一种乌骨藤皂苷药物组合物及其制备方法

专利名称：一种乌骨藤皂苷药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单味中药的提取物，具体的说，本发明涉及一种乌骨藤皂苷提取物及其 制备方法、用途、药物组合物等。
背景技术：
乌骨藤，又名通光散，通光藤，系萝蘼科(Ascl印iadaceae)牛奶菜属(Marsdenia R. Br.)植 物通关藤(Marsdeniatenacissima(Roxb.)WightetArn.)的藤茎。主要产于云南、贵州等地，始 载于《滇南本草》。乌骨藤含有甾体酯苷、生物碱、有机酸、多糖、树脂及色素等多种化学 成分。它的药理活性非常广泛，具有抗肿瘤、免疫调节、保肝利尿等作用。
目前，临床使用的由乌骨藤单味中药制成的消癌平有多种剂型，如片剂、胶囊、糖浆、 颗粒、口服液、咀嚼片、注射液等，这些制剂均具有抗癌、消炎、平喘等功效，对胃癌、肝 癌、肺癌、食道癌等多种肿瘤具有确切的抗肿瘤疗效，并可配合放疗、化疗的辅助治疗，是 一种很有前途的抗肿瘤中药。
但由于乌骨藤化学成分复杂，分离难度大，研究深度还不够，对本品起到抗肿瘤作用的
有效成分并未进行合理准确的定位和控制。目前消癌平的制备方法仅为简单的水提醇沉，质 量控制仍采用部颁标准中的分光光度法，对其中具有抗菌消炎活性的绿原酸进行含量测定作 为质控指标，而绿原酸本身的含量并不能反映其抗肿瘤活性的好坏，显然以绿原酸作为质控 指标不是很妥当。
随着中药现代分离技术的发展，对中药乌骨藤的化学成分研究也逐渐深入，逐渐明确了 具有C21甾体皂苷母核的皂苷类成分的抗肿瘤作用。如CN1544032A中公开了乌骨藤皂苷提取物 具有抗月中瘤活性；文献"Two New C21 Steroidal Glycosides from Marsdenia tenacissima (ROXB.)WIGHT et ARN, Chem. Pharm. Bull, 54(5)， 696-698 (2006)"指出个别乌骨藤苷如乌 骨藤苷L(tenacissoside L)和乌骨藤苷M (tenacissoside M)具有体外抗肿瘤活性，其他乌骨 藤苷单体未见抗肿瘤活性报道。但是，目前关于乌骨藤的抗肿瘤作用机制还不明确。文献"中 国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京:科学出版社，1977, (63) :442-465"及 "《抗癌中药的临床应用》"中认为乌骨藤具有明显的提高机体免疫的作用，能有效地提高 人体的免疫功能，其抗癌作用的实现可能不是细胞毒，而是通过加强机体免疫力来达到抗癌 效果；也有药理研究认为，乌骨藤中独特的化学成分"新C21 —甾体苷"具有诱导和促使微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定的独特作用机制。
由于乌骨藤皂苷成分的结构类似，极性差别很小，所以分离难度很大，在无法找到有效 的规模化生产制备结构明确的乌骨藤皂苷的方法背景下，很多研究人员采用将此类皂苷水解 的方法去制备乌骨藤皂苷元。此外， 一些科研工作者通过实验室方法也分离到微量的乌骨藤 皂苷单体，并进行了结构确证。例如陈纪军等从乌骨藤的茎中分离得到通光藤苷F, G， H和I， 并根据光谱数据和化学方法推定了其结构邢旺兴等分离鉴定出通光藤苷J(tenacissoside J) 和通光藤苷K (tenacissoside K);王曙等从乌骨藤茎中分离、纯化得到通光藤苷 L(tenacissoside L)、通光藤苷M(tenacissoside M)。但目前对乌骨藤苷单体的分离手段主 要还是实验室微量样品的制备，只能用于结构分析，无法达到规模化生产制备的水平。
目前上市的乌骨藤单味中药制成的消癌平制剂中，其制备工艺和质量标准还不成熟，反 映其临床功效与药理作用的有效成分有待于进一步明确。因此，很有必要对其进行深入开发 研究，明确其抗肿瘤药效物质基础，建立乌骨藤制剂的科学而客观的指标，从而使制剂质量 稳定、可控。
本发明正是在长期研究的基础上，运用了中药现代化方法的合理组合，解决了乌骨藤皂 苷成分难以分离的缺憾，制得的皂苷提取物中主要成分结构明确，水溶性好，适合制备成口 服制剂和注射剂等多种剂型。药效实验证明，按照本发明制得的乌骨藤皂苷提取物在抗肿瘤 方面具有显著的活性，而且安全无毒副作用。本法具有很好的重复性，适合工业化生产。

发明内容
本发明旨在提供一种主要成分明确且含量高的乌骨藤皂苷提取物及其制备方法，及其在 抗肿瘤方面的用途。
