专利名称：：鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于兽医生物新医药
技术领域：
，涉及一种鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒引起的一种急性高度接触性传染病，呈世界分布，主要侵害雏鸡，也危及育成鸡和蛋鸡，使其抵抗力降低，产蛋和蛋品质下降。90年代初，英国爆发了以呼吸症状、肾脏病变和肌肉坏死等为主的变异传染性支气管炎，主要危害肉种鸡和蛋鸡，毒株称为793/B或4/91。新城疫是由新城疫病毒引起的高度接触性传染性疾病，可感染各种家禽，主要侵害鸡和火鸡。本病一年四季均可发生，每年的秋冬和初春时节发生率最高，主要侵害病鸡的神经系统、呼吸系统和消化系统，表现为呼吸困难、下痢、神经症状和产蛋鸡的产蛋下降。该病发病急、感染率和死亡率高，给养禽业特别是养鸡业造成了巨大的损失。随着对这两种疾病研究的不断深入，防控措施也不断完善，特别是多种疫苗的成功运用，使得这两种疾病一度得到很好的控制。目前应用的疫苗主要是传染性支气管炎病毒H52、H120、M41等毒株和新城疫病毒I系、II系、m系、LaSota株、N79株、N88株等毒株制备的单苗或联苗，这些疫苗稳定性、保存期、免疫剂量等技术方面均很好，但在免疫方面存在以下不足1、传染性支气管炎病毒血清型众多，这给免疫预防带来了很大的困难，单一血清型疫苗只能对同型的传染性支气管炎病毒产生免疫力，而对其它型的传染性支气管炎病毒只能提供部分保护或根本不保护，如现在使用的H52、H120、M41毒株制备的疫苗对很多地方流行的传染性支气管炎病毒已经不能够提供保护作用；2、目前我国新城疫预防常用I系、II系、m系、LaSota株、N79株、N88株等新城疫疫苗，90年代以前，当新城疫发生时，用LaSota株、I系等疫苗紧急预防会起到很好的效果，但是最近几年，在很多地方流行的新城疫病毒毒株已经发生改变，使用上述疫苗已经不再能够起到很好的保护作用。
发明内容针对当前传染性支气管炎和新城疫疫苗免疫方面存在的不足，本发明提供一种能够对传染性支气管炎新的血清型病毒和新城疫新的抗原性病毒起到很好预防作用的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，解决国内很多地方原有疫苗对上述两种病毒只能提供部分保护、甚至不保护的问题，从而预防鸡传染性支气管炎和鸡新城疫的发生。该二联灭活疫苗的毒种鸡传染性支气管炎病毒北京A2株具有很好的免疫原性，专门预防当前流行的新毒株引发的传染性支气管炎疾病，保护率可达80_100%;该疫苗所用的GM株抗原谱很广，具有很好的免疫原性，在预防抗原性变异的新城疫毒株引发的疾病方面很有效。本发明的另一目的在于提供该鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备方法。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，该疫苗的毒种为鸡传染性支气管炎病毒北京A2株和鸡新城疫病毒GM株，作为抗原的鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒分别用烷化剂灭活后混合，按比例加入油佐剂乳化配制而成。其中，鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒与油佐剂的比例可以为其它，但本发明优选1:3。本发明中用于灭活病毒的烷化剂可为p-丙内酯、甲醛和戊二醛等，本发明优选0.5%。一1%。的甲醛水溶液。本发明所述的油佐剂包含重量百分比为90-92%白油、4-8%司本-80、2-4%吐温-80和硬脂酸铝。将重量百分比为90-92%白油、4-8%司本-80、2-4%吐温-80混合，100毫升混合液中加入1-2克硬脂酸铝即得本发明的油佐剂。本发明还提供了该鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备方法，其步骤如下(1)生产用毒制备将传染性支气管炎种毒，按0.lml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，36—40h收胚，放置于4'C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用将新城疫种毒，按0.1ml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，30—48h左右收获死亡胚，放置于4'C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。(2)生产用毒灭活将生产用毒分别用0.5%。_1%。的甲醛水溶液，37匸灭活16—24h，中间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的两种生产用毒按1:1混合，再按照1:3的比例(抗原:油佐剂)加入油佐剂乳化配制成二联灭活疫苗。本发明所用的鸡传染性支气管炎病毒北京A2株与鸡新城疫病毒GM株，均为目前流行的变异毒株。毒株为从病鸡体内按病毒常规分离方法分离得到，即采集可疑鸡的器官或组织充分碾磨，离心取上清，接种鸡胚分离病毒。鸡传染性支气管炎病毒北京A2株与M41株、T株、Gray株、4/91株等阳性血清进行气管环交叉中和反应，与4/91株阳性血清相关系数很高，而与其他三株基本不相关。鸡新城疫病毒GM株为基因W型，交叉中和试验表明GM株与LaSota株和传统强毒F4sE9株之间中和能力均较差。