具有转化尿素能力的乳酸乳球菌及其驯化方法与应用的制作方法

专利名称：：具有转化尿素能力的乳酸乳球菌及其驯化方法与应用的制作方法具雜舰素能力的乳酸乳球菌及期ll化旅与应用fejt领域本发明属于生物及生物医药技术^^，特别涉及利用乳酸乳球菌治疗尿毒症。具体是驯化乳酸乳球菌，使欺备转f根素能力的方法。本发明涉及的驯化菌可以简单、有效地去除模拟尿毒症患者胃臓中的尿素，从而达到减少患者体内尿素累积，治疗尿毒症的目的。背景扰长1尿毒症(uremia)，从字面意JU:看，意n，血尿，最早是由Piony教授用来描述肾衰竭附临床症状。尿毒症是与水盐、电解质、^m^SL和机体代谢异常密切相关的临床综合症，并且与肾功育繊同时发生。尿毒症主要是由慢性肾衰(CRF)、慢性肾病(ARF)或者严重的大面积急性肾衰竭弓跑的。肾脏由上100万个极小的过滤单《i^勘戈，主要功能包撤戯胡滩新P东代谢后的麟和多余的水分，调节水、盐、酸碱、离开衡，帝隨红生长麟，调节、滩维生素D及控制血压。许多原发性或縱性肾脏疾病患是肾结构和功倉,踬害，最终导致急性或慢性肾功能衰竭。其中慢性肾功會緣竭是一种M^展的疾患，其后果是引起一系列代谢紊乱和临床症>1^形且成的综合症。尿毒症即肾衰晚肌当肾功能衰竭进一步发展，B^的肾小球滤过率仅为正常的10X以下，^|#肾单位<10%，内生Jl酐清除率〈10ml/min，JfiJl酐〉442pmo1/L(5mg/dL)，血尿魏〉21.4腿ol/L(60mg/dL)，即出现明显的尿毒症(uremia)症候群，表现为全身多脏器功能衰竭，临床可表现为恶心呕吐、烦躁不安、血压增高、心慌、胸闷、不能平卧、呼吸困难、严重贫血、抽搐，严重者昏迷，以及水中毒、高血钾等电解质紊乱和代谢性酸中毒等，需要依靠透析维持生命。常可因高血钾、脑水肿、肺水肿、心功能衰竭而突粉E亡。尿毒症毒素学说认为，新陈代谢是维持生命的基本保障，而人体的肾脏在这种保障中起着不可替代的作用。因各种病因戶膽成的肾功能与结构的损伤，使得某些在正常情况下原本可以通过肾脏排泄的毒素在体内产生积累，造成了机体的一系列病理改变，甚至^S生命，这质就是附胃的尿毒症毒素。目前已经知道的尿離患者f械内约有200多种物质的浓度比正常人高，其中—些代谢产物经动物实验和临床观察证明是有毒的，可弓IMR毒症的^f歪状。目前还没有査出某一种尿毒症毒素可以单激的引起所有尿毒症症状。各种尿毒症毒素，包括尿素、甲状旁腺麟(FIH)、卩2球蛋白和聚多麟術口尿毒症的临床症状有关。肾衰会引起很高的发病率和住院率，和高血压、逾L、病、夕卜周血管病变并列为四大疾病。尿素(Urea)是最微认定的一种尿毒症毒素，在体内的积蓄会引起一系列中毒症状，如疲劳，呕吐，嗜睡，头痛，舰辦及出血。一直以来临床上舰素作为尿毒症毒素的清除目标。对尿毒症的现有主要治疗手乾主要包括手术治疗和血液净化疗法，即肾移植、鹏透析和血M析等。血液透析方法t超几十年的发展，技术成熟，疗效显著，但是治疗费用昂贵，很多患者得不到治疗。口月蹄柳治疗尿毒症题年来发展的一条新路。靠口服的化学吸附材料和离子交换材料，在車者消ttit中吸收尿毒症毒素。氧化淀粉是最早用于治疗尿毒症的口服吸附材料，口服后与肠腔中尿素结合从粪便中排出，以離氮质血症。其中口服包醛氧化淀粉510g，每日23次，有一定治疗效果。缺点是药量过大，月艮用不便，并且不能与碱性药物合用，否则会斷氐药效。近年研究的新型口服制剂^I程化的娥杆菌。转化了脲縫因《址由//"從^欲腦的;kjlj杆菌&6力^&/^03//01€5，可以在大鼠肾衰模型中转化尿素。但是，&0^^&/^0^是条件致病菌，在应用时需要对细菌进行微囊化处理，转化尿素的能力不高，对胃肠环境的适应性较差。因此，为了能满足实际临床应用的需要，急需开发出能清除尿素、吸舰素代谢;^、鹏胃肠道环境、并m人体^^^害的食用菌。
