专利名称：丹参总酚酸对微循环障碍引发的疾病的预防和治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药产品丹参总酚酸的新用途，特别涉及丹参总酚酸对微循环障碍引发的疾病的预防和治疗作用。
背景技术：
丹参总酚酸(TSA)是丹参水溶性成分中酚酸类化合物的总称。丹参总酚酸，可应用于制备治疗心脑血管疾病、肾病、肝病、肺炎、肺心病、胰腺炎、糖尿病、颈椎病、眼底血管性疾病、眼底神经性疾病、偏头痛、慢性胃炎、眩晕、骨伤科
疾病、高原疾病、老年痴呆症等的药剂中。丹参总酚酸(TSA)的制备方法有多种，举例如下丹参饮片或丹参粗粉先用水或稀碱于3 0 9 9'C下初提得丹参中的水溶性成分，然后提取液加酸调p H1 6 ，沉淀去除杂质后，直接干燥或浓縮后干燥，得浸膏粉末；干燥所得浸膏粉末用5 0 9 0%乙醇水溶液回流提取1 4次，合并提取液，静置，取上清液，即得高纯度丹参总酚酸溶液；所得溶液直接干燥或浓縮后干燥，即得所述的丹参总酚酸浸膏粉末。
微循环是包括细动脉、毛细血管、细静脉在内的血管床，占体内血管的90%,是维持新陈代谢的重要部分。高脂血症、高血压、感染、精神刺激、跌打损伤、手术、介入治疗等都可以引起微循环障碍。微循环障碍包括血管径变化、过氧化物产生、血管内皮粘附因子ICAM-1、白细胞粘附因子CDllb/CD18表达、白细胞与血管内皮细胞粘附、血浆白蛋白外漏、血管外肥大细胞脱颗粒释放TNF-a、组织胺、5羟色胺、炎性因子等血管活性物质、以及形成血拴、出血等多环节变化的复杂过程。
缺血再灌注损伤是介入疗法、外科手术、溶栓后出现损伤的主要病理基础。缺血再灌注后白细胞与血管内皮细胞黏附、肥大细胞脱颗粒是血管损伤的主要病理环节。
肥大细胞脱颗粒是一型变态反应的主要病理环节，是花粉病，皮肤病，哮喘，腹泻的主要病理基础。
目前，尚不清楚丹参总酚酸对缺血再灌注引起的微循环障碍是否有抑制作用。本研究证明了丹参总酚酸可以改善缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍，从而达到治疗和/或预防微循环障碍引发的疾病的作用，并提供一种中药药物制剂。
发明内容
本发明发现中药产品丹参总酚酸的新用途，特别涉及丹参总酚酸对缺血再灌注引起的肠系膜微循环障碍的预防和治疗改善作用。从而将其应用于治疗和/或预防微循环障碍引发的疾病，如:高脂血症、高血压、感染、精神刺激、跌打损伤、花粉病、皮肤病、哮喘、腹泻、手术或介入治疗等引发的微循环障碍。
本发明发现，丹参总酚酸对再灌注后白细胞的粘附、细静脉血管壁过氧化物、血浆白蛋白血管漏出和肥大细胞脱颗粒的抑制作用。丹参总酚酸还可以浓度依存地抑制过氧化氢诱导的粒细胞黏附分子CDllb/CD18的表达。
本发明所述丹参总酚酸，可以根据现有技术制备，符合药用标准即可。
本发明所述制备的药物，是用上述丹参总酚酸作为药物活性成分制备成的药物组合物。
本发明的药物组合物，以丹参总酚酸作为药物活性成分，同时含有药物可接
受的载体，其中丹参总酚酸在组合物中所占重量百分比是0.1-99.9%，其余为药
物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。
本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。
本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、 EDTA二钠、EDTA钙钠， 一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、
表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、e —环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、
硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如l-20袋或粒或片，每剂lmg-1000mg。本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的
材料和方法
丹参总酚酸由天津天士力制药股份有限公司提供。1、实验动物
