蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用的制作方法

专利名称：蚯蚓纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术的领域，具体地说，本发明提供蚯蚓纤连蛋白酶 降解纤维连接蛋白的应用，以及在乙型肝炎治疗中的应用。
背景技术：
乙型肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。 通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行。据有 关资料，肝炎检测阳性的患者己经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携 带者)将近4亿。是当前危害人民健康最严重的传染病。多见于儿童及 青壮年。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人 可转变为原发性肝癌，这些疾病对病人以及社会的危害更加严重。
发病过程 一般来说，肝细胞受乙肝病毒入侵后，乙肝病毒本身并 不直接引起肝细胞的病变。乙肝病毒只是利用肝细胞摄取的养料赖以生 存并在肝细胞内进行复制。病毒复制的表面抗原、e抗原和核心抗原都释 放在肝细胞膜上，激发人体的免疫系统来辨认，并发生反应。这种在肝 细胞膜上发生的抗原抗体反应可造成肝细胞的损伤和破坏，从而产生一 系列临床症状。
治疗手段我国多数患者是在围生期或年幼时感染HBV造成免疫耐 受，往往形成慢性感染，这些患者需要积极而有效的治疗，否则可能发 展为肝硬化甚至肝癌，导致死亡。然而迄今尚无一种可靠的治疗方法能 清除或永久抑制HBV的复制，从而终止肝脏的炎症和坏死。慢性乙型肝 炎目前的治疗目标是①抑制HBV复制(HBsAg、 HBeAg消失)；②非 扩增法检测不出HBVDNA水平；③病情改善，ALT复常；④肝组织学 改善； 减少肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞肝癌的发生率。目前用于治疗乙肝的药物主要包括干扰素、核苷酸类似物等抗病毒药物和胸腺肽等 免疫调节药物。
1. 传统干扰素与聚乙二醇干扰素干扰素目前仍是治疗乙型肝炎 的一线药物，它具有明确的疗程，疗效好，可使HBsAg消失和抗HBs 产生，无耐药性等优点，但是由于同时存在副作用较多、不能使用于失 代偿性肝硬化患者、注射治疗麻烦及代价昂贵等缺点而限制了其使用。 在美国，很多的医生倾向于选择核苷(酸)类似物治疗慢性乙肝。
2. 拉米夫定短期用拉米夫定对HBV DNA的抑制作用、HBeAg 转阴率、HBeAg血清转换率及血清ALT复常率均优于干扰素，而且服用 方便，可以用于失代偿性肝硬化及肝移植前后患者，但是其持续应答率 不及干扰素，而且存在一个较突出的耐药性问题，且随着服用时间的延 长，耐药性也会逐渐增加。
3. 阿德福韦酯是一新型核昔(酸)类似物，口服阿德福韦酯是阿德 福韦的前体，能有效抑制乙肝病毒复制、改善组织学、延缓疾病进展成 肝硬化、肝功能失代偿及肝癌，它的耐药性发生低于拉米夫定，且对拉 米夫定耐药者有很好的治疗效果，但是长期服用有一定肾毒性，需定期 监测血清肌酐和血磷。
4. 恩替卡韦是环戊酰鸟苷类似物，我国SFDA去年年底刚批准 用于慢性乙型肝炎的治疗。
5. 其他其他还在进行n、 m期临床试验的药物有恩曲他滨、特必
夫定、克拉夫定。
6. 免疫调节治疗免疫调节治疗是治疗慢性乙型肝炎的重要手段之
一，目前用于治疗乙型肝炎的免疫调节药物主要是胸腺肽。胸腺肽剌激
T细胞，增强非特异性免疫功能，其不良反应小，耐受性好，使用安全，
对于有抗病毒治疗指针，但不能耐受或不愿接受干扰素和核苷酸类似物 治疗的患者可选用胸腺肽。
随着乙型肝炎发病机理研究的深入，研究工作者发现纤维连接蛋白
在乙型肝炎发病过程中发挥着重要作用。纤维连接蛋白(Fibronectin， FN) 是一种存在于血液、体液及各种组织中的具有多种功能的糖蛋白，来源 于肝细胞，枯否细胞和内皮细胞，通过与整合素结合调节细胞间的粘附、免疫、凝血和血小板的聚集，另外在肿瘤与纤维化的发展与发病机制中， FN也起着重要的作用。
一、 纤维连接蛋白的结构及功能
FN按分布不同可分为两种， 一种是分布于血浆的血浆型FN(pFN)， 另一种是广泛分布于人体内细胞表面的细胞型FN(cFN)。 pFN是一种可溶 性的蛋白质，在血液中浓度很高。血液中的可溶性的FN大部分是由肝细 胞合成。cFN作为不溶性FN的一部分，可以掺入到细胞周围基质中，肝 脏中的FN主要由内皮细胞，贮脂细胞及枯否细胞分泌。FN分子可以结合 多种分子发挥其功能，如胶原蛋白、肝素、血纤维蛋白及细胞表面受体， 其中与细胞表面受体的结合主要是通过FN分子中的RGD序列。识别RGD 序列的一些粘合素分子都可以识别FN中的RGD序列，所以FN可通过RGD 与受体相连，从而发挥调节作用。
FN还具有病毒结合活性，与甲型肝炎病毒(HAV)结合后，发生HAV 的屏蔽现象，可干预病毒检测的放免法，通过富含FN的血产品有助于肝 炎病毒的频繁传播。有学者发现人肝脏中的FN通过与HBV前S2区编码的 一特异抗原决定簇结合，从而使病毒在肝窦内循环时被肝细胞所吸收， 促进病毒对肝细胞的作用。同时，在肝纤维化及肝细胞癌时，FN在RNA 水平发生变化。
二、 纤维连接蛋白与慢性肝炎、肝硬化
HCV和HBV感染后常进展为慢性病毒性肝炎。慢性肝病尤其是活动 性病变，由于致病因素的持续作用和机体免疫功能失调，以致肝细胞持 续受损，纤维组织不断增生而导致肝硬化。Martinez-Hernandez等提出FN 在肝脏的纤维化过程中发挥重要的作用，可促使肝细胞分泌胶原，促进 成纤维细胞的趋化性，促进成纤维细胞及肝细胞等与胶原基质的粘附作 用。存在于成纤维细胞表面的细胞连结素，它与酸性粘多糖及胶原具有 很强的亲和性，以FN为核心，结合粘多糖及胶原成为三元复合体，做成 细网构造，被视为肝纤维化的基础。与正常人群相比较，慢性活动型肝 炎(CAH)患者中FN水平明显增加。
血浆型FN绝大部分由肝细胞合成，炎症造成血浆中FN消耗导致血浆 中FN降低，FN减少则反映了肝细胞合成蛋白质功能的减退，故在肝硬化时，血浆FN水平则明显降低，然而在急、慢性肝炎时增加。Odenthal等 提出在肝纤维化的急性阶段及接近纤维化阶段，细胞型的FN mRNA表达 增加。Jamagin等用鼠急性肝损伤模型检测到，内皮细胞主要产生EIII-A 阳性的FN，相反被激活的贮脂细胞主要分泌EIII-B阳性FN。 Shigem等采 用免疫组化及原位杂交法检测到了在肝纤维化区细胞型FN(EIII-APR阳 性)沉积，提示细胞型FN在肝纤维化时起关键作用。在纤维化肝脏中，肝 细胞与非实质细胞中细胞型FN的mRNA表达增加，而且表达FN的细胞也 有所增加，细胞型FN在肝纤维化形成的早期发挥着重要的作用。 三、纤维连接蛋白与肝细胞癌
细胞外基质(ECM)被认为在肿瘤、肿瘤侵袭及转移中发挥重要的作 用。不同分化的肝癌其ECM定位不同。FN、 FN受体(整合素a5与(31)及其 片段mAD2(恶性病变相关DNA连接蛋白2)的研究，提示整合素a5(31和FN 与肝癌分化有关，并影响肝癌的侵袭性与转移。
