专利名称：：吲哚-2,3-二酮在制备治疗妇科阴道炎外用制剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及吲哚-2,3-二酮(indole-2,3-dione)在制备治疗妇科阴道炎的外用制剂中的应用。阴道炎是常见的妇科疾病，为女性阴道及其周围的结缔组织发生炎症的一类疾病，主要表现为外阴搔痒,阴道分泌物增多,发病率高,且易反复发作，给病人的生活和工作带来极大的不便。在我国，由于个人卫生条件以及医疗条件的限制，或在妇科小手术和计划生育手术中无菌操作观念淡漠等原因，使阴道炎的发病率很高。随着女性阴道炎发病率的逐年升高，由此引起的盆腔炎也在日益增多。目前，阴道炎的治疗多采用局部或全身使用抗菌消炎药的方法，但观察发现，长期使用抗菌消炎药等西药，往往造成女性阴道及生殖器的菌群失调，而炎症及其继发炎性反应并未得到有效的控制，且毒副作用较大，并可能损害卵细胞和生殖健康。从天然产物中筛选并制定出更加安全有效的控制阴道炎的药物和给药方案，成为解决阴道炎问题的重要途径。口引哚-2,3-二酮是来自于龙虫下并维持其生存所必需的一种天然海洋活性物质，现已证明也是存在于海洋生物、中药青黛和人体内的天然活性物质。吲哚-2,3-二酮是成分单一的紫红色有机天然物质，化学结构明确，其单体己可合成，结构式为本发明人从事海洋活性物质吲哚-2,3-二酮的综合开发利用研究，长期研究和大量试验结果表明，作为一种结构明确的天然海洋活性物质，吲哚-2，3-二酮具有良好的对抗阴道炎的作用，并且无阴道刺激性，毒性低，副作用小，在制备治疗妇科阴道炎外用制剂方面有良好的应用前景。与目前人工合成的阴道专用药物相比，U引哚-2,3-二酮用于制备治疗阴道炎外用制剂，具有一定优势，有着巨大的开发价值。本发明目的是提供吲哚-2,3-二酮在制备治疗妇科阴道炎外用制剂中的应用。所述的B引哚-2,3-二酮为天然产物或人工合成产品。人工合成的吲哚-2,3-二酮，其纯化方法包括用超纯水和无水乙醇按1:1-8的体积比混合，加入人工合成的吲哚-2，3-二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶，加热温度为50-80°C，滤去上清液，按上述方法重复纯化1-3次，以减少重金属离子，其结晶纯度达99%;将经纯化的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过100目筛，分别按栓剂、软胶囊及泡腾片工艺制成50mg或100mg规格的外用制剂。所述的栓剂按如下工艺制备称取明胶，加入蒸馏水，浸泡，使明胶溶胀变软，于8(TC水浴加热溶解，充分融熔得明胶溶液，再加入甘油，轻搅使之混匀，继续加热搅拌，使水分蒸发至粗放量为止，得到甘油明胶溶液；所述的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过100目筛，与吐温-80、冰片醋的95%乙醇稀释液共同搅拌，将其加入上述的甘油明胶溶液中，搅匀，趁热灌入己涂有液体石蜡的栓模中，冷却，削去溢出部分，脱模，制成50mg或100mg规格的甘油明胶栓剂。所述的软胶囊按如下工艺制备将所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末过100目筛，加入PEG400与丙二醇，研磨直至溶解，形成均匀溶液，于软胶囊机上压囊、干燥，包装，制成50mg或100mg规格的外用软胶囊。所述的泡腾片按如下工艺制备，将所述的吲哚-2,3-二酮、乳糖、酒石酸和羧甲基淀粉钠，研磨成粉末过100目筛，相互混匀；加入吐温80的2%乙醇溶液制成软材，16目筛制粒，干燥，14目筛整粒；加入微粉硅胶和羧甲基淀粉钠，混匀，压片，包装，制成50mg或100mg规格的外用泡腾片。