200 220g的Wister雄性大鼠由北京大学医学部动物中心提供，试验前禁食12小时，可以自由饮水，动物合格证号SCXK(京)2002- 0001。动物被置于常规词养环境，动物的处理按照北京大学医学部规定的动物处理和伦理方针进行。
2、缺血-再灌注模型的建立及给药
缺血-再灌注组(I/R):按30mg/kg体重的用量，取sodium pentobarbital,施腹腔注射进行麻醉。在大鼠的右侧颈静脉插入3号聚乙烯静脉注射管，并留置。沿腹正中线切开20-30mm，轻柔地将近回盲部的回肠取出腹外,展开至有载玻片的观察台上。用37。C的Krebs-Ringer缓冲液连续地在展开的肠系膜上滴加。肠系膜微循环动态用置于37。C恒温箱的倒立生物显微镜(Di即hot TMD-2S， Nikon，东京)，在12V, 100W的白光条件下观察。在20倍物镜头下选择观察部位,用有时间显示的录像系统，将观察内容用S-VHS录像带纪录保存。选择的观察部位为直径在25-35um之伺的细静脉非分枝部(长度在200u m以上)的微循环血管床。经过10分钟的基础观察之后，用聚乙烯管结扎观察部环流的前肠系膜动静脉10分钟，再解除结扎，将时间调至0处，连续观察同一视野的微循环动态30分钟(2)。假手术组(Sham):将大鼠麻醉开腹，不作缺血-再灌注处理。丹参总酚酸给药组(TSA+I/R):在缺血20分钟前经颈静脉按5 mg/kg/h的给
药量连续静滴入丹参总酚酸至观察结束。每组6只大鼠。
3、微循环动态的观察
微循环动态用连接于倒立生物显微镜的CCD摄像系统(CC-090,Flovel，东京)和SIT萤光摄影机(C-2400-08、滨松7才卜二夕^、滨松)连续纪录。
血管经的测定用video measuring gauge (IV-560, *々工 < 、东京)经时地测血管经。
粘附于细静脉管壁的白细胞数计数:在纪录的图像上，经时地计数在细静脉管壁的同一部位停留30秒以上的白细胞(粘附白细胞)，计算100ym长细静脉上粘附的白细胞数。
细静脉管壁DHR萤光强度测定为了观察过氧化物的产生部位和动态，将过氧化物感受萤光素dihydrorhodamine 123 (以下称DHR、 Molecular Probes、Eugene、 0R、 USA) 10 MM滴加在观察的微循环血管床表面，用SIT萤光摄影机(C-2400-08、滨松7才卜二 ， 7、滨松)，选激起波长420-490 nm、发光波长520 nm，经时地纪录D服氧化后的萤光强度。D冊被细胞内及细胞外产生的H202氧化成可发萤光的rhodamine 123。用digital image processor(NIH Image 1. 35)软件测定测细静脉管壁的DHR萤光强度，以缺血-再灌注前的值为基础值，再以各时限的萤光强度与基础值的比作为过氧化物的指标。
细静脉白蛋白渗出的测定另取大鼠，沿颈静脉缓慢推注FITC-标记的牛血清白蛋白(50mg/kg),基础观察10分钟后，用倒置荧光显微镜观察(DM-IRB， Leica，Germany), 455nm激发光，汞灯作为发射光源(IOOW)。用CD录像机连续记录各组滴注前(O分钟)及滴注10分钟、20分钟、30分钟时细静脉血管内和相邻的血管外间质的FITC荧光图象。用Image-Pro Plus 5. 0软件测定细静脉血管内和相邻的血管外间质的FITC荧光强度，用0分钟时细静脉管壁与血管外间质的FITC荧光的比为基础值。计算各时间点数值与0分钟的比值，用以表示大鼠肠系膜细静脉白蛋白渗出的变化率。
肥大细胞脱颗粒率在缺血-再灌注30分后，将0. 1 % toluidine blue滴加在观察部位，用CCD摄像机纪录。用20倍的对物镜计数5个视野的脱颗粒和未脱颗粒的肥大细胞数，计算脱颗粒的肥大细胞占计数的整个肥大细胞数的百分比，为肥大细胞脱颗粒率。
外周血粒细胞粘附分子CDllb、 CD18的测定另取220-250g的SD雄性大鼠(北京大学医学部动物中心提供，动物合格证号SCXK(京)2002-0001)，禁食饮水12小时后，用20%乌拉坦溶液(北京化学试剂公司，批号040301 )1. 25mg/kg体重肌肉注射麻醉。腹腔注射腹主动脉取血，肝素抗凝(20u/ml全血)。将血样分为正常组、H202添加组、丹参总酚酸(0.21^/1111)+ H202组、丹参总酚酸(0. 5rag/ml)+ H202组、丹参总酚酸(111^/1111)+ H202组，加入FITC标记的CDllb或CD18抗体(BD biosciences Pharmingen, USA)，用溶血素(BD biosciencesImmunocytometer Systems, USA)破碎红细胞，经洗涤后，用流式细胞仪(FACSCalibur, BD company, USA)分选粒细胞，计数5000个细胞，测定FITC标记的抗CDllb或抗CD18抗体的平均荧光强度。
