专利名称：对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及从黑紫橐吾中分 离得到的两个对映艾里莫芬垸酸组成的混合物及其可药用盐以及药物 组合物。该天然产物具有抑制乙肝表面抗原活性，可预期制备治疗乙肝 病毒感染疾病和抗乙肝病毒药物中的药物用途。技术背景乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的传染病。通过血液与体液传播， 具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89 亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严 重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化， 少数病人可转变为原发性肝癌。现在乙型肝炎的治疗主要有核苷类药 物、保肝类药物和免疫制剂等，但均不能完全控制病情的进展。目前核 苷类药物中最常用也是最有效的是拉米夫啶，但其长期使用可导致耐药 性，停药后易反跳，这严重影响了药物的疗效。目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀 灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物还存在 毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点，因此开发新 型抗病毒药是当今药物研发领域的当务之急。橐吾属(Ligularia genus)是菊科的一个小属，全属约130种，绝 大多数种类产于亚洲，仅2种分布于欧洲，另有齿叶橐吾[Ligularia dentate (A. Gray) Hara]在英国有栽培或逸生。我国有111种，大部分种类集中于西南地区。本属一些种类的根含橐吾醚、橐吾醚醇、橐吾 醇、艾里橐吾醇、橐吾酮、橐吾内酯等化学成分，并以紫苑或山紫苑之 名入药。主治支气管炎、哮喘、肺结核、咯血、肝炎等症[S. W. Liu， 中国植物志。科学出版社，1989，第4页]。在橐吾属植物中倍半祐的含 量较高。人们从该属植物中分得了多种新的倍半萜类化合物，其中不少具有各种各样的生物活性，这对我们进一步寻找新骨架倍半萜以及新的 活性靶点，提供了雄厚的物质基础。黑紫橐吾[Ligularia atroviolacea (Franch.) Hand.-Mazz.]为多 年生草本植物。根肉质，多数。茎直立，不分枝，高25-60厘米，被密 的黑紫色有节长柔毛，上部近花序处混生白色蛛丝状毛，基部直径3-5 毫米，被枯存叶柄纤维包围。小花全部管状，多数，黄色，长6-7毫米， 管部长约3毫米，冠毛淡黄色，与花冠近等长。瘦果圆柱形，长约5毫 米，光滑。花果期8-12月。产于云南西北部。生于海拔3000-4000米 的冷杉林下、高山草地[S. W. Liu，中国植物志。科学出版社，1989，77 页，41页]。云南民间用于清热解毒及治疗感冒、咳嗽用。本发明人在对 菊科橐吾属植物和菊科千里光属的提取及化学成分研究中，曾经发现其 中含有大量的艾里莫芬烷内酯，如近年来发明人发现岩生千里光中的艾 里莫芬烷内酯具有对肿瘤细胞HL-60， A549和KB株均有一定的细胞毒 性(赵昱等，Chinese Chemical Letters, 2002年，13巻第4期，333-334 页)。此外，本发明人还报道了鸡足千里光的几个艾里莫芬烷内酯也对 KB肿瘤细胞株和A549细胞株有一定的细胞毒性(赵昱等，Chinese Chemical Letters, 2002年，13巻第8期，754-757页;赵昱等，Chinese Chemical Letters, 2005年，16巻第3期，362-364页)。但是，对于 黑紫橐吾的化学成分研究和生物活性研究尚少见报道。黑紫橐吾的化学 成分研究至今只有一篇文献报道[R. Hanai等，Chemical and genetic study of Ligularia tongolensis， Ligulaxia cymbulifera and Ligularia atroviolacea in the Hengduan mountains of China. Bulletin Chemical Society of Japan, 2005， 78， 1302—1308],作者 使用薄层层析TLC检出其中主要成分为Ehrlich反应呈阳性的化合物， 而这些化合物由于稳定性差而难于分离，所以作者采用液相层析与质谱 联用(LC-MS)以及液相层析与核磁共振波谱联用(LC-画R)等技术结 合1H-1HC0SY以及HSQC等二维波谱技术手段鉴定出其中三个主要成分 为呋喃雅槛蓝烷倍半萜3 e -当归酰基-呋喃并艾里莫芬烷-15， 6 a -内 酯、3P,6e-二当归酰基-呋喃并艾里莫芬垸-15酸和3P-当归酰基 -60-(3-甲基丁酰基)呋喃并艾里莫芬垸-15酸。而迄今，尚未见科研人 员对该植物进行深入以及系统的化学和药理活性研究，因此选用该植物 进行化学成分和有关的药理活性研究，是一种比较理想的选择，不仅可以填补历史空白，还可以为以后更进一步的研究提供事实依据。本发明人在现有技术的基础上作了进一步的研究，发现从橐吾属药 用植物黑紫橐吾中提取的两种艾里莫芬型倍半萜酸异构体具有显著的 抑制乙肝表面抗原乙肝病毒作用，并经文献查阅，到目前为止，尚没有 有关该化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。 