本发明人首先证明了吲哚-2,3-二酮外用制剂具有有效抑制阴道炎的作用。已完成临床前的大鼠阴道刺激性试验，并完成了在小鼠、大鼠的急性、慢性毒理学安全性评价研究，对血液生化和心、肝、脾、肺、肾、生殖等二十种组织进行病理切片检测。结果如下(一)治疗实验性阴道炎的研究结果显示高、中、低剂量组吲哚-2,3-二酮外用制剂对白色念珠菌及脆弱拟杆菌实验性阴道炎大鼠模型阴道的菌落计数疗效均优于模型对照组,给药后4d显效，8d菌落数继续下降(尸O.01或尸O.05);对白色念珠菌、脆弱拟杆菌感染的阴道分泌物计数疗效均优于模型对照组,给药后4d显效,8d分泌物继续减少(尸O.Ol或尸<0.05)。病理组织学观察显示，吲哚-2,3-二酮外用制剂治疗实验性阴道炎后，感染炎症显著好转,与给药前相比病变明显减轻。表明吲哚-2，3-二酮外用制剂对大鼠白色念珠菌和脆弱拟杆菌造成的实验性阴道炎具有良好的治疗作用。(二)治疗女性阴道炎临床观察结果显示吲哚-2,3-二酮外用制剂对真菌性阴道炎具有良好的治疗作用，与阳性对照药物双唑泰栓的治疗效果无显著差异。(三)大鼠阴道刺激性试验结果显示u引哚-2，3-二酮外用制剂大鼠阴道给药后，阴道无显著充血、水肿、组织变性或坏死等刺激性变化，病理切片显示组织结构完好，未见变性、坏死、缺失或过度角化，血管未见扩张充血，亦无血栓形成，周围组织未见水肿、炎细胞浸润，血管内皮完整，内皮细胞排列整齐。根据"阴道刺激性试验判断标准"无明显剌激性反应，反应级数为o。(四)吲哚-2,3-二酮小鼠急性毒性LD50为1091士359mgkg-lig;在Wistar大鼠6个月长期毒性试验证明吲哚-2,3-二酮对进食情况及行为活动等无影响，血液生化学等指标未见异常，在22种脏器和组织的病理组织学观察也未见异常，说明吲哚-2,3-二酮毒性低。具体实施例方式下面通过实施例和试验例进一步阐述本发明吲哚-2,3-二酮在制备抗真菌药物中应用的有益效果。选用天然产物或人工合成的吲哚-2,3-二酮。其纯化方法包括用超纯水和无水乙醇按1:1-8比例混合，加入人工合成的吲哚-2,3-二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶，加热温度为50-80°C，滤去上清液，按上述方法重复纯化l-3次，以减少重金属离子，其结晶纯度达99%;将经纯化的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过100目筛，分别按栓剂、软胶囊及泡腾片工艺制成50mg或100mg规格的外用制剂。动物实验与临床观察以栓剂外用制剂为例。实施例l:制剂的制备吲哚-2，3-二酮明胶栓剂的制备吲哚-2,3-二酮——1%吐温-80——2%冰片醋的95%乙醇稀释液——15%甘油——34%明胶——40%水加至5000.0mL~~制成鸭舌形阴道栓剂~~画枚称取处方量明胶，于加入蒸馏水，浸泡，使明胶溶胀变软，于8(TC水浴加热溶解，充分融熔得明胶溶液，再加入甘油，轻搅使之混匀，继续加热搅拌，使水分蒸发至粗放量为止，得到甘油明胶溶液；所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末过100目筛，与吐温-80、冰片醋的95%乙醇稀释液共同搅拌，将其加入上述的甘油明胶溶液中，搅匀，趁热灌入已涂有液体石蜡的栓模中，冷却，削去溢出部分，脱模，即得。软胶囊的制备吲哚-2,3-二酮——25%PEG400——55%丙二醇——20°/。制成1000粒制备软胶囊内容物将H引哚-2,3-二酮过100目筛，按上述比例加入PEG400与丙二醇，研磨直至溶解，形成均匀溶液。