4、统计处理
各测定值用one—way analysis of variance (AN0VA)处理，各组经时变化用T检验,各组间比较用F检验。各测定值用均值士标准误表示，P 〈 0. 05为有
显著意义。
实验结果
1. 丹参总酚酸对再灌注后大鼠肠系膜细动脉和细静脉血管经的影响
在本观察时间内，缺血再灌注组大鼠细动脉和细静脉血管径没有发生显著的变化.丹参总酚酸没有引起再灌注后大鼠肠系膜细动脉和细静脉血管径的显著变化。
2. 丹参总酚酸对再灌注后大鼠白细胞与肠系膜细静脉粘附的抑制作用
如图1所示，Sham组在本观察结束时仅有少量的白细胞粘附于细静脉。I/R组大鼠在再灌注早期就有大量的白细胞粘附于细静脉管壁，随着再灌注的进行，黏附白细胞逐渐增多。丹参总酚酸在再灌注开始时就显著地抑制了白细胞的粘附。
3. 丹参总酚酸对再灌注后大鼠肠系膜细静脉管壁过氧化物的抑制作用。
图2示缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉管壁DHR发光强度的变化和丹参总酚酸的抑制效果。Sham组在本观察期间内，细静脉管壁DHR的萤光强度没有显著的变化。I/R组在再灌注10分后细静脉管壁D冊萤光强度开始增加，并持续增加。丹参总酚酸在再灌注30分时显著地抑制了大鼠肠系膜细静脉管壁DHR萤光强度的增强。
4. 丹参总酚酸对再灌注后大鼠肠系膜细静脉血浆白蛋白漏出的的抑制作用
图3示缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉血浆白蛋白漏出的变化和丹参总酚酸的抑制效果。Sham组在本观察期间内，仅有少量的血浆白蛋白的漏出。1/R组从再灌注10分后细静脉管壁血浆白蛋白漏出开始增加，并持续增加。丹参总酚酸在再灌注30分时显著地抑制了大鼠肠系膜细静脉血浆白蛋白漏出的增强。
5. 丹参总酚酸对再灌注后大鼠肠系膜间质肥大细胞脱颗粒的的抑制作用
图4示丹参总酚酸对再灌注后肠系膜间质肥大细胞脱颗粒的影响。在再灌注30分后、与假手术组比、1/R组的肥大细胞脱颗粒率显著增加。丹参总酚酸在可以显著地抑制肥大细胞脱颗粒。
6. 丹参总酚酸对过氧化氢诱导的大鼠外周血粒细胞黏附分子CDllb/CD18表达的的抑制作用图5示丹参总酚酸对过氧化氢诱导的大鼠外周血粒细胞黏附分子CDllb/CD18表达的影响。与对照组相比，过氧化氢添加组的粒细胞黏附分子CDllb和CD18的表达都显著地升高。丹参总酚酸0. 5mg/ml以上的浓度，可以浓度依存地抑制过氧化氢诱导的粒细胞黏附分子CDllb和CD18的表达。
缺血再灌注后大鼠肠细膜血管径没有显著变化，而粘附在细静脉管壁上的白细胞数、细静脉血管壁DHR萤光强度、FITC标记血浆白蛋白血管漏出率和血管外间质组织中的肥大细胞脱颗粒率显著增加。丹参总酚酸可以抑制白细胞的粘附、抑制细静脉血管壁过氧化物、血浆白蛋白血管漏出和肥大细胞脱颗粒。丹参总酚酸可以浓度依存地抑制过氧化氢诱导的粒细胞黏附分子CDllb/CD18的表达。
总之，本发明表明，丹参总酚酸可以可以预防和治疗缺血再灌注引起的微循环障碍。从而将其应用于治疗和/或预防微循环障碍引发的疾病，如高脂血症、高血压、感染等以及因精神刺激、跌打损伤、花粉病、皮肤病、哮喘、腹泻、手术或介入治疗等引发的微循环障碍。
图1表示Sham组在本观察结束时仅有少量的白细胞粘附于细静脉。
图2表示缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉管壁DHR发光强度的变化和丹参总酚酸
的抑制效果。
图3表示缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉血浆白蛋白漏出的变化和丹参总酚酸的抑制效果。
图4表示丹参总酚酸对再灌注后肠系膜间质肥大细胞脱颗粒的影响。
图5表示丹参总酚酸对过氧化氢诱导的大鼠外周血粒细胞黏附分子CDllb/CD18
