治疗用合成寡核苷酸的制作方法

专利名称：：治疗用合成寡核苷酸的制作方法治疗用合成寡核苷酸本申请是申请日为2000年12月12日，国际申请号PCT/CA00/01467,国家申请号为00818858.0，发明名称为"治疗用合成寡核苷酸"的申请的分案申请。发明领域本发明涉及用于治疗癌症的寡核苷酸组合物。
背景技术：
：癌症是一种非正常细胞的异常净积聚，它主要由过度增殖、不适当的细胞死亡或二者结合所致。增殖是通过细胞周期致使一个细胞分裂为两个细胞的细胞连续积聚。细胞周期的5个主要阶段是G。、G,、S、G2和M。在G。阶段，细胞是静止的。在任何时候，体内的大多数细胞处于该阶段。G,阶段期间，对应于分裂信号的细胞产生DNA合成所需的RNA和蛋白质。S-阶段期间(SE:早期S-阶段；SM:中期S-阶段；和SL:后期S-阶段)，细胞复制其DNA。G2阶段期间，构建蛋白质，为细胞分裂作制备。有丝分裂(M)阶段期间，细胞分裂为两个子细胞。细胞周期过程中的变化发生于所有癌症中，这种变化可由基因的过度表达、调节基因的突变或DNA损伤关卡的消失引起(HochhauserD.,Anti-CancerChemotherapeuticAgents8:903，1997)。与癌细胞不同，大多数正常细胞不会因为变化期的细胞衰亡而无限度地增殖。细胞衰亡是一种导致细胞生长停止的程序化细胞死亡反应(Dimri等，Proc.Natl.Aca.d.Sci.USA92:20，1995)。据报道，DNA损伤，结肠、乳腺和卵巢癌细胞与拓扑异构体抑制剂的接触以及鼻咽癌细胞与顺铂的接触可通过诱导衰亡来防止这些细胞的增殖(Wang等，CancerRes.58:5019，1998;Poele等，Br.J.Cancer80:9，1999)。合成寡核苷酸是在细胞中内在化的多阴离子序列(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta1197:95，1994)。据报道，合成寡核苷酸选择性地与核酸(Wagner，R.Nature:372:333，1994)、特异性细胞蛋白质(Bates等，J.Biol.Chem.274:26369，1999)和特异性核蛋白质结合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252:207，1998)来抑制癌细胞的增殖。据报道，合成的含鸟嘌呤(G)和可变数量的胸腺嘧啶(T)的27个碱基的序列(寡核苷酸GTn)，其中n1或7并且其中碱基的数量20(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252:207，1998)通过序列与45kDa核蛋白质的特异性结合抑制癌细胞系的生长；但另据报道，其中碱基数量20的GTn对癌细胞系没有活性(Morassutti等，NucleosidesandNucleotides18:1711，1999)。据报道，两种合成的用3'-氨基垸基修饰的15个碱基和29个碱基的富含GT的寡核苷酸形成G-四集体，该四集体与核仁蛋白结合并抑制癌细胞系的增殖(Bates等，J.Biol.Chem.274:26369，1999)。据报道，合成的6碱基TTAGGG-硫代磷酸酯在体内和体外抑制非洲淋巴瘤细胞的增殖，所述硫代磷酸酯具有与哺乳动物端粒重复序列相同的序列(Mata等，Toxicol.AppliedPharmacol.144:189，,1997)。但另据报道，合成的6碱基TTAGGG-磷酸二酯不具有抗端粒酶的活性(US5,643,890)。细胞死亡可由促进细胞凋亡的免疫调节剂，或者由直接引发导致细胞死亡途径的凋亡诱导剂引起(Muzio等，Cell85:817，1996;Levine，A.，Cell88:323，1997)。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡过程，其特征在于显著的形态学变化，这些变化包括核染质的缩聚、细胞皱縮、核破碎、原生质膜形成气泡并形成膜结合的细胞凋亡体(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.68:251，1980)。细胞凋亡的分子标志是细胞核DNA分解为寡核小体长度的碎片，这是内源性内切核酸酶活化的结果(WyllieA.，Nature284:555，1980)。半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶(Caspases)作为一种关键酶参与细胞凋亡的后期过程。半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶家族包括至少14种有关的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶。所有的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶都包含保守的QACXG(其中X是R、Q或G)五肽活性位点基元(CohenG.，Biochim.Bi叩hys.Acta1366:139,1997)。许多半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶是作为无活性酶原被合成的，所述酶原在半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的特异性分解位点分解后被活化(CohenG.，Biochim.Biophys.Acta1366:139，1997);或者它们作为无活性的酶被合成，这些酶需与用于活化的调节分子结合(Stennicke等，J.Biol.Chem.274:8359，1999)。除了它们在细胞凋亡中的作用以外，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶还与B和T淋巴细胞的活化和增殖、炎症期间细胞因子的成熟、红细胞生成期间祖代细胞的分化和晶状体纤维的发育有关(Fadeel等，Leukemia14:1514，2000)。关于B和T淋巴细胞，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3在B淋巴细胞以及CD4(+)、CD8(+)、CD45RA(+)和CD45R0(+)亚型的T淋巴细胞的活化中起作用(Alam等，J.Exp.Med.190:1879，1999)。此外，促细胞分裂剂和白介素-2对T淋巴细胞的刺激与半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶途径的活化和PARP的分解有关(Wilheim等，Eur.J.Immunol.28:891，1998)。