本发明提供了一种含乌骨藤皂苷提取物的药物组合物及其在抗肿瘤方面的用途。 本发明还提供了乌骨藤皂苷的活性成分乌骨藤皂苷A、 B、 D或H单体的制备及分析检
测方法。
本发明另外提供了一种乌骨藤皂苷提取物，其中乌骨藤皂苷A、 B、 D或H中的一种或 几种为主要成分，其中按重量百分含量计，乌骨藤皂苷A、 B、 D或H的一种或几种的总含 量为50-100%。
本发明提供的乌骨藤皂苷提取物，按重量百分含量计，乌骨藤皂苷A和H的比例约为1:
0.2~5，优选地约为l: 0.5~4，更优选地约为l: 1.6~2.5。进一步地，本发明的乌骨藤皂苷提
取物，按重量百分含量计，其中A: B: D: H约为h 0.1~2: 0.2-5: 0.2~5，优选地A: B: D: H约为l: 0.25~1.5: 0.5~4: 0.5~4;更优选地A: B: D: H约为1: 0.8-1.2: 1.5~2.5:1.6~2.5，最优选地A: B: D: H约为l: 1: 2: 2。
本发明提供的制备上述乌骨藤皂苷提取物的方法，包括以下步骤
(1)取乌骨藤药材，加入溶剂提取1 4次，每次1 3小时，合并提取液，浓縮至一 定体积；
(2) 取浓縮液，加入有机溶剂进行多次液一液萃取，使乌骨藤皂苷充分转移至有机层 中，合并有机层，浓縮至稠膏状；
(3) 将上述稠膏状粗提物加有机溶剂溶解，过滤，滤液过氧化铝层析柱，并加有机溶 剂洗脱，薄层监测，收集、合并含乌骨藤皂苷的流份，浓縮至干，即得乌骨藤皂苷粗品(a);
(4) 将乌骨藤皂苷粗品(a)溶于水中，过滤，滤液过由聚酰胺-大孔树脂串联的层析 柱，水充分洗脱后，加有机溶剂解析大孔树脂上富集的皂苷类成分，浓縮，干燥，即得乌骨 藤皂苷粗品(b);
(5) 将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于有机溶剂中，过硅胶层析柱并加有机溶剂洗脱，收 集皂苷部分，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷精制品(c);
(6) 将上述乌骨藤皂苷精制品(c)加入到适量溶剂中，加热使溶解，过滤，静置， 结晶，过滤，干燥，得到以乌骨藤皂苷A、 B、 D或H中一种或几种为主成分的乌骨藤皂苷 提取物(d)。
上述步骤(1)中，所述的提取溶剂可以选自水、甲醇、丙酮或1%-95%的乙醇中的一种 或几种，优选为60%-80%的乙醇，最优选为75%乙醇，对皂苷的提取率较高，确保了药材 资源的充分利用；步骤(2)中，萃取所用的溶剂可以为乙酸乙酯、正丁醇、氯仿等，优选为 正丁醇、乙酸乙酯；步骤(3)中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙醇、石油醚， 优选为乙酸乙酯。所用的氧化铝可以为中性氧化铝、酸性氧化铝或碱性氧化铝，优选为中性 氧化铝。
步骤(4)中，聚酰胺的作用在于选择性好，研究表明聚酰胺虽然不吸附乌骨藤的活性皂 苷成分，但却能选择吸附其中的其它有机酸、色素杂质，利用这一特征对本品进行纯化，可 使含量进一步提高，尤其在脱色除杂方面，起到显著的作用。同时，此步骤串联使用的大孔 树脂又能选择性吸附住有效皂苷类成分，同时对多糖等杂质不吸附，可再利用这一特征，通 过水洗脱去除多糖等大极性杂质，对本品进行了进一步的纯化除杂。在此步骤中，选择了两 种不同性质的层析材料并巧妙的采用串联方法使用，达到了乌骨藤活性皂苷类成分的进一步 富集和纯化，为本品制备工序中的核心部分。
步骤(4)中所用的聚酰胺可以为多种不同的目数，如10 30目、60~100目、200~300 目等，优选为60-100目的聚酰胺。其中所用的大孔树脂型号可为HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、 DlOl、 D1300,优选树脂型号为HPD-100大孔树脂。有机溶剂可为甲醇、乙醇、丙酮 或水中的一种或几种，优选5%-95%的乙醇。
步骤(5)中，所述的有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚中的一 种或多种，优选为单一溶剂，最优选为乙酸乙酯。选用单一溶剂进行洗脱，而不是采用混合 溶剂的梯度洗脱，不但为实现工业化生产提供了保证，而且同样取得了很好的效果，在洗脱 过程中，少量的非皂苷类成分可被先行洗脱，从而有效分离，而样品中的残存少量色素类成 分基本都被死吸附在硅胶上，无法洗脱，从而达到有效分离；所选用的硅胶目数可以为 100-200目和200-300目，优选100 200目，不但分离速度快，效率高，而且纯化效果也较 好。