现已证实FN参与慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发生发展，主要通过选 择性剪切和改变与受体的结合来发挥调节作用。其在分子水平中的调控 机制仍不清楚，尚需进一步的研究。
蚯蚓俗称地龙，其种类繁多，资源丰富。蚯蚓作为药物使用，在我 国已有1200多年的历史。最原始的方法是利用整个鲜蚯顿或干蚯顿；随 着发展，后来发现蚯蚓的药用价值与其中含有的多种化学成分有关。目 前已经分离到多种不同纯度的蚯蚓成分，其中包括纤溶酶、纤溶酶原激 活剂、钙调素和钙调素结合蛋白、胆碱酯酶、过氧化氢酶、超氧化物歧 化酶SOD、促髓系细胞增殖组分、抗微生物蛋白、收縮血管蛋白、溶血 蛋白、免疫球蛋白样粘连物和抗肿瘤蛋白、抗菌肽等，取得了较大的进 展。
在蚯蚓体内有一组蛋白，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQIDN0.5， SEQIDNO.6, SEQ IDNOJ， SEQIDN0.8， SEQIDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQIDNO.ll， SEQIDN0.12， SEQIDNO,13， SEQIDN0.14， SEQIDNO.15 (这15
种氨基酸序列的共性具有共同的功能域H43， D91， S^(其上编号对应
于SEQ ID NO.l氨基酸序列)组成的催化三联体，其中SEQ ID NO.2- SEQ
8IDNO.ll与SEQIDNO.l具有85%以上的同源性)。本发明首次发现其 在与血清孵育过程中可迅速降解血清组分纤维连接蛋白，因此将其称为 蚯蚓纤连蛋白酶。通过进行用所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水 平的作用的研究，发现蚯蚓纤连蛋白酶处理组对HBsAg， HBeAg的分泌 具有抑制作用，通过用所述蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作 用的研究表明，转基因小鼠血清中ALT， AST上升被抑制，HBsAg分泌 受到抑制，并且其可使HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻。因此， 所述蚯弼l纤连蛋白酶可以用于制备预防或治疗与纤维连接蛋白相关的疾 病，如乙型肝炎的药物的应用。

发明内容
本发明的一个目的是提供蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的 应用。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l。
在另一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43， D91， S,其上编号对应于SEQ ID NO.l氨基酸 序列)组成的催化三联体。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有80%以上的同源性。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDNO.3, SEQIDNO.4, SEQ ID N0.5， SEQIDN0.6， SEQIDNO.7, SEQIDN0.8， SEQIDN0.9， SEQ ID NO.IO， SEQIDNO,ll， SEQ ID NO,12， SEQ ID N0.13, SEQ ID N0.14, SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQ IDNO.3, SEQ IDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ ID NO.6，SEQIDNO,7， SEQIDNO.8, SEQ ID NO,9， SEQ ID NO.IO， SEQ ID NO.ll， SEQIDN0.12， SEQIDNO.13, SEQIDNO.14,或SEQIDNCU5 所示的氨基酸序列的单一组分使用。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQ ID NO.3, SEQ ID N0.4， SEQIDN0.5， SEQIDNO,6， SEQIDNO.7, SEQIDNO.S， SEQ IDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQ ID NO.ll, SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDN0.14， SEQIDN0.15所示的氨基酸序列中的两种或多种。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用， 所述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID NO,2， SEQ ID NO.12, SEQ IDN0.13, SEQIDNO.14,以及SEQ ID N0.15，其中SEQ ID NO. 1丰度 最高。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0~10pM。 在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-2pM。 在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的用量为0-5pg/ml。 本发明的另一个目的是提供所述蚯蚓纤连蛋白酶用于制备药物的应
用，所述药物用于预防或治疗与纤维连接蛋白有关的疾病。
在一个实施方案中，所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎，肝硬化，
肿瘤等疾病。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l。
在另一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43， D91， S^(其上编号对应于SEQ IDNO.l氨基酸 序列)组成的催化三联体。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有80。/。以上的同源性。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列与SEQ ID NO.l具有85%以上的同源性。
