专利名称：：免疫抑制药用核苷组合物及其在制备免疫抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药活性成分的组合物及该组合物的应用，具体涉及一种源自虫草的免疫抑制药用核苷类成分的组合物，以及这种组合物在制备免疫抑制药物中的应用。技术背景随着外科手术技术的改进以及新型免疫抑制剂的不断问世与应用，利用器官移植救治终末期器官衰竭正在全球更为广泛地开展。据美国国立器官分配网(UnitedNetworkforOrganSharing，UNOS)的最新统计资料显示，截止2004年末，全球主要器官移植累计总数肾脏移植651964例，肝脏移植134469例，心脏移植72698例，肺移植18793例，胰肾联合移植17739例，胰腺移植5805例，肠移植593例[王祥慧.上海交通大学学报(医学版)，2006，26:568-575]。虽然新型强效免疫抑制剂的不断推出使器官移植后近期的急性排斥显著减少，但同种器官移植长期存活的改善并不乐观[FlechnerSM.CurrOpinOrganTransplant,2004，9(4):383-388]。其中,免疫抑制剂的长期应用造成的肝、肾毒性，移植肾血管病变和肝功能严重受损，以及移植后恶性胂瘤的发生等诸多问题，正在成为器官移植长期存活的重要障碍。理想的免疫抑制剂应该是选择性强、作用快速、效果明显、停药后作用可逆，不良反应少，不损伤机体正常免疫功能的药物。但目前常用免疫抑制剂如糖皮质激素类、细胞毒类药物和真菌代谢产物(环孢素等)等多存在特异性差(往往在治疗中同时影响机体正常的免疫应答功能)和安全性低(有效剂量和中毒剂量很接近)等缺陷，不良反应较多。因此，寻找高效、低毒的免疫抑制剂是药学工作者急迫的任务。中药是我国传统文化的宝贵遗产，迄今为止已经有数千年的临床实践经验，并且业已形成了自己独有的一套理论体系，在华人社会有着极其广泛的认受性。研究中药活性成分，是发展现代中药新药的重要途径之一。冬虫夏草是最早发现抗排斥反应中药，也是研究最多的药物之一。李贵仁等[李贵仁.中国中医眼科杂志，1994,5:70]在角膜移植排斥反应实验中，发现冬虫夏草能显著降低排斥反应，并能强化激素效果。体外实验也表明冬虫夏草能抑制小鼠脾脏细胞对刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)的增殖反应，延长小鼠同种异体移植皮片的存活时间，选择性增强抑制淋巴细胞亚群而发挥其对免疫应答的负反馈调节作用[孟明.上海免疫杂志，1993，13:261]。人工虫草菌粉3g/kg.d，与环孢素A合用有协同作用。临床上，用其替代;e充唑嘌呤，与环孢素A、泼尼松组成新的三联用药，因此副作用小，替代硫唑噪呤后，可减轻后者引起的白细胞减少及肝功能损伤。另有实验表明，虫草对CsA致急性肾毒性，在大鼠肾功能、尿钠、钾排出量、肾组织促上皮生长因子及肾皮质线粒体功能等方面有保护作用[赵学智.中华肾脏病杂志，1995，11:23]。人工虫草具有良好的预防急性排斥作用，对慢性排斥具有一定的治疗作用，能提高移植物的长期存活率[任吉忠，等.中国中西医结合肾病杂志，2002,3:581-583]，且可保护肝肾功能，刺激造血，改善低蛋白血症和高脂血症，减少感染等，是一种较理想的器官移植免疫抑制剂[孙明，等.中国中西医结合杂志，2004，24:808-810]，但其免疫抑制成分尚不清楚[李锋，等.川北医学院学报，2001，1.6:08-110]。此外，虫草对机体还有明显的免疫增强作用[徐方云:'药品评价，2005,2:334-339;刘玉华，等.医药产业资讯，2006，3:311-312]。
发明内容本发明目的是提供一种源自虫草的核苷组合物，以及这种核苷组合物在制备免疫抑制药物中的应用(即在抗器官移植排斥等方面的应用)，从而提供一种有效的器官移植免疫抑制剂。本申请的第一个发明目是通过如下技术方案实现的一种免疫抑制药用核苷组合物(或称为"源自虫草的核苷组合物"或"源自虫草的免疫抑制药用核苷组合物")，其组成和重量比例为，尿香腺苷鸟香=2~22:1~14:1~18,或其中任意两种的组合物。本申请推荐以下优化方案尿苷55g，腺苷35g，鸟苷45g。上述组合物中可以加有药用辅料，例如糊精、淀粉和微晶纤维素。所用组合物和辅料可以用乙醇搅拌混合后，制成各种剂型的制剂。完成本申请的第二个发明目的技术方案是上述源自虫草的免疫抑制药用核苷组合物在制备免疫抑制药物中的应用。根据发明人对冬虫夏草多年的研究认为核苷类成分是其重要的免疫调节活性物质，不同的核苷类成分组成和/或用量，因机体状态的不同而产生不同的免疫调节(增强或抵制)作用，其通过免疫抑制，尤其是通过抑制激活的免疫功能产生防治器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的效果。以上应用方法的效果见以下实验1.不同核苷及其组合物对大鼠正常巨噬细胞释放功能的影响无菌获取大鼠腹腔巨噬细胞，贴壁纯化，1.5-2x1(^细胞/ml接种于细胞培养板中，核苷样品分别为腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、尿苷+^泉苷+鸟苷(UAG);A高浓度为5.56mg/ml，G高浓度为0.42mg/ml，U高浓度为10.8mg/ml，UAG高浓度为(0.44:0.28:0.36mg/ml)，各组从高浓度依次倍比稀释，形成8个浓度梯度，低浓度到高浓度定为浓度1到浓度8，样品以培养液溶解并稀释，这些浓度即为细胞培养体系中的终浓度。