专利名称：槐角苷的制药应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女关节软骨退化和骨性关节炎的药物中的应用。
背景技术：
骨性关节炎(osteoarthritis OA)是中老年中最常见的骨关节疾病，其发病及进展过程受年龄、激素、环境、基因等多种因素影响。最主要病理表现为滑膜关节的软骨缺损。绝经后妇女发病率高于男性，低雌激素水平妇女骨性关节炎发病率增加(sowers MR，McConnell D，Jannausch M等，Estradiol and its metabolites and theirassociation with knee osteoarthritis Arthritis Rheum.2006 8；54(8)2481-7)，提示雌激素在骨性关节炎的发病中起作用。雌激素通过与关节中的雌激素受体(estrogen receptor ER)结合起作用，在软骨及软骨下骨中均有表达，其蛋白活性及构象改变以及在关节中表达水平可影响骨性关节炎发病。
雌激素受体是核受体，属于甾体激素受体家族。位于胞质及胞核中，经典的作用方式类似于配体依赖性的转录因子，通过结合于靶基因的启动子区，直接作用于同源DNA序列，或者通过蛋白-蛋白相互作用作用于其它转录因子。此外，基于雌激素在某些细胞体系中观察到的快速效应，目前学者提出了非基因组效应。ER有两种亚型雌激素受体-α和雌激素受体-β。雌激素受体-α基因位于染色体6q25-27，包含8个外显子140kb。雌激素受体-β基因位于染色体14q22-24，包含8个外显子大约40kb。
性激素对维持人体骨量起重要作用，老年性或手术性的性激素降低均可导致失骨，引起骨质疏松性骨折。绝经后的骨质疏松症常见于高龄妇女，其治疗相当困难。当今社会，人口老化，踏入高龄的妇女不断增加，妇女在绝经后骨质丢失率随血循环中雌激素水平的减少而增高，进而出现骨质疏松症，增加了骨折的危险性，因骨质疏松、骨折和各种并发症导致的死亡人数越来越多。
Ham等较早报道了使用猕猴去势模型180只配对组分成3组，一组为模型组，另外两组分别使用雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy，ERT)、大豆植物雌激素(SPE)。3年后，模型组较雌激素替代疗法组软骨缺损程度严重，且骨赘生长较多，提示长期的雌激素替代治疗能够缓解骨性关节炎。并测定关节软骨中胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-2、IGFBP-3、胶原、蛋白多糖水平，结果发现雌激素替代疗法组IGFBP-3水平高于模型组，其它指标则无统计学差异。对胫骨近端软骨下骨区(SC)及干骺端(EMC)骨转换指数测定后发现，模型组在两区的骨转换指数最高，大豆植物雌激素(SPE)组次之，雌激素替代疗法(ERT)组最低。模型组中SC区的骨化程度高于EMC区，大豆植物雌激素组骨小梁体积高于模型组。提示长期的雌激素替代疗法通过降低SC区的骨形成从而降低骨性关节炎的风险，最近同一研究小组对胫骨近端关节周围骨赘测量后发现长期的雌激素替代治疗并不能够持续的降低软骨骨交界区及胫骨关节周围骨赘的形成(Olson EJ，Lindgren BR，Carlson CS等，Effects of long-termestrogen replacement therapy on the prevalence and area of periarticular tibial osteophytes insurgically postmenopausal cynomolgus monkeys Bone.2007年4月20日)。流行病学资料也提示绝经后妇女骨量下降，所导致的骨生物力学改变与OA发病相关，最近，Jacobsen等对入选的3913例(男1470例，女2443例)骨性关节炎患者，测定骨密度及髋关节关节间隙，发现男性患者关节间隙终生变化不大，而女性在45岁之后关节间隙明显变窄，且与骨量降低有显著相关性(P<0.0001)(JacobsenS，Jensen TW，Bach-Mortensen P等.Low bone mineral density is associated with reduced hip joint spacewidth in womenresults from the Copenhagen Osteoarthritis Study Menopause.2007年6月1日)。