据此完成本发明。发明内容本发明的目的是提供了由式(卜a)和式(l-b)所示的两个对映艾 里莫芬垸酸组成的混合物及其可药用盐，以及含有该二化合物的药物组 合物或其溶剂化物，具体地说是该两个对映艾里莫芬烷酸在治疗乙肝病 毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物中的应用。<formula>formula see original document page 5</formula>式(l-a)式(1-b)其中式(1-a)化合物为10 0-氢-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯 -12，15-二酸；式(1-b)化合物为lOci-氢-8-酮-艾里莫芬垸 -3 (4) ， 6 (7) -二烯-12, 15-二酸。本发明中式(l-a)和式(1-b)所示对映艾里莫芬烷酸优选从菊科 橐吾属植物中分离纯化得到。本发明的又一目的是提供了式(1)化合物用于制备降低乙肝表面 抗原、防治乙型病毒性肝炎的药物用途；本发明的另一个目的是提供了一种用于降低乙肝表面抗原、防治乙 型病毒性肝炎的药物组合物或者它的可药用盐和可药用辅料及溶剂化 物，其特征为含有治疗有效量的作为活性成分的由式(1-a)和式(l-b) 化合物组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾 剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或 软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明中式(1-a)和式(l-b)化合物来源可以是黑紫橐吾Ligularia atroviblacea (Franch.) Hand. -Mazz.的任一部位，即可以是其根、茎、 叶、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物。优选其地下部分。
具体实施方式
本发明人对该植物提取物通过多种正、反相层析手段得到该有效抑 制乙肝表面抗原(HBsAg)的分泌活性的一个活性化合物，又经红外、 质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构为前人未报道 过的两个结构新颖的艾里莫芬垸酸倍半萜对映体。本发明人发现，采用 MTT法测定式(l-a)和式(l-b)化合物对H印G2. 2. 15细胞生长的抑制 作用，从黑紫橐吾中提取的式(l-a)和式(l-b)化合物对H印G2.2.15 细胞生长的无明显抑制作用，而对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙肝表面抗 原(HBsAg)的分泌具有显著的抑制作用，提示式(1-a)和式(l-b) 化合物具有用药安全、降低乙肝病毒表面抗原高效的特点。因此，根据 本发明人的研究，从黑紫橐吾中提取的式(l-a)和式(1-b)化合物可 以用于治疗乙肝病毒感染性疾病和用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病 的药物。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(卜a)和式(l-b) 化合物对H印G2. 2. 15细胞生长抑制作用以及对H印G2. 2. 15细胞分泌的 HBsAg之抑制作用试验的结果，说明其在制药领域中的新用途。其中Me 代表甲基(CH3) ， 0Et代表乙氧基(0CH2CH3)。实施例给出了式(l-a) 和式(l-b)化合物的部分活性数据。必须说明，本发明的实施例是用 于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行 的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1:式(卜a)化合物10e-氢-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二 烯-12，15-二酸以及式(1-b)化合物lOa-氢-8-酮-艾里莫芬烷 -3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸的制备1. 1仪器与试剂熔点用显微熔点仪(北京泰克公司生产)测定，温度未校正；旋光在 日本产Polax-2L型自动旋光仪上测定；红外光谱IR由BrukerVector-22红外光谱仪测定，经KBr压片；紫外光谱用Shimadzu UV-240 紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱1H-丽R，核磁共振碳谱13C-丽R 和2D丽R由IN0VA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN INOVA-400 MHz) 测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200， 200-300和300-400目)以 