于软胶囊机上压囊、干燥，包装，卽可。泡腾片的制备B引哚-2，3-二酮——25%酒石酸——11%碳酸氢钠——35%羧甲基淀粉钠——12%乳糖——12%吐温80的2%乙醇溶液——4%微粉硅胶——1%画片吲哚-2，3-二酮、乳糖、酒石酸、上述一半处方量的羧甲基淀粉钠，过100目筛，相互混匀；加入上述处方量的吐温80的2%乙醇溶液制成软材，16目筛制粒，干燥，14目筛整粒；加入上述处方量的微粉硅胶和剩余处方量的羧甲基淀粉钠，混匀，压片；包装，即可。注意生产过程中必须严格防止水分的吸收，颗粒(如果制粒)与压片车间要控制空气的温湿度，相对湿度一般控制在20%25%，温度1821。C或者1525°C。试验例1:吲哚-2，3-二酮外用制剂对实验性阴道炎的治疗作用以实施例1制备的吲哚-2,3-二酮明胶栓剂为例来说明吲哚-2,3-二酮外用制剂对实验性阴道炎的治疗作用。选用160180g，雌性SD大鼠IOO只，未交配。将50只大鼠从阴道口注入浓度为5.6X107/ml的白色念珠菌液O.lml，每天一次，连续二次，10d后取大鼠阴道分泌物做菌培养，培养出现阳性结果即表明真菌性阴道炎造模成功。按同样的方法，将浓度为5X10Vml脆弱拟杆菌液O.lml注入其余50只大鼠阴道内,连续二次，10d后取大鼠阴道分泌物做菌培养，细菌培养阳性，说明厌氧菌性阴道炎造模成功。将40只感染白色念珠菌大鼠随机分成5组，每组8只，设置不给药的模型组、阳性对照组(双唑泰栓剂，每天阴道塞入含50mg/kg的栓剂，连续7d)和吲哚-2,3-二酮明胶栓剂高、中、低剂量组(剂量分别为50、25、10mg/kg，每天阴道塞入受试栓剂一次，连续7d)，各组动物分别在给药前，给药后4d、8d取阴道分泌物，然后置沙氏培养基上培养,进行菌落计数。取40只脆弱拟杆菌感染SD大鼠模型，用上述方法以相同分组、剂量给药、相同时间取阴道分泌物在厌氧菌专用培养基上培养，置37'C厌氧箱内培养48h，做菌落计数。根据菌落数和阴道分泌物的多少进行量化评分，再根据评分进行治疗效果的评价。菌落数(CFU/ml)小于5，计为0分；菌落数在5~10之间，计为1分；菌落数在10-100之间，计为2分；菌落数在100~1000之间，计为3分；菌落数大于1000,计为4分。阴道分泌物极少、正常，计为0分；阴道分泌物明显减少、基质样粘稠，计为1分；阴道分泌物脓样、粘稠,计为2分；阴道分泌物较多,采脓样性分泌物，计为3分。各试验组给药结束以后取阴道组织置10%甲醛中固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察。实验结果如下表1n引哚-2，3-二酮明胶栓剂对大鼠实验性阴道炎分泌物菌落的影响(^iSD，n-8)"""阴道分泌物歸麵分给药前给药后4d给药后8d同模型组比较，承表示P〈0.05，A表示P0.01。7505025104.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.003.97±0.421.54±0.82A1.96±0.45A2.25±0.34A2,64±0.74A3.89±0.571.12±0.23A0.69±0.12A0.83士0.26厶1.07±0.31A505025104.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.004.00±0.003.88±0.623.11±0.55A2.78±0.67A2.96±0.51A3.33i0.46A4.00±0.783.45±0.49*3.49±0,38*3.43±0.68*3.62土0.53白色念珠菌阴道炎双唑泰栓d引哚-2,3-二酮栓剂脆弱拟杆菌阴道炎双唑泰栓吲哚-2,3-二酮明胶栓剂模型组阳性对照组g遣遣慢塾狄剂剂剂模,高中低量且里量齐齐齐高中低表2吲哚-2,3-二酮明胶栓剂治疗大鼠实验性阴道炎对其分泌物的影响(x士SD,n-8)"~""阴道分泌物计分给药前给药后4d给药后8d同模型组比较，*表示尸<0.05，A表示户O.Ol。