雷公藤氯内酯醇T₄的新用途的制作方法

专利名称：雷公藤氯内酯醇T₄的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及雷公藤氯内酯醇T4治疗/预防神经免疫炎症性疾病的用途，尤其涉及雷公籐氯内酯醇T4在治疗/预防内毒素脂多糖和AP卜"介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎症性疾病的新用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以记忆和认知功能 障碍为主要临床特征的常见的神经变性疾病，其严重危害中老年人身心 健康，主要病理特征为相关脑区内大量的神经炎性斑块(Neuritic plagues, NPs)和神经元内神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)的形成，以及神经元和神经突触的丟失。虽然引起AD的病因和发 病机制目前尚未完全阐明， 一般认为P -淀粉样蛋白(amyloid-beta, A 13)是AD主要的致病因素，所以"AI3级联反应学说，，已为大多数学者所 接受，即各种原因所导致的Ap代谢异常，引起A^在脑组织的异常积聚， 进而触发了与AD病理生理、生化相关的级4关反应，最终导致神经元的损 害。AP在体内有单聚体、寡聚体和凝聚态(纤丝状)几种存在方式， 研究发现寡聚态的A^比纤丝状、单聚体的A(3更具有神经毒性，对包括 学习记忆的神经生理破坏作用更为广泛。同时，研究表明AD的发生与发 展与A (3介导的胶质细胞相关的免疫异常密切相关。研究A P激活小胶质细胞的相应环节，对于探讨神经免疫机制在AD 发生、发展中的作用以及寻找药物干预具有重要的意义。AD患者脑内A P代谢及其清除异常，引起AP的异常沉积，激活小胶质细胞的非特异 性免疫反应并介导神经元损伤，促进AD病理、病程M。 A(3诱导小胶 质细胞活化过程中的信号转导机制涉及丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK ) 家族成员的p3讓PK、 ERK1/2和JNK,它们参与介导许多炎症介质(如 胂瘤坏死因子cx (TNF-a)、白细胞介素(IL-1))的释放，而TNF-a、 IL-1又可作为下游信号分子介导促炎症细胞因子的作用。AI3与小胶质 细胞表面相关"受体"结合引发一系列的信号级联反应，最终可激活 了调节免疫和炎症反应的核转录因子的NF-kB,其在A(3介导的小胶质 细胞炎症反应引起神经元损伤过程起关键作用，其活化后调控下游含有 NF-kb结合序列的耙基因的转录表达，包括TNF-a、 iN0S、环加氧酶2 (Cyclooxygenase， C0X-2) 、 IL-1等。到目前为止AD的治疗仍缺乏j效的药物，虽然胆石威脂酶抑制剂和 薩DA受体拮抗剂是当前临床上常用的主要治疗药物，能不同程度地改善 AD病理晚期病人的认知和记忆功能，〗旦不能阻止AD早期病理发展的进程和延緩病情进展。雷公藤氯内酯醇(tripchlorolide， TJ是中药雷公 藤中提取或以先导化合物一雷公藤内酯醇(triptolide， T1())经羟基酰 化并氯化修饰后得到的减毒单体，其不仅提高了母体化合物的溶解性， 也使毒性大大降低，而且免疫抑制活性得到提高。以往研究已发现1、 T,类似物雷公藤内酯醇(T,。)能促进外周移植神经的存活。2、雷公藤多 苷(TWP)腹腔注射能改善AD样大鼠的学习记忆障碍并减少胶质细胞的 数量。3、腹腔注射T,。显著延緩内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)介导的多巴胺能神经元损伤、改善动物的行为能力，并抑制LPS引 起的脑内补体受体C3 (0X-42)的表达和炎症性细胞因子TNF-ot和IL-1 (3的生成。4、雷公藤类似物(LLDT-8)显著抑制LPS诱导的RAW 264. 7 小鼠腹腔巨噬细胞p3脂APK、 ERK1/2和JNK磷酸化从而减少诱导型一氧 化氮合酶(iN0S)的产生。提示雷公藤提取物具有调节经典的炎症性信号 转导通路的作用。但有关雷公藤氯内酯醇L对LPS或寡聚态A (3卜42诱导 的胶质-炎症反应对神经元的毒性损伤是否具有保护作用及其具体的药 理靶点和机制目前还未明确。因此，L在该领域具有很高的研究、开发 价值和应用前景。多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种高复发率、高致残率 的中枢神经系统(CNS)脱髓鞘疾病。发病机制与CD/T淋巴细胞介导的CNS 免疫反应有关，发病关键是血-脑脊液屏障受破坏，炎性细胞进入中枢 神经系统。实验性变态反应性月卤脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是研究MS的理想动物才莫型。外源性的糖皮质 激素在抑制EAE血-脑脊液屏障损伤，减少主要组织相容性复合物II (應C- II)在小胶质细胞和血管周细胞的表达，抑制LPS诱导的EAE模型 的iN0S和NO的增加，诱导平衡EAE免疫的Th2反应，促进免疫反应T 细胞凋亡等方面都具有重要作用。外源性的糖皮质激素对EAE发病的关 键因子一单核细胞趋化蛋白—l (monocyte chemokine protein, MCP-1) 的mRM表达也有抑制作用。目前研究已发现1、雷公藤内酯醇(L。) 可兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴的下丘脑，启动内源性糖皮质激素，从 而发挥T10对EAE的抑制作用。2、雷公藤内酯醇L。、 DXM剂量减半后 联合使用，可降低EAE的发病率和临床评分，并抑制MCP-1 mRNA表达。 3、单独应用雷公藤内酯醇L。或LLDT-8均减少EAE模型的发病率和严重 程度。LLDT-8治疗EAE的机制与其抑制T细胞反应及减少IL-2和IFN-Y的产量有关。而雷公藤内酯醇L。能明显抑制脾单核细胞和脊髓组织 Thl/Th(IL-17)和Th2细胞因子的mRNA表达。目前有关雷公藤氯内酯 醇L对多发性硬化病理过程中小胶质活化是否有抑制作用及对神经元是 否具有保护作用也尚未明确。因此，雷公藤内酯醇T,在该领域同样具有 很高的研究、开发价值和应用前景。格林-巴利综合症(Guillain-Barre Syndrome, GBS)是一种常见的周围神经系统(PNS)脱髓鞘疾病。