关于细胞因子，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3活性是通过活化的T淋巴细胞释放IL-2(Posmantur等，Exp.CellRes.244:302，1998)和促炎细胞因子白介素-16的加工和成熟所必需的(Zhang等，J.Biol.Chem.273:1144，1998)。关于红细胞生成，半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的活化与红细胞生成的调节有关，据示该酶调节GATA-1，一种对于红细胞前体的成熟至关重要的核调节蛋白质(DeMaria等，Nature401:489，1999)。细胞溶解是细胞的完全或部分破坏，它由免疫系统介导。活化的巨噬细胞和单核细胞产生包括，但不限于细胞因子的生物活性分子。细胞因子包括，但不限于白介素(IL)-1、IL-1|3、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-ot。IL-lp降低骨髓细胞对细胞减^性药物、放射和自体骨髓移植中使用药物的体外肿瘤细胞清除的敏感性(Dalmau等，BoneMarrowTransplant.12:551，1993)。IL-6诱导B细胞分化，刺激IgG分泌(Taga等，J.Exp.Med.166:967，1987)，诱导细胞毒性T细胞分化(Lee等，Vaccine17:490，1999)并促进巨核细胞成熟(Ishibashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8953，1989)，并且对癌细胞还具有抗增殖因子(Mori等，Biochem.Biophys.Res.Co画.257:609，1999;Alexandroff等，Biochem.Soc.Trans.25:270，1997;Takizawa等，CancerRes.53:18，1993:Novick等，Cytokine4:6，1992)和增殖前因子(proproliferativefactor)的功能(Okamoto等，CancerRes.57:141,1997;Okamoto等，Int.J.Cancer72:149，1997;Chiu等，Clin.CancerRes.2:215,1996;Lu等，Clin.CancerRes.2:1417，1996)。在鼠的肿瘤模型中，工L-IO提高疫苗的效力(Kauffman'等，J.Iiranunother.22:489，1999)并上调抗癌自体反应性T细胞的反应(Alleva等，I腿unobiol.192:155,1995)。IL-12单独和与其它细胞因子联合使用时，促进白细胞的成熟并诱导Y-干扰素的分泌。据报道，IL-12具有抗癌活性(Stine等，AnnalsNYAcademyofScience795:420，1996;Chen等，JournalofImmunol.159:351，1997),所述活性包括，但不限于活化特异性溶细胞性T淋巴细胞，活化天然杀伤细胞(NK)并诱导抗血管生成蛋白质IP-10和MiG。TNF-a引起实体肿瘤的坏死(Porter等，TrendsinBiotech.9:158，1991)，敏化癌细胞对y放射引发的细胞凋亡(Ki咖ra等，CancerRes.59:1606，1999)并保护骨髓前体细胞，使其免受抗肿瘤剂的影响(Dalmau等，BoneMarrowTransplant.12:551，1993)。然而，大多数现有技术的抗癌疗法，无论是涉及诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导细胞凋亡，还是激发免疫系统的，都被证明不能满足临床的应用。这些疗法中的许多方法不够有效或具有毒性，具有明显的副作用，导致形成耐药性或免疫致敏，以及致患者虚弱。因此，一直需要新的组合物和方法，所述组合物和方法能诱导癌细胞的细胞周期停滞、抑制癌细胞增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶、诱导癌细胞的细胞凋亡并刺激免疫系统细胞产生细胞因子。
发明内容本发明通过提供包含2—20个鄉基的3'-0H，5'-OH合成寡核苷酸(下文称"序列")的组合物和方法满足了这种需要，所述寡核苷酸选自(G工)n、(T,Gx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GJy)b、(TyGx)b、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是l一7的整数，n是l一12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，并且其中所述序列诱导一种选自下列的反应诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶、诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。将治疗动物癌症的有效量的包含序列和可药用载体的组合物施用于患癌症的动物，包括人。本发明的序列在下列方面具有出人意料的和令人惊奇的能力满足了医疗领域长足的未实现的需求并对动物，包括人具有重要的益处，所述方面是诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶并诱导癌细胞中细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。因此，本发明的一个目的是提供一种有效治疗动物，包括人的疾病的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种有效治疗癌症的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞衰亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞的细胞周期停滞的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导癌细胞的细胞周期停滞的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种抑制细胞增殖的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种抑制癌细胞增殖的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于Fas的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于TNFR1的