专利名称：一种转基因水稻制剂的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程产品作为口服制剂，更具体涉及到一种转基因水稻制剂 的制备方法，获得在水稻种子中表达人胰岛素样生长因子(IGF-1)的转基因水 稻，将转基因种子直接用于口服或口服制剂，该制剂在治疗或预防糖尿病和高血 糖症的应用。技术背景类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)是一类参与许多增生与新 陈代谢过程的重要生长因子之一，对人体骨骼生长起着重要的作用，还能够促进 相应细胞的成熟以及参与人体创伤的愈合。类胰岛素生长因子一l(Insulin-like growth Factor-I， IGF-I)是一种含70个氨基酸及3个二硫键、无糖基化位点的单 链多肽分子(De Bree， et al" 1998， Protein Expression & Purification, Vol:13， 319-325)。基于其中可识别的二硫键位置分析，其二级结构被认为与胰岛素相似， 它们保守的甘氨酸都在相同的位点上，而且含有相似的非极性核心氨基酸残基。 在医疗上，它有着广泛的应用前景。仅以重组生产的人IGF-I (AIGF-I)及其复合 体而言，己经被有效地用于治疗生长激素敏感综合症(growth hormone insensitivity syndrome, GHIS)，其中包括生长激素缺陷(GH receptor deficiency)，IGF基因缺失、生长激素信号转导途径受阻；此外它还被用于有治疗患有I型或II型糖尿病或有着严重胰岛素抗性症状的一系列病人。在这些病人中，用rWGF-I 治疗都能够明显地改善病人的症状。此外，而用rhIGF-I或其复合体 rhIGF-I/IGFBP-3还有可以治疗慢性炎症、营养紊乱等症状，如克罗恩氏病 (Crohn's disease,又称节段性回肠炎)，少年慢性关节炎以及膀胱/胆囊纤维化等。 在大多数情况下，重组蛋白质的有效表达需要多肽长度至少在80个氨基酸以 上，尽管如此，其表达水平也非常低，因而，提高多肽表达水平的方法主要是通 过融合蛋白的方式。到目前为止，融合蛋白载体的研究主要在原核生物大肠杆菌和酵母，例如麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein MBP)、 FLAG (Einhauer et al， 2001, J. Biochem.Biophys.Methods, Vol 49:455-465 ) and谷胱甘肽(GST) (Papaioa腦u et al， 2002, Protein Expression & Purification, Vol，13: 462-466)等被用于在大肠杆菌和酵母的宿主表达系统，虽然有些融合载体已经商业化，但仅用 于实验室的基础研究。而利用植物表达体系表达多肽的研究起步较晚。最近，有 报道利用蛋白质二硫键歧化酶(PDI)和绿色荧光蛋白(GFP)作为融合蛋白来 表达多肽，但表达量都很低。在另一方面，虽然许多多肽已成功地在大肠杆菌和 酵母为宿主进行了表达，由于这些宿主具有可能的病原污染，存在着明显的安全 隐患。另外，目前的原核细胞融合蛋白载体的融合蛋白的分子量较大、表达量低 以及表达后形成不溶的包涵体，这些给下游的加工带来麻烦，此外。由于不适合 真核生物，尤其是高等植物细胞的宿主系统。虽然有人尝试用植物细胞来表达多 肽，但是表达量一直是一个瓶颈。发明人在利用水稻胚乳细胞特异性表达平台和 水稻分子伴侣作为融合蛋白载体在水稻胚乳细胞高效表达了人胰岛素样生长因 子一 1 ，但如何利用这些转基因产品是目前的重要课题。随着中国的生活水平提高，饮食结构发生了巨大变化，据不完全统计，在中 国13亿人口中，糖尿病患者高达4000万，1/5的城镇人口患有高血糖症，两者 总计人数已达近l亿，中国已成为仅次于印度的世界上第二大糖尿病大国，糖尿 病也是中国非传染性慢性疾病中排第三位的主要疾病(心血管疾病、肿瘤、糖尿 病)，是严重威胁中国人民健康的常见病和多发病，给国民经济带来沉重负担， 严重影响社会经济的发展。其发病增长之速，涉及人群之广，消耗卫生资源之大， 造成残疾、死亡之多，已达到触目惊心的地步，预防和控制糖尿病是中国亟待解 决的重大民生问题。糖尿病的治疗在晚期主要是依赖注射胰岛素，随着基因重组技术的发展， 胰岛素的生产主要靠重组DNA技术。