在一个实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列，所 述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQ IDN0.5， SEQIDNO-6， SEQIDN0.7， SEQIDN0.8， SEQIDNO,9， SEQ ID NO.IO， SEQ ID NO.l 1， SEQ ID N0.12, SEQIDNO.13, SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.l, SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDNO-4， SEQIDN0.5， SEQIDNO,6， SEQ ID N0.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO.ll， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15 所示的氨基酸序列的单一组分使用。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID N0.4， SEQIDNO.5, SEQIDNO.6, SEQIDNO.7, SEQ ID NO.8 ， SEQ IDN0.9， SEQIDNO.IO， SEQ ID NO.l 1， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列中的两种或多种。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用， 所述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID NO.2, SEQ ID NO,12， SEQ IDN0.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15,其中SEQ ID NO.l丰度最高。
在一个优选实施方案中，所述蚯顿纤连蛋白酶的剂量为2000mg/kg 大鼠体重。
在一个优选实施方案中，所述蚯蚓纤连蛋白酶的剂量为50mg/kg小 鼠体重。
本发明还提供一种用于治疗与纤维蛋白相关的疾病的药物，所述药物 包含上述蚯虫引纤连蛋白酶作为活性成分。所述药物的有效量可以由本领 域技术人员根据实际情况确定。
在一个实施方案中，所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎，肝硬化，
肿瘤等疾病。
在一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为2000mg/kg大鼠体重。 在另一个优选实施方案中，所述药物所用剂量为50mg/kg小鼠体重。 所述药物的所用配制方法，使用方法以及所用的辅料为本领域技术人 员所众所周知。本发明所针对的对象，为哺乳动物，如人，小鼠，大鼠。在一个实施 方案中，本发明所述的蚯蚓纤连蛋白酶以及包含其的药物针对人进行施 用。
本发明通过蚯蚓纤连蛋白酶与人血清孵育后SDS-PAGE检测血清蛋 白的变化，首次发现所述蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能 力。本发明将所述蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育，经SDS-PAGE发现有 几个血清蛋白条带消失或者变淡。经质谱鉴定，得到一快速降解的蛋白 为纤维连接蛋白。该蛋白在机体内有相当多的生理功能，其中之一就是 与乙型肝炎病变的发展有关。用蚯蚓纤连蛋白酶降解纤维连接蛋白纯品， 将降解片段进行N端测序，发现作用位点比较单一，主要集中在赖氨酸 和精氨酸两个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性，具有一定 的水解特异性。
本实验还进行了所述蚯蚓纤连蛋白酶对HepG 2.2.15细胞水平的作用 的研究。实验结果表明，与空白细胞相比，蚯蚓纤连蛋白酶处理组HBsAg， HBeAg的分泌均受到抑制，细胞培养基中HBsAg， HBeAg含量有所下降。 与拉米夫定阳性对照组相比，蚯蚓纤连蛋白酶对HBeAg的分泌有更强的 抑制作用。
本实验室还进行了蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用的 研究。结果表明，与生理盐水阴性对照组相比，转基因小鼠血清中ALT， AST上升被抑制，HBsAg分泌受到抑制，这两个指标均优于拉米夫定的 治疗效果。生理盐水组及拉米夫定组转基因小鼠的血清FN随生存时间的 延长而增加，使用蚯蚓纤连蛋白酶后含量基本维持在恒定的水平。对肝 脏的病理学观察结果显示，蚯蚓纤连蛋白酶组对乙型肝炎有治疗作用，
与生理盐水组相比，可使HBV转基因小鼠的肝脏坏死病变减轻，疗效与 拉米夫定组类似。
因此，本发明在HBV转基因小鼠水平证明蚯蚓纤连蛋白酶对乙型肝 炎转基因小鼠的HBsAg分泌有一定的抑制作用，对血清ALT、 AST维持 正常的水平有有益的帮助。乙型肝炎转基因小鼠病理切片观察发现，蚯 蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的肝脏病变有一定的保护作用。
本发明认为蚯蚓纤连蛋白酶在对乙型肝炎治疗中，对慢性乙型肝炎的治疗更有优势。目前临床使用的乙型肝炎治疗药物，包括干扰素、拉
米夫定、阿德福韦酯等主要使HBsAg,HBVDNA恢复到一定的水平。但 乙型肝炎治疗的另一个困难是病变引起肝硬化的发生，蚯蚓纤连蛋白酶 恰巧具有降解纤维连接蛋白的能力，不仅可以在一定程度上阻断病毒的 传播，而且可以降低肝脏的纤维连接蛋白的量，缓解肝硬化的发生。
本发明认为蚯弼l纤连蛋白酶对乙型肝炎、尤其是慢性乙型肝炎预防和 治疗作用机理之一是蚯蚓纤连蛋白酶有快速降解纤维连接蛋白的能力。 由于纤维连接蛋白在机体内的生理功能很多，与细胞间的粘附、免疫、 凝血和血小板的聚集以及老化都有关系，所以预期蚯蚓纤连蛋白酶对凝 血、肿瘤等疾病也有一定的作用。


图h蚯蚓纤连蛋白酶与血清共同孵育后SDS-PAGE图
A:血清在37。C孵育不同时间后SDS-PAGE图(M:标准分子量；1:对照
(未加蚯蚓纤连蛋白酶的血清)；2: 15min; 3: 30min; 4: 45min; 5: 60min; 6: 90min; 7: 120min; 8: 180min )
B:蚯蚓纤连蛋白酶与血清在37。C共同孵育不同时间后SDS-PAGE图(M:
标准分子量；1:对照(未加蚯蚓纤连蛋白酶的血清)；2: 15min; 3: 30min; 4: 45min; 5: 60min; 6: 90min; 7: 120min; 8: 180min) 图2: MALDI-TOFMS法鉴定被蚯蚓纤连蛋白酶迅速降解的条带 图3:蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白作用位点图
图4:大鼠口服蚯虫引纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白相对含量的变化 (Mean士SD, n=6).
