专利名称：一种抗i型糖尿病融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗I型糖尿病融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
糖尿病已成为当今世界上最大的公众健康问题之一。糖尿病分为I型和II
型，I型为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM),由胰岛素分泌缺陷产生，I型糖尿病 占糖尿病总数的5 - 10%，全国I型糖尿病患者至少100万，并且还呈上升趋势。 I型糖尿病患者必须长年使用胰岛素以维系生命，给家庭和社会造成精神上和 经济上的巨大压力，且糖尿病引起的各种病发症是致残和死亡的主要原因，因 此I型糖尿病的防治迫在眉捷。I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，IDDM)由 胰岛素分泌缺陷产生，它是一种针对胰岛！3细胞的自身免疫性疫病。虽然导致 IDDM的自身抗原包括胰岛素谷氨酸脱羧酶、胰岛素、热休克蛋白、羧基肽酶H
等多种抗原，但是实验中仅给动物口服一种自身抗原-胰岛素，即诱导了免疫耐 受，产生了保护作用(&/e/7ce, 1994， 265: 1237 )。这是由于口服抗原能诱导调 节性T细胞分泌抑制性细胞因子，如TGF-p,对由相互间无关的各种抗原诱导 的、但在同一特异器官发生的所有病理免疫反应进行抑制，即抗原驱动旁观者 抑制(Antigen-driven Bystander Suppress ion)。旁观者抑制的诱导是抗原特
异性的，而效应是非特异的，这为预防I型糖尿病等自身免疫疾病提供了一条 新的途径(T/zm "加/ 7b&y, 1998， 19: 173)。同时，研究表明霍乱毒素B亚基(CTB ) 可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统，并且CTB偶联抗原可能涉及到与传
统大剂量口服自身抗原产生免疫耐受效应明显不同的免疫调节机制，可能涉及 到发炎细胞的移动行为的变化A'Wec/wo/, 1998， 16， 292 ),暗示CTB
偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治I型糖尿病等自身免疫性疫病更具有实
际应用价值，而且还有潜在的治疗前景(尸roc 〃 "W， 1997，
94:4610 )。为此，我们运用分子克隆技术获得CTB与人胰岛素融合基因(见本 人专利申请书(专利申请号200310121132.1 ),在转基因家蚕幼虫和蛹中表达 该融合蛋白，经动物试验表明口服含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白的 家蚕幼虫和蛹对N0D小鼠具有明显抑制胰岛炎作用。因为CTB融合基因蛋白中 CTB的活性和功能很大程度取决于携带的多肽的分子量大小(Backstrom et al,6^ e, 149:211),因此，用人胰岛素B链抗原表位抗原表位取代人胰岛素基 因，减少融合蛋白的分子量，有利于发挥CTB的更有效的生物学功能。为了提 高表达量，在上游引物的设计中添加了部分杆状病毒后晚期高效表达的多角体 编码区与非编码区序列。
为此，本研究运用分子克隆技术获得CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基 因，在转基因家蚕幼虫和蛹中表达该融合蛋白，经动物试验表明口服含CTB与 人胰岛素B链抗原表位融合蛋白的家蚕幼虫和蛹对N0D小鼠具有明显抑制胰岛 炎作用，使其成为一种新型抗I型糖尿病的方法。
发明内容
本发明的目的是构建CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因，并提供CTB 与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白及其制备方法。 本发明通过如下技术方案来实现。
本发明提供一种融合基因，所述融合基因为SEQ IDN0: 1所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供上述融合基因表达的融合蛋白。
本发明还进一步提供一种表达载体，所述表达载体包含有SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列，具体的讲，所述的表达载体是指pBac-CTBINB-SP。
本发明更进一步提供包含上述表达载体的重组病毒，具体的讲，所述重组 病毒是指2006年8月30日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)保存，保藏编号为CGMCC No. 1796的重组病毒。
本发明提供上述表达载体的制备方法，包括如下步骤
(1) 以SEQ ID No, 2和SEQ ID No. 3所示核苷酸序列为引物，pBac-CTBINS 质粒为模板、进行PCR扩增，得到SEQ ID No. l所示核苷酸序列；
(2) SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经&/z HI和化oRI双酶切后，连接在同 样被^3/zzHI和双酶切的转移载体pBacPAK8上。
本发明提供上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤
(1) 将重组杆状病毒BmBacCTBINB-SP感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增；
(2) 扩增后的重组杆状病毒BmBacCTBINB-SP注射至家蚕幼虫和蛹体内， 分别取家蚕幼虫和蛹淋巴血；
本发明提供上述重组病毒的制备方法，步骤如下
将所述表达载体pBac-CTBINB-SP与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染 家蚕细胞BmN，进行6轮空斑和Southern点杂交筛选，筛选出含CTB与人胰岛 素B链抗原表位融合基因的重组杆状病毒BmBacCTBINB-SP。
本发明提供的融合蛋白可用于制备治疗I型糖尿病的药物。 本发明的有益效果是用家蚕高效表达CTB与人胰岛素B链抗原表位融 合蛋白，比直接从原核生物中表达的蛋白活性高，家蚕是可以无菌大规模饲养 经济昆虫，可以低成本地大规模伺养，而且不会造成公害，蚕体中有多种天然 蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；可以家蚕 生产的融合蛋白可以作为口服疫苗，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
图1是含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的昆虫杆状病毒转移质 粒pBac-CTB-INB (图注说明AcMNPV/AcNPV :苜蓿银紋夜蛾多角体病毒多角 体启动子5'端/3'端旁侧序列；P:苜蓿银紋夜蛾多角体病毒多角体启动子；A (Polyhedin Poly A+ signal )多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号；M13 ori: M13噬菌体复制起始点；Amp:氨节青霉素基因；ori:pUC复制起始点)
图2家蚕表达产物的GM1-ELISA分析；1、 BmCTBINB-SP感染的家蚕血淋
巴；2、野生病毒感染的家蚕血淋巴。
生物保藏事项
提交生物保藏日期2006年8月30曰
生物保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏单位地址北京巿海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所 保藏编号CGMCC No. 1796 分类命名杆状病毒家蚕核型多角体病毒。
具体实施方式
实施例1:
(1 )构建含有CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的转移质粒 pBac-CTBINB-SP。
设计SEQ ID No: 2和SEQ ID No: 3所示序列的2条引物Pl、 P2。 以pBac - CTBINS质粒(见200310121132. 1号专利申请)为模板、SEQ ID No: 2和SEQIDNo: 3所示序列为引物进行扩增，获得大小约为430bp的融合基因 CTBINB-SP,将PCR获得的目的片段经A諸HI和AcdU双酶切后，连接在同样 被A，HI和fcoRI双酶切的转移载体pBacPAK8上，构建含CTB与人胰岛素B 链抗原表位融合基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTBINB-SP。
(2) 含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组家蚕杆状病毒 BmBacCTBINB-SP的获得将转移质粒pBac-CTBINB-SP与家蚕核型多角体病毒 DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori )细胞BmN，进行6轮空斑和Southern点 杂交筛选，筛选出含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组杆状病毒 BmBacCTBINB-SP。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保存，保藏编号为CGMCC No. l"6。
(3) 表达CTB与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白将重组杆状病毒 BmBacCTBINB-SP感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病 毒BmBacCTBINB-SP注射至家蚕幼虫和蛹体内，分别取家蚕幼虫和蛹淋巴血，
经6000rpm 10分钟离心后取上清，稀释10倍后加等体积的2 x蛋白上样缓冲 液，进行12%的SDS-PAGE分析。结果表明，CTB与人胰岛素B链抗原表位融合 基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物为15kD左右，与预测大小基本一致。对CTB 与人胰岛素B链抗原表位融合的表达产物进行免疫活性鉴定，结果表明表达 产物具有很强的免疫活性，通过CTB标准品可以计算得出在幼虫和蛹体中的 表达量分别达到385jug/ml和480jug/ml。
(4)本发明还对用家蚕幼虫蚕蛹中表达的CTB与人胰岛素B链抗原表位 融合蛋白进行动物试验。在家蚕幼虫和蛹体表达CTB与人胰岛素B链抗原表 位融合蛋白，经过过滤(100 KD超滤)，12000rmp和30000rmp离心后经 冷冻干燥后用于动物试验。将4周龄雌NOD小鼠随机分成4组，每组IO只， 做病理学分析。从第5周开始口服给药，剂量为50jag融合蛋白/鼠，每周 给药2次，连续喂5周。以口服给正常的蚕血淋巴为阴性对照。小鼠胰岛作 组织切片结果表明给药组胰岛炎显著低于对照N 0 D小鼠。