发明内容本发明目的是掛共一种具摘化尿素效能的乳酸乳球菌及其驯化的方法，使乳酸乳球菌會,化尿素。本发明的方法，素加压驯化，逐渐M^尿素之外的氮源，培养出能利用尿素、以尿素为氮源的工程菌。提高驯化菌的尿素转化^t主，并且测试驯化菌在模拟胃肠环境中的生长和活性。为今后研糊于临床治疗的生物制剂、实￡,业化打$*础。本发明掛共的乳酸乳球菌，已于2007年12月3日保藏于"中国典型培MM中心"(湖北省^t又市武昌珞珈山5t汉大学保藏中心430072)，其号为CCTCCNO:M207190。保藏土t^物的分类命名是乳酸乳球菌NKSWH-1浪丁名称/octoNKSWH-1本发明提供的乳酸享博菌的具{辆1|化效去在不小于尿毒症患者的肠胃尿素浓度的割牛下，将乳酸乳球菌连续传彬咅养，步骤如下第一、筛选具有尿素抗性的孚戚乳球衝第二、在樹腿素压力下驯化培养，筛选出能够适tWt浓度的乳酸乳球菌；第三、逐荐赠加培养基中尿素的浓度，筛选出育濒鹏更高尿素浓度的乳酸乳球菌；第四、逐渐斷氐培养基中乳酸乳球菌驗培养基M17的比例，增加m^养基的比例，筛选出靜多禾拥尿素作为营养的乳酸乳球菌；第五、同时重复±，三步和第四步；第六、当混合培养基超晗10%M17、90X无mi咅养基时，用限制培养基平板和纯化培养基平板交替^#，ff选出目的菌种，即具^化尿素能力的乳酸乳球菌；第七、保存菌种。—簡U化旅的具体实验餅是-第一、取具有尿素抗性的乳酸乳球難液50mL(按照1%術只的接种量)接种到驗5mL含100%M17和6mg/dL尿素的混合培养基的试管内，在温度为3(TC的条件下静置i^24小时；第二取上步培养后的a^50ML转接至装有495mL雜羊MMi咅养基含98WM17，2%无氮培养基、12m^dL尿素的试管内，与第一步相同的^f牛，继续静置培养24小时；第三、此后每培育24小时测量发酵液的OD600nm，当发,中活菌^ilj1.5xl05+/mL时，即以1%#1的接种量，顺雜种到M17含量M^2X，同时无M^养基增加2X，尿素增加6m^dL的混合培养基中，与第一步相同的割牛，继織置i歸24小时；第四、重复上述第三步，直至混合i咅养基达到不含M17、100%为无氮培养基、尿素浓度300mg/dL,共乡纽50个周肌串勝具W^专化尿素能力的乳酸乳球菌。b^方法在接种至混合培养基超U含10%M17、90%无氮培养基、240m^dL尿素开始，遇到瓶颈，培养24小时后发酵液中活菌数ii^i不到1.5xl05个/mL(乳酸乳球菌在纯的M17培养基中培养24小时后，发,中活菌数避l」3.0xl05个/mL)。此后的接菌方法改变为，取100-发酔液，接种矜300mg/dL尿素的M17平板，30。C培养，24小时后，挑取生长良好的单菌落，接种于相对上一步M17含1M^2X、无節咅养基增加2%，，素浓度增加6mg/dL的混合培养基中培养。然后依次调整培养基组成，舒嗨合培养基超杯含M17、100%为无氮培养基、尿素浓度300mg/dL。