步骤(6)中，结晶溶剂优选为乙醇-水(1: 1)的混合溶剂。本步骤中通过结晶，可以 进一步纯化乌骨藤皂苷，从而得到成为组分明确，比例适当的乌骨藤皂苷提取物。
本发明提供的制备乌骨藤皂苷A、 B、 D或H单体的制备方法，包括以下步骤 将步骤(5)中的乌骨藤皂苷精制品加入到异丙醚-丙酮(5: 1)的混合溶剂中，加热使溶解，
过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，继续通过ODS硅胶柱，60%乙醇洗脱，可以得到含量
为98%~99.8%的乌骨藤皂苷A。
将步骤(5)中的乌骨藤皂苷精制品加入到异丙醚-乙醇(2: l)的混合溶剂中，加热使溶解，
过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，继续通过ODS硅胶柱，40%乙醇洗脱，可以得到含量 为98%~99.5%的乌骨藤皂苷B。
将步骤(5)中的乌骨藤皂苷精制品加入到异丙醚-乙醇(1:2)的混合溶剂中，加热使溶解，
过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，继续通过ODS硅胶柱，40%乙醇洗脱，可以得到含量 为98%~99.5%的乌骨藤皂苷D。
将步骤(5)中的乌骨藤皂苷精制品加入到甲醇-水(3: 1)的混合溶剂中，加热使溶解，过 滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，继续通过ODS硅胶柱，50%乙醇洗脱，可以得到含量为 98%~99.5%的乌骨藤皂苷H。
对于本领域的技术人员而言，要获得本发明所述的乌骨藤皂苷提取物，可通过上述六个 步骤得到；也可以将乌骨藤皂苷提取物加适量的A、 B、 D或H的单体混合得到；也可以直 接按比例将相应单体混合得到。
本发明所述的乌骨藤皂苷A (Tenacissoside A)结构式为C48H74019;乌骨藤皂苷B (Tenacissoside B)的结构式为C5iH78019;乌骨藤皂苷D (Tenacissoside D)的结构式为C51H8o019;乌骨藤皂苷H (Marsdenoside H)的结构式为C48H76019;其中，文献 "phytochemistry， 25(12)， 2861-2865， 1986"中公开了乌骨藤皂苷A、 B、 D的光谱数据，文 献"phytochemistry， 66 (9) ， 1040-1051， 2005"中公开了乌骨藤皂苷H的光谱数据。乌骨藤 皂苷A、 B、 D、 H分别具有如下的结构式
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乌骨藤皂苷A (Tenacissoside A)的结构式
<formula>formula see original document page 7</formula>乌骨藤皂苷D (Tenacissoside D)的结构式<formula>formula see original document page 7</formula>
乌骨藤皂苷B (Tenacissoside B)的结构式本发明还提供了一种含乌骨藤皂苷提取物的药物组合物。它包含治疗有效量的乌骨藤皂 苷提取物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。可采用本领域公知的方法来制备本发 明的药物组合物，合适的药物组合物包括片剂、胶囊、软胶囊、糖浆、颗粒、口服液、咀嚼 片、滴丸、粉针或注射液等，优选注射液、片剂、胶囊。本发明的乌骨藤皂苷提取物的有效 剂量范围为约0.05 — 500mg/kg/天。为了说明本发明乌骨藤皂苷提取物的抗肿瘤活性，选择了 来源于上皮组织的肺癌和肝癌以及来源于间叶组织的肉瘤，对其进行了抗肿瘤活性的研究， 实验结果表明本发明提供的乌骨藤皂苷提取物具有确切的抗肿瘤活性。
本发明与现有技术相比，具有以下显著的效果-
(1) 本发明提供的乌骨藤皂苷提取物成分明确，以乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H其中一种或 几种为主要活性成分，从而明确建立了乌骨藤皂苷提取物的科学而客观的指标，使其质量稳 定、可控。药效实验证明，本发明制得的乌骨藤皂苷提取物药效确切，在抗肿瘤方面具有显 著活性，而且毒副作用较小。因此开发本发明提供的乌骨藤皂苷提取物具有非常高的价值。
(2) 本发明提供的乌骨藤皂苷提取物的制备方法，解决了乌骨藤皂苷成分难以分离的缺 憾，制得的皂苷提取物中杂质少，皂苷含量高，主要成分结构明确，水溶性好。且本发明的 制备工艺经多批生产验证，证明其重复性、稳定性好，乌骨藤药材的资源利用率高，提取物 的得率高，适合工业化生产。