许多研究显示雌激素无论在体内或是体外对软骨细胞均有确切作用，且与雌激素受体表达水平有关。II型胶原C端肽(CTX-II)是II型胶原蛋白在体内的特异代谢产物，由于体内的II型胶原大多分布于软骨中，因此血及尿液中的CTX-II可作为软骨代谢特异标志物。使用该评价指标的相关报道较多。Andersen等观察大鼠去势后2、4.、6.、8周尿液中CTX-II含量并用去势前含量做矫正，发现2周时软骨代谢最旺盛，后逐渐降低。2周时ERT以及雌激素受体调节剂(SERM)可抑制2周时的软骨代谢。而4周的软骨代谢情况与8周后膝关节软骨的退变情况最具相关性(Hoegh-Andersen P，Tankó LB，Andersen TL等，Ovariectomized rats as a model of postmenopausal osteoarthritisvalidation and applicationArthritis Res Ther.2004；6(2)R169-80，2004年2月19日)。
最近Oestergaard等将46只SD大鼠随机分为4组，去势模型组、早期ERT组、延期ERT组以及假手术(sham)组。并对血中CTX-II测定，并对9周后关节形态改变评分，用免疫组化方法测定关节中CTX-II.结果发现ERT能缓解关节软骨退变，且延期ERT较早期干预效果差，在关节中检测到CTX-II，且共定位于软骨缺损区(Oestergaard S，Sondergaard BC，Hoegh-Andersen P等，Effects of ovariectomy and estrogen therapyon type II collagen degradation and structural integrity of articular cartilage in ratsimplications of the time ofinitiation，Arthritis Rheum.2006年8月；54(8)2441-51)。已有文献报道去势后，关节软骨ER表达水平降低(参见Oshima Y，Matsuda K，Yoshida A等，Localization of EstrogenReceptors alpha and betain the Articular Surface of the Rat Femur.ActaHistochem Cytochem.2007年2月27日；40(1)27-34；和Dai G，Li J，Liu X等，Therelationship of the expression of estrogen receptor in cartilage cell andosteoarthritis induced by bilateral ovariectomy in guinea pig，J.Huazhong Univ SciTechnolog Med Sci.2005；25(6)683-6)。有报道绝经后宫颈中基质金属蛋白酶(MMP)表达增高，而抑制其组织抑制物(TIMP)的表达。而MMP为关节软骨胶原破坏最主要因素，Lee等发现17β-E2可抑制软骨细胞MMP-1mRNA表达，并可改善MMP和TIMP之间的平衡协调(Richette P，Dumontier MF，Francois M等，Dual effects of17-beta-oestradiol on interleukin 1beta-induced proteoglycan degradation in chondrocytes，Ann Rheum Dis.2004年2月；63(2)191-9)。因此，去势后雌激素水平降低，ER表达水平降低，增加MMP表达水平，导致II型胶原代谢增加软骨基质破坏。
以上动物实验，提示雌激素的波动可能为绝经后妇女骨关节炎发病的始动因素之一，早期雌激素干预可抑制软骨中ER水平降低防止OA的发生。而ERT后期则主要为通过雌激素受体调节软骨下骨代谢，抑制骨性关节炎发生及缓解骨性关节炎进程。
雌激素对于关节软骨作用的量效关系，研究较多且多为体外实验。多认为低剂量的雌激素可抑制炎症因子诱导的软骨基质降解，而高剂量的雌激素可促进软骨退变。IL1-β是目前研究骨性关节炎发病中较为确定的前炎症因子，Richette等通过培养兔关节软骨细胞发现低浓度17β-雌二醇(E2)(0.1nmol/l)抑制白介素(IL)1β诱导的蛋白多糖降级，而高浓度(10nmol/l)可增加其作用(Lee YJ，Lee EB，Kwon YE等，Effect of estrogen on the expression of matrixmetalloproteinase(MMP)-1，MMP-3，and MMP-13 and tissue inhibitor of metalloproternase-1 inosteoarthritis chondrocytes Rheumatol Int.2003 Nov；23(6)282-8.2003年4月9日)。