目前在发达国家，胰岛素类似物有逐步取代 胰岛素的趋势；在中国胰岛素产品种类众多，有常规人胰岛素(R)、中效人胰 岛素(低鱼精蛋白锌胰岛素)、鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)和预混胰岛素(30R、 50R)等，此外，还有一些中药制剂也用于糖尿病的治疗，但由于中国糖尿病患 者的发展之快，使得药物供不应求，同时胰岛素需要注射，使用十分不便，长期 使用易产生抗性和副作用；尤其在中国还没有对高血糖患者有特效的自主知识产权的药物进行治疗与预防。发明内容本发明的目的是在提供了一种转基因水稻制剂的制备方法，方法易行，操作 方便，制剂成本低，服用方便，安全、无毒、疗效好。本发明的另一个目的是在于提供一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防糖 尿病和高血糖症的药物中的应用。本发明利用人胰岛素样细胞生长因子(IGF-1)具有治疗患有I型或II型糖 尿病或有着严重胰岛素抗性症状的病人有明显效果的原理，利用IGF — 1融合蛋 白在口服后在胃中受蛋白酶的作用，水解融合蛋白释放出功能的IGF — 1分子， IGF — 1与肠胃腔内细胞表面的IGF—l受体结合，激活一系列生理代谢途径，通 过增加肌肉对葡萄糖的吸收和减少肝脏对葡萄糖的释放以及增强细胞对胰岛素 的敏感性，来达到降低血糖水平的目的。同时，由于IGF — 1是一类参与了许多 细胞增生与新陈代谢过程的重要生长因子，对细胞生长具有一定刺激作用，长期 服用，可恢复胰腺细胞生长，达到彻底治疗糖尿病的目的。本发明利用以亚洲人民的主要食物稻米为药物表达受体，以水稻和小麦的非 储藏蛋白为融合蛋白，在胚乳细胞高效表达胰岛素样细胞生长因子(IGF-1)融 合蛋白，没有任何病原菌污染和副作用，安全可靠。本发明针对现有治疗糖尿病的药物采用注射方法使用不方便和注射使用IGF 一l产生的副作用的弊病，拟解决中国糖尿病和高血糖症患者迅速增加而有效药 物供应不足的现状，采用基因工程技术在水稻种子表达IGF—1的融合蛋白，改 常规注射方式为口服方式，不仅省去了IGF—1纯化加工等步骤，降低注射产生 一些副作用，还可降低药品价格。为了实现上述目标，本发明采取了以下技术措施A、水稻胚乳特异性启动子及信号肽的获得为了获得较强的水稻胚乳特异 性表达的启动子和信号肽，根据生物信息学分析，采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋 白基因家簇中的一个成员基因的启动子具有较高活性。为了获得G,"a 启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gf7h (基因库登记号AP003256) 合成了一对核苷酸引物(专利申请号200510019084.4的序列1和2)用于PCR扩增。为了便于基因克隆，在正向引物的5'端加入了一个粘性末端的酶切位点， 在反向引物的5'端加了一个平末端的酶切位点。从水稻品种台北309叶片中提 取基因组DNA，以此DNA为模版，按照标准的PCR程序，利用上述引物扩增 出了一个1284碱基的DNA片段。经DNA序列分析，此DNA片段具有明显的 启动子结构，得到了一种可介导重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽。B、 水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建经PCR获得GW^启动子和信号 肽的序列后，PCR产物经粘性末端和平末端内切酶消化后，将这个片段与经粘 性末端和平末端内切酶消化的pBI221片段连接(美国克隆技术(Clontech)有 限公司)，然后导入大肠杆菌品系DH10B (美国Invitrogen生物技术公司的产品)， 形成了含有G/73"启动子、GW3a信号肽和终止子的水稻胚乳特异性表达的 基本载体，并将这个载体质粒命名为pOsPMP2 (专利申请号200510019084.4)。C、 融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成从美国生物技术信息中 心(NCBI)基因库里获得了水稻ft》(基因库登录号为AAB63469)、和人类胰 岛素生长因子一l基因(基因库登录号为CAA01955)的氨基酸序列，由DNA 分析软件马克载体(MacVector，英国的阿克尔勒斯(Accelrys )公司产品)将 这些基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，由美国商 业化的Blue Heron Biotechnology公司人工合成了这些基因，这种经水稻密码子 优化的水稻基因的C末端片段和一种经水稻密码子优化的人IGF-1基因。