图5:蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用 5-1: ALT的变化 5-2: AST的变化 5-3: HBsAg的变化
5-4:血清中纤维连接蛋白FN相对含量的变化 5-5:转基因小鼠肝脏病理观察结果
A:生理盐水组(IO倍)B:蚯蚓纤连蛋白酶处理组(IO倍) C:拉米夫定组(IO倍)
图6蚯弼l纤连蛋白酶对HepG2.2.15细胞水平的作用 6-1:蚯虫引纤连蛋白酶对HBsAg和HBeAg分泌的影响 6-2:拉米夫定对HBsAg和HBeAg分泌的影响
以下本文将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处，可
根据本领域技术人员所熟悉的参考书如蛋白质技术手册(汪家政、范 明主编，科学出版社)、抗体技术实验指南(沈关心、龚非力等译，科学 出版社)、药理实验方法学(第三版，主编徐淑云，人民卫生出版社)、 分子生物学实验指导(刘进元，清华大学出版社)、分子克隆实验指南(第 三版，黄培堂等译，科学出版社)等以及本文所引用的参考文献中所列 的方法来实施。
实施例
实施例l蚯蚓纤连蛋白酶与血清共孵育试验
实验方法与结果
1. 取新鲜人血清，稀释2倍，加入一定浓度的蚯蚓纤连蛋白酶(0 10j^M) (SEQIDNO.l)于37。C孵育，分别于15, 30, 45, 60, 90, 120禾口180min取
样，同时以空白血清(在37。C孵育15, 30,45, 60，90, 120和180min)作为对照。
2. 将上述血清酶解产物及空白血清孵育样品用去离子水稀释10倍，加入 2xSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10分钟，进行8% SDS-PAGE，最后以考 马斯亮蓝染色。
3. SDS-PAGE图见图1。结果显示空白血清在37。C孵育不同时间蛋白质条 带无明显变化(见图1A)。血清与蚯蚓纤连蛋白酶的孵育产物中有一些蛋 白条带迅速降解(见图1B)。
实施例2典型蛋白条带的鉴定
实验方法与结果
14仪器日本岛津/KRATOS激光离子化质谱仪AXlMA-CFRTMPlus型，质 量数范围1 500,000Da，质量数精度< 5ppm，分辨率20,000，灵敏度 lOfmol。
步骤
1. 将所选择的胶带'a，用切胶笔切下，置于eppendorf(EP)管中，并记录
点号及相应的位置；
2. 力口 50(iLDDH2O洗两次，10min/次；
3. 加50mMNH4HCCV乙腈4: 1溶液50jiL，超声脱色5min或37。C脱 色20min，吸干；
4. 重复步骤3，直至蓝色褪去；
5. 加乙腈50jaL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min;
6. 力B 10 mM 二硫苏糖醇(DTT) (10jjL1MDTT， 990(iL 25mM NH4HC03 配制)20(xL， 56。C水浴lhr;
7. 冷却到室温后，吸干，快速加55mM碘代乙酰胺(IAM) (55pL 1M IAM， 945^iL25mMNH4HC03配制)20pL，置于暗室45min;
8. 依次用25mMNH4HC03、 50%乙腈溶液和100%乙腈洗，乙腈脱水到 胶粒完全变白为止，真空抽干5min;
9. 将0.1吗/pL的胰蛋白酶储液以25mMNH4HCO3稀释10倍，每EP管 加2nL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4。C或冰上放置30min， 待溶液被胶块完全吸收，加25mMNH4HC03 10-15pL置37°C，消化过夜；
10. 加入2%三氟醋酸(TFA)终止反应，使TFA终浓度为0.1%,振荡 混匀，10000rpm离心。
11. 消化产物上清液进行质谱分析(参考蛋白质化学与蛋白质组学一书。 夏其昌、曾嵘等，科学出版社)，获得酶解肽段的分子质量。
12. 将不同肽段的分子质量结果与NCBI数据库进行比对(MASCOT search program)。确定鉴定的蛋白质。
结果鉴定结果表明，蛋白条带V为纤维连接蛋白(见图2，在鉴定肽段 中，有21个肽段与纤维连接蛋白的酶解肽段比对成功，可能性分数为92， 结果可靠。)实施例3蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白水解位置的确定
实验方法与结果
1. 将10^纤维连接蛋白(Sigma-aldrich， USA， lmg/ml)与2^1蚯蚓纤 连蛋白酶(SEQIDNO.l) (0 2pM)在37"C孵育不同时间，将酶解产物 进行8% SDS-PAGE并转至PVDF膜(Millipore， USA)。
2. 将膜进行考马斯亮蓝染色，将酶解产生的主要条带进行N端测序(仪 器为Applied Biosystem Automated Protein Sequencer, Applied Biosystem Inc., USA),确定水解位点。
3. 蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点见图3。结果显示蚯蚓纤 连蛋白酶对纤维连结蛋白的作用位点比较单一，主要集中在赖氨酸和精 氨酸两个碱性氨基酸附近，具有典型的胰蛋白酶的特性。
实施例4大鼠口服蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白浓度的变化
实验方法与结果
1. 选择健康雄性SD大鼠6只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)
(200~250g)，禁食12小时，自由饮水。
2. 服药前取空白血0.5ml。灌胃服用蚯蚓纤连蛋白酶(粗酶，硫酸铵沉淀 法获得，参考文献Zhou J, Wu C, He RQ，(1998) J. Biochem. Mol. Bio.& Biophys. 5， 17-18,主要成分有SEQ ID NO.l， SEQ ID N0.2, SEQ ID NO.12, SEQIDN0.13， SEQIDN0.14， SEQIDNO,15，其中SEQID NO.l丰度最高)(每kg大鼠体重灌胃服用2000mg蚯蚓纤连蛋白酶)， 定时取血(0.5， 1， 1.5， 2， 3， 4， 6， 8， 26h)，经眼眶静脉丛收集全 血，分离血清，于-2(TC保存备用。
3. ELISA法测定上述血清中纤维连结蛋白的浓度
(1) 将血清(步骤2制得)稀释50倍，在96孔酶标板(Coming incorporated Costar , USA)中每孔加入样品50|il， 37。C孵育2小时，PBST
(137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KC1, lOmmol/L Na2HP04, 2mmol/L KH2P04， 0.02% Tween 20， pH7.4)洗涤。
(2) 加入100W 5%马血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)37。C封 闭2小时，PBST洗涤。(3) 加入50 pl纤维连结蛋白抗体(Sigma, USA) ， 37。C孵育2h， PBST 洗涤。
(4) 加入IOO pl辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(北京中杉金桥生物 技术有限公司)，37"孵育lh， PBST洗涤。
(5)加入100 ^显色剂暗处显色10分钟。加入50 pl 2M的硫酸终止反应。
显色剂的配制方法为
四甲基联苯胺(TMB)溶液(6mgTMB溶于lmlN， N-二甲基甲酰胺) 100^1， 30%双氧水15|il， 0.1mol/L PB (1.0M NaH2P04 87.7ml， 1.0M Na2HP04 12.3ml，稀释至1000ml, pH6.0) 10ml。酶标仪450nm测定OD 值。用OD值的变化表征纤维连结蛋白浓度的变化(以用药前纤维连结 蛋白的ODo值为100%，用药后某一时刻t纤维连结蛋白的相对浓度
FN =^ixl00%， ODt为不同时间点测得的Jtoi青中乡书t^蛋白的OD值。 OD。
4.大鼠灌胃服用蚯蚓纤连蛋白酶后血清中纤维连接蛋白浓度的变化见图 4。结果显示纤维连接蛋白浓度首先随着时间的延长而降低，约4小时达 到最低点，然后随时间的延长有所恢复。
实施例5蚯蚓纤连蛋白酶对HBV转基因小鼠的治疗作用
实验方法与结果
1. 实验动物C57BL/6J-HBV转基因小鼠(购自北京大学医学部实验动 物部)。转入的基因片段是编码包膜蛋白HBsAg的S基因，preS基因以及 编码X抗原的X基因(参考文献董宇红、席宏丽、田枫、康爱君，苦 参素对HBsAg转基因小鼠血清Thl和Th2细胞因子水平的影响中华实验和 临床病毒学杂志，2004， 18 (3) 277-280。 Chisarl FV. Hepatitis B virus transgenic mice: insights into the virus and the disease. Hepatology， 1995， 22: 1316-1325.)小鼠在北京大学医学部实验动物部符合SPF级动物饲 养标准的环境中进行实验。
2. 实验分组实验前进行动物的筛选，选择HBsAg阳性(按照商业购买 试剂盒的操作步骤进行测定与评判，Hepanostika HBsAg Ultra,Biom6rieux， Netherlands)的实验动物27只，按照HBV转基因小鼠血清中
分泌HBsAg的高低(以OD值(450nm)的大小表示)进行分组，每组9 □
/ 、 o
阴性对照生理盐水(0.9%NaCl)
阳性对照拉米夫定(灌胃剂量为100mg拉米夫定/kg小鼠体重) 药物蚯蚓纤连蛋白酶(混合物(与上同)，灌胃剂量为50mg蚯蚓 纤连蛋白酶/kg小鼠体重)
3. 给药方案
(1) 灌胃每天灌胃一次，持续21天，观察至30天。
(2) 取血分别在用药前，用药10天、20天取血，制备血清，测定谷-丙转氨酶(ALT)，谷-草转氨酶(AST)(使用中生北控公司的IFCC推 荐法，仪器为日立7170A型全自动生化分析仪。操作步骤按照试剂盒说明 书进行操作)。在用药后7、 14、 21、 30天取血，制备血清，测定HBsAg
(使用试齐U盒为Hepanostika HBsAg Ultra, Biom&ieux， Netherlands,检 测仪器为BIO-TEK Instruments EL311型酶标仪。操作步骤按照试剂盒说 明书进行操作)。
因为小鼠血容量有限，为了保证小鼠的生存质量，每次取血体积一 般控制在0.2ml以下，并间隔足够的时间，所以测定ALT、 AST的取血时 间与测定HBsAg的取血时间不同。
(3) 取组织在实验最后一天取血完成后，断颈处死小鼠，收集肝组织， 部分保存于4%甲醛中固定，制备石蜡切片，HE染色，进行肝脏病理变化 观察；部分保存于液氮中备用。
4. 检测指标(1)体重；(2)谷-丙转氨酶(ALT);(3)谷-草转氨酶(AST); (4)HBsAg; (5)对肝脏的病理学观察。
5. 实验结果随着实验的进行，三个实验组动物活动状态没有显著性的 差别。体重也没有显著性差异。与生理盐水组相比，转基因小鼠血清中 ALT, AST上升有所抑制，结果见图5-l， 5-2。与生理盐水组相比，转基 因小鼠血清中HBsAg有所降低，结果见图5-3。转基因小鼠血清中纤维连 接蛋白(FN)含量的变化见图5-4，结果显示，生理盐水组及拉米夫定组 转基因小鼠的FN随生存时间的延长而增加，蚯蚓纤连蛋白酶实验动物组
18FN含量基本维持在恒定的水平。对转基因小鼠肝脏的病理学观察结果见