与雌激素受体相似识别相似的DNA序列但配体尚未确定的受体，称做雌激素受体的相关受体，属于孤核受体，分别为ERR-α、ERR-β、ERR-γ(根据1999年核受体命名委员会命名原则分别为NR3B1、NR3B2、NR3B3)。其在某些组织中雌激素可促进其表达。研究发现ERR-α可能调节雌激素信号转导并与ER相互作用。Bonnelye等通过免疫组化染色证实ERR-α成年大鼠关节软骨细胞中有表达，并且发现在体外培养的软骨细胞中ERR-α过表达可诱导SOX-9表达增加，促进骨软骨发育，而抑制ERR-α表达可抑制软骨形成。提示ERR-α在软骨形成及保持其稳态中起作用(Bonnelye E，Zirngibl RA，Jurdic P等，The orphan nuclear estrogenreceptor-related receptor-alpha regulates cartilage formation in vitroimplication of Sox9Endocrinology 2007年3月，148(3)1195-205)。
综上，雌激素及其受体对骨关节炎的发病及病变程度都有影响，雌激素受体在关节软骨及软骨下骨中均有表达，蛋白活性及构型差异可影响雌激素对关节软骨及软骨下骨的作用，其基因多态性与骨关节炎的发病相关。目前多项研究显示雌激素受体调节剂同样具有雌激素替代治疗的作用，且雌激素能促进其受体表达水平，提示雌激素受体介导了雌激素对骨性关节炎的作用。妇女绝经后，骨性关节炎发病率增高，雌激素替代治疗效果流行病学证据尚不充分。雌激素及其受体在骨性关节炎中的作用机制尚不明确，需要更多的前瞻性的流行病学观察，以及更加深入的体外及体内实验研究。
但是，摄入人体雌激素也会带来很多副作用，最严重的是会增加乳腺癌和子宫内膜癌的发病率。
所以，该技术领域一直想寻找一种没有诸如增加乳腺癌和子宫内膜癌的发病率危险的药物来治疗骨性关节炎。
染料木素(genistein)是存在于植物中的一种异黄酮成分，在多种植物中以甙元本身或糖甙的形式存在。糖甙中组成氧甙键的糖可以是诸如葡萄糖的单糖，也可以是诸如新橙皮糖(neohesperidose)、葡糖基芹菜糖(glucosylapiosied)；糖链所在的位置可以是在7位或4’位形成单链，也可以在7，4’形成双链；或者在8位或6，8位形成碳甙键。在多种糖甙中，最常见的是染料木素—4’—0—吡喃葡萄糖甙(genistein-4’-glucopyranoside)，又名槐角苷(sophoricoside)和染料木素—7—0—吡喃葡萄糖甙(genistein-7-0-glucopyranoside)，又名染料木甙(genistin)。
R1 R2 Hβ-D-Glc槐角苷 (sophoricoside) β-D-GlcH染料木甙(genistin) H H 染料木素(genistein) 染料木甙是大豆的一种活性成分，属于异黄酮类。1953年曾经报道在豆渣中存在，将豆渣用作牲畜的饲料，因其中所含的染料木甙具有雌激素样活性而使牲畜的体重增加。
近年来，人们进一步发现，大豆中的这类异黄酮能降低绝经期前妇女患乳腺癌的危险，并能抑制大鼠膀胱肿瘤的生长和前列腺癌的早期发展。最近又报道含有染料木甙的大豆提取作为雌激素剂外，尚可抑制肠道的葡萄糖摄入，从而可能用于糖尿病以及用作葡萄糖诱导脂类过氧化的保护剂。此外，从老龄雌性大鼠所得股骨干骺端组织(femoral-metaphyseal tissues)的体外试验，染料木甙或染料木素能引起干骺端组织中碱性磷酸酶、DNA和钙含量的显著增加，表明他们具有对骨代谢的合成作用，同时染料木甙能预防对卵巢功能切除大鼠的骨丢失。
槐角苷(sophoricoside)得自槐角，即豆科(Leguminosae)槐属植物槐树(Sophora japonica L)的果实，为常用中药，槐角苷尚存在于尼泊尔黄花木(Piptanthus nepalensis)茎和漆树科植物宽叶尚乳香(Schinus latifolius)叶中，槐角苷具有抗炎作用，能明显抑制发炎过程的增生期，并有降低谷丙转氨酶的作用。近年尚报道能同时抑制大鼠由角叉菜胶引起的水肿和巴豆油诱导的耳水肿，以及作为白介素—5的抑制剂。
