专利名称：一种硫酸鼠李聚糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种硫酸鼠李聚糖及其制备方法和应用。
技术背景研究发现作为抗凝血药物已经广泛应用了70多年的肝素具有多种副作用，如诱发血小 板减少症、出血作用。近年来人们除继续研究开发低分子量肝素，如依诺肝素、那屈肝素 钙、达肝素钠和亭扎肝素钠外，还根据肝素的结构特点进行天然高分子的结构改造。实验 证明，这些肝素类物质都具有一定的抗凝血活性，但也都有一定的毒性。血栓类疾病严重 危害人类的身体健康，是现代社会主要的致死性疾病之一。目前，每年抗血栓药物的全球 市值约为120亿美元，并且每年以15%的速度递增；抗凝血药物的全球市值约为40亿美元， 并以13%的速度逐年递增，但现有的药物远远不能满足人们日益增长的需要。海藻是抗凝 血多糖的一个天然丰富来源。目前海藻多糖的研发主要集中于红藻多糖和褐藻多糖，而绿 藻多糖的研发很少，有关硫酸鼠李聚糖未见报道。 发明内容本发明的目的是提供一种硫酸鼠李聚糖及其制备方法和应用，它能弥补现有技术的上 述不足。一种硫酸鼠李聚糖，其特征在于该硫酸鼠李聚糖是由L-鼠李糖基以a」l,3-糖苷键和 a-l，2-糖苷键连接的线形长链分子；a-l，3-糖苷键连接的L-鼠李糖基与a-l，2-糖苷键连接的 L-鼠李糖基的摩尔比为1~6: 1;硫酸基位于a-l,3-L-鼠李糖基的C-2位和域C-4位，和/ 或位于a-l,2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位，硫酸鼠李聚糖中硫酸基的重量百分含量为 15~40%;分子量为50000~800000道尔顿。上述硫酸鼠李聚糖的制备方法，其特征在于将海藻藻体浸泡于水中匀浆，室温下搅拌， 分离出海藻沉淀物，再向沉淀物加水，加热提取，分离出清液，将所得清液浓縮，脱盐， 再将脱盐后的溶液浓縮，脱蛋白，再将脱蛋白后的溶液浓縮，醇沉，干燥，溶解，然后依 次通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将收集的溶液浓縮，脱盐，再将脱盐后的 溶液浓縮，干燥，粉碎。上述硫酸鼠李聚糖在制备抗凝血药物或抗栓药物中的应用。本发明制备产品所用原料是天然海藻，对人体无毒副作用，可长期使用。产品的抗凝 血活性和抗栓活性好，可以通过添加各种附剂制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊等作为预防 和治疗血栓栓塞性疾病的抗凝血药物或抗栓药物，将具有良好的市场应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一歩的说明。称取干燥的海藻藻体，加入海藻重量1~80倍的水浸泡匀浆，室温下搅拌0.01~2小时， 离心弃去清液，取含海藻藻体的沉淀物，再加海藻重量1 80倍的水，在40 100'C水浴中 搅拌提取多糖0.1 12小时，离心弃去杂质，取清液，将所得清液减压浓缩，然后进行透析 或超滤去除盐，将除去盐后的多糖溶液减压浓縮，然后用酶法和/或Sevage法去除多糖中的 蛋白质，再将去除蛋白质后的多糖溶液减压浓縮，加入4倍体积的浓度为95% (重量百分 浓度，下同)乙醇水溶液使多糖沉淀，将所得沉淀用无水乙醇洗涤1 3遍，在40 8(TC烘 箱中干燥0.01~6小时，然后将所得多糖加入少量水溶解，通过离子交换色谱柱Q-Sepharose Fast Flow分离，依次用蒸馏水、0.01-3.0 mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱峰的洗脱液， 将所得多糖溶液减压浓縮，然后进行透析或超滤去除盐，将除去盐后的多糖溶液减压浓缩， 再通过凝胶色谱柱Sephacryal S-400 HR进一步分离，用0.01-0.5 mol/L醋酸钠的水溶液洗 脱，收集洗脱峰的洗脱液，将所得多糖溶液减压浓縮，然后进行透析或超滤去除盐，将除 去盐后的多糖溶液减压浓缩，冷冻干燥，粉碎即得本发明的硫酸鼠李聚糖。