图5-5。 A:生理盐水组，肝小叶结构存在，肝细胞水肿，以肝小叶中央区 为著。肝血窦和中央静脉明显扩张，点灶状肝细胞坏死，每10个低倍视 野可见12个肝细胞坏死灶。B:肝小叶结构存在，肝细胞水肿，以肝小叶 中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩张，点灶状肝细胞坏死和少量单 核淋巴细胞浸润，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏死灶。C:肝小叶结 构存在，肝细胞水肿，以肝小叶中央区为著。肝血窦和中央静脉明显扩 张，小灶状肝细胞微泡状脂肪性变性，每10个低倍视野可见4个肝细胞坏 死灶。生理盐水组6只转基因小鼠，蚯蚓纤连蛋白酶处理组6只转基因小 鼠与拉米夫定组6只转基因小鼠的肝组织病理切片观察结果表明与生理 盐水组相比，蚯顿纤连蛋白酶实验动物组HBsAg转基因小鼠的肝脏坏死 病变减轻，疗效与拉米夫定组类似。
实施例6蚯蚓纤连蛋白酶对H印G 2.2.15细胞水平的作用
1.细胞系及培养条件HepG 2.2.15细胞系(Mount Sinai Medical College, New York)，其特点是基因组中插入HVB基因(参考文献 Production of hepatitis B vims particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 1005-1009)。培养基为DMEM高糖培养基(Dulbecco，s modified eagle medium, Gibco， Invitrogen Corporation, US A)，同时加入10°/。的胎牛血清 (PAA, Austria), 380吗/ml抗生素G-418 (Amresco， USA)和青霉素-链霉 素溶液(终浓度为100 units/ml青霉素和100吗/ml链霉素，HyClone, USA)。培养条件为C02培养箱，37'C培养。
2. 实验分组
阳性对照拉米夫定处理组；
用药组蚯虫引纤连蛋白酶处理组(单一组分SEQIDNO.l)。
3. 用药方案
将HepG2.2.15细胞进行接种(96孔板，每孔lx104个细胞)。细胞接种 三天后，分别加入不同浓度的蚯蚓纤连蛋白酶(培养基中药物终浓度为 0-5(ig/ml)和拉米夫定(培养基中药物终浓度为0-100)iM)。细胞接种六天时更换相应的含药培养基。在细胞接种九天时收集细胞培养基，用于
测定HBsAg， HBeAg。
4. HBsAg， HBeAg的测定方法将步骤3收集的细胞培养基12000rpm离心 5min，取适量，采用乙型肝炎病毒s抗原及e抗原诊断试剂盒(酶联免疫 法，华美生物工程公司)按照说明书步骤进行测定。
5. 实验结果见图6，结果表明，与空白细胞相比，蚯蚓纤连蛋白酶处理 组HBsAg， HBeAg的分泌均受到抑制，细胞培养基中HBsAg， HBeAg 含量有所下降。蚯蚓纤连蛋白酶的几种纯化产物的氨基酸序列序列表
SEQ ID NO.l
MIVGGIEARP YEFPWQVSVR RKSSDSHFCG GS函DRWVV CAAHCMQGES
IFSLVGIVSW GIGCASGYPG VYSRVGFHAG WITDIITNN SEQ ID N0.2
FSLVGIVSWG IGCASGYPGV YSRVGFHAGW ITDTIT则 SEC ID NO.3
MELPPGTKIV GGIEARPYEF PWQVSVRRKS SDSHFCGGSI INDRWVVCAA
SVKDGSGIFS LIGIVSWGIG CASGYPGVYS RVGFHAAWIT DIITNN SEQ ID NO.4
LSVKDGSGIF SLIGIVSWGI GCASGYPGVY ARVGSQTGWI TDIITNN
21SEQ ID NO.5
VKDGSGIFSL GGIVSWGIGC ASGYPGVYSR VGFHAGWITD TITNN SEQ ID NO.6
MELPPGTKIV GGIEARPYEF PWQVSVRRKS SDSHFCGGSI INDRWVVCAA
SVKDGSGIFS LIGIVSWGIG CASGYPGVYS RVGFHAAWIT DIITNN SEC ID NO.7
DDIYSPLYTI TSDMICATDN TGQNERDSCQ GDSGGPLSVK DGNGIFSLIG IVSWGIGCAS GYPGVYARVG SQTGWITDII TNN
SE(J ID NO.8
SEQ ID NO.9<formula>formula see original document page 23</formula>HFASAINIGG NVQAALLPAN NNNDYSDLTC VISGWGRTGS SNVLPDTLQK ASIQVIGTTQ CQSLMGSIGN IWDNHICLYD NANNVGSCNG DSGGPLNCPD GGTRVAGVTS WGVSSGAGNC LQTYPSVYTR TSAYLSWIAN NS
SEQ ID N0.14
PVITTAQCTAAMVGVGGANI WDNHICVQDP AGNTGACNGD SGGPLNCPDG GTRVVGVTSW VVSSGLGACL PDYPSVYTRV SAHLGWIGDN SR
SEQ ID NO.15
PVITTAQCTAAMVGVGGANI WDNHICVQDP AGNTGACNGD SGGPLNCPDG GTRVVGVTSW VVSSGLGACL PDYPSVYTRV SAYLGWIGDN SR参考文献
1. 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒对纤维连接蛋白基因表达的调节。胃肠
病学和肝病学杂志2004， 13 (1) : 85-87。
2. 纤维连接蛋白在慢性中毒性肝病中的变化及其意义。现代中西医结 合杂志2003， 12 (16) : 1692-1693。
3. 纤维连接蛋白检测在肝病中的临床意义。中国热带医学2006， 6(5): 818-819。
4. Activation of fibronectin gene expression by hepatitis B virus x antigen. Journal of Viral Hepatitis, 2004, 11, 332—341.
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6. Fibronectin is essential for hepatitis B virus propagation in vitro: May be a potential cellular target Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 757—764.
7. Fibronectin of Human Liver Sinusoids Binds Hepatitis B Virus: Identification by an Anti-Idiotypic Antibody Bearing the Internal Image of the Pre曙S2 Domain. Journal of Virology, Feb. 1995, p. 840—848.
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9. Latent fibronectin-degrading serine proteinase activity in N-terminal heparin-binding domain of human plasma fibronectin. Eur. J. Biochem. 1991, 201: 71 -77.
10. Collagen-binding domain of human plasma fibronectin contains a latent type-IV collagenase. Eur. J. Biocheni. 1991, 201: 79-84.序列表
<110>中国科学院生物物理研究所
<120〉蚯顿纤连蛋白酶在乙型肝炎治疗中的应用
<130〉 IB080567
<160〉 15
<170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
<211> 239
<212〉 PRT
<213〉 蚯蚓
<400〉 1
Met lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin 15 10 15
Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser 20 25 30
lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly 35 40 45
Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser 50 55 60
Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val 65 70 75 80
Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val lie 85 90 95
Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys 100 105 110
Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser 115 120 125
Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie Cys Cys Pro Ala Val Leu 130 135 "0
Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala Val 145 150 155 160
Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn165 170 175
Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gy Gly Pro 180 185 190
Uu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu Val Gly lie Val
195
200 205
Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg
210
215 220
Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp lie lie Thr Asn Asn
225
<210〉 2
<211> 238
<212> PRT
<213> 蚯顿
〈400〉 2
230 235
lie 1
Val
Gly Gly lie Glu
5
Ala Arg Pro Tyr Glu 10
Phe Pro Trp Gin Val 15
Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie 20 25 30
lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu 35 40 45
Ala Pro Ala. Uu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala.
50
55
60
Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val Asn
65
70
75
80
Glu Asn Tyr Asp Pro Ala. Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys 85 90 95
Thr Ala Val Ala lie Thr Phe Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala
100
105
110
Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly
115
120
125
Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg
130
135
140
Tyr Val Thr Uu Asn lie Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala. Val Tyr
145
150
155
160
Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr 165 170 175
Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 180 185 190
27Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu Val Gly lie Val Ser 195 200 205
Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val 210 215 220
Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp Thr lie Thr Asn Asn 225 230 235
<210〉 3
<211〉 246
<212> PRT
<213> 蚯虫引
<400> 3
Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg
1
5
10
15
Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp
20
25
30
Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 35 40 45
Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val
50
55
60
Val Gly G]u His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His
65
70
75
80
Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Thr Asn 丁hr Leu 85 90 95
Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ser Val Ala lie Thr Phe Asp
100
105
110
lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tvr Val 115 120 125
Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly 130 135 140
lie Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Asp Thr Thr
145
150
155
160
Asn Gin Tyr Cys Glu Asp Val Tvr Pro Leu Asn Ser lie Tyr Asp Asp 165 170 175
Met lie Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp SeT Cys 180 185 190
Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie
195
200
205
28<formula>formula see original document page 29</formula>lie Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cvs Ala Ser 210 215 220
Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly Ser Gin Thr Gly Trp lie 22^ 230 235 240
Thr Asp lie lie Thr Asn Asn 245
〈210〉 5
〈211〉 245
〈212〉 PRT
〈213> 蚯顿
<400> 5
Met 1
Glu
Leu Pro Pro Gly Lys 5
lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro 10 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser
20
25 30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala
35
40 45
Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val
50
55
60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp
65
70
75 80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu
85
90 95
Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie
100
105 110
Asn Va.l Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr
115
120 125
Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie 130 135 140
Cys Cys Pro Ala Va.l Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn
145
150
155 160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met
165
170 175
lie Cys A〗a Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin
180
185 190
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe
195
200 205
Ser Leu Gly Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr210 215 220
Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly 丁rp lie Thr Asp
225 230
Thr lie Thr Asn Asn 245
235 240
〈210〉 <211> <212> 〈213>
6
246 PRT 蚯蚓
<400〉 6 Met
Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Gly Gly lie 5 10
Glu Ala Arg 15
Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp
20 25
30
Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 35 40 45
Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val 50 55 60
Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His
65
70 75
80
Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Ala Asn Thr Leu
85 90
95
Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ser Val Ala lie Thr Phe Asp
100 105
110
lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val 115 120 125
Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly 130 135 140
lie Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Val Thr Thr
145
150 155
160
Asn Gin Phe Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser lie Tyr Asp Asp
165 170
175
Met lie Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys
180 185
190
Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie 195 200 20^
Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly 210 215 220
31Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp lie Thr
225 230
Asp lie lie Thr Asn Asn 245
<210〉 7
〈211〉 283
<212> PRT
〈213〉 蚯顿
235 240
<400〉 7
Met Leu 1
Leu Leu Ala Leu Ala Ser Leu Val Ala Val Gly Phe Ala Gin 5 10 15
Pro Pro Val Trp Tyr Pro Gly G1y Gin Cys Ser Val Ser Gin Tyr Ser 20 25 30
Asp Ala Gly Asp Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys lie Val Glv Gly 35 40 45
lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg
50
55 60
Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg
65
70 75 80
Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu 85 90 95
Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val 100 105 110
Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val His Glu Asp Tyr Asn 115 120 125
Gly Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Val Asn Ala
130
135 140
lie Ala lie Asp lie Asn Asp Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala 145 150 155 160
Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie 165 170 175
Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Va.l Thr Leu 180 185 190
Asn Val Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Asp lie Tyr Ser Pro Leu Tyr 195 200 205