日本专利申请JP11-116487只揭示了槐角苷在治疗糖尿病等疾病中的应用。
中国专利CN01113081.4也只揭示了槐角苷在治疗妇女绝经后骨质疏松症中的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供对人体的乳房和子宫没有雌激素样副作用的槐角苷在制备预防和/或治疗关节软骨退化，特别是绝经后妇女关节软骨退化的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供对人体的乳房和子宫没有雌激素样副作用的槐角苷在制备预防和/或治疗骨性关节炎，特别是绝经后妇女骨性关节炎的药物中的应用。
因此，本发明一粉末涉及一种下式槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女关节软骨退化的药物中的应用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氢-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羟基异黄酮-4’-D-葡糖苷)。
本发明另一方面涉及一种下式槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女骨关节炎的药物中的应用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氢-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羟基异黄酮-4’-D-葡糖苷)。
优选的是，所述的槐角苷从豆科植物(sophora subprograms)，如大豆或槐角，特别是槐角中提取得到。
制药领域的技术人员可根据常规的技术，将所述的槐角苷制备成各种剂型，如口服的胶囊剂、片剂等常规剂型。
图1是实施例3中显示各组子宫HE染色情况的显微镜图(40倍物镜)。
图2是实施例4中显示各组CTX-II基线比值变化情况的曲线图。
图3A是关节整体病理切片甲苯胺蓝染色显微镜图(1倍物镜)，其中显示了股骨、胫骨和内外侧半月板；图3B是关节面病理切片甲苯胺蓝染色的显微镜图，其中显示了股骨、胫骨和关节面缺损。
图4是实施例5中显示各组面病变情况的柱性图，它基本上体现了表3的内容。
图5是正常关节软骨ER-α免疫组化染色的显微图，(40倍物镜)；正常关节软骨ER-α表达于表层、中间层及肥大细胞层。
图6是病变关节软骨ER-α疫组化染色的显微图(40倍物镜)，其中，关节面破坏区软骨细胞ER-α失表达。
图7是实施例6中各组关节软骨ER-α免疫组化染色显微图(40倍物镜)。
图8是各组关节软骨细胞ER-α表达阳性率比较的柱形图，它基本上体现了表4的内容。
图9是正常关节软骨TUNEL染色的显微图(40倍物镜)，图中少量调亡细胞分布于钙化软骨细胞层及肥大软骨细胞层，箭头表示凋亡细胞。
图10是各组关节软骨TUNEL染色的显微图(40倍物镜)。
图11是实施例7中各组关节软骨凋亡指数比较的柱形图，它基本上体现了表5的内容。
具体实施例方式 实施例1动物分组及造模 66只6月龄雌性SD大鼠随机分为模型组(ovariectomized，OVX)、假手术组(SHAM)，以及各药物干预组ERT组、选择性雌激素受体调节剂(SERM)组、仙灵骨葆组、槐角苷10毫克组(HDA10)、槐角苷20毫克组(HDA20)、槐角苷40毫克组(HDA40)、槐角苷80毫克组(HDA80)。
1.造模方法 OVX组及各药物干预组以1％戊巴比妥钠溶液按5ml/kg，腹腔注射，待麻醉起效后，大鼠俯卧体位，肋弓下第3腰椎处去毛，以苯扎溴铵酊消毒皮肤，切皮，切口长约1cm，切开皮下、筋膜，钝性分离肌肉，小心切开腹膜，组织镊伸入切口，小心提起腹腔白色脂肪，轻手翻开脂肪，找到梅花状卵巢，1号无菌丝线结扎，眼科剪从输卵管剪断分离卵巢，压迫止血后，将脂肪小心放入腹腔，将切口移向对侧，同样方法切除对侧卵巢，逐层缝合腹膜、筋膜、皮下、皮肤。消毒伤口。
SHAM组以同样方法暴露卵巢，但不予切除，切除同量周围脂肪后，闭合切口。
2.动物饲养条件及干预措施 大鼠饲养于中科院上海生命科学研究院动物实验中心SPF级动物房。恒温、恒湿清洁环境。温度24℃。湿度40～60％。每天12h光照/12h黑暗，净化水、普通饲料喂养。