GBS由细胞免疫和体液免疫介导，致病 性抗体目前被认为是最主要的损害机制。实验性变态反应性神经炎 (experimental autoimmune neuritis, EAN)是研究GBS发病机制的理 想动物模型。EAN发病中，致敏T细胞通过血-神经屏障，在神经内膜 与主要组织相容性抗原MHCII型结合，分泌多种细胞因子，作用于单核， 巨喧细胞、淋巴细胞、粒细胞和血管内皮细胞，引起以单个核细胞浸润 为主的炎症反应。目前研究已发现1、雷公籐多苷(TWP)在免疫机制 中的多个环节上调节免疫应答。TWP对ConA诱导的T淋巴细胞增殖，IL-2 的产生和抗体免疫复合物的形成均有明显抑制作用。2、 TWP在EAN中可 通过抑制B7-1及B7-2基因转录或转录以上环节，抑制CD28的翻译或 翻译水平以上环节，从而抑制CD28 - NF- k B信号途径来抑制免疫反应。 综上所述，大量的基础研究和许多的临床研究显示雷公藤提取物对 于神经免疫炎症过程具有明显的抗炎和免疫调节作用，但由于雷公藤的 粗提物的毒性作用大，限制了其临床应用。发明内容本发明的目的在于提供一种雷公藤氯内酯醇L新用途，具体为雷公 藤氯内酯醇L在制备治疗/预防内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和(3淀粉样肽H2(A P卜42)介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎 症性疾病的药物中的应用。所述神经免疫炎症性疾病为阿尔茨海默病、多发性硬化、急性播散 性脑脊髓炎或格林-巴利综合症。所述的神经毒性作用是指内毒素脂多糖介导的神经元损伤。所述的神经毒性作用是指寡聚态A |3卜"介导的神经元损伤。所述的神经毒性作用是指内毒素脂多糖和/或寡聚态A (3卜《诱导的 胶质-炎症反应对神经元的早期损害作用。本发明的雷公藤氯内酯醇L一般以药物組合物的形式使用，这种组 合物含治疗有效剂量的作为活性成分的雷公藤氯内酯醇T4和可药用辅 料。含有雷公藤氯内酯醇L的药物组合物可通过口服、注射或粘膜给药， 可以制成片剂、胶嚢、粉剂、颗粒、锭剂等剂型供临床应用。上述各种 剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。雷公藤氯内酯醇L较雷公藤粗提物相比，毒性大大下降，具更强的 免疫抑制作用和抗炎活性，并具备了分子量小、亲脂性高等能透过血-脑、血-神经屏障的特性。本申请提供了中药单体雷公藤氯内酯醇L具有以下功能可减轻 LPS和寡聚态A P卜42诱导的胶质炎症反应对神经元的早期损害，保护神 经细胞的存活，减少神经元凋亡；可减轻LPS和寡聚态A(3卜"诱导的小 胶质细胞的iN0S和C0X-2表达；减轻寡聚态AP卜"对NF-k B和JNK信号通路的激活作用，有助于减少炎症病理对神经免疫炎性疾病进程中神经元的损害、改善神经功能缺损的症状。从而为雷公藤氯内酯醇T4应用，阿尔茨海f犬病、、多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、格林-巴利综 基础，既有很强的科学性和创新性，又有4艮高的开发应用价值。


图1:雷公藤氯内酯醇T4对神经元和小胶质细胞存活的影响。T4 (0-80nM)处理原代皮层神经元(孕16天，体外培养第6天)、Neuro-2A神 经细胞、原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞48h，细胞活力用MTT还 原法检测，值用均数土标准差(mean土S.D.)表示(n-5/组)。*P<0. 05， **P<0. 01或***P<0. 001对照组比较。图2.1:雷公藤氯内酯醇L对寡聚态A P卜42激活的小胶质细胞条件 培养液引起的神经毒性的影响。(A)神经细胞和小胶质细胞的存活力检 测原代皮层神经元(孕16天，离体培养第6天)、Neuro-2A神经细胞、 原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞用寡聚态Ap卜42 (0.2, 1.0， 5.0ja M)处理48h,细胞活力用MTT还原法检测。(B)小胶质细胞条件培养液(CM) 对神经细胞活力的影响单独含寡聚态A^-42 (1. OjuM)的培养液置于空 白培养板、寡聚态AP卜"(1. OiliM) (AP-CM)和等体积HBSS (HBSS-CM) 诱导小胶质细胞24h后，培养液转移到原代皮层神经元和Neuro-2A神经 细胞，继续培养48h。
(C) T4处理的小胶质细胞条件培养液(T4-CM)对 原代皮层神经元活力的影响。(D) T4处理的小胶质细胞条件培养液 (T4-CM)对Neuro-2A细月包活力的影响。Neuro-2A细月包活力^r测用MTT还 原法；原代皮层神经元用抗FITC-MAP-2抗体染色计数法。值代表均数土 标准差(mean ± S. D.)并用直方图表示。M#^0. 001与对照组(HBSS-CM) 比较；**代0. 01, ***代0. 001，与模型组(A P -CM)比较。图2.2:雷公藤氯内酯醇L对LPS诱导的小胶质细胞条件培养液引 起的神经毒性的影响。(A)原代皮层神经元(孕16天，离体培养第6天)、 Neuro-2A神经细胞用LPS (0.1,1.0,10 p g/ml)处理48h， MTT还原法 检测细胞活力。(B，C)雷公藤氯内酯醇L及其LPS处理的小胶质细胞条 件培养液对神经细胞活力的影响单独含LPS (1. 0jLig/ml)的培养液置 于空白培养板、LPS (1. 0jug/ral) (LPS-CM)和等体积HBSS(对照组) (HBSS-CM)诱导原代小胶质细24h后，培养液转移到原代皮层神经元(B) 和Neuro-2A神经细胞(C)中继续培养48h。原代皮层神经元用抗 FITC-MAP-2抗体染色计数法；Neuro-2A细胞活力岸企测用MTT还原法。 值用均数土标准差(mean土S.D.)表示。###P<0. 001与对照组(HBSS-CM) 比较；**P<0. 01, ***P<0. 001与模型组(LPS-CM)比较。图2. 3:雷公籐氯内酯醇T4和LPS(1. 0jiM)或寡聚态A^—42 (1.0 jiM)及其条件培养基处理的原代皮层神经元形态学改变。荧光显凝:镜显示 MAP-2阳性神经元及其突触，标尺-40/am。图3.1:雷公藤氯内酯醇T4对寡聚态APi—2激活的小胶质细胞产生 炎症介质(TNF-oc、 IL-1 P 、 PGE2和NO)水平的影响。