVSFYKNVVSGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLAN 183 FVISCFGIIVYRGFYFGLYDTL 215 VAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRRRMM 276 AGANILRGVAGAGVLAGFD； 较佳地，所述的靶标是在SjANT和ADP相互作用的活性位点，所述的活性位点由SjANT氨基酸序列中的下述氨基酸构成ALA24，ALA27，LYS28，ALA31，ALA32，GLU35，LYS38，LEU39，PRO82，ASN83，ARG86，TYR87，THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VAL101，LYS102，SER123，GLY124，ALA127，GLY128，SER131，LEU132，VAL135，LEU138，ASP139，ARG142，SER186，GLY189，ILE190，TYR193，ARG194，TYR197，PHE198，TYR223，THR226，VAL227，GLY230，LEU231，SER233，TYR234，ILE236，ASP237，ARG240，ARG241，ALA276，ASN279，ILE280，ARG282，GLY283，VAL284，GLY286，ALA287，和LEU290。
如本文所用，“药学上可接受的盐”具体地可列举与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐，或与有机碱形成的盐，如甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸盐，或与甲酸、乙酸，苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐。
本发明是试验发现，如式I的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，如式II或III所示的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，都可以有效地抑制SjANT与其底物(ADP)的结合，具有较明显的抑制日本血吸虫感染的保护活性，具有用于治疗和/或预防日本血吸虫感染的用途。
在本发明中，所述的可用于治疗和/或预防日本血吸虫感染的组合物是药物组合物，其中包括治疗和/或预防日本血吸虫感染的有效量的至少一种有效成分以及至少一种药学上可接受的载体。所述的有效成分选自如式I所述的化合物或其药学上可接受的盐或水合物、如式II或III所示的化合物或其药学上可接受的盐或水合物。
所述的药学上可接受的载体指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明还涉及这种药物组合物在制备治疗和/或预防日本血吸虫感染的药物上的新用途。
所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式之一施用口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中预防日本血吸虫感染时优选口服或肌肉注射，治疗日本血吸虫感染时优选腹膜内或静脉内给药方式。
还需要指出的是，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物活性强度、服用、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。建议剂量如为开始每日5-10mg/kg，维持量为每日2-4mg/kg。胶囊剂为0.1-0.5g/粒；注射液为0.1-0.5g/5ml；口服溶液为2-10g/50ml。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于获得了可能与ANT有效结合，并能杀死日本血吸虫的化合物。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 SjANT分子模拟及虚拟筛选 以SjANT蛋白序列(UniProt ACQ5DFR4)为提问序列，用BLASTP对PDB蛋白库进行搜索。按照同源性的高低及蛋白的性质，选取了ADT1_BOVIN(PDBID为10KC)为模板进行结构模建。目标蛋白和模板蛋白的序列一致性为53％，表明模建具有很大的可靠性。
先利用InsightII(Version 2000)/Homology模块中的多重联配的方法进行序列联配，然后经过手动调节得到合理的序列联配(图1)，在联配的基础上，采用InsightII/Homology中的模块进行结构的构建。
对于得到的结构，采用PROCHECK进行评价，主要是评价键长、键角和二面角是否合理，其结果以Ramachandran图(图2)的形式给出。结果显示模板晶体结构与模建结构的指标相近，说明模建结构合理，最终模型如图3所示。
获得比较合理的靶标蛋白结构以后，就可以进行虚拟筛选。我们对包括39万多个小分子的SPECS化合物库进行了虚拟筛选。虚拟筛选流程如图4。
首先采用
Glide对SPECS化合物库进行了第一轮筛选。我们从SjANT模建结构出发，蛋白结合位点质心由模板结构中配体的质心来定义，网格边界尺寸选择为20A，这样产生的空间网格将包含结合位点，对接打分方法为SP，保留能量打分最好的10,000个分子进入第二轮筛选。
第二轮筛选使用Glide的MMGBSA打分进行评价。MMGBSA打分是在原有对接构象的基础上，对结合能力更准确的评价参数，它综合了考虑了原子间相互作用能和水分子的溶剂效应。通过这轮筛选后，有653个小分子进入下一轮。
第三轮筛选中，我们将小分子与来源于人的ANT蛋白模型进行对接，将小分子与人ANT蛋白(来源于Swiss Model)对接构象的MMGBSA打分与第二轮所得的MMGBSA打分进行比较，选择打分差异负于-10kJ/mol的结构作为虚拟筛选的最终结果。这样的筛选策略，有助于提高潜在活性化合物的选择性，而同时减少毒副作用。这一轮筛选得到122个化合物。