药物溶媒选择1％羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethycellulose，CMC-Na)，SHAM组及OVX组以溶媒灌胃。
药物组分别采取以下剂量溶解于所述溶媒后灌胃 ERT组补佳乐(Progynova，戊酸雌二醇片，法国schering S.A生产，批号072A-2)0.8mg/kg/天； SERM组易维特(Evisa，盐酸雷洛昔芬片，西班牙lilly S.A生产，批号A208711)3mg/kg/天； XLGB组仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药有限公司，批号060361)270mg/kg/天； HDA10组槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批号04292004)10mg/kg/天； HDA20组槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批号04292004)20mg/kg/天； HDA40组槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批号04292004)40mg/kg/天； HDA80组槐角苷(上海金木生物科技有限公司，批号04292004)80mg/kg/天。
3.动物取材 大鼠分别于造模前、3周、5周、7周用代谢笼收集大鼠尿液1～1.5ml于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。
11周后颈椎脱臼法处死大鼠，取子宫测量其湿重后投入4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)固定。取右侧完整膝关节投入4％PFA中固定。
实施例2实验前后大鼠体重及子宫湿重 实验前后称量大鼠体重，处死取材时同时取子宫称量湿重，结果如表1。
表1 实验前后大鼠体重及子宫湿重(x±Sx)
注与SHAM组比较**P<0.01，*P<0.05；与OVX组比较△△P<0.01，△P<0.05。
数据统计采用方差分析，SHAM组子宫湿重组内差异大，考虑处于不同月经周期所致。实验前后各组间体重无统计学差异。去卵巢处理各组与SHAM组子宫湿重有统计学差异(P<0.01)，提示卵巢摘除成功。SHAM组及ERT组子宫湿重与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，其他处理组与OVX组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示雌激素对子宫有刺激作用，而其他各组则无明显子宫刺激作用。
实施例3子宫切片观察 1.包埋将实施例1得到的大鼠子宫4％多聚甲醛固定24小时；75％酒精脱水过夜；85％酒精脱水45分钟；95％酒精脱水45分钟×2；100％酒精脱水45分钟×2；浸入二甲苯中透明15分钟×2；65℃烘箱，浸蜡3小时；石蜡包埋。
2.切片制作取大鼠子宫管腔冠状面，石蜡切片机(Leica，ModelRM2235)切片，厚5μm.放入温水30℃中，多聚赖氨酸处理载玻片铺片。65℃烘箱烤片3小时切片备用。
3.子宫HE染色1)切片脱蜡至水65℃烘箱3小时；浸入二甲苯10分钟×3；100％酒精10分钟×2；95％酒精10分钟×2；85％酒精10分钟；75％酒精10分钟；双蒸水。
2)染色苏木素4分钟；流水冲洗反蓝10分钟；伊红A液4分钟；伊红B液2分钟； 3)脱水95％酒精10分钟×2；100％酒精10分钟×2； 4)透明二甲苯10分钟×2； 5)中性塑胶封片 图1显示了40倍显微镜下各组子宫HE染色的情况。图1中的第一行从左至右分别为SHAN组、ERT组和SERM组；第二行从左至右分别为XLGB组、HDA 10组和HDA 20组；第三行从左至右分别为HDA 40组、HDA 80组和OVX组。其中Sham组子宫内膜增厚、呈鳞屑状；OVX组子宫内膜变薄、平坦；ERT组子宫内膜较OVX组厚；其他各组类似OVX组。
实施例4CTX-II含量测定 1.采用Urine Pre-clinical(PC)Cartilaps ELISA试剂盒，竞争性酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定实施例1得到的尿液中CTX-II浓度，多功能生化仪(Beckman coulter，DXC800)测定尿液中肌苷(creatinine，下称为Crea)浓度，并采用以下公式矫正CTX-II含量 矫正CTX-II(mg/mmol)＝CTX-II(g/L)/Crea(mmol/L) 2.ELISA方法原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