〔实验例1〕含有融合基因的转移质粒pBac-CTBINB-SP的构建
以pBac-CTBINS质粒(见本人专利申请书(专利号200310121132.1 )) 为模板、P1和P2为引物进行扩增，反应条件为94'C预变性5分钟，扩增时94 。Cl分钟，57。Cl分钟，72i:i分钟，反应30个循环，最后72'C保温IO分钟， 获得大小约为430bp左右的目的融合基因CTBINB-SP，且该基因5，和3'端分 别带有和fcoRI位点。将上述目的融合基因进行勘/z/HI和双酶 切后连在同样被^瓜HI和酶切的pBacPAK8 (CLONTECH公司)上，构建 含CTB与人胰岛素B链抗原表位基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTBINB-SP，经 酶切分析和PCR鉴定基因正确插入后，经过自动序列测定表明构建的融合基因 序列完全正确，融合基因序列及其编码的氨基酸序列如上所示。
〔实验例2〕CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组杆状病毒的获得 取5u 1含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒 pBac-CTBINB-SP和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ul Lipofectin (GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC一IOO培养基混均。将事
先培养在35mmDish中的BmN细胞用无血清的TC-100 (GIBCOBRL公司)培养基 洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物，27。C培养4-5天，收取 上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35 mm Dish中的BmN细胞，l小时 后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑， 感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern杂交，取阳 性克隆的上清进行6轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染BmN细胞扩增。即可 得到大量的含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组杆状病毒，该病毒 已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京 中关村，保藏编号为CGMCC No. 1796。
〔实验例3〕CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表
达
取扩增的含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组杆状病毒注射到 五龄家蚕(Bombyx mori)幼虫和蛹中,每头注射2ul左右(滴度为1 x 107ml ), 分别取24、 48、 72、 96、 120和144小时表达的家蚕淋巴和蛹血，6000rpml0min 离心后取上清，用PBS pH7. 4稀释10倍后，加入等体积的2x蛋白质上样缓冲 液(100Mm Tris.HC1,40/。 SDS, 0. 1%溴酴蓝，10%甘油)，取20ul进行SDS-PAGE 分析。结果表明，CTB与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白在家蚕和蛹中获得高 效表达，经Western杂交表明表达产物分子量为15kD。将家蚕幼虫和蛹体含 有表达的CTB与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白的血淋巴，高速冷冻离心，取 上清。稀释后包被酶标板，同时以CTB为标准品，按照常规的ELISA步骤搡作， 其中兔抗CT一抗(购自SIGMA公司)稀释5000倍，山羊抗兔二抗(购自华美 生物工程公司)稀释IOOO倍，用OPD(购自上海化学试剂公司)显色，于492腿 处测定OD值，结果表明幼虫和蛹体表达的目的蛋白有很强的免疫活性，表达量 分别达到385|ag/ml和480jag/ml。
〔实验例4〕家蚕幼虫蚕蛹中表达的CTB与人胰岛素B链抗原表位融合 蛋白进行动物试验。
在家蚕幼虫和蛹体表达CTB与人胰岛素B链抗原表位融合蛋白，经过过
滤(100 KD超滤)，12000rmp和30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕 幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。将4周龄雌NOD小鼠随机分成4组， 每组10只，从第5周开始喂服，剂量为50ng/鼠，每周给药2次，连续 喂5周。以口服给正常的蚕血淋巴为阴性对照，第10周处死小鼠，取小鼠 胰岛作组织病理切片，观察胰岛炎发生情况，并作相应评分。结果表明给药 组的小鼠胰岛炎指数为1.7 ±1.1,而对照组的小鼠胰岛炎指数高达为3.8 ±1.7，给药组胰岛炎显著低于对照小鼠。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