(A) BV-2细胞； (B)原代培养的小胶质。细胞用T4 (1.25-1 OnM)预处理lh，然后加用 寡聚态AP,—42 (1.0 jiM)处理24h或3h(IL-1 |3)，收集的上清液用于 ELISA检测TNF-oc和IL-1 P ， EIA法检测PGE2和Griess法检测NO 水平。值用均数土标准差(mean土S.D.)表示(n-4/组)。詩P〈0. 01， ###P<0. 001与对照组比專交;*P<0. 05， **P<0. 01或丰"P〈0. 001与模型 组(A P )比较。图3.2:雷公藤氯内酯醇T4对LPS激活的小胶质细胞产生炎症介质 (TNF-oc、 IL-lp、 PGE2和NO)水平的影响。(A) BV-2细胞；(B)原 代小胶质细胞。细胞用T4 (1. 25 — 10nM)预处理lh,然后加用LPS (1. 0 jug/ml)处理12h或2h(IL-ip),收集上清液用于ELISA检测TNF-a 和IL-1P， EIA法检测PGE2和Griess化学法检测NO水平。值用均数 土标准差(mean土S. D.)表示(n-4/组)。###P<0. 001与对照组比较； *P<0. 05， **P<0. 01， ***P<0. 001,与模型组(LPS)比较。。图4.1:雷公藤氯内酯醇T4对寡聚态AP卜42诱导的小胶质细胞iN0S 和C0X-2蛋白表达的影响。BV-2细胞用T4(1. 25-10nM)预处理lh，再加 用寡聚态AP卜"(l.OjuM)处理24h. (A) Western Mot显示BV-2细胞 iNOS和COX-2蛋白表达水平，|3-acUn作内参照蛋白。(B)蛋白半定量 分析蛋白条带用点密度分析后，计算目的蛋白/p-actin比值，然后 每个样本组以对照组的相对倍数比表示。值代表均数±标准差(mean ± S. D.)。 ##P<0. Ol与对照组比專交；*P<0. 05, **P<0. Ol与才莫型组(AP)比 较。图4. 2:雷公藤氯内酯醇T4对LPS诱导的小胶质细胞iNOS和COX-2 mRNA和蛋白表达的影响。BV-2细胞用雷公藤氯内酯醇丁4 (1.25-10nM) 预处理lh,再加LPS (ljug/ml)处理12h。 (A) Westernblot显示BV-2 细胞iNOS和COX-2蛋白表达水平，P-actin作内参照蛋白。(C)RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳显示iNOS和C0X-2mRNA， 0-actin作内参照。(B, D)半 定量分析蛋白和扩增的DM条带用点密度分析并分别计算目的蛋白/ P-actin或目的基因/P-actin基因产物比值。值代表均数土标准差 (mean土S.D.)。 ###P<0. 001与对照组比较；*P<0. 05， **P<0. 01或 ***P<0. 001与模型组(LPS)比较。图5:雷公藤氯内酯醇T,对LPS激活的小胶质细胞内超氧阴离子 (SOA)水平的影响。(a) BV-2细胞用雷公藤氯内酯醇L (1.25-10nM) 和10 mM NAC预处理lh，然后加入LPS (1 u g/ml)处理24h。 t-BHP (100 jaM)单独处理lh作为阳性对照。NBT还原法用于检测超氧阴离子(02一)。光学相差显微镜显示含蓝色颗粒的阳性细胞(NBT阳性细胞)；(A):未 用药物的对照组；(B): LPS单独处理组；(C): t-BHP单独处理组；(D): NAC对照组;(E， F， G， H): 1.25， 2.5, 5.0和10 nM的T4预处理组；(I): 空白对照组(无药物及NBT处理).标尺-50jam。 (b) NBT比色定量NBT 溶解液处理后，用酶标仪检测(检测波长630nm)。值用均数土标准差 (mean ± S. D.)表示(n-5/组)。###P<0. OOl与对照组比净交；**P<0. Ol或 ***P<0. OOl与才莫型组(LPS)比较。图6: T4对寡聚态AP,—42诱导的小胶质细胞NF-kb核转位水平的 影响。(A)荧光显《效镜分析NF-k B核转位BV-2细胞用雷公藤氯内酯 醇T, (10nM)和NF-kb抑制剂PDTC (20juM)预处理lh，再加用寡聚 态Ap卜"(1. OjiiM)处理lh，细胞用抗FITC-p65抗体(绿色)标记，细胞 核用碘化丙啶(PI)(红色)显示，箭头显示p65核阳性的细胞，标尺=20 lim。 (B)定量计数p65核阳性细胞的百分H (C) Western blot检测 NF-KBp65亚基水平提取胞核和胞浆蛋白，分别进行SDS-PAGE，然后 用p65抗体检测。(D)蛋白半定量分析蛋白条带用点密度分析后，计 算胞核和胞浆p65蛋白的比值，然后每个样本组以对照组的相对倍数比 表示，值代表均数土标准差(tnean土S. D.)。 ##P<0. 01, ###P<0. 001与 对照组比较；**P<0. 01, ***P<0. 001与模型组(A P )比较。。图7:雷公藤氯内酯醇T4对寡聚态AP卜42诱导的小胶质细胞MAPK磷 酸化水平的影响。(A) Western blot枱r测MAPK石粦酸化水平BV-2细胞用 T4(10nM)、 JNK抑制剂:SP600125 (lOpM)、 p38抑制剂SB203580 (10 liM)和ERK抑制剂U0126 (10uM)预处理lh，再加入寡聚态Ap卜"(1.0 liM)处理lh,提取的蛋白进行SDS-PAGE，然后用磷酸化和总的3种MAPK (p38 MAPK, ERK1/2和JNK)抗体进行;险测。(B)蛋白半定量分析蛋白 条带用点密度分析后，计算磷酸化和总的目的蛋白比值，然后每个样本 组的值以对照组的相对倍数比表示，值代表均数土标准差(mean士 S.D. )。 **P<0. 01, ***P<0. OOl与对照组比较；##P<0. 01， ###P<0. 001 与模型组(AP)比较。图8. 1: JNK和NF-kB抑制剂对寡聚态A P卜"诱导小胶质细胞产 生细胞因子、NO和PGE2水平以及神经细胞存活的影响。(A) BV-2细胞 产生炎症介质水平细胞用JNK抑制剂SP600125 (10 yM)、 PDTC(20 pM)和/或寡聚态AP卜42 (1.0 juM)处理24 h (测TNF-ot、 NO和PGE2) 或3h (测IL-1 P )，收集的上清液用ELISA检测TNF-cc和IL-1 6 ， Griess化学法检测N0产量，EIA检测PGE2。