(3) 本发明提供的制备乌骨藤皂苷单体的方法不但为质量控制和结构分析提供了保证， 采用HPLC对有效成分的进行含量测定从而更好地控制产品的内在质量。而且也克服了乌骨藤 皂苷单体只能在实验室微量制备的缺点，从根本上解决了乌骨藤皂苷单体大规模产业化生产
的问题。
MeO'
乌骨藤皂苷H (Marsdenoside H)的结构式
具体实施例方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例中，所用的水为纯化水，所用乙醇为药用级，其他溶媒均为分析纯，分离材料为 层析用级别。乌骨藤药材产地为云南和贵州；提取物中乌骨藤皂苷的含量测定采用高效液相 色谱(HPLC)法，乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H对照品均为自制品，纯度大于98%;液相条件 为
流动相 乙腈水=36: 64
检测器 蒸发光散射检测器 流速 0.8毫升/分钟
色谱柱 C18柱，250cm x 4.6mm，粒径5 ii m 柱温 30 °C
乌骨藤皂苷提取物中乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H的含量测定方法
供试品溶液的制备精密称取乌骨藤皂苷提取物20.0mg，以甲醇溶解转移至100mL容 量瓶并定容至刻度，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备分别取乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H各20.0mg，精密称定，加甲醇制成 每lml含200lig的溶液，即得。
分别精密吸取20yL对照品和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定。
实施例一
取乌骨藤药材100kg，粉碎切成粗粉，装入热回流提取罐，加8倍量的75%乙醇，加热 回流提取3次，每次2h，放出提取液，合并，过滤，滤液浓縮至20L，分别加入等体积乙酸 乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯液，浓縮至稠膏状再加入乙酸乙酯50L加热使溶解，过滤，滤 液过中性氧化铝柱，并加50L乙酸乙酯洗脱，薄层监测，收集乌骨藤皂苷部分，并浓縮至干， 得乌骨藤皂苷粗品(a) 3.2kg。
取粗品(a)，加水100L，搅拌使溶解，板框过滤，滤液过由聚酰胺U00 200目，20L) -大孔树脂(HPD-IOO， 100L)串联的层析柱，水充分洗脱后，解除串联，加70%乙醇解析大 孔树脂上富集的皂苷类成分，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷粗品(b) 1.9kg。
将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于20L乙酸乙酯中，过滤，滤液过硅胶层析柱，加乙酸乙酯 20L洗脱，收集皂苷部分，浓缩，干燥，即得乌骨藤皂苷精制品(c) 1.4kg。
将上述乌骨藤皂苷(c)加入到7L乙醇-水(1: 1)的混合溶剂中，加热至回流使溶解，到以乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H为主成分高纯度 的乌骨藤皂苷提取物(d)l.lkg。
经高效液相色谱法含量测定，本品中乌骨藤皂苷A、B、D、H的含量分别为16.5%、15.8%、 32.1%、 31.2%。
实施例二
取乌骨藤药材100kg，粉碎切成粗粉，装入提取罐中，加10倍量的水加热回流提取3次， 每次2.5h，放出提取液，合并，过滤，滤液浓縮至50L，分别加入等体积乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯液，浓縮至稠膏状再加入乙酸乙酯50L加热使溶解，过滤，滤液过中性氧化铝 柱，并加50L乙酸乙酯洗脱，薄层监测，收集乌骨藤皂苷部分，并浓縮至干，得乌骨藤皂苷 粗品(a) 2.6kg。
取粗品(a)，加水200L，搅拌使溶解，板框过滤，滤液过由聚酰胺(100-200目，40L) -大孔树脂(HPD-600, 150L)串联的层析柱，水充分洗脱后，解除串联，加95%乙醇解析大 孔树脂上富集的皂苷类成分，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷粗品(b) 1.4kg。