每个浓度设四个复孔。阳性对照组分别采用LPS(终浓度10jig/ml)和地塞米松(终浓度20pg/ml),阴性对照组直接在细胞悬液中加入细胞培养液。每浓度设四个复孔，培养16h后收集细胞上清液检测NO，TNF-cx和IL-l。各组检测值与阴性对照组比较，进行f检验，比较差异性。结果单种核苷(U、A、G)的对正常巨噬细胞释放NO，TNF-oc和IL-1的影响不明显，UAG则显示促进作用(见表l,表2和表3)。2.不同核苷及其组合物对大鼠激活巨噬细胞释放功能的影响无菌获取大鼠腹腔巨噬细胞，贴壁纯化，1.5-2x106细胞/1111接种于细胞培养板中，除空白组外，每孔细胞培养液中加入LPS(终浓度10|ig/ml)，空白组加入细胞培养液，培养0.5h后，空白对照组，免疫促进阳性对照组，免疫抑制作用阳性对照组和样品组分别加入等体积细胞培养液、LPS(终浓度10ng/ml)、地塞米松(终浓度20pg/ml)和不同核苷(样品与浓度与上述方法相同)，每浓度设四个复孔，培养16h后收集细胞上清液，检测NO，TNF-a和IL-1。各组检测值分别与免疫促进阳性和免疫抑制阳性对照组比较，进行f检验，比较差异性。结果A、U、G低剂量对LPS激活的巨噬细胞释放NO、TNF-oc和IL-l有明显的抑制作用，高剂量呈一定程度的增加作用。UAG组合，对LPS激活的巨噬细胞释放NO、TNF-a有明显抑制作用，且随剂量增加作用呈增强趋势；对LPS激活的巨噬细胞释放IL-1，低剂量时无明显影响，高剂量时呈现一定程度的增加作用(见表l,表2和表3)。表l不同核苷及其组合对正常和激活巨噬释放NO的影响(7±SD，n=4)样品浓度(mg/ml)巨噬细胞NO释放量正常激活Al0.048.02±0.79**32.18±1.16,A20.098.46±0.62#31.18±2.01脂A30.178.08±0.78w27,22±3.20附A40.358.23±0.19#2U7±2.56s#A50.707.17土0.95糾17.50±1.53***A61.397.88±0.37#15.93±0.73,A72.786.59±0.42##**15.59土1.12脂A85.568.61±0.63#14.01±0.79##YYGl0.0035.91±0.71糾**37.12±1.03鹏G20馬8.01±0.56#35.17±2.61隨G30.0137.60土0.81糾37.45±2.80##YYG40.02610.51±0.99#*32.30±0.96*#YYG50.0529.61±1.33#26.97±U6,G60.10511.34±0.58**.21.59±0.59,G70.2107.60±0.28#12.45±1.105諮G80.4206.68±0.94***9.19±0.72*#YYUl0.088.34±0.22#58.11±3.92,U20.1698.90±0.98#51.32±3.99U30.3388.24±0.70#55.61±7.35YYU40.6759.03±1.07*48.92±4.74yy<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>G50.05218.68±0.59**42.17±7.10##YG60.10520.98±0.53**"*31.85土2.91##G70.21019.02±0.65"*32.19±0.18**G80,42019.49±0.74**27.45±1.56##Ul0.0821.89±0.86**糾142.82土1.39鹏U20.16921.12±1.11*糾171.74±51.98#YU30.33823.34土3.68糾97.63±19.77*YYU40.67520.51±0.72*糾90.61±35.59YU51.3522.71±0.42****58.27±20.72U62.7021.09±0.78**##57.44±6.83Y￥U75.4022.05土0.95一■75.21±27.17YU810.8022.38±1.04****66.07±9.69YYUA(0.04:0.02)21.25±0.75*糾36.54±3.48*#YYUG(0.04:0.02)23.13±1.23**##34.88±2.56AG(0.04:0.04)20.63±0.78#*38.30±1.43##YUAG1(0細:0.002:0扁)22.06±1.15**糾59.41±21.19UAG2(0.007:0.004:0.005)20.11士0.40糾52.80±6.58￥YUAG3(0.014:0.009:0.011)22.36±2.79**48.20±8.35#￥UAG4(0.028:0.018:0.022)21.34±1.02*糾38.83±5.12##YUAG5(0.055:0,035:0.045)22.57土2.69卵42.58±6.08*#YUAG6CO,11:0.07:0.09)22.02±0.