Thr lie Thr Ser Asp Met lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Gin Asn
210
215 220
32Glu Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys
225
230 235 240
Asp Gly Asn Gly lie Phe Ser Leu lie Gly lie Val Ser Tip Gly lie 245 250 255
Gly Cys Ala Ser Glv Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly Ser Gin 260 265 270
Thr Gly Trp lie Thr Asp lie lie Thr Asn Asn 275 280
<210> 8
<211> 245
<212> PRT
<213〉 蚯虫引
<400> 8
Met 1
Glu
Leu Pro Pro 5
G工y Lys lie
Val Gly Gly 10
lie Glu Ala
Arg Pro 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser
20
25
30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Ala Cys Ala
35
40
45
Ala His Cvs Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val 50 55 60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp
65
70
75
80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu 85 90 95
Asn A印Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp lie
100
105
110
Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr
115
120
125
Arg Lvs Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie 130 13^ 140
Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn
145
150
155
160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met
165
170
175
lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gin
180
185 190Gly Asp Ser 195
Ser Leu Val 210
Pro Gly Val 225
Thr lie Thr
<210〉 9
〈211〉 246
<212> PRT
〈213〉 蚯躬l
〈400〉 9
Met Glu Leu 1
Pro Tyr Glu
Ser His Phe 35
Ala Ala. His 50
Val Gly Glu 65
Asp Val Asp
Glu Asn Asp
lie Asn Val 115
Tyr Arg Lvs '130
lie Cys Cys 145
Asn Ala Phe
Met lie Cys
Gin Gly Asp
Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe 200 205
Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly Tyr 215 220
Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp 230 235 240
Asn Asn 245
Pro Pro Gly Thr Lvs lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg 5 10 15
Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Thr Asp 20 25 30
Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 40 45
Cys Met Gin Gly Giu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val 55 60
His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His 70 75 80
Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asn Pro Arg Thr Leu 85 90 95
Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp 100 105 110
Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val 120 125
Ser Gin Cys Ser Glv Trp Gly Ser lie Asn Ser Gly Gly 135 140
Pro Ala Val Uu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr 150 155 160
Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp 165 170 175
Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys 180 185 190
Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie
34195 200 205
Phe Ser Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala Ser Gly 210 215 22i)
Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr
235 240
225 230
Asp Thr lie Thr Asn Asn 245
〈210〉 10
<211> 245
<212〉 PRT
〈213〉 蚯虫弓l
<400〉 10
Met Glu Leu Pro Pro Gly Lys lie Val Gly Gly lie Glu Ala Gly Pro 15 10 15
Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val Ser Val Arg Arg Lys Pro Ser Asp Ser 20 25 30
His Phe Cys Gly Gly Ser lie lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala 35 40 45
Ala His Cys Met Gin Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val 50 55 60
Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp 65 70 75 80
Val Asp Ser lie Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu 85 90 95
Asn Asp Val Ser Val lie Lys Thr Ala lie Ala lie Thr Phe Asp He 100 105 110
Asn Val Gly Pro lie Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr 115 120 125
Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly Trp Gly Thr lie Asn Ser Gly Gly lie li30 135 ' 140
Cvs Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn lie Thr Thr Asn 145 150 155 160
Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr lie Tyr Asp Asp Met 165 170 175
lie Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met 丁hr Asp Arg Asp Ser Cys Gin 180 185 190
Glv Asp Ser Gly Glv Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe 195 200 205
35Ser Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly lie Gly Cys Ala. Ser Gly Tyr 210 215 220
Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp lie Thr Asp
225 230
Thr lie Thr Asn Asn 245
235 240
<210〉 〈211〉 <212〉 〈213>
11
239 PRT 蚯顿
<400〉 11
lie Val Gly Gly lie Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gin Val 15 10 15
Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser lie 20 25 30
lie Asn Asp Arg Trp Val Val Cvs Ala Ala His Cys Met Gin Gly Glu 35 40 45
Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Va.l Gly Glu His Asp Ser Ser Ala 50 55 60
Ala. Ser Thr Val Arg Gin Thr His Asp Val Asp Ser lie Phe Val His 65 70 75 80
Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ser Val lie Lys 85 90 95
Thr Val Asn Ala lie Ala lie Asp lie Asn Val Gly Pro lie Cys Ala 100 105 110
Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gin Cys Ser Gly 115 120 ' 125
Trp Gly Thr Val Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg 130 135 140
Tyr Val Thr Leu Asn Val Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Asp lie 丁yr 145 150 155 160
Ser Pro Leu Tyr Thr lie Thr Ser Asp Met lie Cvs Ala Thr Asp Asn 165 170 175
Thr Gly Gin Asn Glu Arg Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Glv Pro 180
Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly lie Phe Ser Leu lie G1y lie Val 195 20i) 205<formula>formula see original document page 37</formula>Gin
225
<210> <211> <212〉 <213〉
13 242 PRT 蚯虫引
<400〉 13
Met Gly 1
Gly Glu Gin 5
Tyr lie lie Glv Gly Ser Asn Ala Ser 10
Pro Gly 15
Glu Phe Pro Trp Gin Leu Ser Gin Thr Arg Gly Gly Ser His Ser Cys 20 25 30
Gly Ala Ser Leu Leu Asn Ala. Leu Asn Gly Leu Ser Ala Ser His Cys 35 40 45
Val Asp Gly Ala Ala Pro Gly Thr lie Thr Val lie Ala Gly Leu His 50 55 60
Asp Arg Ser Gly Thr Pro Gly Ser Gin Glu Val Asp lie Thr Gly Tyr 65 70 75 80
Thr Met His Glu Asn Tyr Asn Gin Gly Thr Asn Thr Tyr Ala Asn Asp 85 90 95
lie Ala lie Leu His Phe Ala Ser Ala lie Asn lie Gly Gly Asn Val 100 105 110
Gin Ala Ala Leu Leu Pro Ala Asn Asn Asn Asn Asp Tyr Ser Asp Leu 115 120 125
Thr Cys Val lie Ser Gly Trp Gly Arg Thr Gly Ser Ser Asn Val Leu 130 135 140
Pro Asp Thr Leu Gin Lys Ala Ser lie Gin Val lie Gly Thr Thr Gin 145 150 155 160
Cys Gin Ser Leu Met Gly Ser lie Gly Asn lie Trp Asp Asn His lie 165 170 175
Cys Leu Tyr Asp Asn Ala Asn Asn Val Gly Ser Cys Asn Gly Asp Ser 180 185 19b
Gly Gly Pro Uu Asn Cys Pro Asp Gly Gly Thr Arg Val Ala Gly Val 195 200 205
Thr Ser Trp Gly Val Ser Ser Gly Ala Gly Asn Cys Leu Gin Thr Tyr 210 215 220
Pro Ser Val Tyr Thr Arg Thr Ser Ala Tyr Leu Ser Trp lie Ala Asn 225 230 235 240
Asn Ser
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〈400〉 14
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Ala Met Val Gly Val Gly Gly Ala Asn lie Trp Asp Asn His lie Cys 165 170 175
Val Gin Asp Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Cys Asn Gly Asp Ser Gly 180 185 190
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Ser Trp Val Val Ser Ser Gly Leu Gly Ala Cys Leu Pro Asp Tyr Pro 210 21^ 220
Ser Val Tyr Thr Arg Val Ser Ala Tyr Leu Gly Trp lie Gly Asp Asn 225 230 23^ 240
Ser Arg
权利要求
1.蚯蚓纤连蛋白酶用于降解纤维连接蛋白的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.l。
3. 权利要求1的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序列， 其氨基酸序列具有H43， D91， S^(其上编号对应于SEQIDN0.1氨基酸序 列)组成的催化三联体。
4.权利要求1或3的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。
5.权利要求1或3的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，所述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4， SEQ IDN0.5， SEQIDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQ IDNO.IO， SEQIDNO.il， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQIDN0.14， SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。
6.蚯躬l纤连蛋白酶用于制备药物的应用，所述药物用于预防或治疗与 纤维连接蛋白有关的疾病。
7.权利要求6的应用，所述疾病为乙型肝炎，慢性乙型肝炎，肝硬 化，肿瘤疾病。
8. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.l。
9. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸序 列，其氨基酸序列具有H43， D91， S'88(其上编号对应于SEQIDN0.1氨基 酸序列)组成的催化三联体。
10. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸 序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO.l具有80%以上的同源性。
11. 权利要求6或7的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶具有这样的氨基酸 序列，所述氨基酸序列选自SEQIDN0.2， SEQIDN0.3， SEQIDN0.4，SEQIDNO,5， SEQIDN0.6， SEQIDNO,7， SEQIDNO,8， SEQIDNO,9， SEQIDNO.IO， SEQIDNO.ll， SEQIDNO,12， SEQIDN0.13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列。
12. 权利要求6的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQIDNO,3， SEQIDN0.4， SEQIDN0.5， SEQIDN0.6， SEQ ID NO.7 ， SEQ ID N0.8 ， SEQ ID NO.9， SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11 ， SEQIDN0.12， SEQIDN0.13， SEQIDNO.14, SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列的单一组分使用。
13. 权利要求6的应用，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用， 所述混合物包括SEQ ID NO.l, SEQ ID N0.2， SEQ ID NO.3 ， SEQ ID N0.4， SEQIDNO.5, SEQIDNO.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO, SEQIDNO.il， SEQIDN0.12， SEQIDNO,13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列中的两种或多种。
14. 权利要求13的应用，所述蚯蚓纤连蛋白酶作为粗酶混合物使用，所 述混合物主要成分有SEQ ID NO.l ， SEQ ID N0.2， SEQ ID N0.12, SEQ ID N0.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15,其中SEQ ID NO.l丰度最高。
15. —种用于治疗与纤维连接蛋白相关疾病的药物，所述药物包含所述 蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。
16. 权利要求15的药物，其中所述纤维连接蛋白相关疾病为乙型肝炎， 慢性乙型肝炎，肝硬化或肿瘤疾病。
17. 权利要求15或16的药物，所述蚯蚓纤连蛋白酶的氨基酸序列为 SEQIDNO.l;或具有H43， D91， S"8(其上编号对应于SEQ ID NO.l氨基 酸序列)组成的催化三联体；或与SEQ ID NO.l具有80%以上的同源性； 或选自SEQIDNO.2, SEQ ID NO.3 ， SEQIDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ ID N0.6， SEQIDNO.7, SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO, SEQ ID NO.l 1， SEQIDNO.12, SEQIDNO.13, SEQIDNO.14, SEQIDNO.15 所示的氨基酸序列。
18. 权利要求15或16的药物，其中所述蚯蚓纤连蛋白酶作为选自SEQ ID NO.l, SEQIDNO.2, SEQ ID NO.3 ， SEQIDNO.4, SEQIDNO.5, SEQ IDN0.6, SEQIDN0.7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO,SEQIDNO.il， SEQ ID NO. 12， SEQ ID NO. 13， SEQ ID NO. 14， SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列的单一组分使用；或作为粗酶混合物使用，所述 混合物包括SEQIDNO.l, SEQIDNO.2, SEQIDN0.3， SEQ ID NO.4, SEQIDNO,5， SEQIDNO.6, SEQIDNO,7， SEQIDNO.8, SEQIDNO.9, SEQIDNO.IO， SEQIDNO.il， SEQIDNO.12, SEQIDNO,13， SEQ ID N0.14, SEQIDNO.15所示的氨基酸序列中的两种或多种。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，本发明提供了蚯蚓纤连蛋白酶对纤维连接蛋白的降解作用；本发明还提供了所述蚯蚓纤连蛋白酶用于治疗乙型肝炎的应用，尤其是对慢性乙型肝炎，乙型肝炎引起的肝硬化的预防和治疗作用；本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述蚯蚓纤连蛋白酶作为活性成分。
文档编号A61P31/20GK101525610SQ20081010135
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者荣 潘, 王学清, 蓉 肖, 赫荣乔, 岚 陈 申请人:中国科学院生物物理研究所