专利名称：一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，属生物医用材料 技术领域。
背景技术：
组织工程学是一门利用工程学和生命科学的原理研究和开发具有生物活性 的人工替代物以维持恢复或提高人体受损组织的功能的交叉学科。组织工程的 基本原理和方法是通过生物过程将自体或异体的活细胞诱导分化增殖后种植到 体外构建的细胞外基质模拟物(可生物降解支架)中，经体外培养形成细胞/支 架复合物，然后将该细胞/支架复合物移入患者体内受损的组织或器官部位，通 过植入细胞的增殖分化与周围组织整合，重建器官组织的缺损部位；同时，在 此过程中，可生物降解支架材料逐渐降解排出体外，最终完成受损器官组织的 再生。
组织工程包括"种子细胞"，"支架材料"，"细胞/支架复合物"三方面的内 容。其中，支架材料作为体外人工构建的细胞外基质模拟物是最为重要的内容。 它不仅为所种植细胞的黏附生长提供空间结构支撑，而且要引导细胞构建特定 功能的组织或器官。理想的组织工程支架通常必须具备的性能包括(1)具有良 好的生物相容性；(2)具有与特定组织生长相适应的微结构(织态结构、孔径、 孔隙率等)；(3)具有与特定组织生长相适应的降解与吸收速率；(4)加工性能 良好，有适宜的力学强度以满足体内外操作并适应再生的组织。
有研究表明，纳米与微米共存的空间结构可以为组织生长提供一种综合的 结构空间，是一种更为理想的亚微观结构形态。
聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物是良好的生物支架材料之一，生物相容性好， 能在体内完全降解。但作为支架材料，其降解较快，尤其是聚乳酸在体内的降 解产物乳酸易造成局部无痛炎症且强度较弱等缺点。研究表明聚乳酸、聚乳酸/ 乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合而成的多孔支架材料不仅可以提高多孔支架的 压縮强度，而且可以中和聚乳酸降解所产生的酸性，延缓聚乳酸的降解速度。
壳聚糖是一种碱性多糖，其结构和性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚 糖非常类似。它不仅具有天然材料良好的生物相容性和可降解性，而且壳聚糖 分子链上富含氨基，具备抗菌功能，且氨基和羟基基团可接枝改性，赋予其衍 生物独特的生物和材料方面的性能。所以壳聚糖作为一种新型的组织工程支架材料越来越受到人们的重视。Madihally等于1999年制备了膜状，片状，管状， 球状的壳聚糖支架，平均孔径在l-250Mm，但是强度较差。研究表明用共混方法 制备的聚乳酸/壳聚糖多孔复合支架材料，具有良好的微结构、机械性能和降解 性能，其炎症反应远远低于纯聚乳酸材料，并且具备良好的抗菌性，可以用作 细胞支架材料植入体内。但是，共混的一个典型缺点是降低聚乳酸的玻璃转化 温度，而且对于力学性能无明显改善；另外该方法也无法控制支架的结构。
我国专利CN1394654公开了组织工程用聚乳酸多孔支架的制备方 法。CN1418904公开了壳聚糖-聚乳酸接枝共聚物的制备方法。CN1316464公 开了聚乳酸/甲壳素类多孔支架材料的制备方法，包括聚乳酸/甲壳素类熔融多 孔支架材料、聚乳酸/甲壳素溶液多孔支架、聚乳酸/壳聚糖类接枝共聚多孔支 架材料的制备方法，制得的材料具有更好的生物相容性，消除了传统材料存在的 细菌性和无菌性反应。CN1895684采用纳米蜘蛛丝纤维、天然纳米蚕丝纤维、天 然纳米纤维素纤维、天然纳米甲壳素纤维以及天然纳米胶原纤维基制备了组织 工程支架，制备出的天然纳米纤维基组织工程细胞支架有着很好的承载强度、 可调控的支架孔隙率、很好的生物相容性与细胞亲和性。CN1919352公布了采 用静电纺丝法制备的壳聚糖纤维支架，可应用于仿生细胞外基质、伤口敷料、 酶、基因和药物的载体和仿生细胞外基质。