其中，鸡传染性支气管炎病毒北京A2株具有如下特性(1)在电镜下可见到典型的冠状病毒粒子；(2)发病鸡除出现明显的呼吸道症状外，剖检可见支气管有炎性渗出物，肾肿大花斑样，尿酸盐沉积明显等；(3)回归SPF鸡和无母源抗体的普通鸡都复制出与临床症状极为相似的病状，明显的吸道症状，肾脏呈花斑样肿大、尿酸盐沉积等;(4)分离得到的病毒与1%鸡红细胞不产生凝集；(5)病毒蛋白结构分析表明该毒株除出现与其他毒株相同的蛋白条带外，还在31KD处出现一条蛋白条带；(6)将该毒株阳性血清与M41株、T株、Gray株、4/91株进行气管环中和反应，其阳性血清与4/91株中和，而与其他三株均不相关；本发明选用的鸡新城疫病毒GM株具有如下特性(1)单因子阳性血清交叉抑制试验证明GM毒株为新城疫病毒；(2)发病鸡临床上突然出现呼吸症状，剖检气管出血、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血；(3)分离得到的病毒能够凝集1%鸡红细胞；(4)SPF鸡回归试验与临床症状出现相似的症状出现呼吸症状，剖检气管出血、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血；(5)毒力测定结果表明MDT为52.8h，ICPI为1.875，IVPI为2.73，表明GM株是强毒株，F基因的序列分析也说明该毒株属于基因W型，属于强毒株；(6)交叉中和试验表明GM株与LaSota株和传统强毒F48E9之间的中和能力均较差。本发明的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗及其制备方法有益效果如下(1)鸡传染性支气管炎病毒北京A2株具有很好的免疫原性，专门预防当前流行的新毒株引发的传染性支气管炎疾病，保护率可达80—100%;(2)新城疫病毒GM株抗原谱很广，具有很好的免疫原性，在预防抗原性变异的新城疫毒株引发的疾病方面很有效；(3)将传染性支气管炎病毒北京A2株和新城疫病毒GM株按本发明的制备方法配制成二联灭活疫苗，与同样方法配制的传染性支气管炎病毒M41株和新城疫病毒LaSota株二联灭活疫苗进行效力比较表明，本发明的疫苗对新血清型的传染性支气管炎病毒北京A2株和新城疫新抗原性病毒GM株有很强的保护效果，有效解决了国内原有疫苗对上述两种病毒只能提供部分保护、甚至不保护的问题。具体实施例方式实施例1鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备(1)生产用毒制备将传染性支气管炎病毒北京A2株种毒不用稀释，按0.lml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，大约40h收胚，放置于4。C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。将新城疫GM株病毒稀释104倍，按0.lml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，大约48h左右收获死亡胚，放置于4。C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。(2)生产用毒灭活将生产用毒北京A2株和GM株分别用0.5%。的甲醛水溶液，37°C灭活16h，中间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的两种生产用毒按1:1混合，再按照1:3的比例(抗原:油佐剂)加入油佐剂乳化配制成二联灭活疫苗。所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，包括90%白油、7%司本-80、3%吐温-80组成的混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为100毫升油佐剂混合液加入1克。本实施例共制备出3批鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，批号分别定为200601、200602、200603，制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。其中，所用毒种传染性支气管炎病毒北京A2株的标准①病毒含量将北京A2株鸡胚病毒液做10倍系列稀释，取10—i-10—1()稀释度的病毒接种10日龄SPF鸡胚，由最高稀释度开始，每一个稀释度接种5个，O.lml/枚，尿囊腔接种，37°0孵育6天，每天照蛋2次，及时取出死亡胚，培养至144h，观察鸡胚病变，出现巻縮胚、胚体失水、发育迟缓、内脏主要在肾部位有尿酸盐沉积等症状。按照Reed—Muench法计算鸡胚病毒半数感染量，测得的EID5。为10_65/0.lml0②免疫原性将EI"。为10—65/0.lml的北京A2株鸡胚尿囊毒和ELDs。为10—8'70.1ml的GM株鸡胚尿囊毒，经灭活后混合，按照1:2的比例(抗原油佐剂)制成油乳剂灭活疫苗，按照0.3ml的免疫量免疫15日龄SPF鸡10只；三周后，连同条件相同的对照鸡5只，分别攻北京A2株强毒，每只鸡气管滴入北京A2株强毒0.2ml，观察14天，对照鸡全部发病，免疫鸡保护8/10以上，或免疫鸡全部保护，对照鸡发病4/5，发病症状为发病鸡除出现明显的呼吸道症状外，剖检可见支气管有炎性渗出物，肾肿大花斑样，尿酸盐沉积明显等。③纯净性:该毒种按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录检验，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。④特异性将北京A2株与北京A2株特异性的血清中和后，接种鸡胚不引起死亡或病变。⑤保存期在一2(TC，湿毒保存期6个月，—80。C冻干毒保存期暂定为至少3年。所用毒种新城疫病毒GM株的标准①病毒含量将GM株鸡胚病毒液做10倍系列稀释，取10—5-10_12稀释度的病毒接种10日龄SPF鸡胚，由最高稀释度开始，每一个稀释度接种5个，O.lml/枚，尿囊腔接种，37-C孵育5天。每6h照蛋一次，及时取出死亡胚。培养至120h，观察鸡胚病变和死亡情况，胚体出血、头和四肢有出血点。按照Reed—Muench法计算鸡胚病毒半数感染量，测得的ELDs。