将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于15L乙酸乙酯中，过滤，滤液过硅胶层析柱，加乙酸乙酯 15L洗脱，收集皂苷部分，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷精制品(c) l.lkg。
将上述乌骨藤皂苷精制品(c)加入到5L乙酸乙酯-乙醇(3: 1)的混合溶剂中，加热至 回流使溶解，过滤，滤液静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到以乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H为 主成分高纯度的乌骨藤皂苷提取物(d)0.7kg。
经高效液相色谱法含量测定，本品中乌骨藤皂苷A、B、D、H的含量分别为12.5%、 11.8%、 36.9%、 35.2%。
实施例三
取乌骨藤药材200kg，粉碎切成粗粉，装入提取罐中，加6倍量的95%乙醇加热回流提 取3次，每次1.5h，放出提取液，合并，过滤，滤液浓縮至100L，分别加入等体积正丁醇萃 取3次，合并正丁醇液，浓縮至稠膏状再加入无水乙醇50L加热使溶解，过滤，滤液过中性 氧化铝柱，并加50L无水乙醇洗脱，薄层监测，收集乌骨藤皂苷部分，并浓縮至干，得乌骨 藤皂苷粗品(a) 6.6kg。
取粗品(a)，加水300L，搅拌使溶解，板框过滤，滤液过由聚酰胺(100~200目，100L) -大孔树脂(HPD-IOO， 100L)串联的层析柱，水充分洗脱后，解除串联，加50%乙醇解析大 孔树脂上富集的皂苷类成分，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷粗品(b) 3.8kg。将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于40L乙酸乙酯-乙醇(1: 1)的混合溶剂中，过滤，滤液过 硅胶层析柱，加乙酸乙酯-乙醇(1: 1) 40L洗脱，收集皂苷部分，浓縮，干燥，即得乌骨藤
皂苷精制品(c) 2.2kg。
将上述乌骨藤皂苷精制品(c)加入到11L甲醇-水(2: 1)的混合溶剂中，加热至回流 使溶解，过滤，滤液静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到以乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H为主成 分高纯度的乌骨藤皂苷提取物(d)1.7kg。
经含量测定，本品中乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H的含量分别为10.5%、 14.4%、 23.0%、 27.9%。
实施例四
取乌骨藤药材100kg，粉碎切成粗粉，装入热回流提取罐，加7倍量的95%乙醇，加热 回流提取3次，每次1.5h，放出提取液，合并，过滤，滤液浓縮至20L，分别加入等体积乙 酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯液，浓縮至稠膏状再加入乙酸乙酯60L加热使溶解，过滤， 滤液过中性氧化铝柱，并加60L乙酸乙酯洗脱，薄层监测，收集乌骨藤皂苷部分，并浓縮至 干，得乌骨藤皂苷粗品(a) 3.5kg。
取粗品(a)，加水100L，搅拌使溶解，板框过滤，滤液过由聚酰胺(60~100目，40L) -大孔树脂(HPD-400, 100L)串联的层析柱，水充分洗脱后，解除串联，加75%乙醇解析大 孔树脂上富集的皂苷类成分，收集乙醇洗脱液，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷粗品(b) 2.2kg。
将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于30L乙酸乙酯中，过滤，滤液过硅胶层析柱，加乙酸乙酯 30L洗脱，收集皂苷部分，浓縮，干燥，即得乌骨藤皂苷精制品(c) 1.5kg。
取上述乌骨藤皂苷精制品(c) 300g，加入1.5L的异丙醚-丙酮(5: 1)的混合溶剂中， 加热使溶解，过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到乌骨藤皂苷A27.4g (高效液相测定 其含量为88.4%)。取上述乌骨藤皂苷A，加60。/。乙醇200ml，溶解，过滤，滤液过反相ODS 硅胶柱，并加60%乙醇洗脱，薄层检测，收集乌骨藤皂苷A流分，减压浓縮，干燥，得到乌 骨藤皂苷A纯品16.4g (高效液相测定含量99.6%)， MS: m/z=977[M+Na]+。