经 密码子优化后的这些基因的核苷酸序列比原始基因序列改变了 11.2-21.4%，遗传 密码改变了 30.5-54.3%。在人工合成基因时，在基因合成的引物5'和3'末端 分别加上平末端和粘性末端的限制性内切酶，便于基因克隆。D、 融合蛋白表达载体pOsPMP26的构建用限制性内切酶Nael禾D Ncol消化pOsPMP3质粒DNA (专利申请号 200610019285.9)，将PCR扩增的说》C DNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体， 最终形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26 ((^"" C-ZGF-AMw)。E、 水稻基因遗传转化水稻种子去壳后，在20%次氯酸钠中消毒20分钟， 用灭菌水漂洗3次，然后在愈伤组织诱导培养基上诱导20-25天，诱导的愈伤组 织转移到预处理培养基上生长9-10天后，用于遗传转化。将0.5微克的表达载体质粒pOsPMP26和具有选择性标记质粒pOsPMP5 (专利申请号 200610019285.9)的DNA，与50微升的金粉、250微升的1 M氯化钙和50微升 的0.1M亚精胺混合后，反应3 Q分钟，用酒精洗三次，将DNA包裹在金粉上， 然后按照美国杜邦公司的基因枪方法，将两个质粒共转化到台北309产生的愈伤 组织。在含有潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，具有潮霉素B抗性的愈 伤组织在再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色植 株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株， 获得转基因植株，这些转基因植株经PCR检测，证明其含有融合蛋白基因后， 转到试验田生长发育成成熟的种子，此为T1种子。F、 高表达转基因植株的筛选转基因水稻经过4个月左右的生长和发育， 抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻T1代种子。其中有50-60% 的转基因植株正常结实。当T1种子收获后，从水稻成熟胚乳的粗提取物，采用 蛋白质印迹法，筛选高效表达的转基因单株，利用蛋白质定量检测的酶联免疫(ELISA)技术(美国的R&D system公司产品)定量分析表达量，从Tl种子 中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合 蛋白的转基因品系。供大面积生产融合蛋白之用。G、 转基因水稻种子的加工转基因水稻成熟后，按常规方法收割。经谷物 砻谷机去壳后形成糙米，然后将糙米碾磨成60—80目的米粉，经制片机加工成 转基因水稻制剂包括含2.5毫克IGF—1的口服片剂或胶囊或含25毫克IGF—1 的口服冲剂。本发明的主要优点有本发明利用胰岛素类似物一胰岛素样生长因子一l作为一种新药来治疗糖 尿病和高血糖症，不仅降低血糖效果比胰岛素显著，而且可以克服长期使用胰岛 素产生的药物耐性。本发明利用大众食物一水稻稻米作为载体，利用谷物胚乳特异性多肽融合蛋白表达的技术平台，在水稻胚乳中高效表达IGF — 1小分子多肽，采用直接利用， 克服了其他重组蛋白或多肽需要纯化的步骤，成本低廉。本发明直接利用转基因水稻米粉制成口服制剂，釆用口服方式取代使用极不 方便的注射方式，使用方便、副作用小，安全可靠，具有广阔的应用前景。
图l、构建的pOsPMP26 的限制性内切酶图谱。图2含有IGF-1融合蛋白的转基因水稻种子与分子证据。图3、水稻米粉制成的1.5克(20mglGF-l/片)样品。图4、水稻种子中的融合蛋白的IGF-1的生物活性检测。图5、用含有转基因水稻喂养小鼠对降低餐后血糖的效果。图6、用含有转基因水稻喂养糖尿病模型小鼠对降低血糖的效果。
具体实施方式