为10—870.lml。②免疫原性将EIDs。为10—65/0.lml的北京A2株鸡胚尿囊毒和ELDs。为10—8'70.lml的GM株鸡胚尿囊毒，经灭活后混合，按照1:2的比例(抗原油佐剂)制成油乳剂灭活疫苗，按照20ul的量免疫15日龄SPF鸡10只，三周后，连同条件相同的对照鸡5只，分别攻GM株强毒，每只肌肉注射GM株强毒0.2ml,观察14天，对照鸡全部发病，免疫鸡保护8/10以上，或免疫鸡全部保护，对照鸡发病4/5，鸡以死亡为主。③纯净性:该毒种按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录检验，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。④特异性将GM毒株与GM毒株特异性的血清中和后，接种鸡胚不引起死亡或病变。⑤保存期在一2(TC，湿毒保存期6个月，一8(TC冻干毒保存期暂定为至少3年。实施例2鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备(1)生产用毒制备将传染性支气管炎北京A2株种毒不用稀释，按0.lml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，大约40h收胚，放置于4-C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。将新城疫GM株病毒稀释104倍，按0.lml/枚接种量接种10曰龄SPF鸡胚，大约48h左右收获死亡胚，放置于4T:冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。(2)生产用毒灭活将生产用毒北京A2株和GM株分别用1%。的甲醛水溶液，37'C灭活24h，中间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的两种生产用毒按1:1混合，再按照1:3的比例(抗原油佐剂)加入油佐剂乳化配制成二联灭活疫苗。所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，92%白油、4%司本-80、4%吐温-80组成的混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为100毫升油佐剂混合液加入2克。制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。所用传染性支气管炎病毒北京A2株和新城疫病毒GM株的标准参见实施例l。实施例3鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备(1)生产用毒制备将传染性支气管炎北京A2株种毒不用稀释，按O.lml/枚接种量接种10日龄SPF鸡胚，大约40h收胚，放置于4。C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。将新城疫GM株病毒稀释104倍，按0.lml/枚接种量接种10曰龄SPF鸡胚，大约48h左右收获死亡胚，放置于4。C冰箱中过夜，收取尿囊液，过滤后作为生产用毒。(2)生产用毒灭活将生产用毒北京A2株和GM株分别用0.7%。的甲醛水溶液，37'C灭活20h，中间振荡4一5次。(3)乳化将灭活后的两种生产用毒按1:1混合，再按照1:3的比例(抗原油佐剂)加入油佐剂乳化配制成二联灭活疫苗。所用的油佐剂配制是按照重量百分比计算，90%白油、8%司本-80、2%吐温-80组成的混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为100毫升油佐剂混合液加入1克。制备的疫苗物理性状检验、安全检验、效力检验等均合格。所用传染性支气管炎病毒北京A2株和新城疫病毒GM株的标准参见实施例1。实施例4疫苗效力比较试验1、效力试验中检验用毒效力比较试验中传染性支气管炎病毒采用北京A2株和M41株，新城疫病毒采用GM株和F^9株。均由福州大北农生物技术有限公司保存。传染性支气管炎病毒北京A2株强毒，EIDs。为10—65/0.lml，M41株强毒，E瓜。为10-7/0.lml,攻毒时采用气管内攻毒。新城疫病毒GM株强毒，ELDs。为10_870.lml,F幼E9强毒，ELD50为10—70.lml，攻毒时采用肌肉注射。2、效力试验中两种疫苗按照实施例1制备出3批鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)，批号分别为200601、200602、200603;按照实施例1制备方法、原料与标准制备出的3批鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)，批号分别定为200610、200611、200612;对这两种疫苗进行效力比较试验。3、效力比较试验(1)传染性支气管炎效力比较试验每批疫苗选用3周龄SPF鸡50只，其中20只皮下注射二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)0.3ml，20只皮下注射二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)0.3ml，10只不免疫作为对照；3周后，任选10只免疫二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)的鸡气管内滴入M41株(107EID50)0.2ml,其他10只气管内滴入北京A2株(1065EID5。)，任选10只免疫二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)的鸡气管内滴入M41株(107EID5。)0.2ml，其他10只气管内滴入北京A2株(1065EID5。)