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p53/p21的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于p21/waf-1/CIP的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于P15^B的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于Pl6ink4的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导不依赖于TGF-pl受体的癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导非激素依赖性癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种诱导非耐药性癌细胞的细胞凋亡的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种活化细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种活化癌细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种治疗自身免疫疾病的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种治疗淋巴细胞增殖性疾病的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种治疗感染的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种治疗炎症的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种调节T-或B-细胞活化的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种调节祖代细胞成熟的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种调节红细胞生成的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种调节细胞中转录因子的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种增强针对细胞的其它治疗剂的效果的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种增强针对癌细胞的化疗剂的效果的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种增强放射的抗肿瘤效果的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生细胞因子的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-1J3的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-6的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种剌激免疫系统细胞产生IL-10的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生IL-12的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种刺激免疫系统细胞产生TNF-oc的组合物和方法。本发明的另一个目的是提供一种易于制备的组合物。本发明的另一个目的是提供对接受者毒性最低的组合物。在阅读了下列公开的技术方案和附录权利要求书的详细描述后，本发明的这些和其它目的、特征和优点将变得十分清晰。图1:用0|ig/inl和100蹄/ml的6碱基GTSEQIDNO:25培养的Jurkat人T细胞白血病细胞的荧光[Fluo-3-AM]。图2:不使用0吗/ml和100pg/ml的GTSEQIDN0s:66、67、81、82的83培养的Jurkat人T细胞白血病细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的活化(用细胞计数方法(A)和比色法(B)测定)。图3:Jurkat人T细胞白血病细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶的活化。(A)用0pg/ml和100pg/ml的6碱基GTSEQIDNO:25培养的细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3的活化；(B)用0pg/ml和100吗/ml的6碱基GTSEQIDNO:25培养的细胞中半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶7的活化(a)和PARP含量(b)。具体实施例方式本发明提供一种包含2—20个碱基的3'-OH，5'-OH合成寡核苷酸(序列)的组合物，所述寡核苷酸选自(G;Ty)n、(TyG丄、a(GxTy)n、a(TyG》n、(GxTy)b、(TyG丄b、a(GxTy)b、a(TyG》nb，其中x和y是l一7的整数，n是1一12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列诱导选自下列的反应诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。将治疗动物癌症的有效量的包含序列和可药用载体的组合物施用于患癌症的动物，包括人。本发明的序列在下列方面具有出人意料的和令人惊奇的能力满足了医疗领域长足的未实现的需求并对动物，包括人具有重要的益处，所述方面是诱导细胞周期停滞、抑制增殖、诱导细胞凋亡和活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。本发明采用的术语"序列"是指2—20个碱基的3'-OH，5'-OH合成寡核苷酸，其中包含A、C、G和T碱基。.本发明采用的縮写"GT"、"AG"、"CG"、"GG"、"AGT"和"CGT"是指以任何顺序合成的包含指定碱基的序列。本发明采用的术语"反应"是指诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。