卯****36.06±1.01##YYUAG7(0.22:0.14:0.18)24.80±2.14****35.98土7.09##￥UAG8(0.44:0.28:0.36)24.55±2.13**糾33.90±1.22##YLPS46.09±5.12**66.15±8.86LPS+DEX一28.05±3.01#*control19.02±0.7319.44±0.55##YY与空白组比较，*P<0.05，**PO.01;与LPS组比较，#P<0.05,##P<0.01;与LPS+DEX组比较，YPO.05,PO.Ol。表3不同核苷及其组合对正常和激活巨噬细胞释放IL-1的影响(？±SD，n=4)样品浓度(mg/ml)巨噬细胞IL-1释放量(pg/ml)正常激活Al0.0495.42±8.582.58±23.94##A20.09104.14±6.68*一81.87±15.73##A30.1775.14±13.46**糊87.99±8.00##YA40.3594.36±4.05**##91.56±5.37*"*YA50.7085.26±8.93****103.22±10.413#A61.3993.31±11.87**##116.07±6.89*#￥A72.7885.72土7.21**#*U2.15土4.33糾A85.5685》0±5.58**#s114.56±9.35##188.4095.65±15.33**#136.37±16.70Gl0.00346.13±20.87*##75.01±33.37*<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01;与LPS组比较，#P<0.05,##P<0.01;与LPS+DEX组比较，YPO.05,YYPO.Ol。具体实施例方式实施例1虫草药粉(80目)经超临界二氧化碳流体萃取脱脂，残渣用2倍量70%乙醇回流提取2小时，重复提取2次，提取液低温回收乙醇至无醇味。浓缩液置4oC冰箱放置析晶，母液冷冻干燥，以2倍量水溶解后置4oC^^箱放置再析晶，重复析晶梯:作2次。母液低温浓缩至约1/2原体积，上ODS柱，以1倍柱体积水洗脱除杂后，改用30%乙醇洗脱至在254nm下无吸收，洗脱液低温浓缩后冷冻千燥，即得虫草核苷提取物。按以下比例选取提取物中的尿芬、腺苷与鸟苷組成药粉尿苷55g，腺苷35g，鸟苷45g，药粉内加入辅料淀粉15g,糊精40g,微晶纤维素10g，以30%乙醇搅拌混合，制粒、千燥、整粒后压制1000片(每片重0.2g)。用于免疫抑制，每次12片。实施例2尿苷55g，腺苷35g，鸟苷45g,淀粉15g，糊精40g，微晶纤维素10g，30%乙醇适量。药粉内加入辅料糊精、淀粉和微晶纤维素，以30%乙醇搅拌混合，制粒、千燥、整粒后装填胶嚢1000粒(每粒重0.2g)。用于免疫抑制，每次1~2粒。实施例3，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:1。实施例4，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:2。实施例5，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:4。实施例6，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟普=2:1:6。实施例7，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:8。实施例8，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷乌苷=2:1:10。实施例9,与实施例1基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:12。实施例10，与实施例l基本相同，但各組分的重量比例改为尿苦腺苷鸟苷=2:1:14。实施例ll，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:1:16。实施例12，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿普腺苷鸟普=2:1:18。实施例13，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:2:1。实施例14，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:4:1。实施例15，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:6:1。实施例16，与实施例l基本相同，^旦各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:8:1。实施例17，与实施例1基本相同，^旦各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=2:10:1。实施例18,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟香=2:12:1。实施例19，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为:尿苷腺苷鸟苷=2:14:1。实施例20,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=4:1:1。