表达的影响。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例l '片剂
处方丹参总酚酸105g 微晶纤维素55g 微粉硅胶3g
硬脂酸镁1.5g制法取原、辅料分别过100目筛；丹参总酚酸、微晶纤维素，混匀，用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，6(TC干燥，取出，过30目筛整粒，加入微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。
实施例处方丹参总酚酸85g 硫酸钙118g 微晶纤维素37g
微粉硅胶2.4g 硬脂酸镁1.2g
制法取原、辅料分别过100目筛；取丹参总酚酸、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60°C干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。实施例处方丹参总酚酸133g 硫酸钙 208g 微晶纤维素 68g
微粉硅胶 5g 硬脂酸镁 2.5g
制法取原、辅料分别过100目筛；取丹参总酚酸、硫酸钙、微晶纤维素，混匀，用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60°C干燥，取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，即得。实施例4胶囊
取丹参总酚酸60g，加入适量淀粉，硬脂酸镁等辅料，制粒，整粒，装入1号胶囊，即得。实施例5口服液
取丹参总酚酸7g，加入适量蔗糖，防腐剂，加水到1000ml，分装成10ml—支，
即得口服液。
实施例6
颗粒剂
取丹参总酚酸83g，加入适量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分装，即得。实施例7注射剂
取丹参总酚酸8.5g，加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH值。注射用水稀释至1000ml,用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。实施例8注射剂
丹参总酚酸2g,加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水溶解，混匀，调pH值。注射用水稀释至1000ml,用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。
权利要求
1、丹参总酚酸或其药物组合物在制备一种治疗和/或预防微循环障碍引发的疾病的药物中的应用。
2、 权利要求l的应用，其特征在于，丹参总酚酸对再灌注后白细胞与肠系膜细静脉粘附有抑制作用。
3、 权利要求l的应用，其特征在于，丹参总酚酸对再灌注后肠系膜细静脉管壁过氧化物有抑制作用。
4、 权利要求l的应用，其特征在于，丹参总酚酸对再灌注后肠系膜细静脉血桨白蛋白漏出有抑制作用。
5、 权利要求l的应用，其特征在于，丹参总酚酸对再灌注后肠系膜间质肥大细胞脱颗粒有抑制作用。
6、 权利要求l的应用，其特征在于，丹参总酚酸对过氧化氢诱导的外周血粒细胞黏附分子CDllb/CD18表达有抑制作用。
7、 权利要求l的应用，所述应用是对高脂血症、高血压、感染、精神剌激、跌打损伤、花粉病、皮肤病、哮喘、腹泻、手术或介入治疗引发的微循环障碍的应用。
8、 权利要求l的应用，其特征在于，所述药物组合物，以丹参总酚酸作为药物活性成分，同时含有药物可接受的载体。
9、 权利要求8的应用，其特征在于，所述药物组合物可作为任何可药用的剂型。
10、 权利要求9的应用，其特征在于，所述剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
全文摘要
本发明涉及中药产品丹参总酚酸的新用途，特别涉及丹参总酚酸对微循环障碍引发的疾病的预防和治疗作用。
文档编号A61P19/00GK101574392SQ20081005299
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月5日 优先权日2008年5月5日
发明者杨继英, 俊 郭, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司