本发明采用的术语"治疗性治疗"和"有效量"是指有效诱导选自下列反应的量诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌症细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。本发明采用的术语"悬浮肿瘤模型"和"实体肿瘤模型"是指原发性或继发性癌或肉瘤。本发明采用的术语"化疗剂"是指一个国家或州政府的管理部门批准的，或者美国药典或其它通常知道的药典列出的用于治疗动物，包括人的癌症的任何药物。本发明采用的术语"抗肿瘤"是指防止癌细胞的发育、成熟、增殖或扩散。本发明采用的术语"增强"是指大于各种药物相加的活性的协同程度。本发明采用的术语"协同"是指两种或多种药物协调作用。给动物，包括人施用有效量的本发明序列是一种预防、治疗或消除疾病的治疗性治疗，所述疾病包括，但不限于癌症、类风湿关节炎、淋巴细胞增殖性疾病和哮喘。癌症包括，但不限于鳞状细胞癌、纤维肉瘤、类肉瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、骨肉瘤、皮肤黑素瘤、基底细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、脑癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和由其生成的转移瘤。序列的治疗有效性可通过不限于下列的方法得到增强化学修饰碱基、糖或磷酸酯骨架，化学添加序列或者用包含适当序列的细菌质粒用生物技术扩增序列，将序列与生物或化学载体配合，或者将序列与组织型或细胞型定向的配体或抗体偶联。'通过使本发明的序列与可药用载体均匀、紧密地结合来制备包含一种或多种序列和可药用载体的组合物。可药用载体包括液体载体、固体载体或包括这两者。液体载体是水性载体、非水性载体或是这两者，并且包括，但不限于水性悬浮液、油性乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位置特异性乳液、长滞留乳液、粘性乳液、微乳和毫微乳。固体载体是生物载体、化学载体或是这两者，并且包括，但不限于病毒载体系统、颗粒、微粒、毫微颗粒、微球、毫微球、微泵、细菌细胞壁提取物和使序列缓释的生物降解或非生物降解的天然的或合成的聚合物。用于配合序列与固体载体的方法包括，但不限于直接吸附于固体载体的表面;直接地或者通过连接部分与固体载体的表面共价偶联；和与用于制备固体载体的聚合物共价偶联。任选地，序列可通过添加非离子或离子性聚合物，例如聚氧化乙烯脱水山梨醇一油酸酯(土温)或透明质酸来稳定。优选的水性载体包括，但不限于水、盐水和可药用缓冲剂。优选的非水性载体包括，但不限于矿物油和中性油或其混合物。与用于使所述序列呈示于响应细胞的可药用载体无关，可任选地包括赋形剂。这些赋形剂包括，但不限于抗氧剂、缓冲剂和制菌剂，还可以包括悬浮剂和增稠剂。可单独施用一种或多种序列，或者可将其与其它治疗形式联合施用，所述其它治疗形式包括，但不限于化疗剂、免疫治疗剂、抗菌剂、抗病毒剂或与放疗联合施用。化疗剂包括，但不限于抗代谢剂、DNA损害剂、微管破坏剂、微管稳定剂、肌动蛋白解聚剂、生长抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、嘌呤抑制剂、嘧啶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、CDK抑制剂、血管生成抑制剂和分化促进剂。给药途径包括，但不限于口服、局部、皮下、透皮、真皮下、肌内、腹膜内、膀胱内、关节内、动脉内、静脉内、真皮内、颅内、损害部位内、肿瘤内、眼内、肺内、脊髓内、前列腺内、置入体腔、经鼻吸入、肺吸入、经皮、电介入途径。根据给药途径，单位剂量体积优选为约0.001—100ml/剂，更优选为约0.01—50ml/剂，最优选为约0.1—30ml/剂。每剂给予的序列的量优选为约0.001—100mg/kg，更优选为约0.01—10mg/kg和最优选为约O.l—5mg/kg。本发明的序列或序列加治疗剂可以以单剂疗法、多剂疗法或在一个治疗方案中连续输注的形式给药一段时间，所述时间对于被治疗的疾病、接受治疗者的状况和给药途径而言是适宜的。此外，所述序列可以在所述治疗剂给药之前、同时或之后给予。将有效增强化疗剂的抗肿瘤作用量的序列与化疗剂联合施用于患癌症的动物。每剂施用的治疗剂的量优选为约O.OOl—lOOOmg/m2或者约0.01—1000mg/kg，更优选约0.01—500mg/W或者约0.01—500mg/kg并且更优选约0.I—IOOmg/V或者约0.1—100mg/kg。施用的特定的序列和特定的治疗剂、每剂的量、给药方案和给药途径应由医师用本领域专业技术人员已知的方法决定，并且还应取决于癌症的类型、癌症的严重程度、癌症的位置和其它临床因素，如接受者的大小、体重和身体状况。此外，可任选地使用体外分折以帮助确定序列给药或序列加治疗剂给药的最佳范围。虽不期望受到下列假说的限制，据认为本发明的序列形成一类新结构，并且它们不是作为反义RNAs、反义DNAs、三倍螺旋体形成的DNAs、端粒酶抑制剂、转录活化剂或转录抑制剂而起作用。下列实施例将用于进一步举例说明本发明，而同时不对本发明构成任何限制。相反，在阅读本发明的说明书之后，对于本领域专业技术人员来说，应该清楚必需借助各种其它的实施方案、其改变的和等同的方案，在不背离本发明实质精神下来自我启发。实施例1序列的制备磷酸二酯和硫代磷酸酯序列由HUKABELScientificLtd(Montreal,Quebec,Canada)用EXPEDITE8900自动DNA合成系统(PersS印tiveBiosystems,Inc.,Farminghan，MA)禾口由Sigraa-Genosys(Woodlands,TX)用算盘分割的合成技术(AbacusSegmentedSynthesisTechnology)制备。除非另有说明，使用的序列是磷酸二酯序列。除非另有说明，在临用前，将序列分散到高压灭菌的去离子水或高压灭菌的药用缓冲剂中，例如，但不限于盐水。实施例2细胞和试剂所有的细胞系均得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD)并且在ATCC建议的培养基中进行培养。表1显示了细胞系、它们的产地和它们的特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>将细胞接种到6(1ml/孔)、24(0.5ml/孔)或96(0.1ml/孔)孔平底微滴板并保持在37'C下和596C02气氛中。除非另有说明，将2.5X105个细胞/ml与0pg/ml(对照)和100pg/ml(治疗的)的包含A、C、G和丁的2、一45个碱基的序列一起培养48小时。实施例3细胞增殖的测定用二甲基噻唑-二苯基四唑翁(MTT)还原测定细胞增殖(Mosman等，J.Immunol.Methods65:55，1983)。