Song等(美国专利6699287)采用壳聚糖及其衍生物制备的支架可用于皮 肤的再修复，特别是皮肤烧伤。Ma等(美国专利6673285)采用聚乳酸、聚乙 醇酸等用粒子致孔法制备的多孔纤维状支架，支架具备良好的贯穿型孔结构， 易于细胞生长和分化，并具备良好的机械强度。Ma等(美国专利6146892)也 公布了采用热致相分离的方法制备的聚乳酸、聚乙醇酸支架，支架具备良好的 三维多孔结构，可用于器官移植，肌腱修复等组织工程领域。Mikos等(美国 专利5512600)采用醋酸乙烯或甲基丙烯酸纤维填充聚乳酸、聚乙醇酸支架， 所制得的支架具备良好的生物相容性和强度。
上述方法都未釆用壳聚糖纤维增强，而且制得的三维支架都不是纳米微米 共存结构的。
发明内容
本发明的目的在于通过聚乳酸或聚乳酸/乙醇酸共聚物和壳聚糖纤维的复 合杂化以制备出聚合物基纳米复合增强组织工程支架材料。本发明方法制得的 支架可以解决以下主要问题
(1)组织工程支架材料的微观结构和材料强度的矛盾问题细胞的生长过 程需要首先在支架上附着、然后逐渐增殖、生长。在此过程中，需要不断吸收营养物质和排出代谢物。因此要求支架材料具有有利于粘附附着的表面(亲水 性较高和较高的比表面积)、足够大、足够多的孔(细胞生长需要数百微米)并 且内部三维相通(有利于营养物质的输入和代谢物的排出，也有利于血管和神 经的长入)。就支架材料的韧性以及细胞的粘附、增长而言，支架材料骨架部分
的微观尺寸越小越好；这是因为，骨架部分尺寸越小，同种材料制备的支架材 料的韧性越好，越有利于组织在动态条件下的生长；骨架部分尺寸越小，相同 密度条件下材料的比表面积越大，各结构单元间存在相互作用，导致带电能级 间歇加大和表面能大大增加，使之能有效地增强细胞黏附、诱导细胞生长，并 有利于组织再生。所以通过热致相分离法制备的骨架部分为纳米尺度的支架材 料是理想的。但是纳米尺度支架材料的力学强度不足，甚至个别局部无法承受 细胞移动造成的载荷，是纳米支架材料在应用中的最大瓶颈之一。采用壳聚糖 纤维复合增强则可以解决支架材料强度不足的问题。
(2) 聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物支架降解过程中的酸性问题釆用碱性 多糖壳聚糖的复合杂化可以中和支架降解过程中的酸性产物从而解决酸性问 题。
(3) 支架在细胞增长过程中支架材料的强度降低速率与细胞增长速率相适应 问题采用壳聚糖纤维复合杂化不仅可以增强支架，降低酸性，而且壳聚糖纤 维的降解速率小，可以控制支架材料的强度降低速率与细胞的增长速率相适应。
为了实现上述发明目的，本发明的壳聚糖短纤维增强的纳米支架的制备方 法如下
第一步对壳聚糖短纤维进行接枝改性。
(1) 配制聚乳酸类聚合物/二氯甲烷CH2Cl2溶液。
(2) 加入壳聚糖短纤维和接枝改性剂，冰浴中磁力搅拌3小时至縮合反应 完全。所使用的壳聚糖短纤维是直径在5—80ym，脱乙酰度为50—95%的壳聚 糖纤维。接枝改性剂为含有活性反应基团的硅烷类化合物(如乙烯基三乙氧基 硅垸等)或有机胺类化合物(如N ， N' - 二环己基碳二亚胺DCC等)。
(3) 取出改性壳聚糖纤维，滤纸吸干，用CH2Cl2流液冲洗交联物表面3遍 后吸干；空气中干燥至少1天至恒重后置于干燥器中保存备用。
第二步纳米支架的制备。
(1)在60。C恒温水浴中，将浓度为10 — 100g/L的聚乳酸类聚合物溶解于 溶剂中。溶剂为四氢呋喃、四氢呋喃/水、二噁烷/水。(2) 在均相溶液中加入接枝改性壳聚糖短纤维，长度约1毫米，聚合物与 改性壳聚糖短纤维的质量比为100: 10 — 100: 60 。超声混合均匀后，放入预冷 的成型玻璃容器中。