( B, C )抑制剂处理的小胶 质细胞条件培养液对神经细胞活力的影响BV-2细胞用SP600125 (10ja M)和PDTC (20yM)和/或APh2 (1. 0jiM)处理24h后条件培养液转移 到(B)Neuro-2A神经细胞和(C)原代皮层神经元中继续培养48h。 Neuro-2A细胞活力4盒测用MTT还原法；原代皮层神经元用抗FITC-MAP-2抗体染色计数法。值代表均数±标准差(mean ± S. D.) 。 ###P<0. 001与对 照组比较；***P<0. 001与冲莫型组(A P )比4交。图8.2: I-kB和JNK信号在寡聚态AP卜"激活的小胶质细胞中的 关系。(A，C)Westernblots检测I-kB-ol蛋白和JNK磷酸化水平BV-2 细胞用SP600125 (lOjaM) T4 (10nM)和PDTC (20jaM)处理lh,再用 寡聚态AP,-" (l.OjLiM)处理，收集蛋白，进行SDS-PAGE,然后用磷酸 化I- k B- a 、磷酸化JNK和总JNK抗体检测。(B， D)蛋白半定量分析 蛋白条带用点密度分析后，计算磷酸化I-KB-a/p-actin和磷酸化 JNK/总JNK蛋白水平比值，然后每个样本组的值以对照组的相对倍数比 表示，值代表均数±标准差(mean ± S. D.) 。 # P<0. 05， ##P<0. 01与对照 组比较；*P<0. 05, **P<0. 01与模型组(A P)比较。
具体实施方式
实施例1.雷公藤氯内酯醇T4对神经元和小胶质细胞存活的影响 方法MTT还原法检测(1) Neruo-2A细胞、BV-2细胞、原代小胶质细胞接种于96孔培养 板中，每孔接种100 jiil (1 x 104个细胞/孔)，细胞贴壁后可供药物干预； 原代小鼠皮层神经元细胞每孔100pl (初始接种lxl(f个细胞/孔)，离 体培养第6天供药物干预。(2) 不同浓度(0、 5、 10、 20、 40、 80nM)的雷公藤氯内酯醇T4作用 48h后每孔加入5mg/ml MTT溶液IO W, 37。C孵育4 h。(3) 加入终止液(含10。/。SDS、 5%异丙醇、0. 012N盐酸)终止培养， 37。C孵育过夜。(4) 次日以570 nm波长用酶标仪器测定各孔OD570值，计算细胞 存活率。(5) 细胞存活率=(各个组样本OD/对照组OD) xioo%;各个组样 本OD =各个组样本实际OD读数-空白孔0D读数；对照组0D =对照组 实际OD读数-空白孔OD读数。结果1. 1 一定剂量的雷公藤氯内酯醇L对小胶质细胞有毒性作用，而对 神经元的活力无明显影响。原代皮层神经元、原代培养的小胶质细胞、Neuro-2A细胞和BV-2小 胶质细胞经不同浓度的雷公藤氯内酯醇T4(5-80nM)处理48小时后，如 图l所示，在20 - 80 nM浓度范围的雷公藤氯内酯醇T4明显引起原代培 养的小胶质细胞和BV-2小胶质细胞的活力下降，IC50的值分别是 75.84nM和29. 74 nM。而原代皮层神经元即使在雷公藤氯内酯醇T4高达 80 nM浓度时，其细胞活力也未受到影响。Neuro-2A神经细胞在80 nM浓度的雷公藤氯内酯醇L作用后，其细胞活力出现小程度的下降，约20%。提示，雷公藤氯内酯醇L在20-80nM浓度范围对小胶质细胞有明 显的细胞毒性作用，而对原代皮层神经元活力无明显影响。实施例2.雷公藤氯内酯醇TV咸轻寡聚态寡聚态A P h2/LPS引起的胶 质_炎症反应对神经细胞的毒性损害 方法1. MTT还原法检测具体操作方法同实施例1所述MTT还原法检观'j。2. 免疫荧光细胞化学(1) 离体培养第6天的原代皮层神经元，以4%多聚甲醛室温固定 30 tnin ;(2) 去固定液，用PBS洗三遍，每次3 oiin;(3) 用含5 %BSA的TBSTx封闭60 min,可在摇床上轻轻摇动；(4) 去封闭液，用含5 %BSA的TBSTx稀释的抗MAP-2抗体(1: 1000 ) 孵育，4'C过夜；(5) 去除一抗稀释液，用TBSTx洗涤三次，每次5min，洗涤在摇床 上轻轻摇动；(6) 去除洗涤液，加入1毫升稀释的FITC-荧光标记的二抗孵育60min;(7) 回收荧光标记的二抗，用TBSTx洗涤三次，每次5 min;(8) 细胞核用DAPI(4' ， 6-diamidine-2， -phenyl indole) ( 1: 1000 ) 衬染2min;(9) 回收DAPI稀释液，用TBSTx洗涤三次，每次5 min;(10) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片；(11) 于荧光显微镜下拍照计数。结果2. 1雷公藤氯内酯醇T,对寡聚态A P卜"激活的小胶质细胞条件培 养液引起的神经毒性的影响我们首先确认了 A P卜"刺激的小胶质细胞对神经细胞(包括原代皮 层神经元和Neuro-2A细胞)具有强大的神经毒性，如图2.1 C和D所 示，A0-CM引起Neuro-2A细胞活力下降约53%，引起原代皮层神经元 的存活率下降约56% (代O. 001)。在寡聚态AP卜"浓度低于1. 0 jLiM时， 并没有引起BV-2细胞和原代小胶质细胞活力的改变(图2. 1A)。单独寡 聚态AP卜"(0. 2-5 liM)也能剂量依赖性地引起Neuro-2A细胞和原代皮 层神经元存活率的下降(代O. Ol或代O. 001)(图L1A)。由于无法排除 寡聚态A卩卜"在孵育过程(24h, 37。C)中其构象发生的变化，此过程可 能有一些纤丝状或原纤维状的A^-42的形成，因此，进一步设计的实验 扣除了上述的影响，如图2.1B，结果仍显示，与来自空白培养板(无细胞、同样孵育24h， 37°C )的含单独A P w2的培养基处理的神经细胞比较， A P -CM导致原代皮层神经元存活率和Neuro-2A细胞活力的下降约为分 别为前者的50%和54%。提示，APh2刺激的、小胶质细胞介导的胶质-炎症反应对神经细胞(原代皮层神经元和Neuro-2A细胞)具有比单独A P h2刺激更强大的神经毒性，此作用至少大部分来自于小胶质细胞分泌 的产物。雷公藤氯内酯醇T4处理的条件培养液提供了一种神经保护作 用(图2. 1C，D)，提示其可能减轻了 Ap卜42刺激的小胶质细胞产生的炎 症反应，从而对神经细胞的毒性损伤。雷公藤氯内酯醇T4 (10nM)+A|3 -CM组使受累神经细胞存活率升高，与对照组(HBSS-CM)比较，在原代 培养的皮层神经元和Neuro-2A细胞的存活率分别增加36%和34% (代O. 001),并且雷公藤氯内酯醇T4所提供的神经保护作用呈现一定的 剂量依赖性。