3.CTX-II(μg/L)测定 1)取实施例1得到的大鼠尿液，解冻，室温溶解30分钟，取200μl分装，用于Crea测定，另取各样品10μl加标准A液，4倍稀释； 2)标准品配制按下表分别配制，0μg/L，1.56μg/L，3.13μg/L，6.25μg/L，12.5μg/L，25μg/L，50μg/L，100μg/L8个浓度梯度的标准品； 表2CTX-II(μg/L)测定标准品梯度浓度配制
3)取已包被抗生物素蛋白链菌素的96孔板，向其中加入100μL生物素化抗原，加封口膜室温孵育30分钟； 4)清洗液15去离子水稀释，备用； 5)洗板5次； 6)将标准品、样品、质控品10μL加入各孔，接着向各孔中加入150μL主要抗体，封口膜封闭后，放入4℃冰箱孵育21±3小时； 7)洗板5次； 8)每孔加入100μL过氧化物酶联抗体，封口膜封闭，室温孵育60分钟； 9)洗板5次； 10)每孔加入100μL四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)底物显色，暗室孵育15分钟； 11)向每孔加入终止液各10μL； 12)酶标仪(Molecular Devices Corporation，BD03315)测定吸光度值(optical density，OD)，分别以450nm及650nm，测吸光度，生成4参数logistic回归曲线，读取各样本浓度值。
4.尿液中Crea(mmol/L)的测定由上海瑞金医院检验科采用多功能生化仪(Beckman coulter，DXC800)测定。
根据上式计算出CTX—II基线比值，结果如图2所示，与同时间点模型组比较图中的**表示P<0.01，图中的*表示P<0.05。
去卵巢后各组CTX-II型浓度基线百分比变化趋势如图2所示，数据处理采用方差分析，结果提示OVX组去卵巢后尿中CTX-II含量明显增加(P<0.01)，关节软骨Col II代谢旺盛，但在7周内逐渐回到接近基线水平。SHAM组实验期间尿中CTX-II含量基本稳定(P>0.05)，关节软骨Col II代谢基本稳定。雌激素替代疗法、选择性雌激素受体调节剂、HDA80可以显著压低去卵巢后短期内CTX-II的代谢峰(P<0.01)。中成药仙灵骨葆、HDA40同样有此作用，但作用相对较弱(P<0.05)。雌激素替代疗法、有雌激素样作用雌激素受体调节剂、HDA和中成药有预防及缓解此病理过程的作用。
实施例5关节面病变情况观察 1.大鼠膝关节病理学石蜡切片制作 A)包埋1)大鼠膝关节4％PFA固定48小时；2)15％乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)脱钙15日；3)75％酒精脱水过夜；4)85％酒精脱水45分钟；5)95％酒精脱水45分钟×2；6)100％酒精脱水45分钟×2；7)二甲苯透明20分钟×2；8)65℃烘箱，浸蜡3小时；9)石蜡包埋。
B)切片制作以内侧副韧带为标志做冠状面，石蜡切片机(Leica，ModelRM2235)切片，厚5μm.放入温水30℃中，多聚赖氨酸处理载玻片铺片。65℃烘箱烤片3小时，切片备用。
2.甲苯氨蓝染色、关节面缺损测量 A)甲苯氨蓝染色 1)切片脱蜡至水65℃烘箱3小时，二甲苯10分钟×3，100％酒精10分钟×2，95％酒精10分钟×2，85％酒精10分钟，75％酒精10分钟，双蒸水； 2)染色1％甲苯氨蓝5分钟，流水冲洗10分钟； 3)脱水丙酮I、II各10分钟； 4)透明 二甲苯I、II各10分钟； 5)中性塑胶封片。
B)关节病变图像分析 由2位资深图像分析技师采用Axionplan 2 imaging显微图像分析系统(Axioplan 2多功能自动荧光显微镜，KS400图像分析系统Ver3.0，AxioCam数码相机分辨率3900×3090)独立测量病变长度测量股骨内外侧髁，胫骨平台内外侧四个关节负重区软骨面病变区(如图3A和3B所示)，最后取平均值，并分别计算4个关节面病变百分比，最后计算膝关节总体病变白分比 关节面各部病变百分比＝病变区长度/负重关节面总长度×100％ 膝关节关节面病变百分比＝病变区总长度/关节面总长度×100％ 各组大鼠膝关节各部分及整体退变情况如下表3及说明书附4所示，数据处理采用方差分析。