本发明的硫酸鼠李聚糖通过与淀粉和/或糖粉充分混合后，用浓度为75%的乙醇水溶液 制软材，然后过12目不锈钢筛进行制粒、于50 60'C下干燥后，通过14目的不锈钢筛整 粒。再加入硫酸鼠李聚糖1%重量的硬脂酸镁和/或滑石粉，充分混合均匀后按一般压制片 芯要求进行压片，使得片芯具有适宜的硬度。将压制得到的素片用糖浆和滑石粉进行交替 包粉衣层15 18层、包糖衣层10 15层，最后打光即得具有抗凝血作用或抗血栓作用的片 剂。本实施例中所述的海藻藻体可为宽礁膜、礁膜、袋碟膜、北极礁膜、破礁膜、囊礁膜、 厚礁膜、尖种礁膜、皱礁膜、褐色礁膜、石莼、孔石莼、长石莼、花石莼或硬石莼；所述 的乙醇还可改用甲醇、丙酮或异丙醇；所述的离子交换色谱柱Q-Sepharose Fast Flow还可 改用DEAE Sepharose Fast Flow、 DEAE Cellulose 、 DEAE Sephadex、 Q-Sepharose XL、 Q Sepharose、 Q Sepharose 4 Fast Flow、 QAE Sephadex或Dowex;所述的用蒸馏水和0.01~3.0 mol/L氯化钠水溶液洗脱也可改用蒸馏水和0.01~3.0mol/L氯化钾水溶液洗脱；所述的凝胶 色谱柱Sephacryal S-400 HR还可改用Toyopearl HW-65、 Sephacryal S-300 HR、 Sephacryal S-200 HR、 Sephacryal S-100 HR、 Sephacryal S-500 HR、 Sephacryal S-訓O SF、 Superdex 200、 Superose 6、 Superose 12、 Sepharose 6 Fast Flow、 Sepharose 4 Fast Flow、 Sepharose 2B、 Sepharose 4B、 Sepharose 6B、 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B;所 述的用0.01~0.5 mol/L醋酸钠水溶液洗脱也可改用蒸馏水溶液、0.01~0.5 mol/L氯化钠水溶 液、0.01~0.5 mol/L氯化钾水溶液或0.01~0.5 mol/L碳酸氢铵水溶液洗脱；所述的片剂还可 改为散剂、颗粒剂或胶囊。本发明的硫酸鼠李聚糖为类白色或白色无定形粉末，用气相色谱测定6次制得的硫酸 鼠李聚糖的单糖组成，用硫酸钡-明胶比浊法测定硫酸基含量，用高效凝胶渗透色谱法测定分子量，用高碘酸氧化、Smith(史密斯)降解、甲基化分析、红外光谱、核磁共振波谱和质 谱测定糖链结构，并通过分析确定，得到的硫酸鼠李聚糖是由L-鼠李糖基以a-l，3-糖苷键 和a-l,2-糖苷键连接的线形长链分子；a-l，3-糖苷键连接的L-鼠李糖基与a-l，2-糖苷键连接 的L-鼠李糖基的摩尔比为1~6: 1;硫酸基位于a-l,3-L-鼠李糖基的C-2位和/或C-4位，和 /或位于a-l,2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位，硫酸鼠李聚糖中硫酸基的重量百分含量为 15~40%;分子量为50000~800000道尔顿。