及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均由青岛海洋化工厂生产；所用试 剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C;薄层制备层析(PTLC)用 Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用聚酰胺(14-30和100-200目)采用 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂产品；葡聚糖凝胶S印hadex LH-20 采用瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司产品；反相硅胶RP-18 采用日本Fuji Silysia Chemical公司的Chromatorex产品；MCI为日 本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254mn和365nm的紫外灯；显 色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。1.2提取与分离供提取用黑紫橐吾药材地下部分于2001年8月采自于云南丽江境 内。取5. 0公斤干燥的黑紫橐吾Ligularia atroviblacea (Franch.) Hand. -Mazz.地下部分粉碎成粉末，加50升95%乙醇浸泡。在室温下浸 泡3次，每次7天。乙醇提取液合并，减压回收溶剂至干得到462克浸 膏，用3公升水分散，再依次用60—90。石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃 取。减压回收醋酸乙酯提取液得到89.0克浸膏。该浸膏用800克100 一200目硅胶柱层析，氯仿一甲醇(50: 0—0: 1)梯度洗脱。薄层层析 检测合并相同流份，含有式(1)化合物的部分浸膏再经制备薄层(60 一90°，石油醚一醋酸乙酯4: 1)继以葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱层 析纯化(甲醇洗脱)，最终得到45毫克式(1)化合物。丄3结构鉴定化合物(1-a)为白色粉末状固体，ESI-MS显示分子离子峰m/z 279 [M+H]+，结合13C-腿R谱和1H-匪R谱显示的碳以及氢的个数，推算出化 合物(1-a)的分子式为"H1805，氢谱中显示两个甲基，从化学位移以及 裂分情况显示化合物(l-a)为一艾里莫芬烷类倍半萜。在薄层TLC板上 溴甲酚绿显蓝色，说明化合物中具有羧基。1H-腿R谱的低场区显示两个烯氢[S 7.37 (1H,单峰)，H-6; 7.17 (1H,三重峰，J".0Hz)， H-3] 的信号，表明与此两烯碳相邻的碳原子分别为季碳和叔碳，结合13C-NMR 谱中低场区出现的几对碳信号[S 142.9 (CH)， 135.9 (C) ， 17L 9 (C) 和S 152.8 (CH)， 132.9 (C)， 197.3 (C)]显示化合物中具有3 (4)-烯 -15酸和6(7)-烯-8-酮基团。此外，13C-画R谱还显示结构中存在饱和 羧基(S 180.5)。从1H-丽R谱中H-11的化学位移向低场移动[S 3.85 (四重峰，J = 7. 2 Hz)]，可推测12位甲基被氧化成羧基。考虑到1H-丽R 谱中两个甲基信号分别出现在5 1.27 (双峰，J二7.2Hz)和S 1.51(单 峰)，初步判断化合物(1-7)的骨架是含8-酮-3(4)，6(7)-二烯-12, 15-二酸[8-oxo-3(4)，6(7)-dien-12， 15-dioic acid]结构的艾里莫芬烷类 化合物。化合物结构确定的难点是10-H构型的确定，化合物(1-a)的谱 图数据与化合物10 e -H-3 P -angeloyloxy-8-0X0-eremophi 1-6 (7)-en-12 oic acid的数据非常相似仅有的区别在于化合物(1-a)中3位脱 去当归酰基生成双键且15位的甲基被氧化成羧基。通过与10位氢构型 不同的已知化合物的1H-丽R谱和13C-丽R谱进行对照，确定IO位为3 _ 构型。因此，化合物(1-a)的结构最终被确定为10 P -氢-8-酮-艾里莫芬 烷-3(4)，6(7)- 二烯-12， 15- 二酸H-8-0X0-eremophi1-3(4)， 6(7)_dien-12， 15-dioic acid]。化合物(1-b)的1H-丽R和13C-丽R谱与化合物(1-a)的非常相似， 根据13C-丽R和DEPT谱可得出化合物(l-b)中共有15个碳，包括2 X CH3， 3XCH2， 4XCH(含两个烯氢)，6XC(含两个羧基和一个酮基)，也与化合 物(1-a)的元素构成相同，这表明化合物(1-b)可能是化合物(l-a)的的 一个对映异构体。进一步比较化合物(1-b)和化合物(l-a)的1H-丽R和 13C-丽R谱数据，也验证了这一推测。二者在薄层TLC板上在不同的体 系下均为一个斑点存在，难以分离，因此是和化合物(l-a)以混合物的 形式存在(从1H-丽R和13C-丽R谱上信号峰的强度可以初步推断出质量 比约为2: 3)。化合物(1-b)和(l-a)在HPLC上也很难达到基线分离，且 紫外UV扫描图谱十分相似，因此也可以推断出两化合物为结构非常相 似可能为一对映异构体。