由表1、表2可见，高、中、低剂量组吲哚-2，3-二酮明胶栓剂对白色念珠菌、脆弱拟杆菌感染的菌落计数疗效均优于模型对照组,给药后4d显效,8d菌落数继续下降(尸O.Ol或尸O.05);高、中、低剂量组吲哚-2,3-二酮明胶栓剂对白色念珠菌、脆弱拟杆菌感染的阴道分泌物计数疗效均优于模型对照组,给药后4d显效，8d分泌物继续减少(尸O.Ol或户<0.05)。白色念珠菌阴道炎和脆弱拟杆菌阴道炎模型经过治疗后阴道组织病理学检查结果显示模型组阴道壁三层结构完好,粘膜下层、肌层见多量散在广泛分布的中性粒细胞、单核细胞浸润，细小血管扩张充血，粘膜下层疏松水肿。吲哚-2,3-二酮明胶栓剂高剂量组阴道三层结构完整，粘膜下层,肌层见少量炎细胞浸润，细小血管轻度扩张充血，中、小剂量组粘膜下层、肌层见中量中性白细胞、单核细胞等浸润,细小血管扩张充血。双唑泰栓阳性对照组阴道壁结构完整,粘膜下层见少许中性白细胞、单核细胞浸润。此结果表明双唑泰栓阳性药与吲哚-2,3-二酮明胶栓剂治疗实验性阴道炎后，感染炎症显著好转,与给药前相比病变明显减轻。n引哚-2,3-二酮明胶栓剂对大鼠白色念珠菌和脆弱拟杆菌造成的实验性阴道炎具有良好的治疗作用。试验例2:d引哚-2，3-二酮外用制剂治疗妇科阴道炎的临床观察以实施例1制备得到的n引哚-2,3-二酮明胶栓剂为例来说明B引哚-2,3-二酮外用制剂治疗妇科阴道炎的临床观察。选择24例患真菌性阴道炎，病程2个月以上且复发至少505025102.10±0.002.39±0.002.51±0.002.44±0.002.09±0.002.23±0.421.52±0.82A1.15±0.45A1.64±0.34A1.24±0.74A2.31±0.570.87±0.23A0.75±0.12A1.16±0.26A1.22±0.31A505025102.91±0.002.82±0.003.00±0.002.93±0.002.84±0.002.76±0.622.01±0.55A2.32±0.67*2.08±0.51A2.42±0.46*2.89±0.781.65±0.49A1.73±0.38A1.56±0.68A2.39±0.53*白色念珠菌阴道炎双唑泰栓喷哚-2，3-二酮明胶栓剂脆弱拟杆菌阴道炎双唑泰栓n引哚-2,3-二酮明胶栓齐iJ组g慢量懂，柳遣遣遣塾抄剂剂剂掛炒剂剂剂模瞎高中低模^高中低1次以上的患者，1月内未口服抗菌药物、2周内未外用抗菌制剂,无全身器质性疾病，非妊娠期及哺乳期,血尿常规、肝肾功能、血糖均正常者。随机分为治疗组和对照组各12例。治疗组年龄20~48岁，平均35岁，对照组年龄18~50岁,平均37岁。诊断依据小阴唇及阴道黏膜覆盖大量黄色或白色豆腐渣样分泌物,擦除后露出红肿的黏膜面,部分黏膜面糜烂甚至溃疡。分泌物用悬滴法在显微镜下找到芽生胞子或假丝菌丝。治疗方法治疗组每日睡前置入阴道穹隆部吲哚-2,3-二酮明胶栓剂l枚(含药量为50mg),1次/d，连用7d。阳性对照组每日睡前置入阴道穹隆部双唑泰栓1枚，1次/d,连用7d。治疗后2，4,8周复诊,并根据疗效判定标准进行评定。疗效判定标准痊愈为症状完全消失,黏膜损伤愈合,真菌镜检阴性。显效为症状明显改善,黏膜损伤明显好转,真菌镜检阴性。进步为症状改善，黏膜损伤好转，真菌镜检阳性。无效为症状及黏膜损伤未见明显好转,真菌镜检阳性。有效率以痊愈加显效计。