本发明的硫酸鼠李聚糖的抗凝血作用是通过对健康人静脉血活化部分凝血活酶时间、 凝血酶时间的影响进行评价的，抗栓作用是通过对大鼠体内、体外试验性血栓形成的影响 进行评价的，实验结果证明，本发明的产品具有明显抗凝血活性和抗血栓作用。具体的实 验方法和结果如下1. 对健康人静脉血活化部分凝血活酶时间的影响取健康人静脉血，置于含有1/10(血液与 抗凝剂体积比为9: 1)重量百分浓度为3.3%的枸橼酸钠抗凝液的塑料管中，轻轻颠倒混匀，以3000转/分钟离心15分钟，收集上层血浆，备用。取9份待测血浆，每份90pL，分别加入 浓度为IO、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600吗/mL的硫酸鼠李聚糖水溶液10nL， 37。C下孵育lmin，加入活化部分凝血活酶时间试剂IOO ^L， 37t:孵育2分钟，加入37。C预 热浓度为0.025 mol/L的CaCl2水溶液100 ^L，记录凝固时间，即为活化部分凝血活酶时间值。 对照组加入生理盐水10pL，按上述方法测定活化部分凝血活酶时间值。实验结果表明，硫 酸鼠李聚糖可明显延长活化部分凝血活酶活化时间，与对照组比较有显著性差异(P < 0.001)，表明本硫酸鼠李聚糖具有显著抗凝血作用，能抑制内源性凝血途径或共有凝血途径。 不同浓度的硫酸鼠李聚糖对活化部分凝血活酶时间的影响表现为浓度愈大，凝固时间愈长， 表明硫酸鼠李聚糖的抗凝血作用与浓度呈线性关系。2. 对健康人静脉血凝血酶时间的影响血浆的分离如上所述。取9份待测血浆，每份90^L， 分别加入浓度为IO、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600吗/mL的硫酸鼠李聚糖水溶 液10pL， 37'C下孵育1分钟，加入37r预热凝凝血酶时间试剂200pL，'记录凝固时间，即为 凝血酶时间值。对照组加入生理盐水10^L，按上述方法测定凝血酶时间值。实验结果表明， 硫酸鼠李聚糖可明显延长血浆凝血酶时间，与对照组比较有显著性差异(P〈0.001)，表明本 硫酸鼠李聚糖具有显著抗凝血作用，能抑制凝血酶活性或抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白。 不同浓度的硫酸鼠李聚糖对凝血酶时间的影响表现为浓度愈大，凝固时间愈长，表明硫酸 鼠李聚糖的抗凝血作用与浓度呈线性关系。3. 对大鼠体内试验性血栓形成的影响取体重200 250克的健康雄性Wistar大鼠，随机分 为生理盐水组、20.0mg/Kg硫酸鼠李聚糖组、10.0mg/Kg硫酸鼠李聚糖组、5.0mg/Kg硫 酸鼠李聚糖组和5.0mg/Kg肝素组，每日分早晚2次灌胃，每次各灌胃0.4mL，生理盐水组灌以生理盐水0.4mL。于第11天按每日总量灌胃后20分钟，用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠 (40.0mg/Kg)，剥离右侧颈总动脉15mm长，用体内血栓形成仪的刺激电极将动脉近心端 轻轻挑起，用测温探头挑起动脉远心端。药后30分钟用1.6mA直流电流持续刺激7分钟。当 动脉内因血栓形成阻塞血流时，血管表面温度突降。从刺激开始到温度突降所需时间称阻 塞时间(Ocdusiontime，简称OT)，以OT长短作为药效指标。各组实验数据以均数加减标准 差表示，进行统计学处理，组间差异的显著性检验用t检验。实验结果表明，本硫酸鼠李聚 糖的水溶液有明显的抗动脉血栓作用，剂量增加则作用增强，而且硫酸鼠李聚糖比肝素有 明显抗动脉血栓作用(PO.OOl)。