如上所述任意一种方法制备的具^$#^素能力的乳酸乳球菌在斷氐尿素浓度中的应用。此种方法得到的50代驯化菌在24小时内，可以将培养液中的尿^^浓度从40.01±1.94mg/dL显著地斷氏到32.99±3.13mg/dL,清除率17.5%。未驯化菌的发M的尿素浓度在24小时内从40.07±1.50m^dL反而稍鹏加到41.33±4.09mg/dL，缘自细菌的4ti射产物。体系pH对驯化菌的转4fcM素能力有一定影响。24小时内，接种在100MMNaHCQ3(pH=6.8)做缓冲溶液的M17培养基中的驯化—輒以比接种在无NaHC03缓冲溶液的M17培养基中的别l化菌转化更多的尿素，培养基中的尿素浓度从40.01±1.94mg/dL显著斷氏到28.78±2.55mg/dL，清除率28.2%。未添加NaHC03缓冲溶液的培养基中的驯化菌，尿素浓度仅降低到32.額.63mg/dL。乳酸乳球菌和大多,的最适pH值都是6.8，乳酸孚阅難生长过程中会不断产生乳酸斷氐培养基的pH值，这既影响了细菌本身的生长，又抑制了别i化菌盼话性。NaHC03作为缓冲溶舰以傲寺培养基的中性pH。添加镍盐(MC12)对驯化菌的转化尿素能力有一定影响。在100HMNaHCO3缓冲的M17培养基中添加NiCl2(200MM)倉滩皿一步的提高驯化菌的尿素转化能力，在24小时内，培养基中的尿素浓度从40.09±0.76mg/dL进一步斷氐到25.73±2.46mg/dL，清除率35.8%。本发明的鄉意义本发明选择的乳酸乳球菌是一种天然的非致病性、可食用菌，不需要进行微囊化处理，而且可以抵抗患者肠胃环境。经过在富含尿素的培养基中驯化培育，乳酸乳球菌获得了在体外转化尿素的能力。获得的别l化菌(已被鉴定是乳酸乳球菌Z^tococ^/^teMG1363)可以在24小时内，将培养基中的尿素浓度从40.01±1.94m^dL显著斷氏到32.99±3.13m^dL。采用本发明提供的驯化乳酸乳球菌治疗尿毒症，具有成本低廉、使用方便、清除率教高m点。作为治疗尿毒症的辅助疗法，具有很好的临床娜前景。具]式^Bfi例l.乳酸菌的驯化方法取发酵菌液50^L加入到装有5mL混合培养萄含100XM17，尿素6mg/dL)的试管内，在働皇为3(TC的条件下静置培养24小时；取培养后的培^t50ML转接至装有4.95mL减氮培养基(,8%M17，2%无,养基，尿素12mg/dL)的试管内，与上述相同的条件，继续静置培养24小时；之后每培育24小时就测量发,的OD600nm，当发,中活菌数超ljl.5xl()5个/mL时，即以1%体积比的接种量，接种至IJM17含量M^2W，同时无節薪翻加2%，尿素增力P6mg/dL的混合培养基中，！LM^i晗0WM17、100%无氮培养基、尿素300mg/dL的混合培养基。预计50t周期，1200小时。此种施在接种到含腦M17、鄉^mit养基、尿素240mg/dL的混合培养繊段，培养24小时后发酵液中活菌数ffctiifij1.5xl()5个/mL(乳酸乳球菌在纯M17培养基中i鎌24小时后,发,中活菌数超lj3.0xl()5个/mL)。此后的接菌方法改变为，取100&发酵液，接种于M17平板(含有15mg尿素)，3(TC培养。24小时后，衫陬生长良好的单—麟，接种于M17含量减少2%、无氮培养翻加2%、尿鎌度增加6mg/dL的混合培养基中培养。憩鹏养基Sl^iiiiJ不含M17、謂％为无氮培养基、尿紧浓度300m^dL。