实施例1:克隆Gtl3a启动子和信号肽。为了从水稻基因组序列里克隆醇溶谷蛋白的Gtl3a基因的启动子与信号肽， 利用序列1和2 (专利申请号200610019285.9)的引物，采用标准的多聚酶链 (PCR)反应，从台北309品种的基因组DNA中扩增到了 1284碱基的DNA片 段，扩增的片段经限制性内切酶NaeI和XhoI消化，克隆到载体质粒pBI221中， 产生了水稻胚乳细胞特异性表达的表达载体pOsPMP2，经DNA序列分析，这个 DNA片段具有明显的启动子特征和信号肽的序列。实施例2:人工合成含有优化水稻遗传密码子的融合蛋白和目的基因。 从NIBC数据库获取了水稻Bip基因(基因库登记号为AAB63469)和目的 基因人的类胰岛素生长因子-1 (基因库登记号为CAA01955)的氨基酸序列，使用 DNA分析软件马克载体MacVector将融合蛋白基因转换成水稻遗传密码子的核 苷酸序列，氨基酸序列完全相同。由美国的Blue Heron Biotechnology公司人工 合成了这些重组融合蛋白和目的基因。在基因合成过程中，在基因两端加上了 Myll和Xhol酶切位点，克隆到p UC119 (美国Blue Heron Biotechnology克隆载 体)质粒载体，产生了含有水稻密码子优化的pOsBipC。实施例3:构建水稻特异性表达融合蛋白的载体。首先，密码子优化的人类胰岛素样生长因子(human IGF-1)基因通过PCR的方法扩增，克隆到经限制性内切酶Mscl和Xhol消化的pOsPMP2质粒DNA， 转化E.coli宿主细胞DH10B，产生一个中间质粒pOsPMP3。 pOsPMP3质粒D N A用限制性内切酶Nael和Ncol消化，同时用适合的内切酶消化pOsPMP2和 pOsBipC质粒DNA，将融合蛋白基因与表达载体质粒pOsPMP2连接，然后转化 大肠杆菌品系DH10B，产生表达载体质粒为pOsPMP26。其质粒的限制性内切 酶图谱见图1。实施例4:克隆水稻半胱氨酸蛋白酶(3 (Cysteine proteinase p)启动子。 采用PCR的方法从水稻基因组DNA克隆水稻半胱氨酸蛋白酶P基因的启动 子，根据基因库的核苷酸序列设计了两个PCR引物，利用标准PCR反应，从水 稻人工细菌染色体文库中，筛选到一个阳性克隆42M2 (BAC克隆编号)。BAC 克隆经Xhol消化后， 一个5kb的片断Southern杂交证实含有半胱氨酸蛋白酶卩 基因的全序列，以这个BAC克隆DNA为模板，采用标准PCR反应，获得了一 个1113碱基的DNA片段，将这个片段克隆到pBI221载体中，产生了一个中间 载体pOsPMP04 (专利申请号200610019285.9)。实施例5:构建选择性标记基因载体。以pCAMBIA-1301 (英国的Cambia公司)质粒DNA为模版，用标准PCR 方法，扩增出的PCR片段经SmaI和XhoI消化，然后克隆到经用限制性内切酶 Nael和Xhol消化的pOsPMP4载体上，产生了水稻特异性表达的选择性标记的 载体pOsPMP5 (专利申请号:200610019285.9)。实施例6:基因枪介导的基因转化水稻品种台北309种子，脱去谷壳后，经20%的次氯酸钠消毒20分钟，经 无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的 诱导，产生愈伤组织。将Q .5微克的质粒pOsPMP26和Q .5微克具有选择性标 记质粒pOsPMP5 (专利申请号200610019285.9)的DNA，与50微升的金粉、 250微升的1M氯化钙和50微升的0 . 1 M亚精胺混合后，在室温(20-25。C)下反 应30分钟，用酒精洗三次，然后按照杜邦公司的基因枪方法，将包裹有两个质粒DNA金粉，共转化到台北309愈伤组织的细胞中；在含有50微克/毫升的潮 霉素B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗潮霉素B的阳 性愈伤组织，潮霉素B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天 左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株，然后将幼小植株转到生根培养基上， 经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成成熟的 种子。实施例7:筛选表达融合蛋白高的转基因植株。转基因植株在温室或大田经生长与发育，然后开花结种子，形成转基因Tl 代种子，当T1种子收获后，每株转基因植株取10粒种子，加入10毫升的提取 缓冲液 (50mMTris， pH8.0， 50mM NaCl, 10mM EDTA)匀浆，在离心机上每 分钟14000转离心10分钟，上清液用ELISA定量药盒进行酶联免疫检测。