4.对大鼠体外试验性血栓形成的影响药物分组对照组(生理盐水组)、10.0mg/Kg硫 酸鼠李聚糖组、5.0 mg/Kg硫酸鼠李聚糖组、2.5 mg/Kg硫酸鼠李聚糖组和2.5 mg/Kg肝素组。 取健康雄性Wistar大鼠，以戊巴比妥钠静脉麻醉大鼠(40.0mg/Kg)，分离颈总动脉，以干燥 的玻璃注射器自颈总动脉取血2mL，均分于两个硅化聚乙烯管环内，血液在37X:环境中以 17转/分钟转动30分钟后停止，按拉丁方设计的给药顺序分别向每根管环的两端各加药O.l mL，转动60分钟，自聚乙烯管环内倾出血栓，立即称重，测量血栓长度，置60'C恒温干 燥箱中烘干，并称其干重，按上述步骤再取血做其余四组，然后再取5只大鼠重复上述实验， 按以下公式计算各药物组的溶栓率。各组实验数据以均数加减标准差表示，进行统计学处 理，组间差异的显著性检验用t检验。对照组血栓湿重一给药组血栓湿重溶栓率(％) = - x 100%对照组血栓湿重实验结果表明，10.0mg/Kg硫酸鼠李聚糖、5.0mg/Kg硫酸鼠李聚糖组和2.5mg/Kg硫酸鼠 李聚糖组湿重、干重及长度与生理盐水组比较均明显减小(PO.OOl)，表明本硫酸鼠李聚 糖的水溶液具有体外溶栓作用，而且10.0 mg/Kg硫酸鼠李聚糖组和5.0 mg/Kg硫酸鼠李聚 糖组比2.5 mg/Kg肝素组有明显溶栓作用(PO.001 )，肝素组与生理盐水组比较，血栓湿重、 干重及长度均无明显差别。
权利要求
1.一种硫酸鼠李聚糖，其特征在于该硫酸鼠李聚糖是由L-鼠李糖基以α-1，3-糖苷键和α-1，2-糖苷键连接的线形长链分子；α-1，3-糖苷键连接的L-鼠李糖基与α-1，2-糖苷键连接的L-鼠李糖基的摩尔比为1～6∶1；硫酸基位于α-1，3-L-鼠李糖基的C-2位和/或C-4位，和/或位于α-1，2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位，硫酸鼠李聚糖中硫酸基的重量百分含量为15～40％；分子量为50000～800000道尔顿。
2. 权利要求1所述的硫酸鼠李聚糖的制备方法，其特征在于将海藻藻体浸泡于水中 匀桨，室温下搅拌，分离出海藻沉淀物，再向沉淀物加水，加热提取，分离出清液， 将所得清液浓縮，脱盐，再将脱盐后的溶液浓縮，脱蛋白，再将脱蛋白后的溶液浓縮， 醇沉，干燥，溶解，然后依次通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将收集的 溶液浓縮，脱盐，再将脱盐后的溶液浓縮，干燥，粉碎。
3. 权利要求1所述的硫酸鼠李聚糖在制备抗凝血药物或抗栓药物中的应用。
全文摘要
一种硫酸鼠李聚糖，其特征在于该硫酸鼠李聚糖是由L-鼠李糖基以α-1，3-糖苷键和α-1，2-糖苷键连接的线形长链分子；硫酸基位于α-1，3-L-鼠李糖基的C-2位和/或C-4位，和/或位于α-1，2-L-鼠李糖基的C-3位和/或C-4位。制备时将海藻藻体浸泡于水中匀浆，室温下搅拌，分离出海藻沉淀物，再向沉淀物加水，加热提取，分离出清液，将所得清液浓缩，脱盐，再将脱盐后的溶液浓缩，脱蛋白，再将脱蛋白后的溶液浓缩，醇沉，干燥，溶解，然后依次通过离子交换色谱柱分离、凝胶色谱柱分离，将收集的溶液浓缩，脱盐，再将脱盐后的溶液浓缩，干燥，粉碎。本发明的硫酸鼠李聚糖，可用于制备一种新型的抗凝血药物或抗血栓药物。
文档编号A61P7/00GK101328225SQ20081013809
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者毛文君 申请人:中国海洋大学