^6te例2.驯化乳酸菌的分离和纯化取由实施例l制备的乳酸雜限制培养基(葡萄麟脂培养基，除了尿素以外不含有其他氮源物质)平im機分离，置30"恒温箱中培斜8小时，挑取单一菌舊接种于纯似咅养針板(琼月旨平板，M173.725g，葡萄糖lg，琼月旨15g,尿素lg，溴甲1^0.16g，水1000mL，湿热灭菌。)上，同一割牛驗培辨8小时，挑取周围势炎黄色的0客，擬中于限制培养基平敬上二。重复实验，最,隨转化尿素能力最高的菌株。以平板M穿刺管的形式，4"C冰箱保存，或者以甘油管的形式在-7(TC&嫌冻存。[例3.驯化乳酸菌的薪中鉴定取由实施例1制备的乳酸菌按实施例2的方S^离、纯化。为了证明驯化菌依然是/力加cocw/octo'MG1363，对驯化菌进fi^典方法和分子生物学对去的鉴定。在形态学观察的基础上，参照凌代文(1998)主编的《乳酸菌分类鉴定及实验方法》及伯杰氏《细菌鉴定手册》选择生化项目，将细菌首先鉴定到属，然后根据生化is^M性判断到种。根据细菌的开絲、培辦征、生理生化和糖发酵实验结果，再根据《伯杰氏细菌分l^^册(第8版)》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，确定驯化菌仍然为乳酸乳球菌。分子生物学鉴定方法16SrDNA序列分析^S年来薪中鉴定的常用方法。该方法^t乳酸菌的16SrRNA/rDNA进，滩异扩增后，再对核苷,列进行测定，并与已知辦的16SrDNA序列进行比较，以ltbt行乳酸菌鉴定和系统学研究。经PCR扩增，驯化菌基因组中的537261—539411(NC—002662PCR产物序列长度1936bpTm-54.5)^扩增出来，fflil^照NCBIConservedDomainDatabase,驯化菌的16SDNA全基因与Zoctococ泌/acrtsMG1363有至少98%的同源性。依据细菌的絲学、生长性状、械培养、生化反应以及分子生物学方法对驯化菌进行的鉴定结果表明原始菌和驯化菌都是乳球菌乳酸亚种Zorfococ^/必isMG1363。^Bfi例4.驯化乳酸菌，尿素的倉幼实施例2中分离出来的，实例3中鉴定的驯化乳酸菌，ilJl测定底物尿素浓度的^b来^^驯化菌的活性。尿鱟浓度的测定采用二乙酰一躬法。原理为尿素与二乙Sfc"后在强働卩热的斜牛下生^^红色的二嗪化合物(Fearon反应)，在540nm下的吸收值与尿素含量成正比。加入氨基硫脲可以提高灵增加显色稳定性。采取无菌操作分别取浓度0.5g/mL菌悬液50^L，接种于5mL富含尿素培养基内(尿素浓度30mg/dL)，30。C静置培养24h，取菌悬液50pL,重复接种培养2次，最后取菌悬液5mL，离心，去上清，收集的菌体，用7妖菌水啦一3次，加A5mL富含尿素培养基内(尿素浓度30mg/dL),重悬3(TC静置培养，测忠4小时后各试管内残余尿素含量。与初始尿素含量比较，计算驯化菌转化的尿素、话性。24小时后测量含尿素培养基中的尿素浓度，50代驯化菌发m中的尿素浓度从恥.01土L94m^dL显著地斷氏到32.99±3.13mg/dL。未驯化的乳酸菌:SM中的尿素浓度在24小时内没有樹可斷氏。^fife例5.缓冲液pH对驯化乳酸菌，尿素能力的影响实例4中测定的驯化乳酸菌，在生长过程中产生乳酸，不断斷氏发M的pH值，培养24h后，发,的pH值会斷氐到4.0以下。