2. 2雷公藤氯内酯醇T4对LPS激活的小胶质细胞条件培养液引起 的神经毒性的影响。LPS激活的小胶质细胞条件培养液能够引起明显的神经毒性， 如图2. 2B所示，LPS-CM引起Neuro-2A细胞活力下降约57%,LPS-CM 引起原代皮层神经元的存活率下降约52% (代O. 001)。 LPS (0.1-1.0 ju g/ml)单独处理并未引起Neuro-2A细胞和原代皮层神经元活力的 下降(图2.2A)。提示神经毒性作用主要依赖于LPS激活的小胶质 细胞分泌的产物，而非LPS本身。预先用雷公藤氯内酯醇L处理的 条件培养液(T4+LPS-CM)能够提供较肯定的神经保护作用(图2.2B 和C)。雷公藤氯内酯醇T4 (10nM)+LPS-CM组使受累神经细胞存活率 升高，其与对照组(HBSS-CM)比较，原代培养的皮层神经元存活 率和Neuro-2A细胞的活力分别增加40%和38% (P<0. 001)，并且 雷公藤氯内酯醇T4所提供的神经保护作用也呈现一定的剂量依赖 性。2.3雷公藤氯内酯醇T4和LPS或寡聚态A^—42 (l.OjnM)及其条件 培养液对原代皮层神经元形态学的影响如图2.3所示，LPS(l. OpM)-CM和(1. 0 jaM)-CM处理均引起 原代培养的皮层神经元损伤，表现为MAP-2阳性染色的神经胞体丟 失、神经元轴突和树突变短、变少或消失。在LPS-CM组MAP-2阳 性的神经元存活数量仅38%。在AI3-CM组，MAP-2阳性的神经元数量 仅34%。相比之下，雷公藤氯内酯醇T4处理明显增加了 MAP-2阳性染 色的神经元细胞数，神经元的突触大部分保留。10 nM的雷公藤氯 内酯醇T4处理使MAP-2阳性的神经元数量在LPS-CM和A |3-CM分别 保留达77%和70% (代O. 001)。实施例3.雷公藤氯内酯醇T 4对寡聚态A P , - 4 2激活的小胶质细 胞产生炎症介质(TNF-a、 IL-1P、 PGE2和NO)水平的影响。方法1. 细胞培养上清液TNF-oc、 IL-1 p和PGEa产物的测定 小胶质细胞用雷公藤氯内酯醇L处理60 min然后用A &卜《刺激2化用于^r测TNF-a、 PGE2，或刺激3h用于检测IL-1 0 。离心后吸取的上清 收集，若未立即检测，则储存于-8(TC备用。小鼠TNF-a、 IL-1 P通过 ELISA试剂盒(购自BioSource公司)检测，上清PGE2通过EIA试剂盒(购 自Cayman公司)检测。操作程序根据试剂盒说明书。2. NO代i射产物亚硝酸盐的测定小胶质细胞经用雷公藤氯内酯醇L处理60 min然后用A |3卜"刺激 24h,离心后吸取的上清用NO测定试剂盒检测细胞外的NO水平，每组 设5个平行对照。步骤如下(1) 收集的上清转入无菌的EP管中，若未立即检测，于-2(TC保 存备用。(2) 取出Griess Reagent I和II以及样品回复到室温；(3) 用待测样品所用溶液(细胞培养用的基础培养基)稀释标准品 亚硝酸钠(NaN02),将标准品的浓度稀释为0， 1.56， 3.13,6.25, 12.5， 25, 50, 75 jumol/L;(4 )在96孔板中加入标准品及样品，每50 ji 1/孔； (6)每孑L中力口入室S显Griess Reagent I溶液50pl ; (7 )每孑L中力口入室j:显Griess Reagent 1I溶液50yl ; (8)室温避光孵育10min， 540ntn测定吸光值OD。 (9 )才艮据标准品浓度的0D值，用CurveExpert 1. 0软件拟合浓度 -OD值的标准曲线，所测样品OD值根据标准曲线计算出相应浓度。 结果3.1雷公籐氯内酯醇L对寡聚态AP卜"诱导的原代小胶质细胞和 BV-2细胞释^L TNF-cc ， IL-1 P ， N0和PGE;产量的影响胶质细胞介导的炎症介质能够引起明显的神经毒性作用，前面的实 验证实了雷公藤氯内酯醇T4在此过程中提供了一种神经保护作用，是 否这种作用是由于雷公籐氯内酯醇T4的抗炎症效应发挥其神经保护作 用呢？对此，我们检测了雷公藤氯内酯醇L对寡聚态AP卜42诱导的小 胶质细胞产生炎症介质产量的影响。如图3. 1A的实验显示A P卜"(1 ju M)处理BV-2细胞24 h引起TNF-a ， PGE2和NO释放的产量达高峰， 而IL-1 P在3 h达峰值，分別是对照水平的9. 3， 3. 6, 6, 0和3. 78倍 (代O. 001)。雷公藤氯内酯醇L预处理后，能够剂量依赖性地减少此效 应(图3. 1A), 10 nM的雷公藤氯内酯醇L减少TNF-oc 、 IL-1 |3 、 PGE2 和NO水平分别为模型组(AP )的51.5% ，56. 4%，27. 6%和37.3% (代O. 001)。雷公藤氯内酯醇L的这种抗炎效应同样表现在原代培养的 小胶质细胞中(图3. 1B)。同时该剂量范围的雷公藤氯内酯醇T4单独作用并没有改变小胶质细胞基础炎症介质的释发水平。3. 2雷公藤氯内酯醇T4对LPS诱导的原代小胶质细胞和BV-2细胞 释放TNF-ot， IL-lp， N0和PGE2产量的影响我们同样检测了雷公藤氯内酯醇L对LPS诱导的小胶质细胞产生 炎症介质产量的影响。时效关系的实验显示LPS (l|ag/ml)处理BV-2 细胞24引起TNF-ct ， PGE2和NO释放的产量达高峰，而IL-1 P在2h 达峰值，分别是对照水平的5.2， 8.6,28.7和2.5倍(如图3. 2A第二 柱)。而雷公藤氯内酯醇T4预处理能剂量依赖性地减少此效应(图 1 2A), 5 nM的雷/〉藤氯内酯醇L分别减少IL-lp和NO水平为才莫型组 (LPS)的46%和53%。极低剂量的雷公藤氯内酯醇T4 (1. 25nM)也能 明显减退LPS诱导的TNF-a和PGE2产量，分别为模型组的48%和57%。 雷公藤氯内酯醇L的这种抗炎效应也同样表现在原代培养的小胶质细 胞中(图3. 2B)。实施例4.雷公藤氯内酯醇L对寡聚态ApH2/LPS诱导的BV-2小胶 质细胞产生i N0S和C0X-2的影响 方法1. Western-blot检测画和C0X-2的蛋白水平 弃培养液，细胞用预冷的PBS清洗2次，每孔加入100 ji 1细 胞裂解液〔10 mmol/L Tris (PH 7. 4 )、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA、 lmmol/LEGTA、 1 mmol/L NaF、 20 mmol/L Na4P207、 2 ,1/L Na3V04、 0.1%SDS、 0. 