在570nm波长下用重叠的分光光度计阅读器(ELX800，Bio-TEKInstrumentsInc.,Winooski，VT)测定MTTo实施例4Jurkat人白血病T细胞增殖的抑制Jurkat人白血病T细胞是耐受非典型的多种药物ft人悬浮肿瘤细胞模型。将Jurkat细胞与27碱基的GT和CT序列一起培养(表2)。表2Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表中'Tases"为"碱基如表2所示，JurkatT细胞的增殖被测试的GT序列抑制，但不被测试的CT序列抑制。将JurkatT细胞与3、6、9、12、14、15、18、21和24碱基的GT序列一起培养(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表4所示，6碱基GT序列抑制JurkatT细胞的增殖。GTSEQIDNO:25抑制60%增殖，AGTSEQIDNO:49抑制45%增殖。用PHARM/PCS-4软件(MicrocomputerSpecialists,Philadelphia,PA)比较GTSEQIDNO:25和AGTSEQIDNO:49的相对效力，表明GTSEQIDNO:25是AGTSEQIDNO:49的效力的3.4倍。据报道，AGTSEQIDNO:49-硫代磷酸酯抑制端粒酶的活性并诱导非洲淋巴瘤细胞的细胞凋亡(Mata等，Toxicol.Appl.Pharmacol.144:189，1997)。为测定端粒酶活性，用PCR-端粒重复扩增方法(TRAP)(Roche,Laval,Quebec,Canada)分析2x105个JurkatT细胞的提取物。在1—100g/ml浓度下，GTSEQIDNO:25-磷酸二酯表现出0—10%的抗端粒酶活性，而AGTSEQIDM):49-硫代磷酸酯表现出30—75%抗端粒酶活性。GTSEQIDNO:25-硫代磷酸酯和GTSEQIDNO:49-磷酸二酯都没有表现出任何抗端粒酶活性。将JurkatT细胞与2、3、4、5、6和7碱基的GT序列一起培养(表5)。表5Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>TTTGTT-TT(TG)'TT-31SEQIDNO:23-(6bases)GGTGGG隱GG(TG),GG48SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG60SEOIDNO:25-(6bases)TTGTTT-TT(GT),TT34SEQIDNO:26-(6bases)TGGTTG-TG(GT)'TG42SEOIDNO:2W6bases)GGGGTGG-G3(GT)iG241SEOIDNO:62-(7bases)GGGTGGG-G2(GT)G328SEQIDNO:63-(7bases)TGGGTGG-TG2(GT)|G255SEOIDNO:64-(7bases)GGGTGGT-G2(GT),G2T48SEOIDNO:65-f7bases)注表中"bases"为"碱基"。如表5所示，2、3、4、5、6和7碱基的GT序列抑制JurkatT细胞的增殖。实施例5HL-60人早幼粒细胞白血病细胞增殖的抑制HL-60早幼粒细胞白血病细胞是p53突变的人悬浮肿瘤模型。将HL-60细胞与6碱基的GT序列一起培养(表6)。表6HL-60人早幼粒细胞白血病细胞增殖的y。抑制序列%抑制TGTGTG-(TG)37SEQIDNO:9-(6bases)GTGTGT-(GT)313SEQIDNO:10-(6bases)TTTGTT-TT(TG),TT13SEOIDNO:23-(6bases)GGTGGG-GG(TG),GG18SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG35SEOIDNO:25-(6bases)TTGTTT-TT(GT),TT16SEOIDNO:26隱(6bases)注表中"bases"为"碱基"。如表6所示，6碱基的GT序列抑制HL-60细胞的增殖。实施例6MCF-7人乳腺癌细胞增殖的抑制MCF-7人乳腺癌细胞是半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶3阴性的、雌激素依赖性的人实体肿瘤模型。将MCF-7细胞(5x105个细胞/ml)与3和6碱基的GT序列一起培养(表7)。表7MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表7所示，6和7碱基的GT序列抑制MCF-7细胞的增殖。实施例7PC-3人前列腺癌细胞增殖的抑制PC-3前列腺癌细胞是p53突变的、雄激素非依赖性的人实体肿瘤模型。将PC-3细胞(5x1()5个细胞/ml)与3和6碱基的GT序列一起培养(表8)。表8PC-3人前列腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表8所示，3和6碱基的GT序列抑制PC-3细胞的增殖。LNCaP人前列腺癌细胞增殖的抑制LNCaP前列腺癌细胞是TGF-(31受体阴性的、雄激素-非依赖性的、转移性人实体肿瘤模型。将LNCaP细胞(5x105个细胞/ml)与6碱基的GT序列一起培养(表9)。表9LNCaP人前列腺癌细胞增殖的％$"制序列%抑制TGTGTG"(TG)3SEOIDNO:9-(6bases)-9GTGTGT-(GT)3SEQIDNO:10-(6bases)4TTTGTT-TT(TG)TTSEQIDNO:2K6bases)14GGTGGG-GG(TG)GG犯OIDNO:24-f6bases)17GGGTGG-GG(GT)GGSEOIDNO:25-f6bases)18TTGTTT-TT(G"TTSEQIDNO:26-(6bases)22注表中"bases"为"碱基"。如表9所示，6碱基的GT序列抑制LNCaP细胞的增殖。实施例9THP-l人急性单核细胞性白血病细胞增殖的抑制THP-l急性单核细胞性白血病细胞是无p53的人悬浮肿瘤模型。将THP-l细胞(1.6X106个细胞/ml)与6碱基的GT序列一起培养(表10)。表10THP-1人急性单核细胞性白血病细胞增殖的%抑制序列%抑制TGTGTG-(TG)30SEQIDNO:9扁(6bases)GTGTGT-(GT)311SEQIDNO:10-(6bases)TTTGTT-TT(TG)iTT8SEQIDNO:23-(6bases)GGTCGG-GG(TG)iGG6SEQIDNO:24-(6bases)GGGTGG-GG(GT),GG15SEOIDNO:25-f6bases)TTGTTT-TT(GT)iTT1SEOIDNO:26-(6bases)注表中"bases"为"碱基"。