别l化乳酸菌^ff，尿素能力的主要场所^t，由于人体肠道的pH—般鹏在6.8，所以在驯化乳酸菌的培养基中添加NaHC03缓冲液，将发M的pH维持在6.8左右，测试驯化乳酸菌，尿素的能力。培养基中尿素的初々欲度是40.4fttl.l3mg/dL，24小时后再次测量鎌液中的尿素浓度，接种原始菌的富含尿素的M17里的尿素浓度约为41.43±U9mg/dL，而驯化菌将尿素降低到32.4Qtl.63mg/dLo在NaHCCb做缓冲溶液维持pH的斜牛下，驯化菌将尿素浓度进一步附氐到28.78±2.55m^dL。在维持pH=6.8^f牛下添加200NiCl2，在相同时间内尿素浓度斷氐到2573±2.46mg/dL,清除率超1』35.8%。^BI例6.模拟胃肠环，驯化乳酸菌^M尿素能力的影响对于驯化菌而言，首先必须能在人体的肠胃道生存才會拨挥其疗效功能，因此就要求驯化菌倉^多耐受有机体的生理环境。人体胃肠环境中对微生物影响最大因素的包括胃部^pH条件，小肠胆环境，以胃中物的1和抗生素的抑制作用。(1)模拟胃部低pH环境正常人的胃^T王pH1.54.5之间，其pH值的大小因食物^^坏同而波动，通常pH在3.0左右，且食顿尤其是流体)舰胃的时间相对较短，H2小时。将活^tH代的菌种接入pH-3.0的M17液体培养基中，3(TC静置培养，在0、2小时采用无菌水以10倍递M^释颈宜梯度，采用混菌法飾17平板说疗活菌记数，膨个平行实验，求平均值。驯化菌在P^3.0的培养基中培养2小时后，活菌M加了4.52±0.43%;驯化菌在p^6.8的培养基中培养2小时后，活菌数增加5.09士0.52%;相对应的，原始菌在pH=6.8的培养基中培养2小时后，活菌i[ii加46.02±1.00%。结果表明低pH条件在2小时内对驯化菌的生长没有明显的抑制作用，但是，显著低于原始菌的生长能力。小肠是人^B及收营养的重要场所，同时也是驯化菌发弊其作用的主要部位。正常人体小肠中胆汁盐含量在0.03%0.3%范围内波动，驯化菌要育辦定植于小肠就必须有一定的耐，汁盐的能力。而且食物ilil小肠的时间大概在6个小时以上。驯化菌在含有0.1%胆,的培养基中培翁小时后，发M中的活菌数增加了3.17±0.50%:驯化菌在不含有0.1%胆麟的培养基中培翁小时后，发,中的活菌数增加了14.73±1.09%;相对应的，原始菌在不含有0.1%胆的培养基中培翁小时后，发,中的活菌数增加了39292±37.28%。这些结果表明培养基中的0.1%胆麟在6小时内对驯化菌的生长有一定抑制作用。(2)模拟小肠胆麟环境将活^H代的菌种接入含有0.m牛胆M盐的M17液体培养基中(尿素浓度40mg/dL，0.lmMNaHCO顏冲液，pHi.8)，3(TC静置培养，分另瞎0和6小时用无菌水以10倍递#至适宜梯度,采用混菌法飾17平^iJt行活菌记数，膨个平行实验求平均值；并测定尿素浓度。驯化菌在含有O.l%胆酸盐的培养基中培养6小时后，发酵液中的尿素从40.23il.35ra^dL减少到36.27±2.70mg/dL;驯化菌在不含有0.1%胆酸盐的培养基中培#6小时后，发酵液中的尿素减少到36.20±2.61mg/dL;相对应的，原始—^￡不含有0.1%胆酸盐的培养基中培翁小时后，发酵液中的尿素增加至lj41.62il.l9mg/dL(乳酸乳球菌在代谢中把含氮物质转^素并分泌到发酵液中)。这些结果表明，模拟的小肠环境在6小时内对驯化菌^0尿素的能力没有明显的抑制作用。