采用Glide对衍生物进行对接，引入的羟基与口袋氨基酸形成了更多的氢键，引入的脂肪烃基团与受体形成了更多的疏水相互作用对。与式IV化合物相比，部分化合物预测结合自由能(MMGBSA Energy)有所降低，达到了提高活性的目的；其他化合物的预测结合自由能与式IV化合物相差不多。
最后采用QikProp程序计算衍生物的水溶性、脂溶性，计算结果与式IV相近，表明衍生物具有与式IV化合物相似的吸收、分布性质
实施例2 抗日本血吸虫活性化合物体外筛选 实验材料和方法 1.寄生虫 日本血吸虫尾蚴(安徽株)，购自中国CDC寄生虫病预防控制中心 2.宿主 昆明鼠，体重在18-22g之间，购自上海动物中心。
3.动物的接种与虫体的收集 接种采用腹部感染的方法。将小鼠用橡皮筋固定于木板上，然后用电梯刀将其腹部毛剔净。每只鼠感染80-100头尾蚴。
收虫经尾蚴感染32-38天的小鼠采用剪断颈动脉放血的方法处死，然后利用冰冷的加有肝素的生理盐水经胸主动脉灌注，收集成虫。
4.药物的配置 将如式II、III、和IV的受试的化合物样品，均采用DMSO于37℃溶解，配制成原药液，备用；药物要现用现配。
5.成虫的体外培养 将pH为7.2-7.4间的衡氏盐平衡液配制成含20％热灭活的小牛血清，300iu/ml青霉素，300ug/ml链霉素以及0.25ug/mL两性霉素的培养基。在24孔培养板中加入现配的培养基，按2mL/孔，然后，将充分洗净的合抱虫体置入培养板，每孔两对虫。将板置于含5％CO2，37℃培养箱中培养。培养30分钟，待虫体稳定后，将受测化合物按不同的浓度梯度加入培养板的孔中。加药前要从培养基中吸取出相应的的加药体积，以确保每孔的终体积为2mL。每块板均需设置空白对照，包括纯培养基空白对照以及用药组最大剂量的DMSO对照。
6.药效观察 分别在加药后4，12，24，48，72小时，于倒置显微镜下观察虫体的活动能力以及形态生理结构上的变化。
实验结果 经体外72小时连续用药培养发现，受试的96种化合物中，大部分化合物对虫体的生存以及生理形态并无显著影响，而其中三个，其代号分别A03、A05和B22，其结构如图1所示，效果明显，杀虫效果具有明显的剂量依赖性，其体外杀虫效果如表1所示。
表1化合物II、III和IV的杀虫效果
注+++表示虫体生长形态良好，活动能力最佳 ++表示虫体表而有少量空泡，活动被抑制 +表示虫表有大量空泡、破损严重，雌虫尾部肿胀，虫体挛缩 +/-虫体偶有摆动，吸盘扔有活动，体表空泡破损严重， -虫体在两分钟内不动，死亡 对于上述三个化合物，在加药后的4h内，虫体不论是在形态结构还是活动能力上均与对照组的相差无几。而在4-24h内，用药组的虫体的体表首先出现变化，主要表现为有细小空泡出现，且其活动能力减弱，活动僵直，不能灵活自如。作用明显的药物在4-24h的时间段内虫体表面出现大面积的空泡以及严重的皮损，此时的雄虫往往表现为收缩，局部肿胀等，而相对于雄虫，雌虫的变化不太明显，一般表现为活动能力减弱，卵黄腺浑浊以及身体的局部肿胀等。24h以后，体表已发生变化损伤的虫体，其受损程度进一步加剧，到48h时，大剂量组虫体已经死亡。直至72h，虫体在观察的两分钟内无活动，基本都死亡。
实施例3 抗日本血吸虫活性化合物体外筛选 用式V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII的化合物重复实施例2的试验，具有类似的结果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种如式I所示化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，其特征在于，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
其中，R1、R3、R4是氢键受体基团；R2是脂肪烃基团。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R1＝选自氢或羟基，R2选自氢、乙基或环丙基，R3选自氢、羟基或羟甲基，R4选自氢或羟基。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R3选自羟基或羟甲基。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物特异性与SjANT结合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物如式IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII或XIII所示
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物中含有如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐或水合物和药学上可接受的载体。
7.一种如式II的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，其特征在于，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
8.一种如式III的化合物或其药学上可接受的盐或水合物的用途，其特征在于，被用于制备预防和/或治疗日本血吸虫感染的组合物
全文摘要
本发明公开了一类可以杀灭日本血吸虫的化合物，其结构如式I所示其中，R1、R3、R4是氢键受体基团；R2是脂肪烃基团。
文档编号A61K31/403GK101816648SQ20081003765
公开日2010年9月1日 申请日期2008年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者唐赟, 胡薇, 邓王平, 高振霆, 李亦学, 陈宇综, 曹志伟, 孙胜强, 冯正, 肖树华, 张浩冰, 徐斌, 莫筱瑾, 杨忠 申请人:华东理工大学, 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所, 上海生物信息技术研究中心