二者13C-匪R谱数据最显著的差别是化合物 (1-b)中C-IO的次甲基的信号由S 36.4向低场位移至S 39.4，而C-14 (S 15, 6)和C-13 ( S 26. 6)较(1-a)的(5 16. 9和S 27. 2)略向高场位移。 另外，在1H-丽R谱中，化合物(1-b)的Me-14信号由于A/B环稠合方式的改变而向低场位移。其它C和H的化学位移也或多或少的发生了变化。 所有这些数据表明，化合物(l-b)的10-H应是ci-构型。因此，化合物(卜b)的结构被鉴定为10(1-氢-8-酮-艾里莫芬烷 -3 (4) ， 6 (7) - 二烯-12， 15- 二酸[10 a 8-oxo-eremophi 1-3 (4) ， 6 (7) -dien-12， 15-dioic acid]。10 P -氢-8-酮-艾里莫芬垸-3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸[10 e -H-8-oxo-eremophil-3 (4), 6 (7) -dien-12， 15-dioic acid (I-a)]:白色粉 末；C15H1805;紫外光谱UV A max (CHC13) : 216， 240 (肩峰)nm;电 喷雾质谱ESI-MSm/z: 279 [M+H] + ;红外IR v盟;(cm-1) : 3184， 1741， 1728， 1663:核磁共振氢谱1H-NMR (CDC13, 400 MHz) S 1.27 (3H,双 峰，J 二 7. 2 Hz, H-13)， 1.51 (3H，单峰，H-14), 1.28 (1H，多重峰，H-la)， 1.52 (1H，多重峰，H-lb)， 1.97 (1H，多重峰，H-10P)， 2.24 (1H，多 重峰，H-2a)， 2.31 (IH，多重峰，H-2b)， 2.31 (1H，双双峰，J = 16.4， 4.8HzH-9a)， 2.50 (1H，双双峰，J = 16. 4， 4. 8 Hz， H—9b)， 3.85 (1H, 四重峰，J二7.2Hz， H-ll)， 7.17 (1H，三重峰，J 二 4. 0 Hz， H_3)， 7.37 (1H，单峰，H-6);核磁共振碳谱13C-應R (CDC13， 100 MHz) S 17. 0 (q， C-13)， 22.3 (t， C-l)， 22.7 (t， C-2) ， 27.2 (q, C-14), 36.4 (d， C-10)， 38.1 (C—5, s), 39.3 (t， C—9)， 40.2 (d， C一ll)， 132.9 (s， C—7)， 135.9 (d， C一4)， 142.9 (t， C一3)， 152.8 (t， C—6)， 171.9 (s, C-15)， 180.5 (s， C-12), 197.3 (s, C-8)。10 ci -氢-8-酮-艾里莫芬烷-3 (4) ， 6 (7) -二烯-12， 15-二酸[10 a -H-8-oxo-eremophil-3 (4) ， 6 (7) -dien—12, 15-dioic acid (I-b) ] 白色粉 末；C15H1805;紫外光谱UV入max (CHC13) : 220， 240 (肩峰)nm;电 喷雾质谱ESI-MS m/z: 279 [M+H] + ;核磁共振氢谱1H-丽R (CDC13, 400 MHz) S 1.31 (3H，双峰，J = 7.2Hz， H-13)， 1.52 (3H，单峰，H-14)， 1.36 (1H，多重峰，H-la)， 1.59 (1H,多重峰，H-lb)， 1.89 (1H，多重 峰，H-10ci)， 2.26 (1H，多重峰，H-2a)， 2.32 (1H，多重峰，H-2b)， 2.32 (1H,双双峰，J=16.4， 4.8Hz， H-9a)， 2.51 (1H，双双峰，J 二 16.4， 4.8 Hz, H-9b)， 3.49 (1H，四重峰，J = 7. 2 Hz, H—11), 7.37 (1H，三 重峰，J二4.0Hz, H-3)， 7.24 (1H，单峰，H-6) ; 13C-應R (CDC13, 100 MHz) S 15.6 (q, C—13)， 22.7 (t， C-l)， 23.5 (t， C—2)， 26.6 (q， C-14), 39.7 (d， C-10)， 38,5 (C-5， s), 39.4 (t， C-9)， 40.5 (d， C-11)133.2 (s， C-7)， 135.2 (d， C一4), 143,8 (t， C—3)， 152.8 (t， C—6)， 171.2 (s， C—15)， 179.4 (s， C—12)， 198.3 (s， C一8)。实施例2:由化合物(l-a)和(l-b)组成的混合物对H印G2. 2. 15细胞分泌 的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。1) 细胞培养将H印G2. 2. 15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/ml青霉素和 100 u g/ml链霉素，100 u g/mlG418的DMEM培养基中，置37°C， 5%C02， 100 %相对湿度的培养箱中培养。2) 采用MTT法测定由式(l-a)和式(l-b)化合物组成的混合物对 H印G2. 2. 