5% Sodium deoxycholate、 1 % Tri ton-X 100、 1鹏ol/L PMSF、 60 |i g/ml aprotinin、 10|ag/ml leupeptin、 1 |li g/ml peps tat in 〕， i冰面上裂解20min，用细胞刮刀将细胞刮下， 混匀，于14000 x g、4。C离心10min，吸上清液至离心管中，Bradford 法进行蛋白定量。取40 ja g样品，加入等体积的2 x上样緩沖液〔125 mmol/L Tris ( PH 6.8)、 10 % glycerol 、 10% SDS 、 0.006 % bromophenol blue、 130 mmol/L DTT〕混匀，100'C沸水中煮90sec， 以8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法将蛋白转移 到PVDF膜，室温下用封闭液封闭1 h后将膜移入用封闭液稀释的 一抗(兔来源的多克隆抗体iNOS, 1: 1000稀释；兔来源的多克隆抗 体COX-2， l:750稀释)，4。C孵育过夜，洗液洗涤3 x 5 min、 1x10 min，辣根过氧化物酶耦联的IgG 二抗(1:1000稀释)反应2 h， 洗液洗涤3x5 min、 1 x 10 min，用化学发光法显色，X射线底片 曝光。P-actin作为内参照。 2. RT-PCR分析半定量RT-PCR用于^:查iNOS和COX-2mRNA表达水平。Trizol试剂抽 提总RNA，应用Titar^—步法RT-PCR检测系统试剂盒(购自Boehringer Mannheim, Germany) 。 0.5 p g的总RNA加入25 n 1的反应体系。引物序列如下iN0S (基因库号:BC062378.1， 310 bp):正义链5, -CTG CAG CAC TTG GAT CAG GAA CCT G-3，，反义链5, -GGG AGT AGC CTG TGT GCA CCT GGA A-3， ； C0X-2 (基因库号BC052900. 1, 324bp):正义 链5， -TTG AAG ACC AGG AGT ACA GC_3，， 反义链5， -GGT ACA GTT CCA TGA CAT CG-3， ； P-actin (基因库号:BC014861.1， 500bp), 正义链5， -GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC-3，，反义链5， -ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3，。扩增条件94。C变性45 s, 6(TC退火(iN0S) 和58°C退火(COX-2) 45 s， 7(TC延伸1 min。循环数控制在产物达到 平台期前,分别是iNOS 27个循环C0X-2 25个循环。0-actin分别与iNOS 和C0X-2的循环数一致。PCR产物通过l. 6%琼脂糖凝胶电泳分离，于紫外 灯凝胶成像系统(Digital Image Analysis System, PDI， Alpha, USA) 下拍照，半定量通过点密度分析。 结果4.1雷公藤氯内酯醇L抑制寡聚态A P H2诱导的BV-2小胶质细胞 iNOS和COX-2蛋白水平的增加iNOS和COX-2分别是产生NO和PGE2的限速酶。本实施例选择24h时间 点研究寡聚态寡聚态A P 1H2及L干预对BV-2小胶质细胞表达i NOS和 C0X-2的影响。如图4. l所示，基础状态下BV-2细胞只表达少量iNOS和 COX-2,寡聚态Ap卜42 (1. 0|iM)处理BV-2细胞24h后iN0S和C0X-2蛋白表 达明显增加，分别为对照组的4. 0倍和6. l倍。雷公藤氯内酯醇T4 (1. 25 -10 nM)剂量依赖性地减轻寡聚态A P H2诱导的iNOS和COX-2蛋白表达 的增加。10 nM的雷公藤氯内酯醇T4抑制iN0S和C0X-2蛋白的最大效应 分别为单独A P w2处理组的23. 9%和33. 5%。此趋势与其抑制N0和PGE2的程 度相一致。4. 2 雷公藤氯内酯醇L抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞iNOS和 C0X-2 mRNA和蛋白水平的增加本实施例选择12h时间点研究LPS及雷公藤氯内酯醇T4干预对BV-2小 胶质细胞表达iN0S和C0X-2的影响。如图4, 2所示，RT-PCR和Western blot显示，基础状态下BV-2细胞只表达少量iNOS和COX-2 mRNA和蛋白， LPS (lug/ml)处理BV-2细胞12h后iNOS和COX-2 mRNA和蛋白表达均明 显增加，分别为对照组的2， 3倍和2. 6倍(mRNA)及2. 5和4. 8 (蛋白)。 雷公藤氯内酯醇T4 (1. 25-10 nM)剂量依赖性地减轻LPS诱导的iNOS和 C0X-2 mRNA和蛋白表达的增加。10 nM的雷公藤氯内酯醇L抑制iNOS和 COX-2 niRNA的最大效应分别为单独LPS处理组的59。/。和68。/。，抑制iNOS和 C0X-2蛋白的最大效应为74。/。和56%。实施例5.雷公藤氯内酯醇T4抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞内S0A 产量的增加方法改良NBT还原法;^企测细胞内超氧阴离子(S0A):细胞内SOA能将NBT还原为蓝色甲簪颗粒。0. NBT在处理结束时加 入培养孔，37。 C孵育45 min，温PBS洗2边后曱醇固定、风干，还原的 NBT沉积在细胞内，用240 (il的2M氬氧化钾(K0H)和280 ji 1 DMS0 溶解，室温震荡IO min。溶液转移到96孔培养板，每孔100jLtl于酶标 仪检测，波长630 nm。部分细胞种植于含盖玻片的6孔培养板中，处理 方法同上，含蓝色曱簪的颗粒的NBT阳性细胞在相差显微机镜下观察并 拍照。结果5.雷公藤氯内酯醇L抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞内S0A产量的 增力口小胶质细胞内ROS的聚集能激发炎症介质的释放。如图5所示，LPS 处理24 h后明显出现含篮色甲簪颗粒的NBT阳性的细胞(图5a(B))。氧 化剂叔丁基过氧化氢(t-BHP, 100 jnM)处理60 min(作为阳性对照) 同样出现上述现象(图5a(C))。