经 检测每粒种子的IGF-1融合蛋白表达水平达到153微克左右，折合成每克水稻种 子含有 7.5 mg重组融合蛋白，即占0.75 %的种子干重。从T1种子中筛选表达 融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基 因品系，供大面积生产融合蛋白之用。从T1种子中筛选表达重组融合蛋白最高的转基因个体。为了验证高效表达 融合蛋白的转基因株系，不同转基因品系的T 1代种子的粗提取液经SDS-PAGE 聚丙烯凝胶电泳，考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法检测。融合蛋白在聚丙烯凝胶 中清晰可见(见图2);当采用IGF-1抗体检测时，在转基因胚乳可见与预测分 子量相同的融合蛋白，而在非转基因台北309和遗传分离的阴性个体中缺乏融合 蛋白带，表现出典型的孟德尔的遗传分离比例(见图2)。实施例8:转基因水稻的种植与储藏。在正常水稻生长季节(湖北通常为4一6月)播种，在种植区的周围留出10 米的隔离带，以防止转基因花粉飘逸。按每亩2.5公斤种子，采用稀播育秧方式， 在秧龄20—25天左右，按每亩2万株移栽到大田，按正常水稻水肥栽培管理， 直至成熟。釆用专用收割机械收割；稻谷收割后经晒干至低于14%的水分，在 常温下储藏。实施例9:转基因水稻的糙米加工。 将转基因水稻稻谷经普通砻谷机去壳加工成糙米。实施例10:加工后的糙米经磨粉机加工成60 — 80目的米粉。实施例11:水稻米粉经制片机，压縮成重量为1.5克(含20毫克IGF — 1/片)的口服片剂(图3)。实施例12:融合IGF—1的生物活性检测。人乳腺癌细胞系MCF-7在含有10。/。FBS(Promega)的RPMI1640培养基培 养，当细胞贴壁后，经血清饥饿处理，分装到0.1毫升的无血清培养基中(SFM)， 然后分别在无血清培养基加入100纳克/毫升，50纳克/毫升，25纳克/毫升，12.5纳 克/毫升，6.25纳克/毫升的细菌的rhlGF-l (R&D system),和50微升/毫升转基因和 非转基因未成熟的种子提取物，无血清培养基(SFM)和完全培养基(SFM加 入10% FBS)未阳性和阴性对照，细胞培养24小时后，细胞数目经3-(4, 5-dimethylthiazol陽2隱yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT， Sigma)检测。结果 表明50微升转基因提取物相当于大肠杆菌生产50微克的IGF—1生物学活性(图 4)。实施例13: 口服制剂对降低餐后血糖的效果。选用两组小鼠，每组各10只，比较转基因和非转基因水稻种子对餐后血糖 的效果，在灌胃前饥饿12小时，每只小鼠采用0.3毫升的磷酸缓冲液中含有60 毫克转基因或非转基因稻米粉灌胃，灌胃后1小时、3小时、5小时、7小时和9 小时，测定血糖浓度，结果表明灌胃转IGF1基因水稻种子的小鼠的餐后血糖比 灌正常水稻种子的粗提物的血糖在进食后1小时降低了 23.08% (p=0.015)，效果 持续到进食后7小时，血糖浓度从117±5mg/dl降至lj 70mg/dl (p=0.317)的正常水 平(图5)。实施例14: 口服制剂对人工制模的糖尿病小鼠的降低血糖效果。 选用4组，每组10只年龄重量为26土3克的成熟小鼠，每天注射链脲佐菌 素50mg/kg，连续5天，检查血糖指标，100%的小鼠均达到人工制模的糖尿病 标准，形成人工制模的糖尿病小鼠；这些小鼠分为四组，每组10只，含有40% 的转基因稻米粉，折合约28毫克IGF — 1，分别在喂养后3天、6天、9天、12 天测定血糖浓度，测定前空腹6小时后，取小鼠的尾巴血样，利用血糖试纸测定 血糖浓度，结果在服用转基因水稻种子的小鼠的血糖水平在第二天后有明显的降 低，到3天后达到正常水平，此后一直维持在正常水平，显示口服转基因水稻种 子可以快速降低血糖的效果(见图6)。
权利要求