(3)模TOt常见微生物环境大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是人体肠道内最常见的两种致病菌，如果驯化菌能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，就可以耐^菌群。牛^fe:将娥杆菌和金黄色葡辦菌谱种活似4小时，接种于约45。C的LB平板或营养琼脂中，混匀后倒入放有牛津杯的培养皿，分别吸取0.251^驯化菌发酵液、发酵上清液、灭菌发酵液和未接种的无菌^#^50^作对照，于3(TC培养24小时，测量抑菌圈大小，做3^F行求平均值。分别检验了驯化菌的发酵液、发酵上清液、灭菌发^W大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，以未接种的无菌培#^作为对照。结果如表所示，驯化自;杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，抑菌圈直径均大于18mm。样品-，杆菌WS圈直径金黄色葡,菌WM圈直(mm)径Cmm)发,2523发酵上清液2423灭赏发鰣2118无菌J^m00(4)模鹏道常见抗生素环境氨卡青霉素、四环素、庆大霉素、罗红霉素和头孢拉定^f亢生素是临床上常用的几类抗生素。如果驯化舰以上5种抗生素没有耐药性，±生素会在体内抑制驯化菌的生长和话性。脸ty-toer法(琼nrf^^K^)适用于肠道细菌，其原理是根据WI^环大小与最低抑菌浓度的相关性。将抗生素,片贴在涂有乳酸菌的M17平板上，30。C培养24小时，观f柳菌圈的大小，做3个平行样。如表所示，驯化菌的抑菌圈比世界卫生组织(WHO)规定R+菌的抑菌圈小，可见驯化菌具有对以上五种抗生素的抗性。(R+是国际标准，小于该数值表明具有抗生素抗性)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求1、一种具有转化尿素能力的乳酸乳球菌，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCCNOM2071902、一种权利要求l戶皿的乳酸乳球菌的别l化方法，，征是在不小于尿毒症患者的肠胃尿素浓度的^#下，将乳酸L球菌^i传代i^，具体步骤如下第一、筛选具有尿素抗性的乳酸乳球菌；第二在较f跟素压力下驯化培养，鹏出肯雜^itl浓度的享L酸乳球菌；第三、逐綱加培养基中尿素的浓度，麟出育辦适应更高尿素浓度的乳酸乳球衝第四、逐渐附氐培养基中孚L酸乳球菌:S^歸基M17的比例，增加无節咅养基的比例，離出倉雜禾,尿素作为营养的乳酸乳球菌；第五、同时重SJ^第三歩和第四步；第六、当混合培养基超晗10%M17、90%无氮培养基时，用限制培养基平板和纯化培养基平板交替接种，筛选出目的菌种，即具W^化尿素能力的乳酸乳球菌；第七、保存菌种。