雷公籐氯内酯醇T4处理明显减少了NBT 阳性的BV-2细胞的数量和含量(图5a (E， F， G， H))。 NBT还原定量检测 显示雷公藤氯内酯醇T4剂量依赖性地减退LPS诱导的BV-2细胞内R0S 产量(图5b)。最大抑制效应为45% (10nMT4)。 N-乙酰半胱氨酸(NAC, 10mM)， 一种自由基清除剂，抑制了74o/n的细胞内SOA产量(图5b)。雷公 藤氯内酯醇L ( 10 nM)单独作用并没有改变小胶质细胞内ROA的产量。实施例6.雷公藤氯内酯醇T4抑制寡聚态A(3 w2诱导的小胶质 细胞NF- k B活化方法1. 胞核蛋白提取细胞用裂解緩沖液A (10mMHEPES [pH7. 9]， 10mMKCl， 0. 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA， 1 mM DTT， 0.5 mM PMSF) 400 jul冰上裂解细胞15min, 然后加入10o/qNP-40(终浓度0. 2Q/o)振荡20sec,6000 x g 4。C离心5 min, 上清液即为胞浆蛋白。将沉淀重悬于50pl裂解緩冲液B(20 mM HEPES [pH 7. 9] ， 0. 42 M NaCl, 1. 5 mM MgCl2， 1 mM EDTA , 1 mM EGTA mM DTT， 1 mM PMSF)，冰上振荡20min, 14000 xg 4'C离心5 min,上清液即为 核蛋白。2. Western blot检测NF-k Bp65蛋白Bradford法进行蛋白定量后，取40pg样品，加入等体积的2 x上样緩冲液〔125 mmol/L Tris (PH 6.8)、 10% glycerol, 10% SDS、 0.006 % b醒ophenol blue、 130 mmol/L DTT〕混匀，100 。C 沸水中煮90sec,以8。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电 转移法将蛋白转移到PVDF膜，室温下用封闭液封闭1 h后将膜移 入用封闭液稀释的一抗(兔来源的多克隆抗体NF-KBp65， 1: 750稀释)，4'C赙育过夜，洗液洗涤3x5 min、 lxio min，辣才艮过氧化 物酶耦联的IgG 二抗(1: 1000稀释)反应2 h，洗液洗涤3 x 5 min、 lxio min，用化学发光法显色，X射线底片曝光。 3.免疫荧光细胞化学检测NF-KBp65核移位(1) BV-2小胶质细胞以1 x 105 /m 1接种于含盖玻片的培养板中， 药物处理结束后，PBS洗2边，用4%的多聚甲醛室温固定30 min;(2) 去固定液，用PBS洗三遍，每次3 min;(3) 用含5%BSA的TBSTx封闭60分钟，可在摇床上轻轻摇动；(4) 去封闭液，用含5%BSA的TBSTx稀释的抗NF-k Bp65抗体 (1: 500)孵育，4。 C过夜；(5) 去除一抗稀释液，用TBSTx洗涤三次，每次5 min;(6) 去除洗涤液，加入1毫升稀释的FITC-荧光标记的二抗 (1: 500)孵育60 min (在摇床上轻轻摇动)；(7) 回收荧光标记的二抗，用TBSTx洗涤三次，每次5 min。(8) 纟田月包冲亥用2jug/ml》典^:丙口定(propidium iodide, PI ) ^j" 染5 min;(9) 回收PI稀释液，用TBSTx洗涤三次，每次5 min;(10) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖 玻片；(11) 于荧光显微镜下拍照计数。 结果6.雷公藤氯内酯醇T4抑制寡聚态A p卜42诱导的小胶质细胞NF-k B活化NF-kB是调节细胞因子、C0X-2和iNOS表达的关键的核转录 因子。p65是NF-kB最主要的活性亚基，NF-kB p65的核内移位 水平可反映NF-kB活化水平。我们通过免疫荧光化学和蛋白印迹 的方法检测了 NF-kB的活化水平，图6A所示，寡聚态AP^2刺激 BV-2细胞lh后引起BV-2细胞明显的NF-kB p65亚基核内移位， 而雷公藤氯内酯醇T4能明显地抑制此效应。p65核阳性的细胞的 百分率，在雷公藤氯内酯醇L (10 nM)处理组比AP卜42单独处理组 低65. 3%,同时NF-k B抑制剂一PDTC(20 jaM)也明显抑制p65核移 位水平(图6B)。蛋白印迹(图6C和D)也显示，雷公藤氯内酯醇T4 (10 nM)抑制了寡聚态APh2激活的NF-KBp65核蛋白表达水平。NF-k B p65亚基的核/浆比值在雷公藤氯内酯醇L组较单独A P w处理 抑制了 78. "/ ，而PDTC抑制约75. 4%。实施例7.雷公藤氯内酯醇L抑制寡聚态Ap卜"诱导小胶质细 胞JNK磷酸化，但不影响ERK和p38 MAPK磷酸化。方法Westernblot -险测JNK、 ERK和p38MAPK的蛋白石岸酸化水平 弃培养液，细胞用预冷的PBS清洗2次，每孔加入100 ia 1细 胞裂解液〔10 mmol/L Tris ( PH 7. 4 )、 100 mmol/L NaCl 、 1 mmol/L EDTA、 l關ol/LEGTA、 1画1/L NaF、 20 mmol/L Na4P207、 2 mmol/L Na3V04、 0. 1%SDS、 0. 5% Sodium deoxycholate、 1% Triton-X 100、 1 mmol/L PMSF、 60 p g/ml aprotinin、 10 jag/ml leupeptin、 1 jig/ml peps tat in 〕，在冰面上裂解20min,用细月包刮刀将细胞刮下， 混匀，于14000 x g、4。C离心10 min，吸上清液至离心管中，Bradford 法进行蛋白定量。取40jug样品，加入等体积的2 x上样緩冲液〔125 mmol/L Tris ( PH 6.8)、 10 % glycerol, 10% SDS 、 0.006 % bromophenol blue、 130 mmol/L DTT〕混匀，100。C沸水中煮90sec, 以10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法将蛋白转移 到PVDF膜，室温下用封闭液封闭1 h后将膜移入用封闭液稀释的 一抗(1: 1000稀释，兔源多克隆抗体JNK、p-JNK、ERK1/2、 p-ERK1/2、 p38和鼠来源的单克隆抗体p-p38), 4X:孵育过夜，洗液洗涤3x5 min、 lxl0min，辣根过氧化物酶耦联的IgG 二抗(1: 1000稀释) 反应2 h，洗液洗涤3x5min、 1 x 10 min,用化学发光法显色，X 射线底片曝光。 