(3) 在一18。C条件下，将溶液冷冻至少2小时，制得聚合物和壳聚糖短纤 维的复合凝胶。
(4) 在4X:条件下，在50倍体积以上的去离子水中，将凝胶进行水置换， 时间为2天，中间每8小时换水一次。
(5) 将水置换后的凝胶取出，再次在一18。C条件下冷冻至少2小时。
(6) 将冷冻物在冷冻干燥机中冷冻干燥至少3天，即制得壳聚糖短纤维增 强的纳米支架。
本发明所使用的聚乳酸类聚合物包括左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/ 乙醇酸共聚物等。
本发明方法制得的纳米支架呈白色，多孔状。孔隙率大于90%，所制得的 三维网络状支架具有纳米级聚乳酸类聚合物骨架、微米级壳聚糖纤维支撑和微 米级孔共存结构，而且相互贯通。从结构上特别适合细胞的粘附、生长、分化 和营养液的输运。由于加入壳聚糖短纤维，不仅大幅度提高了支架材料的力学 强度，而且大幅度减缓了支架材料降解过程中的pH值的下降，使细胞增长过程
中支架材料的强度降低速率与细胞增长速率相适应。本发明方法简单可行，可 根据需要任意控制支架材料外形及尺寸，所制备的支架能广泛应用于组织工程 领域。
图1为壳聚糖短纤维增强的纳米支架微观结构图。 图2为壳聚糖短纤维增强的纳米支架压縮模量图。 图3为壳聚糖短纤维增强的纳米支架体外降解pH变化图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明方法作进一步的说明。 实施例1:
第一步对壳聚糖短纤维进行接枝改性。
配制浓度为8g/100ml的聚乳酸类聚合物(左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳 酸/乙醇酸共聚物)/二氯甲垸CH2Cl2溶液。加入直径在5 — 80um，脱乙酰度为50_95%的壳聚糖纤维，接枝改性剂(乙烯基三乙氧基硅烷或N， N' - 二环己 基碳二亚胺DCC)，使壳聚糖纤维与接枝改性剂、聚乳酸类物质的质量比分别为
1: 2: 4;冰浴中磁力搅拌3小时至縮合反应完全。取出改性壳聚糖纤维，滤纸
吸干，用CH2Cl2流液冲洗交联物表面3遍后吸干。空气中干燥至少1天至恒重后 置于干燥器中保存备用。
第二步纳米支架的制备。
在50ml溶剂(四氢呋喃、四氢呋喃/水、二噁烷/水)中加入2.5g聚乳酸 类物质(左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物)，在60。C恒温水浴 中溶解。在上述溶液中，加入0.25-1.5g接枝改性的壳聚糖短纤维，长度约1 毫米。超声混合30min后，分装入预冷的成型玻璃容器中。在一18"C条件下， 将溶液冷冻4小时。制得聚乳酸类物质和壳聚糖短纤维的复合凝胶。在4'C条件 下，在50倍体积以上的去离子水中，将凝胶进行水置换，时间为2天，中间每 8小时换水一次。将水置换后的凝胶取出，再次在一18"C条件下冷冻4小时。将 冷冻物在冷冻干燥机中冷冻干燥5天，制得壳聚糖短纤维增强的纳米聚乳酸类 物质支架。
所制得的三维网络状纳米复合支架材料中壳聚糖短纤维分散均匀，界面结 合牢固，纳米聚乳酸类物质骨架、微米壳聚糖纤维支撑与微米级孔共存且相互 贯通依存，其微观形貌如图1所示(放大倍数为2000倍)，孔隙率93—96%; 强度随聚合物和壳聚糖纤维浓度的不同而变化(如图2所示，横坐标为聚乳酸 与壳聚糖短纤维的质量比，纵坐标为压縮模量，单位MPa)。采用壳聚糖短纤维 增强后，不仅力学强度大幅提高，而且减缓了支架降解过程中pH值的下降速率 (如图3所示，横坐标为降解天数，纵坐标为pH值)，从而使细胞增长过程中 支架材料的强度降低速率与细胞增长速率相适应。与同样热致相分离法制备的 纯聚乳酸类物质支架材料相比，复合纳米支架压縮强度提高100—200%，体外 降解速率降低数倍，具有重要的应用价值。