痊愈者治疗8周后月经前复査，若出现小阴唇及阴道黏膜覆盖大量黄色或白色豆腐渣样分泌物,擦除后露出红肿的黏膜面,部分黏膜面糜烂甚至溃疡。分泌物用悬滴法在显微镜下找到芽生胞子或假丝菌丝为复发。观察结果如下表3B引哚-2，3-二酮明胶栓剂治疗组与双唑泰栓阳性对照组阴道炎疗效比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>经过治疗后，两组患者绝大部分临床症状好转，真菌镜检为阴性。治疗后4周、8周随访时，两组均有少数患者再次出现临床症状，真菌镜检阳性，且随着时间的推移，两组复发率均有上升趋势。由表3可见，经治疗，两组的疗效差异均无显著性(P〉0.05);治疗后4周、8周，两组的复发率亦无显著差异(P〉0.05)。以上的临床观察表明，吲哚-2,3-二酮明胶栓剂对真菌性阴道炎具有良好的治疗作用，与阳性对照药物双唑泰栓无显著差异。试验例3:吲哚-2，3-二酮外用制剂对大鼠阴道刺激性试验以实施例1制备的吲哚-2,3-二酮甘油明胶栓剂为例来说明吲哚-2，3-二酮外用制剂对大鼠阴道刺激性试验。选用230-250g成年雌性大鼠6只，随机2组，分别为阴道给药组和对照组，每组3只。阴道给药组每次每只给予吲哚-2,3-二酮明胶栓剂1枚，药量为50mg;对照组每次每只给予相同栓模中制出的未加入吲哚-2，3-二酮的空白甘油明胶栓剂l枚。将吲哚-2，3-二酮甘油明胶栓剂与大鼠阴道接触至少4小时(如有漏出则在4小时内平均分次给药)，观测给予吲哚-2,3-二酮明胶栓剂后24、48、72小时大鼠全身状况及阴道刺激反应。处死大鼠后，取阴道，观察粘膜有无充血、水肿、组织变性或坏死等明显刺激性变化，并做病理组织学检查，与对照组比较。分别于置入栓剂后24、48、72小时处死大鼠，解剖取出阴道，纵向切开，观察接触部位阴道的刺激反应，结果表明，阴道给药组与对照组相比，肉眼观察，阴道无显著充血、水肿、组织变性或坏死等刺激性变化。阴道给药组阴道病理切片观察与对照组相似，组织结构完好，未见变性、坏死、缺失或过度角化，血管未见扩张充血，亦无血栓形成，周围组织未见水肿、炎细胞浸润，血管内皮完整，内皮细胞排列整齐。按表4"阴道剌激性试验判断标准"判断结果。表4阴道刺激性试验判断标准反应级刺激反应""^无明显变化1轻度充血，其范围在0.5xl.0cm以下2中度充血，其范围在0.5xl.0cm以上3重度充血，伴有肌肉变性4出现坏死，有褐色变性5出现广泛性坏死判断结果显示，经观察两组大鼠阴道分别给予吲哚-2,3-二酮明胶栓剂和空白甘油明胶栓剂后，均无明显刺激性反应，反应级数均为O。结果见表2。表5吲哚-2,3-二酮明胶栓剂对大鼠阴道刺激性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上试验结果表明吲哚-2,3-二酮明胶栓剂，其阴道刺激性试验符合阴道用药安全性要求。试验例4:n引哚-2，3-二酮的急性、慢性毒性试验昆明种小鼠50只，大鼠160只，雌雄兼有，体重18—20g，180—220g随机分为5组，每组10只；试验前禁食12h，自由饮水；控制室温在20士2'C。西黄蓍胶用生理盐水配制成1.25%的胶体供试验使用；刚哚-2，3-二酮为橙色粉末状，不溶于水，试验前用1.25%的西黄蓍树胶配制成所需浓度的悬浊液供试验使用。口引哚-2,3-二酮剂量分别为3，2，1.5，1，0.7g'kg—、一次性灌胃，给药容积为0.2ml/Kg，组间比为k=0.7,灌胃容积0.6ml/只。试验于上午进行。观察给药后24h各组动物的死亡和存活情况，计算死亡率，采用孙氏改良法计算LD50。存活动物观察7d，生长良好，体重增加，尸检，心肝肾脑等组织肉眼观察未发现异常变化。