取上述乌骨藤皂苷精制品(c) 300g，加到2.1L的甲醇-水(3: 1)的混合溶剂中，加热 使溶解，过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到乌骨藤皂苷H51.4g (高效液相测定其含 量为82.5%)。取上述乌骨藤皂苷H，加50%乙醇100ml溶解，过滤，滤液过反相ODS硅胶 柱继续通过ODS硅胶柱，并加50%乙醇洗脱，薄层检测，收集乌骨藤皂苷H流分，减压浓 縮，干燥，得到乌骨藤皂苷H纯品33.1g (含量99.5%)， MS: m/z=979[M+Na]+。
取上述乌骨藤皂苷精制品(c) 300g，加入1.5L的异丙醚-乙醇(2: 1)的混合溶剂中， 加热使溶解，过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到乌骨藤皂苷B26.6g (高效液相测定其含量为78.3%)。取上述乌骨藤皂苷B，加40。/。乙醇200ml，溶解，过滤，滤液过反相ODS 硅胶柱，并加40%乙醇适量洗脱，薄层检测，收集乌骨藤皂苷B流分，减压浓縮，干燥，得 到乌骨藤皂苷B纯品16.5g (高效液相含量98.8%)， MS: m/z= 1017[M+Na]+。
取上述乌骨藤皂苷精制品(c) 300g，加到1.8L的异丙醚-乙醇(1: 2)的混合溶剂中， 加热使溶解，过滤，静置，结晶，过滤结晶，干燥，得到乌骨藤皂苷D55.6g (高效液相测定 其含量为75.5%)。取上述乌骨藤皂苷D，加40%乙醇100ml溶解，过滤，滤液过反相ODS 硅胶柱，并加适量40%乙醇洗脱，薄层检测，收集乌骨藤皂苷D流分，减压浓縮，干燥，得 到乌骨藤皂苷D纯品32.1g (含量99.1%)， MS: m/z=1019[M+Na]+。
实施例五
分别取实施例四中的乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H纯品各3g、 3g、 6g、 6g,混和均匀，得到
组分明确、且乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H的比例为l: 1: 2: 2的乌骨藤皂苷提取物。
实施例六
乌骨藤皂苷提取物注射液
取实施例一中的乌骨藤皂苷提取物10g，加适量注射用水溶解后，再加入活性碳0.02g, 加热煮沸30分钟，滤过，加水至900ml，用0.1%的碳酸氢钠溶液调pH至7.0，静置2h，滤 过，滤液加注射用水至1000ml，灌封(10ml/支，10mg/ml)，灭菌，即得。
实施例七
乌骨藤皂苷单体混合物注射液的制备
取实施例五中的乌骨藤皂苷提取物，加适量注射用水溶解后，再加入活性碳0.01g，加热 煮沸30分钟，滤过，加水至1700ml，用0.m的碳酸钠溶液调pH至6.8，静置lh，滤过，滤 液加注射用水至1800ml，灌封(10ml/支，10mg/ml)，灭菌，即得。
实施例八
乌骨藤皂苷提取物的胶囊的制备
取上述实施例二中的乌骨藤皂苷提取物50g，淀粉50g， P-环糊精100g混匀，制粒，过 60目筛，干燥后装成IOOO粒胶囊(50mg/粒)，即得。
实施例九乌骨藤皂苷提取物片剂的制备
取上述实施例三中的乌骨藤皂苷提取物50g，淀粉50g， P-环糊精100g混匀，制粒，过 60目筛，干燥后，加入硬脂酸镁5g，混匀，压制成1000片，包糖衣，即得。
实施例十对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用的研究
1. 实验目的
测试对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。
2. 实验材料
2.1动物
ICR小鼠，18-22g ，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。 2.2瘤种小鼠H22肝癌由南京中医药大学药理毒理研究室提供。
3. 给药方法及疗程
选用18-22g雌性ICR小鼠及生长良好的7-11天的H22瘤种，接种于小鼠右侧腋部皮 下，约4.5-5乂106个细胞/只，接种后随机分笼，24hr后，5-FU (5-氟尿嘧啶)、提取物l、 2、