1、一种转基因水稻制剂的制备方法，其步骤是A、水稻胚乳特异性启动子及信号肽的获得为了获得水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因的启动子，为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a合成了一对核苷酸引物用于PCR扩增，在正向引物的5’端加入了一个粘性末端的酶切位点，在反向引物的5’端加了一个平末端的酶切位点，从水稻品种中提取基因组DNA，以DNA为模版，按照PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段，得到了一种重组蛋白在谷物胚乳中表达的启动子和信号肽；B、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端和平末端内切酶消化后，将这个片段与经粘性末端和平末端内切酶消化的pBI221片段连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的载体，并将这个载体质粒为pOsPMP2；C、融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成从技术信息中心基因库里获得了水稻Bip和人类胰岛素生长因子-1基因的氨基酸序列，由DNA分析软件马克载体将基因的氨基酸序列转换成含有水稻遗传密码子的核苷酸序列，这种经水稻密码子的水稻Bip基因的C末端片段和一种经水稻密码子的人IGF-1基因，在人工合成基因时，在基因合成的引物5’和3’末端分别加上平末端和粘性末端的限制性内切酶；D、融合蛋白表达载体pOsPMP26的构建用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的BipCDNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体，形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26；E、水稻基因遗传转化水稻种子去壳后，在20％次氯酸钠中消毒，用灭菌水漂洗，然后在愈伤组织诱导培养基上诱导20-25天，诱导的愈伤组织转移到预处理培养基上生长9-10天后，用于遗传转化，将0.5微克的表达载体质粒pOsPMP26和质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，反应，用酒精洗三次，将DNA包裹在金粉上，然后按照基因枪方法，将两个质粒共转化到台北309产生的愈伤组织，在含有潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，潮霉素B抗性的愈伤组织在再生培养基上，在光照下经20天的诱导，愈伤组织分化成绿色植株，然后将植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成植株，获得转基因植株；F、高表达转基因植株的筛选转基因水稻经过4个月的生长和发育，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻T1代种子，当T1种子收获后，从水稻成熟胚乳的提取物，采用蛋白质印迹法，筛选转基因单株，从T1种子中筛选表达融合蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达融合蛋白的转基因品系；G、转基因水稻种子的加工转基因水稻成熟后，收割，经谷物砻谷机去壳后形成糙米，然后将糙米碾磨成60-80目的米粉，经制片机加工成转基因水稻制剂。
2、 权利要求1所述的一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防糖尿病的药物 中的应用。
3、 权利要求1所述的一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防高血糖症的药 物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种转基因水稻制剂的制备方法和用途，其步骤是A.水稻胚乳特异性启动子及信号肽的获得；B.水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建；C.融合蛋白和目的基因的密码子优化与基因合成；D.融合蛋白表达载体pOsPMP26的构建；E.水稻基因遗传转化；F.高表达转基因植株的筛选；G.转基因水稻种子的加工，经制片机加工成口服片剂和口服冲剂；一种转基因水稻制剂在制备治疗或预防糖尿病和高血糖症的药物中应用。本发明方法易行，操作方便，制剂成本低，服用方便，安全、无毒、疗效好。
文档编号A61K36/88GK101255420SQ200810047290
公开日2008年9月3日 申请日期2008年4月10日 优先权日2008年4月10日
发明者杨代常 申请人:武汉禾元生物科技有限公司