为用药后24h的死亡率，采用孙氏改良法计算LD50=109U359mg.kg'1(95%可信区间为751-1374mg.kg-1)为确保长期用药的安全性，按国家医药食品监督管理局、国家I类新药慢性毒性试验标准，对吲哚-2,3-二酮进行安全性综合评价。吲哚-2,3-二酮按临床用量的1.17、58.5、117倍的不同剂量给大鼠连续灌胃3个月、6个月及第7个月恢复期对大鼠的体重增长、进食情况以及行为活动等无显著影响，对大鼠的血液学、血液生化学及心电图等各项指标亦无明显的不利影响。22种脏器与组织的病理组织学观察与空白对照组比较均未见异常。结果表明，长期大剂量口服吲哚-2,3-二酮，对动物无明显损害，未发现因蓄积而对机体产生的毒性反应，是一种安全可靠的药物。权利要求1、吲哚-2，3-二酮在制备治疗妇科阴道炎外用制剂中的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的吲哚-2,3-二酮为天然产物或人工合成产品。3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的吲哚-2，3-二酮通过下述方法纯化用超纯水和无水乙醇按h1-8的体积比例混合，加入人工合成的吲哚-2,3-二酮，在磁性搅拌器中缓慢加热至溶解，然后逐渐冷却呈针形橘红色结晶。4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于加热温度为50-8(TC。5、根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所得的针形橘红色结晶再按同样方法重复纯化l-3次。6、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的制剂为栓剂，且按如下工艺制备称取明胶，加入蒸馏水，浸泡，使明胶溶胀变软，于8(TC水浴加热溶解，充分融熔得明胶溶液，再加入甘油，轻搅使之混匀，继续加热搅拌，使水分蒸发至粗放量为止，得到甘油明胶溶液；将所述的吲哚-2，3-二酮研磨成粉末过100目筛，与吐温-80、冰片醋的95%乙醇稀释液共同搅拌，将其加入上述的甘油明胶溶液中，搅匀，趁热灌入已涂有液体石蜡的栓模中，冷却，削去溢出部分，脱模，制成50mg或100mg规格的甘油明胶栓剂。7、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的制剂为软胶囊，且按如下工艺制备将所述的吲哚-2,3-二酮研磨成粉末过100目筛，加入PEG400与丙二醇，研磨直至溶解，形成均匀溶液，于软胶囊机上压囊、干燥，包装，制成50mg或100mg规格的外用软胶囊。8、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的制剂为泡腾片，且按如下工艺制备，将所述的吲哚-2,3-二酮、乳糖、酒石酸和羧甲基淀粉钠，研磨成粉末过100目筛，相互混匀；加入吐温80的2。/。乙醇溶液制成软材，16目筛制粒，干燥，14目筛整粒；加入微粉硅胶和羧甲基淀粉钠，混匀，压片，包装，制成50mg或100mg规格的外用泡腾片。全文摘要本发明涉及吲哚-2，3-二酮在制备治疗妇科阴道炎外用制剂中的应用，所述的吲哚-2，3-二酮为天然产物或人工合成产品，其毒性低，副作用小，且无阴道刺激性，具有良好的改善阴道炎的作用，是一种安全可靠的妇科阴道炎治疗药物。文档编号A61K31/403GK101347426SQ200810146680公开日2009年1月21日申请日期2008年9月5日优先权日2008年9月5日发明者旺岳,硕张,张婷婷,毕建伟,王继波,王青山,静聂申请人:威海华新药业集团有限公司;青岛大学