3、 4分别溶解于适量0.9%氯化钠注射液中，静脉给药，连续8天。第9天处死动物，称体 重、瘤重，计算各组平均瘤重，按如下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。这里提取物l、 2、 3、 4分别指实施例一、二、三、五中最终得到的乌骨藤皂苷提取物，表中所述剂量mg/kg 是指每千克体重的小鼠给予的5-FU或提取物的质量。
模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重
肿瘤生长抑制率(％) = -X100%
模型对照组平均瘤重
4. 结果
表1 对荷瘤小鼠H22肿瘤生长抑制作用-(i ±s)
组别剂量 mg/kg动物数 开始最后体重(克) 开始 最后瘤重(克)抑瘤 率％
模型组-101020.5±2.125.9±2.81.206±0.333
5-FU组25101020肚1.918.4±3.30.201±0.090**83.4
提取物1组40101020.0±2.224.6土3.10.539±0.207**55.3
提取物2组40101020.U2.125.3±2.70.844±0.27*30.0
提取物3组40101020.5±2.025.3±3.00.679±0.247**43.7
提取物4组40101020.5±2.124.4±2.50.516±0.220**57.2
与模型组比较*P<0.05 **P<0.01结果表明，乌骨藤皂苷提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有显著的抑制作用。 实施例十一 对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用的研究
1. 实验目的
测试对Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。
2. 实验材料
2.1动物C57小鼠，18-22g，由上海斯莱克实验动物中心提供。
2.2瘤种
小鼠Lewis肺癌由南京中医药大学药理毒理研究室提供。
3. 给药方法及疗程
将Lewis肺癌种鼠断颈处死后，在无菌条件下分离出生长良好的肿瘤组织，用0.9%生 理盐水洗净血性物后，用天平称重。剪碎后按lg肿瘤组织加入4ml生理盐水比例配制，经 砚磨成均浆后制成肿瘤细胞数为2.8X106/ml的悬液。按肿瘤细胞悬液0.2ml/只接种到健康 C57小鼠右侧肋部皮下。待肿瘤长到直径15X15mm大小时，随机分组，5-FU(5-氟尿嘧啶)、 提取物l、 2、 3、 4分别溶解于适量0.9%氯化钠注射液中，腹腔给药，连续8天。第9天处 死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。这里 提取物l、 2、 3、 4分别指实施例一、二、三、五中最终得到的乌骨藤皂苷提取物，表中所述 剂量mg/kg是指每千克体重的小鼠给予的5-FU或提取物的质量。
模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重
肿瘤生长抑制率(％) = -X100%
模型对照组平均瘤重
4. 结果
表2对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用(^士s)
组别剂量 mg/kg动物数 开始最后体重(克) 开始 最后瘤重(克)抑瘤率 %
模型组-6622.6±1.4 25.7±1.34.823±0.386
5-FU组256622.2±0.6 20.7±1.51.665±0.445**65.5
提取物1组406622.3±0.8 24.1±1.72.562±0.729**46.9
提取物2组406622.2±0.7 24.U1.53.41±0.84**29.3
提取物3组406622.3±0.6 24.8±1.43.290±0.693**31.8
提取物4组406622.1±0.5 25.0±1.12.301±0.670**52.4
与模型组比较P〈0.05 P〈0.Q1
结果表明，乌骨藤皂苷提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长具有显著的抑制作用。实施例十二对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
1. 实验目的
测试对小鼠肉瘤S—180的抑制作用
2. 实验材料
2.1动物ICR小鼠，18-22g ,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。 2.2瘤种小鼠S — 180肉瘤由南京中医药大学药理毒理研究室提供。
3. 给药方法及疗程