0.2ml，任选5只未免疫鸡气管内滴入M41株(1()7EID5。),其他5只气管内滴入北京A2株(1065EID5。)，观察2周，记录免疫鸡和对照鸡的反应和剖检情况。(2)新城疫效力比较试验每批疫苗选用1月龄SPF鸡50只，其中20只皮下注射二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)20ul，20只皮下注射二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)20ul，10只不免疫作为对照；3周后，任选10只免疫二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)的鸡肌肉注射F幼E9株，剂量为105ELD5。，其他10只注射GM株(108'7ELD5Q)0.2ml，任选10只免疫二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)的鸡肌肉注射F幼E9株，剂量为105ELD5。，其他10只注射GM株(1087ELD5。)0.2ml,任选5只未免疫鸡注射F幼E9株，剂量为105ELD5。，其他5只注射GM株(1087ELD5Q)0.2ml，观察14天，记录免疫鸡和对照鸡存活和死亡情况。4、效力比较试验结果(l)传染性支气管炎效力比较试验结果观察2周，对照鸡4/5以上发病或全部发病；三批疫苗对比结果显示，用二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)免疫后攻毒M41的鸡得到的保护比例达到9/10以上，攻毒北京A2株的鸡全部无保护；用二联灭活疫苗(北京八2株+GM株)免疫后攻毒M41的鸡保护不全、甚至无保护，而攻北京A2株的有9/10以上得到保护。发病鸡除出现明显的呼吸道症状外，剖检可见支气管有炎性渗出物，肾肿大花斑样，尿酸盐沉积明显等。详细结果见表l:表l两种二联灭活疫苗对传染性支气管炎的效力比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)新城疫效力比较试验结果观察14天，对照鸡全部死亡；三批疫苗比对结果显示，用二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)免疫后攻毒F48E9的鸡能得到8/10以上保护，攻毒GM株的鸡保护率较低；用二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)免疫后攻毒F48E9的保护率较高;攻GM株的得到保护率也很高，可得到9/10以上的保护。详细结果见表2:表2两种二联灭活疫苗对新城疫的效力比较<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>综上所述，本发明用传染性支气管病毒毒株北京A2株和新城疫病毒毒株GM株制备的二联灭活疫苗对于很多地方发现的传染性支气管炎病毒新血清型和新城疫病毒新抗原性具有很好的保护作用。同时，由于新城疫GM株抗原谱较广，对其他抗原性毒株也具有很好的保护作用；而鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗(M41株+LaSota株)不能提供这种保护。因此，本发明解决了我国现有疫苗对传染性支气管炎和新城疫只提供部分保护、甚至不保护的问题。另外，本发明制备的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗(北京A2株+GM株)减少了打针次数，方便了使用。权利要求1、一种鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，其特征在于毒种为鸡传染性支气管炎病毒北京A2株和鸡新城疫病毒GM株，上述毒株分别用烷化剂灭活后混合作为抗原，按比例加入油佐剂乳化配制而成。2、如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，其特征在于所述的抗原与油佐剂的比例为1:3。3、如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，其特征在于所述的烷化剂为0.5%。一1%。的甲醛水溶液。4、如权利要求1所述的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗，其特征在于所述的油佐剂包含重量百分比为90-92%白油、4-8%司本-80、2-4%吐温-80和硬脂酸铝。5、一种如权利要求l一5任一项所述的鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下(1)生产用毒制备将鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒分别接种于鸡胚，收获鸡胚尿囊液作为配苗用毒；(2)生产用毒灭活将配苗用毒分别加入烷化剂，灭活16—24h;(3)乳化灭活后混合，按比例加入油佐剂乳化配制成二联灭活疫苗。全文摘要本发明属于兽医生物新医药
技术领域：
，涉及一种鸡传染性支气管炎和鸡新城疫二联灭活疫苗及其制备方法。该疫苗所用毒种为鸡传染性支气管炎病毒北京A2株和鸡新城疫病毒GM株，鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒分别用烷化剂灭活后混合，加入油佐剂，乳化配制而成。本发明的二联灭活疫苗能够对传染性支气管炎新的血清型病毒和新城疫新的抗原性病毒起到很好预防作用，可解决国内很多地方原有疫苗对上述两种病毒只能提供部分保护、甚至不保护的问题，从而可有效预防鸡传染性支气管炎和鸡新城疫的发生。文档编号A61K39/295GK101480492SQ20081014656公开日2009年7月15日申请日期2008年9月4日优先权日2008年9月4日发明者娇倪,张国中,张渊魁,许秀梅,赵亚荣,赵建增,赵继勋申请人:福州大北农生物技术有限公司