3、根据权利要求2所述的驯化方法，，征在于，乳酸乳球菌的具l驯tta程和实验^f牛如下-第一、取具有尿素抗性的乳酸乳球難液，按照1%術只的接种量，接种至U魏5mL含100%M17和6mg/dL尿素的混合培养基的试管内，在温度为30°C的^f牛下静置培养24小时；第二^U:歩培养后的发自50ML转接至M4.95mL飾羊减氮培养基含98XM17，2%无氮培养基、12mg/dL尿素的试管内，与第一歩相同的^f牛，继会織置培养24小时；第三、之后^t咅育24小日中测4m酵液的OD600nm，当发M中活菌数超lJ1.5xl()5个/mL时，即以1%#|只的接种量，JI(^g种到M17含量M^2X，同时无Ei咅养翻加2X，尿素增加6mg/dL的混合培养基中，与第一步相同的^f牛，继繊置培养24小时；第四、重复上述第三歩，直至混合培养基达到含0%M7、100%无氮培养基、尿素浓度300mg/dL，尿素总量15mg，共会纽50个周期，先幌具，化尿素能力的乳酸乳球菌；其中，i^无氮培养基的配制方法为葡萄糖lg，KH2P040.3g，Na2HP041.4g，MgS043.0mg，MnSO40.5mg，FeSO40.1mg，NaCll.Omg，CoCl20.1mg，CaCL20.1mg，CuSO40.01mg，ZnSO40.5mg，H3BO30.01mg，AlK(SO4>20.5mg，Na2Mo04O.Olmg，溶鹏1000mL水中，湿热灭菌。4、根据权利要求2或3戶皿的驯化方法，其特征在于，当混合培养基超U含10%M17、90%无氮培养基、240mg/dL尿素时，此后的接菌方法改变为，取100pL发,，接种^"300mg/dL尿素的M17平板，3(TC培养，24小时后，挑取生长良好的单菌落，接种于相对上一步M17含量减少2W、无Ei咅养基增加2Xm素浓度增加6mg/dL的混合培养基中培养，然后依次调整培养基,，直至幌合培养基超i坏含M17、100X无Mi咅养基、尿素浓度300m^dL。5、权利要求1戶脱的具雜化尿素能力的乳酸乳球敏斷氐尿素浓度中的鹏。6、根据权利要求5阮逸的应用，，征在于皿的50代驯化菌在24小时内，育辦将培养液中的尿素浓度从40.01±1.94mg/dL显著地降低到32.99±3.13mg/dL，P=0.01,清除率17.5%。7、根据权利要求6,的自，，征在于戶腿的驯化菌接种在100mM的NaHC03做缓冲的培养基中，在24小时内,倉,将培养液中的尿素浓J^人40.01士1.94mg/dL进一步斷氐到28.78±2.55mg/dL，清除率28.2%。8、根据权利要求7所述的应用，，征在于在100^M的NaHC03缓冲的M17培养基中添加镍盐-NiCL2，200mM，倉雜Sa」步的提高驯化菌的尿素转化能力，24小时后培养基中的尿素浓;g/人40.09±0.76m^dL显著P射氐到25.73±2.46mg/dL，清除率35.8%。全文摘要本发明涉及具有转化尿素能力的乳酸乳球菌的驯化方法。本发明通过改变细菌的生存环境，利用细菌对不同环境的强大适应能力，逐步通过驯化使细菌逐步适应新的环境。在逐步改变外界条件的情况下，对细菌进行培养，不适应新环境的细菌死亡了，而某些细菌会发生变异从而适应新环境，演变成耐性更强的细菌而存活下来，形成新的耐性菌株。本方法在近似于或者高于尿毒症患者胃肠尿素(氨)浓度下对乳酸菌进行加压驯化，培育出了高效率转化尿素、适应胃肠环境的食品级乳酸菌。获得的驯化菌可以在24小时内，将培养基中的尿素浓度从40.01±1.94mg/dL显著降低到32.99±3.13mg/dL。在维持培养基pH，添加镍盐情况下，进一步将尿素浓度降低到25.73±2.46mg/dL。文档编号A61K35/66GK101235360SQ20081005222公开日2008年8月6日申请日期2008年1月31日优先权日2008年1月31日发明者俞耀庭,孔德领,张素爱,宇白申请人:南开大学