选用18-22g雌性ICR小鼠及生长良好的7-11天的S-180瘤种，接种于小鼠右侧腋部 皮下，约4.5-5乂106个细胞/只，接种后随机分笼，5-FU (5-氟尿嘧啶)、提取物l、 2、 3、 4 分别溶解于适量0.9%氯化钠注射液中，24hr后静脉给药，连续8天。第9天处死动物，称体 重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。这里提取物l、 2、
3、 4分别指实施例一、二、三、五中最终得到的乌骨藤皂苷提取物，表中所述剂量mg/kg是 指每千克体重的小鼠给予的5-FU或提取物的质量。
模型对照组平均瘤重-给药组平均瘤重
肿瘤生长抑制率(％) = -X100%
模型对照组平均瘤重
4. 结果
表3对S180的抑制作用(5 ±s)
组别剂量 mg/kg动物数 开始最后体重(克) 开始 最后瘤重(克)抑瘤率 %
模型组-101018.6±0.726.0±2.41.232±0.354
5-FU组25101018.7±0.818.4±2.70.264±0.098**78.6
提取物1组40101018.7±0.825.4±1.10.502±0.179**59.2
提取物2组40101018.7±0.826.3±1.10.75士0.20广39.1
提取物3组40101018.7±0.825.5±1.70.630±0.296**48.8
提取物4组40101018.9±0.724.9±2.40.534±0.218**56.7
与模型组比较*P〈0. 05 **P〈0.01
结果表明，乌骨藤皂苷提取物对小鼠肉瘤S — 180具有显著的抑制作用。
权利要求
1、一种乌骨藤皂苷提取物，其特征在于，按重量百分含量计，乌骨藤皂苷A、B、D和H的总含量为50-100％。
2、 一种乌骨藤皂苷提取物，其特征在于，按重量百分含量计，乌骨藤皂苷A和H的比 例为1: 0.2~5。
3、 权利要求l所述的提取物，其中乌骨藤皂苷A和H的比例为1:0.2~5。
4、 权利要求2或3所述的提取物，其中乌骨藤皂苷A和H的比例为1: 0.5~4。
5、 权利要求4所述的提取物，其中乌骨藤皂苷A和H的比例为1: 1.6-2.5。
6、 权利要求1或2所述的提取物，乌骨藤皂苷A、 B、 D和H的比例为1: 0.1~2: 0.2~5: 0.2~5。
7、 权利要求6所述的提取物，其中乌骨藤皂苷A、 B、 D、 H的比例为1: 0.25~1.5: 0.5~4: 0.5~4。
8、 权利要求7所述的提取物，其屮乌骨藤皂苷A、B、D、H的比例为1: 0.8-1.2: L5 2.5: 1.6~2.5。
9、 权利要求1或2的乌骨藤皂苷提取物的制备方法，包括以下步骤(1) 取乌骨藤药材，加入溶剂提取1 4次，每次1 3小时，合并提取液，浓縮至一定体积；(2) 取浓縮液，加入有机溶剂进行多次液一液萃取，使乌骨藤皂苷充分转移至有机层中， 合并有机层，浓縮至稠膏状；(3) 将上述稠膏状粗提物加有机溶剂溶解，过滤，滤液过氧化铝层析柱，并加适量有机 溶剂洗脱，薄层监测，收集、合并含乌骨藤皂苷的流份，浓縮至干，即得乌骨藤皂苷粗品(a);(4) 将乌骨藤皂苷粗品(a)溶于水中，过滤，滤液过由聚酰胺-大孔树脂串联的层析柱， 水充分洗脱后，加有机溶剂解析大孔树脂上富集的皂苷类成分，浓缩，干燥，即得乌骨藤皂 苷粗品(b);(5) 将乌骨藤皂苷粗品(b)溶于有机溶剂中，过硅胶层析柱并加有机溶剂洗脱，收集 皂苷部分，浓缩，干燥，即得乌骨藤皂苷精制品(c);(6) 将上述乌骨藤皂苷精制品(c)加入到适量溶剂中，加热使溶解，过滤，静置，结 晶，过滤，干燥，得到以乌骨藤皂苷A、 B、 D或H其中一种或几种为主成分的乌骨藤皂苷 提取物。
10、 一种药物组合物，它包含治疗有效量的权利要求1或2所述的乌骨藤皂苷提取物和 一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。
11、 权利要求1或2所述的乌骨藤皂苷提取物用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种单味中药的提取物，具体地说，本发明涉及一种乌骨藤皂苷提取物及其制备方法、药物组合物、抗肿瘤用途等。
文档编号A61K36/185GK101612183SQ200810122738
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者伟 宋, 张喜全, 徐宏江, 杨永安, 鸯 王, 王衡奇, 石赟蓉, 郭安军, 陈智林 申请人:江苏正大天晴药业股份有限公司