如表10所示，6碱基的GT序列抑制THP-1细胞的增殖。实施例100VCAR-3人卵巢癌细胞增殖的抑制21OVCAR-3卵巢癌细胞是p53突变的、p21/waf-1/Cip缺失的、转移性人实体肿瘤模型。将OVCAR-3细胞(5x105个细胞/ml)与2、6和18碱基的GT细胞一起培养并与6碱基的AGT序列一起培养(表11)。表11OVCAR-3人卵巢癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表11所示，2、6和18碱基的GT序列以及6碱基的AGT序列抑制0VCAR-3细胞的增殖。实施例11SK-OV-3人卵巢癌细胞增殖的抑制SK-0V-3卵巢癌细胞是p53突变的、p21/waf-l/Cip缺失的、pl5inMB缺失的、pl6,缺失的、转移性人实体肿瘤模型。将SK-0V-3细胞(5x105个细胞/ml)与2、6和18碱基的GT序列一起培养(表12)。表12SK-0V-3人卵巢癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表12所示，2、6和18碱基的GT序列抑制SK-0V-3细胞的增殖。实施例12磷酸二酯和硫代磷酸酯序列对细胞增殖的抑制据报道，通过用硫原子取代一个或多个磷酸酯基上的非桥氧原子修饰的天然磷酸二酯序列提高寡核苷酸序列在生物体液和细胞中对内切核酸酶的稳定性(Crooke等，AnticancerDrugs6:609,1991)。将Jurkat人白血病T细胞(表13)、LNCaP人前列腺癌细胞(5x105个细胞/ral)(表14)和MCF-7人乳腺癌细胞(5x1()5个细胞/ml)(表15)与具有氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)作为磷酸酯基的非桥接原子的6碱基的GT序列一起培养。表13Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表14LNCaP人前列腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表15MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注表中"oxygenatom"为"氧原子"；"sulfuratom"为"硫原子";注表中"bases"为"碱基"。*注"O"代表磷酸酯基中的氧原子，"S"代表硫原子<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表18所示，6、18、27和33碱基的GT序列以及15碱基的ACG序列不抑制EL-4鼠细胞的增殖。A20鼠白血病B细胞是一种悬浮肿瘤模型。将A20鼠白血病B细胞与6碱基的GT序列一起培养(表19)。表19A20鼠B白血病细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表19所示，6碱基的GT序列抑制A20鼠B白血病细胞的增殖。实施例15犬癌细胞增殖的抑制D-17犬骨肉瘤细胞和CF-51犬乳腺癌细胞是实体肿瘤模型。将D-17犬骨肉瘤细胞(5xl05个细胞/ml)(表20)和CF-51犬乳腺癌细胞(5x10s个细胞/ml)(表21)与6、9、17、27和33碱基的GT序列并与15碱基的ACG序列一起培养。表20D-17犬骨肉瘤细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。表21CF-51犬乳腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如表22所示，人癌细胞比犬癌细胞和鼠癌细胞对6碱基的GTSEQIDNO:25产生的增殖抑制作用更敏感。两种6碱基的GT序列对增殖抑制的协同作用将Jurkat人白血病T细胞与次最佳浓度(5.0g/ml)的6碱基的GT序列一起培养(表23)。表23Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>注.-表中"bases"为"碱基"。如表23所示，同时使用两种6碱基的GT序列具有协同抑制JurkatT细胞增殖的作用。实施例18对化疗剂抗肿瘤作用的增强在0、0.1、1.0或10.0pg/ml的5-氟尿嘧啶或顺铂的存在下，将Jurkat人白血病T细胞与1.0(ig/ml6碱基的GTSEQIDNO:25和27碱基的GTSEQIDNO:1—起培养(表24)。5-氟尿嘧啶是一种干扰DNA和RNA合成的抗代谢剂。顺铂是一种交联DNA并抑制DNA前体的烷基化试剂。表24Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表24所示，6碱基的GTSEQIDNO:25和27碱基的GTSEQIDNO:1增强，并且GTSEQIDNO:25增强0.1禾n1.0jug/ml的顺铂对JurkatT细胞增殖的抗肿瘤作用。在0、0.1、1.0或10.0pg/ml的5-氟尿嘧啶或他莫昔芬的存在下，将MCF-7人乳腺癌细胞(5x1()5个细胞/ral)与.0网/ml的6碱基的GTSEQIDNO:25和27碱基的GTSEQIDNO:1—起培养。他莫昔芬是一种雌激素拮抗剂。表25MCF-7人乳腺癌细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如表25所示，6碱基的SEQIDNO:25增强0.1pg/ml5-氟尿嘧啶和0.1pg/ml他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的抗肿瘤作用。27碱基的SEQIDNO:1不增强5-氟尿嘧啶或他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的抗肿瘤作用。实施例19重复的6碱基的GTSEQIDNO:25对增殖的抑制将Jurkat人白血病T细胞与1、2、3和4重复的6碱基的GG(GT)《G(SEQIDNO:25)—起培养(表26)。表26Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表26所示，6碱基的GTSEQ.IDNO:25对JurkatT细胞增殖的抑制率为60%,而12碱基的GTSEQIDNO:68、18碱基的GTSEQIDNO:69和24碱基的GTSEQIDNO:70对JurkatT细胞增殖的抑制作用减弱。6碱基的GTSEQ.IDNO:25的熔化温度(Tm)为2.5°C，但GTSEQIDNO:68的熔融温度升至56.8°C,GTSEQIDNO:69的熔融温度为76.3°C，GTSEQIDNO:70的熔融温度为86.3°C。