序列表
<110〉 浙江大学
<120> —种抗I型糖尿病融合蛋白及其制备方法 <130〉 200310121132.1 <160〉 3
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223〉 artifical <400> 1
atgccgaata ttaaattaaa atttggtgtt ttttttacag ttttactatc ttcagcatat 60
gcacatggaa cacctcaaaa tattactgat ttgtgtgcag aataccacaa cacacaaata 120
catacgctaa atgataagat attttcgtat acagaatctc tagctggaaa aagagagatg 180
gctatcatta cttttaagaa tggtgcaact tttcaagtag aagtaccagg tagtcaacat 240
atagattcac aaaaaaaagc gattgaaagg atgaaggata ccctgaggat tgcatatctt 300
actgaagcta aagtcgaaaa gttatgtgta tggaataata aaacgcctca tgcgattgcc 360
gcaattagta tggcaaatgg ccccggctcc cacctggtgg aagctctcta cctcgtgtcc 420ggggaacgcg gctaa 435
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220〉
<223> artifical <400> 2
ggggatccat aaatatgccg aatattaaat taaaatttgg tgt 43<210> 3
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> artifical <400> 3
ggggaattct tagccgcgtt ccccggacac gaggtagaga gcttccacca ggtgggagcc 60 ggggccattt gccatactaa ttg 8权利要求
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2. 权利要求l所述融合基因表达的融合蛋白。
3. —种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求l所述的核 苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是指 pBac-CTBINB-SP。
5. 包含权利要求3所述表达载体的重组病毒。
6. 根据权利要求5所述重组病毒，其特征在于，所述重组病毒是指中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No. 1796的重组病毒。
7. 权利要求4所述表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1) 以SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示核苷酸序列为引物，pBac - CTBINS 质粒为模板、进行PCR扩增，得到SEQ ID No. l所示核苷酸序列；(2) SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经A/z/HI和AcoRI双酶切后，连接在 同样被A/ HI和fcdll双酶切的转移载体pBacPAK8上。
8. 权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1) 将重组杆状病毒BmBacCTBINB-SP感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增；(2) 扩增后的重组杆状病毒BmBacCTBINB-SP注射至家蚕幼虫和蛹体内， 分别取家蚕幼虫和蛹淋巴血；
9. 权利要求6所述重组病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下 将所述表达载体pBac-CTBINB-SP与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞BmN，筛选出含CTB与人胰岛素B链抗原表位融合基因的重组杆状病 毒BmBacCTBINB-SP。
10.以权利要求2所述融合蛋白为有效成分制备的治疗I型糖尿病的 药物。
全文摘要
本发明涉及一种抗I型糖尿病融合蛋白及其制备方法。本发明提供一种融合基因及其表达的融合蛋白，所述融合基因为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明还构建了包含上述融合基因的表达载体以及包含上述表达载体的重组病毒。本发明提供的融合蛋白可用于制备治疗I型糖尿病的药物。
文档编号A61K39/106GK101353663SQ20081008470
公开日2009年1月28日 申请日期2008年3月12日 优先权日2008年3月12日
发明者张耀洲, 霁 李, 金勇丰 申请人:浙江大学