实施例21，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=6:1:1。实施例22，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷乌苷=8:1:1。实施例23,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=10:1:1。实施例24,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷乌苷=12:1:1。实施例25，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺香鸟苷=14:1:1。实施例26，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=16:1:1。实施例27，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=18:1:1。实施例28,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=20:1:1。实施例29,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:1。实施例30，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为:尿苷腺苷鸟苷=22:5:1。实施例31,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为:尿苷腺苷鸟苷=22:8:1。实施例32，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:10:1。实施例33，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:14:1。实施例34，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:3。实施例35，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:7。实施例36，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:9。实施例37,与实施例l基本相同，^旦各组分的重量比例改为尿苷腺苷乌苷=22:1:11。实施例38，与实施例1基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:15。实施例39，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苷腺苷鸟苷=22:1:18。实施例40，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿普腺苷鸟苷=22:7:11。实施例41，与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为尿苦腺苷鸟苷=22:12:15。实施例42,与实施例l基本相同，但各组分的重量比例改为:尿苷腺苷鸟苷=22:13:3。实施例4360,分别与实施例l、实施例319基本相同，但组分中没有尿苷。实施例61-79,分别与实施例1、实施例1330基本相同，但组分中没有鸟苷。实施例80-101，分别与实施例1、实施例312,实施例20-30基本相同，但组分中没有腺苷。权利要求1、一种免疫抑制药用核苷组合物，其特征在于，组成和重量比例为，尿苷∶腺苷∶鸟苷＝2～22∶1～14∶1～18，或其中任意两种的组合物。2、根据权利要求1所述的免疫抑制药用核苷组合物，其特征在于，组成和重量比例为，尿苷55g,腺苷35g,鸟苷45g。3、根据权利要求1或2所述的免疫抑制药用核苷组合物，其特征在于，组合物中还加有药用辅料。4、根据权利要求3所述的免疫抑制药用核苷组合物，其特征在于，所述的药用辅料选自糊精、淀粉和微晶纤维素。5、根据权利要求4所述的免疫抑制药用核苷组合物，其特征在于，所述的所用组合物和辅料是用乙醇搅拌混合后，制成制剂。6—种权利要求1~5之一所迷的免疫抑制药用核苷组合物在制备免疫抑制药物中的应用。全文摘要一种免疫抑制药用核苷组合物(源自虫草的免疫抑制药用核苷组合物)，其特征在于，组成和重量比例为，尿苷∶腺苷∶鸟苷＝2～22∶1～14∶1～18，或其中任意两种的组合物。优化方案的组成和重量比例为，尿苷55g，腺苷35g，鸟苷45g。组合物中还可加有药用辅料。所述的药用辅料选自糊精、淀粉和微晶纤维素。本发明还涉及上述源自虫草的核苷组合物在制备免疫抑制药物中的应用。本发明通过免疫抑制，尤其是通过抑制激活的免疫功能产生防治器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的效果，从而提供一种有效的器官移植免疫抑制剂。文档编号A61P37/00GK101306004SQ200810128420公开日2008年11月19日申请日期2008年6月25日优先权日2008年1月16日发明者黎余,李绍平,杨丰庆申请人:李绍平