权利要求
1、一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其特征在于按照如下步骤操作第一步，利用接枝改性剂对壳聚糖短纤维进行接枝改性；第二步，在60℃恒温水浴中，将浓度为10—100g/L的聚乳酸类聚合物溶解，加入接枝改性壳聚糖短纤维，聚乳酸类聚合物与改性壳聚糖短纤维的质量比为10010—10060，混匀后，放入预冷的成型玻璃容器中；在—18℃下，将溶液冷冻至少2小时，制得聚合物和壳聚糖短纤维的复合凝胶；在4℃下，将凝胶用至少50倍体积的去离子水进行水置换；取出凝胶，再次在—18℃下冷冻至少2小时；将冷冻物在冷冻干燥机中冷冻干燥至少3天，即制得壳聚糖短纤维增强的纳米支架。
2、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于对壳聚糖短纤维进行接枝改性的操作步骤如下配制聚乳酸类聚合物/ 二氯甲烷溶液；加入壳聚糖短纤维和接枝改性剂，冰浴中搅拌至縮合反应完全； 取出改性壳聚糖纤维，滤纸吸干，用CH2Cl2流液冲洗交联物表面后吸干；空气中 干燥至恒重。
3、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于所使用的壳聚糖短纤维是直径在5—80um，脱乙酰度为50_95%的壳聚糖纤维。
4、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于接枝改性剂为含有活性反应基团的硅垸类化合物或有机胺类化合物。
5、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于聚乳酸类聚合物是左旋聚乳酸、消旋聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸共聚物。
6、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于第二步中溶解聚乳酸类聚合物所用的溶剂是四氢呋喃、四氢呋喃/水、 二噁烷/水。
7、 根据权利要求1所述的一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法，其 特征在于本发明方法制得的纳米支架呈白色，孔隙率大于90%，具有纳米级聚 乳酸类聚合物骨架、微米级壳聚糖纤维支撑和微米级孔共存结构，而且相互贯 通。
全文摘要
本发明涉及一种壳聚糖短纤维增强的纳米支架制备方法。利用接枝改性剂对壳聚糖短纤维进行接枝改性；将聚乳酸类聚合物溶解，加入接枝改性壳聚糖短纤维，在-18℃下，将溶液冷冻，制得聚合物和壳聚糖短纤维的复合凝胶；4℃下，将凝胶用去离子水进行水置换；取出凝胶，再次在-18℃下冷冻后干燥即制得壳聚糖短纤维增强的纳米支架。制得的三维网络状支架具有纳米级聚乳酸类聚合物骨架、微米级壳聚糖纤维支撑和微米级孔共存结构，且相互贯通。由于加入壳聚糖短纤维，不仅大幅提高了支架材料的力学强度，而且大大减缓了支架材料降解过程中的pH值下降速率。本方法简单可行，可根据需要任意控制支架材料外形及尺寸，可广泛应用于组织工程领域。
文档编号A61L31/04GK101411900SQ20081016001
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月7日 优先权日2008年11月7日
发明者宋国君, 涛 楼, 汪学军 申请人:青岛大学