结果7.雷公藤氯内酯醇T4抑制寡聚态Ap卜42诱导小胶质细胞JNK 磷酸化，但不影响ERK和p38 MAPK磷酸化。是否雷公藤氯内酯醇T4抑制引起炎症反应的上游的MAPK激 酶？通过蛋白免疫印迹检测并计算磷酸化和总MAPK激酶蛋白的比 值可反映MAPK激酶(JNK， p38 MAPK和ERK1/2)的活化程度。如 图7所示，雷公藤氯内酯醇T4 (10nM)明显减退AP卜42诱导的JNK 磷酸化，抑制率为49. 5% (较AP处理组)，但是雷公藤氯内酯醇T4 并没有明显影响p38 MAPK或ERK的磷酸化水平。提示，抑制JNK 磷酸化可能涉及雷公藤氯内酯醇T4对寡聚态AP卜42诱导的小胶质 细胞活化的抗炎机制。另一方面，JNK抑制剂SP600125 (10/aM)、 p38MAPK抑制剂SB203580 (10 p M)和ERK1/2抑制剂U0126 (10 pM) 能够完全阻断寡聚态A P卜"诱导的JNK， ERK和p38 MAPK的磷酸化 水平，提示三种MAPK参与Ap卜42诱导的小胶质细胞活化。实施例8.雷公藤氯内酯醇L在寡聚态AP卜"诱导小胶质细胞 活化中JNK和NF-k B炎症信号通路中的作用方法Westernblot检测JNK、 I-kB蛋白碌酸化水平 Bradford法进行蛋白定量后，取40Mg样品，加入等体积的2 x上样緩冲液混匀，100 。C沸水中煮90秒，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法将蛋白转移到PVDF膜，室温下 用封闭液封闭1 h后将膜移入用封闭液稀释的一抗(1:1000稀释， 兔源多克隆抗体JNK、 p-JNK、和I-KBa)， 4'C孵育过夜，洗液洗 涤3 x 5 min、 1 x 10 min,辣根过氧化物酶耦联的IgG 二抗(1: 1000 稀释)反应2 h，洗液洗涤3x5 min、 1 x 10 min，用化学发光法 显色，X射线底片曝光。P-actin作为内参照。 结果8. 1: JNK和NF- k B抑制剂对寡聚态A P卜"诱导小胶质细胞产生细 胞因子、N0和PGE2水平以及神经细胞活力的影响我们通过检测SP600125和PDTC是否抑制寡聚态AP卜42诱导 BV-2细胞产生炎症介质的水平，以进一步确认AP卜42诱导小胶质细 胞产生的炎症反应是否通过JM和J NF-kB信号通路以及是否与 L的抗炎靶点有关。如图8. 1A所示，SP600125 (10 ja M)和PDTC (20 ]iM)明显减少Ah-"激活的TNF-a 、 IL-1 p 、 PGE2和NO的产量。 MTT显示该浓度的SP600125和PDTC并没有改变细胞的活力。进一 步的研究显示，SP600125和PDTC同样保护了胶质-炎症诱导的神 经毒性损伤，包括原代培养的神经元和Neuro-2A细胞(图8. 1B和 C)。提示，SP600125和PDTC可下调炎症介质的表达并保护了小胶 质细胞介导的AP卜42神经毒性。T4的抗炎效应可能通过抑制NF-k B和JNK信号通路来实现。8.2 雷公籐氯内酯醇L并不改变I-KB-oc的磷酸化水平，且 JNK并不是NF- k B的上游信号分子。当i-kb被磷酸化时，NF-kB即被活化。为进一步确认雷公藤 氯内酯醇T4抑制NF-kB活化是否是首先通过JNK通路以及信号通 路中JNK和NF-kB 二者的关系。我们进一步检测了雷公藤氯内酯 醇L及JNK抑制剂对A P卜42诱导的BV-2细胞活化过程NF-k B上游 的I-kb磷酸化的影响，以及NF-kb抑制剂对JNK-粦酸化的影响。 如图8. 2A和B， SP600125并不影响卜"i秀导BV-2细胞的I-k B-cc的磷酸化水平。而NF-KB抑制剂PDTC明显减少了 JNK磷酸化 水平(图8.2C和D)。提示，至少在AP卜42刺激的小胶质细胞，JNK 并不是NF-k B的上游信号分子。除此之外，雷公藤氯内酯L并不 改变I-KB-a的磷酸化水平(图8. 2A和B),由此可见，雷公藤氯 内酯L的抗炎作用可能作用于NF-kb本身，此过程可能包括了 NF-k B核转位和核内与相应基因位点的结合。
权利要求
1.雷公藤氯内酯醇T4的新用途，其特征在于雷公藤氯内酯醇T4在制备治疗/预防内毒素脂多糖和寡聚态Aβ1-42介导的神经毒性作用所引起的神经免疫炎症性疾病的药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的雷公藤氯内酯醇T4的新用途，其特征在于所 述神经免疫炎症性疾病为阿尔茨海默病、多发性硬化、急性播散性脑 脊髓炎或格林-巴利综合症。
3. 根据权利要求1所述的雷公藤氯内酯醇T4的新用途，其特征在于所述 的神经毒性作用是指内毒素脂多糖介导的神经元损伤。
4. 根据权利要求1所述的雷公藤氯内酯醇T4的新用途，其特征在于所述 的神经毒性作用是指寡聚态A P卜42介导的神经元损伤。
5. 根据权利要求1所述的雷公籐氯内酯醇T4的新用途，其特征在于所述 的神经毒性作用是指内毒素脂多糖和/或寡聚态A P i—42诱导的胶质-炎症反应对神经元的早期损害作用。
全文摘要
本发明涉及雷公藤氯内酯醇T₄治疗神经免疫炎性疾病的用途，提供了雷公藤氯内酯醇T₄在治疗小胶质细胞介导的Aβ_1-42和LPS的神经毒性作用所引起的神经免疫炎性疾病的新用途。本发明提供的中药单体雷公藤氯内酯醇T₄具有以下功能可明显减轻寡聚态寡聚态Aβ_1-42和LPS诱导的胶质-炎症反应对神经元的毒性损伤作用，保护神经元的存活；抑制寡聚态寡聚态Aβ_1-42和LPS诱导的小胶质细胞产生炎症介质的水平；抑制寡聚态寡聚态Aβ_1-42和LPS诱导的小胶质细胞的iNOS和COX-2表达的增加；抑制寡聚态寡聚态Aβ_1-42诱导的小胶质细胞NF-κB和JNK信号通路的激活。从而为雷公藤氯内酯醇T₄应用于神经免疫炎性疾病，尤其是阿尔茨海默病的防治提供了直接有力的实验依据和理论基础，既有很强的科学性和创新性，又有很高的开发应用价值。
文档编号A61K31/585GK101332200SQ20081007148
公开日2008年12月31日 申请日期2008年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者陈晓春 申请人:福建医科大学附属协和医院