15细胞生长的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成IX 105/ml,接种于96孔细胞培养板，每孔100ul，在37i:， 5% C02， 100 %相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的由化合物 (l-a)和U-b)组成的混合物，浓度分别为誦ug/ml， 200ug/ml， 40ug/ml和8ug/ml，每孔200ul，每个浓度设三个复孔，置于37。C， 5%C02, 100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入 5mg/mgMTT试剂10ul，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMS0 200ul，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定0D值。 以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(%)=对照孔0D值-实验组0D 值)/对照孔0D值X10(m。实验重复三次。测定上述混合物对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。取对 数生长期的H印G2.2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成lX105/ml，接种 于96孔细胞培养板，每孔100ul，在37。C， 5%C02， 100%相对湿度 的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的样品，浓度分别为 100 u g/ml， 20 u g/ml和40 u g/ml，每孔200 u 1，每个浓度设三个复孔， 置于37。C, 5% C02， 100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同 浓度样品的培养基，将同 一样品同 一浓度的换出的培养基等体积混匀， 作为待测样品。用ELISA试剂盒测定培养基中乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照。3)实验结果实验结果如表1所示，从黑紫橐吾中提取得到的由式(1-a)和式 (l-b)化合物组成的混合物有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 的作用。其对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，但对H印G2. 2. 15 细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg在第八天时高、中、低剂量下抑制 活性都高于拉米呋啶。表l.样品对他 02.2.15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)懒摔(％)样品浓度Ug/mL)HBsAg卿库(％)第四天第八天式(1-a)和式(l-b) 化合物组成的混合物10020442. 51 25. 5748. 52 33.59 9.23拉米呋啶(3TC)100 20417. 28/ /10. 54该实施例结果说明式(l-a)和式(1-b)化合物组成的混合物对 H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著的抑制作 用，可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的 药物。
权利要求
1.由式(1-a)和式(1-b)所示的两个对映艾里莫芬烷酸组成的混合物及其可药用盐，其特征为式(1-a)化合物的名称为10β-氢-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯-12，15-二酸；式(1-b)化合物的名称为10α-氢-8-酮-艾里莫芬烷-3(4)，6(7)-二烯-12，15-二酸。
2. 根据权利要求1所述之对映艾里莫芬烷酸及其可药用盐或其溶剂化 物，其用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途。
3. —种用于制备治疗乙型病毒性肝炎病毒感染的相关症状或疾病的药 物组合物，其含有作为活性成分的治疗有效量的权利要求1所述之 对映艾里莫芬烷酸及其可药用盐或其溶剂化物和可药用载体。
4. 根据权利要求3的药物组合物，其可以是片剂、颗粒剂、胶囊、口 服液、洗剂、栓剂、擦剂、注射剂、透皮贴剂或气雾剂，还可以采 用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及从黑紫橐吾中分离得到的由两个对映艾里莫芬烷酸组成的混合物及其可药用盐以及药物组合物。由于该对映艾里莫芬烷酸具有抑制乙肝病毒表面抗原活性，可预期用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病的药物用途。
文档编号A61K31/194GK101239054SQ20081006004
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者艳 徐, 施树云, 李校堃, 王彩芳, 王晓雨, 约阿施·史托克希特, 昱 赵, 黄可新 申请人:温州医学院