实施例20由BacillusCalmette-guerin(BCG)衍生的序列对增殖的抑制据报道，BCG衍生的序列抑制体内肿瘤的生长(Kataoka等，Jpn.J.CancerRes.83:244，1992)。另外据报道，当与IMC细胞预先混合并注射到CDF-1小鼠中时，A-2(SEQIDNO:72)和BCGA-4(SEQIDNO:74)对IMC肿瘤生长的抑制分别达88%和37%。将Jurkat人白血病T细胞与由BCG衍生的45碱基的序列一起培养(表27)。表27Jurkat人白血病T细胞增殖的％抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表27所示，BCG衍生的序列对JurkatT细胞增殖的抑制率S24%。实施例21细胞周期停滞的诱导使用CYCLETESTPLUSDNA市售检测盒(BectonDickinson)测定细胞周期阶段。概括地说，如下得到细胞的核将细胞膜溶于非离子洗涤剂中，用胰蛋白酶除去细胞的细胞支架和核蛋白，用RNA酶消化细胞RNA并用精胺稳定核染质。将碘化丙锭加到细胞核中并在安装有电子双重识别能力的流式细胞术(FACSCalibur，BectonDickinson,SanJose，CA)中分析它们的荧光。用M0DFITLT软件(VeritySoftwareHouseInc.,Topsham,MA)分析在细胞周期的G。/G,、早期S(SE)、中期S(SM)、晚期S(SL)或G2/M阶段积聚的细胞。将以指数生长的Jurkat人白血病T细胞(表28)和MCF-7人乳腺癌细胞(5x105个细胞/ml)(表29)与2、6、15、18、27和45碱基的包含A、C、G和T的序列一起培养。将细胞收集并离心，再测定细胞周期的阶段。表28JurkatT人白血病细胞的细胞周期停滞的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表28所示，在JurkatT细胞中，2、6和27碱基的GT序列诱导细胞周期的SE阶段停止，6碱基的CG和AGT，18碱基的GT和45碱基的BCGA-l序列诱导细胞周期的SM阶段停止，6碱基的AG序列诱导细胞周期的G。/G,阶段停止。表29MCF-7人乳腺癌细胞的细胞周期停滞的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表29所示，在MCF-7细胞中，2和6碱基的GT序列诱导细胞周期的SE阶段停止，6碱基的AGT序列和18碱基的GT序列诱导细胞周期的SM阶段停止。实施例22GTSEQIDNO:25、ACSEQIDNO:79和GTSEQIDNO:25+ACSEQIDNO:79诱导细胞周期停滞将Jurkat人细胞白血病T细胞(1X1()6个细胞/ml)与6碱基的GTSEQIDNO:25—起培养24小时，其中补充有6碱基的ACSEQIDNO:79和6碱基的GTSEQIDNO:25+6碱基的ACSEQIDNO:79。GTSEQIDNO:25禾nACSEQIDNO:79通过混合所述寡核苷酸(l:1)并在65。C加热10分钟进行杂交。作为对照，将GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79在65。C加热10分钟(表30)。表30Jnrkat人白血病T细胞的细胞周期停滞的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>如表30所示，6碱基的GTSEQIDNO:25诱导细胞周期的SE阶段后期停止，而补充的6碱基的ACSEQIDNO:79对细胞周期没有影响。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79的杂交抵销GTSEQIDNO:25对细胞周期停滞的诱导作用。这些数据证明，为具有有效性，本发明的序列必须是单链的。实施例23细胞凋亡的诱导原生质膜磷脂酰丝氨酸的再分配和核基质蛋白(NuMA)的释放是正经历细胞凋亡的细胞的特征(Martin等，J.Exp.Med.，182:1545,1995;Miller等，Biotechniques，15:1042，1993)。使用FITC-结合的膜联蛋白V(BDPharmingen，SanDiego，CA)通过流式细胞术测定细胞凋亡期间原生质膜中磷脂酰丝氨酸的再分酉2。用市售的ELISA检测盒(Oncogen/Calbiochem，Cambridge,MA)测定释放到上清液中的NuMA。将Jurkat人白血病T细胞与50一的3、4、5、6禾B7GT碱基序列、5碱基的ACGT序列、6碱基的AG、GG、AGT和CGT序列以及7碱基的GG序列一起培养。表31显示出凋亡的细胞的百分数(对磷脂酰-丝氨酸/膜联蛋白V染色(PS/A-V)阳性的)和由细胞释放的％衡贴。表31JurkatT细胞白血病细胞的细胞凋亡的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表31所示，3、4、5和6碱基的GT、AG、CG和AGT序列诱导JurkatT细胞的细胞凋亡。5碱基的ACGT和6碱基的CGT以及GG序列不诱导JurkatT细胞的细胞凋亡。实施例24细胞内钙的增高(Ca2据报道，细胞内钙(Ca"的增高与细胞凋亡的诱导有关(Lam等，Mol.Endocrinol.7:686,1993)。用荧光探针Fluo-3-AM(CellPermaant，Molecular:Probes,Inc.,Eugene,OR)跟踪(Ca2+)i。Fluo-3-AM荧光增强则表示(Ca2+)i增高。将Jurkat人白血病T细胞与6碱基的GTSEQ.N0:25—起培养24小时。离心收集细胞，将其悬浮于含1%FBS的PBS中，并在37'C用10一Fluo-3-AM负载1小时。在488nm激发波长和530nm发射波长测定细胞荧光(FL1检测器)。在FACSCALIBUR上用程序Cel顧ST(BectonDickinson)分析数据。如附图1所示，JurkatT细胞与6碱基的GTSEQIDNO:25—起培养导致细胞荧光增强88%，表明(Ca"i增高了。实施例25细胞凋亡的诱导通过与细胞表面受体结合的配体引发细胞凋亡，所述配体包括，但不限于Fas(CD95)和肿瘤坏死因子(TNF)。与FasLigand结合的Fas和与TNFRec印tor1结合的TNF引发细胞内产生导致半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶(caspases)活化的引号。半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶引发致命的与核DNA-碎裂有关的细胞凋亡完成的蛋白水解级联反应、核基质蛋白(NuMA)的释放并细胞底物接触的丧失。将Jurkat人白血病T细胞(lx106/ml)与6和27GT碱基序列一起培养(表32)。