实验结果提示OVX组关节软骨退变情况与SHAM组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。提示去卵巢后关节软骨退变加重。除HDA10、HDA20外各药物均可延缓去卵巢所引起的关节软骨退变，其中ERT组与HDA80组效果较好，与OVX组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与SHAM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而XLGB组、SERM组、HDA40有效但不能完全逆转，与OVX组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与SHAM组比较差异无统计学意义(P<0.05)。
表3 各组关节面病变百分比(x±Sx)
注与OVX组比较**P<0.01，*P<0.05；与SHAM组比较△△P<0.01，△P<0.05。
实施例6关节软骨细胞雌激素受体染色、阳性细胞百分比计算 1.软骨细胞雌激素受体染色1)切片脱蜡至水；65℃烘箱3小时；二甲苯5分钟×2；100％酒精5分钟×2；95％酒精5分钟×2；85％酒精5分钟；75％酒精5分钟；双蒸水5分钟×2；PBS5分钟×3； 2)消除内源性过氧化物酶3％H2O2-甲醇10分钟，PBS清洗5分钟×3； 3)抗原封闭0.3％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)30分钟 4)加一抗加ER α抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.sc-542)(150)55μl/片，4℃过夜，PBS清洗5分钟×3； 5)加二抗加生物素化二抗(1200)37℃ 30分钟，PBS清洗5分钟×3； 6)加SABC(StreptAvidin Biotin Complex)加SABC(1300)37℃ 30分钟，PBS清洗5分钟×3； 7)显色加二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)75μl/片3～6分钟，显微镜下观察； 8)套染流水漂洗3分钟；苏木素10秒；流水冲洗10分钟；95％酒精10分钟×2；100％酒精10分钟×2；二甲苯10分钟×2；中性塑胶封片。
2.图像分析、阳性细胞百分比计算由2位资深图像分析技师采用Axionplan 2 imaging显微图像分析系统(同以上实施例)分别在膝关节股骨内外侧髁，胫骨平台内外侧，各取两个视野独立计算ER-α表达阳性细胞百分比，取平均值作为该区域的阳性细胞百分比。取四区平均值作为该膝关节总体阳性细胞百分比。取2人计算结果平均值为最终实验结果。
阳性细胞百分比＝视野阳性软骨细胞数/视野总软骨细胞数×100％ 各组大鼠关节软骨中ER-α表达情况如图7所示，其中SHAM组ER-表达于关节软骨各层，OVX组、HDA10、HDA20组关节软骨浅层ER-α阳性细胞较正常关节软骨明显减少，ERT组、HDA80关节软骨ER-α阳性细胞较OVX显著增多，接近于正常关节软骨。SERM组、XLGB组表达较OVX组增多。
ER-α表达阳性率及各组间差异如下表4和图8所示。实验结果提示正常关节软骨(SHAM组)ER-α表达于表层、中间层及肥大细胞层(图5)。软骨关节面病变区域ER-α失表达。去卵巢后大鼠关节软骨ER-α表达明显减少(P<0.01)。雌激素、SERM以及除10mg剂量组的HDA干预的去卵巢大鼠ER-α表达增加(P<0.01)。但很难恢复到正常水平(与SHAM组比较ERT组P<0.05；其它各组P<0.01)。XLGB组与OVX组比较差异有统计学差异(P<0.05)，且ERT效果最佳明显优于其它组P<0.01。
表4 关节软骨细胞ER-α表达阳性率(x±Sx)
注与OVX组比较**P<0.01，*P<0.05；与SHAM组比较△△P<0.01，△P<0.05。
实施例7软骨细胞凋亡情况观察 1.TUNEL法检测凋亡细胞原理 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30％的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(ternminaldeoxynucleotidyl transferase，TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法。
2.TUNEL染色 1)切片脱蜡至水65℃烘箱3小时；二甲苯5分钟×2；100％酒精5分钟×2；95％酒精5分钟×2；85％酒精5分钟；75％酒精5分钟；PBS5分钟×2； 2)预处理加新鲜蛋白酶K(20μg/ml)60μl/片，37℃湿盒20分钟；PBS清洗2分钟×2； 3)消除内源性过氧化物酶3％H2O2甲醇5分钟，PBS清洗5分钟×2； 4)加平衡液冲洗75μl/片10s，倒去多余液体，吸弃周围液体； 5)加TdT酶立即加入55μl/片工作液(阳性对照不加)37℃湿盒1小时； 6)终止加终止液轻摇15分钟，PBS清洗3分钟×3，轻轻取出多余液体； 7)显色加抗地高辛-过氧化物酶65μl/片室温湿盒30min，PBS清洗2min×4，加足量过氧化物酶底物75μl/片3～6分钟，显微镜下观察； 8)套染流水漂洗3分钟；苏木素10秒；流水冲洗10分钟；95％酒精10分钟×2；100％酒精10分钟×2；二甲苯10分钟×2；中性塑胶封片。
3.图像分析、凋亡指数计算由2位资深图像分析技师采用Axionplan 2imaging显微图像分析系统(Axioplan 2多功能自动荧光显微镜，KS400图像分析系统Ver3.0，AxioCam数码相机分辨率3900×3090)在膝关节股骨内外侧髁，胫骨平台内外侧，各取两个视野独立计算凋亡指数，取平均值作为该区域的凋亡指数。取四区凋亡指数平均值作为该膝关节总体凋亡指数。取2人平均值为实验结果。
凋亡指数＝视野阳性细胞数/视野总软骨细胞数×100％ 图10是各组关节软骨TUNEL染色的显微图(40倍物镜)。其中显示OVX组关节软骨各层均可见大量的凋亡细胞且表层、中层分布增多。SHAM组凋亡细胞则主要集中于软骨钙化层，量少。ERT组、HAD 80关节软骨凋亡细胞较OVX组少，接近于正常关节软骨。其他各组除HAD 20组外较OVX组均有减少。这提示，大鼠正常关节软骨在钙化软骨层有少量凋亡细胞存在，去卵巢后(OVX组)关节软骨细胞凋亡增多(P<0.01)，关节软骨浅层包括表层及中间层均可见凋亡的软骨细胞(参见图10)，除HDA20外各药物干预组均能减少软骨细胞的凋亡，与OVX组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中XLGB组、HDA40组效果较弱，与SHAM组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
下表5及图11显示了各组大鼠膝关节关节软骨中的软骨细胞凋亡指数。
表5 各组关节软骨细胞凋亡指数(x±Sx) Tab 5 The apoptotic index of the 6 groups(x±Sx)
注与模型组比较**P<0.01，*P<0.05；与SHAM组比较△△P<0.01，△P<0.05。
权利要求
1.一种下式槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女关节软骨退化的药物中的应用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氢-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羟基异黄酮-4’-D-葡糖苷)。
2.一种下式槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女的骨性关节炎的药物中的应用
3-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基)-苯基]5，7-二氢-4H-1-苯并吡喃-4-酮(4’，5，7-三羟基异黄酮-4’-D-葡糖苷)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的槐角苷从豆科植物中得到。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的槐角苷从大豆或槐角中提取得到。
全文摘要
本发明涉及槐角苷在制备预防和/或治疗绝经后妇女关节软骨退化或骨关节炎的药物中的应用，其疗效显著，但没有动物体雌激素对子宫、乳房等的副作用，提取方便，来源丰富，有着很广阔的市场前景。
文档编号A61P19/00GK101396369SQ20081004144
公开日2009年4月1日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者宁 杜, 峰 高 申请人:宁 杜