如实施例23测定NuMA。表32Jurkat人白血病T细胞释放的呢NuMA<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>269注表中"bases"为"碱基"。如表32所示，使用6碱基的GTSEQIDNO:25的％NuMA释放大于使用27碱基的GTSEQIDN0s:1、2、3和4的％NuMA释放。实施例266碱基的GTSEQIDNO:25和6碱基的ACSEQIDNO:79对细胞凋亡的诱导将Jurkat人细胞白血病T细胞与6碱基的GTSEQIDNO:25—起培养24小时，其中补充有6碱基的ACSEQIDNO:79和6碱基的GTSEQIDNO:25+6碱基的ACSEQIDNO:79。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79通过混合所述序列(1:1)并在65。C加热10分钟进行杂交。作为X寸照，将GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79在65。C加热10分钟(表33)。如实施例23评价细胞凋亡。表33Jurkat人白血病T细胞的自田胞凋亡的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表33所示，6碱基的GTSEQIDNO:25诱导JurkatT细胞的细胞凋亡，但补充的6碱基的ACSEQIDNO:79对细胞凋亡没有影响。GTSEQIDNO:25和ACSEQIDNO:79的杂交抵销GTSEQIDNO:25的细胞凋亡的诱导作用。这些数据证明，为具有有效性，本发明的序列必须是单链的。实施例27草分支杆菌衍生的富含GT和富含AC的序列对增殖的抑制、细胞周期的停止和细胞凋亡的诱导作用将Jurkat人白血病T细胞与草分支杆菌的murA基因(GenBank:AccessionN咖berX99776)衍生的富含GT和富含AC的序列一起培养。如实施例3通过还原MTT测定增殖的抑制作用，如实施例21通过流式细胞术用碘化丙锭测定细胞周期的停止，以及如实施例23，通过流式细胞术用膜联蛋白-V-FITC评价细胞凋亡。表34Jurkat细胞增殖的抑制、细胞周期的停止和细胞凋亡的诱导<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表34所示，富含GT的SEQIDN0s:81、82和83抑制JurkatT细胞的增殖、诱导所述细胞的细胞周期停滞并诱导其细胞凋亡；但富含AC的SEQIDNO:15对JurkatT细胞的增殖、细胞周期停滞和细胞凋亡均没有抑制作用。实施例28GT序列对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的调节半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶识别3种主要的肽底物序列1)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-1、-4和-5)(SEQIDNO:84);2)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-2、一3和—7)(SEQIDNO:85);和3)lie—(Leu)-Glu—X—Asp(I(L)EXD;半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-8和-lO)(SEQIDNO:86)(Thornberry等，J.Biol.Chem.272:17907，1997)。蛋白质革巴中序列的识别导致革巴的有限的和特异性的蛋白水解，正如在第一个实施例中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3调节半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的活化；正如在第二个实施例中，分解的结构蛋白质耙包括，但不限于核纤层蛋白；或者正如在第三个实施例中，活化的酶包括，但不限于PARP。使用5'_(:2酰胺间隔区臂与标准酰胺-羧基水溶性carbohexiimide缀合技术(Guy等，J.Chromatography.B.Biomed.Sci.Appl.706:149，1998)合成的寡核苷酸，通过化学保护的GT序列或化学保护的AC序列与化学保护的选自NH2-YVAD-C00H(SEQIDNO:84)、NH2-DEVD-COOH(SEQIDNO:85)和NH2-IEGD-COOH(SEQIDNO:87)的序列化学共轭生成NH2-XXXD-COO-GT序列构成物。在共轭后，脱去反应性羧酸酯和反应性氨基的保护基。包括，但不限于NH厂YVAD-COO-GT;NH2-DEVD-COO-GT;禾卩丽2-I(L)EXD-COO-GT的肽-GT(本文称PGT)序列构成物被酶在D和GT之间的羧酸酯官能团处裂解，所述酶包括，但不限于半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶、与癌症转移有关的酶、胶原酶和金属蛋白酶。这类裂解导致半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶获得的GT序列从PGT中释放。由此产生的胞内半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性的增高可，例如提高化疗剂对多种药物耐药的癌细胞的疗效或者增强对弱抗原刺激的免疫反应。为测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化，使用制造商建议的条件，将对照组和处理组细胞洗涤、固定、渗透化并与识别活化形式的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的FITC-缀合抗体(Pharmingen，SanDiego，CA)—起培养。在FACSCALIBUR上，使用程序CellQUEST(BectonDickinson),通过流式细胞术分析与活化的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3有关的荧光。或者，采用基于与颜色指示分子硝基苯胺缀合的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶特异性的肽的分解分析，通过比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化，该分析是在405以分光光度分析法定量进行。实施例29GTSEQIDNOs:66、81、82和83以及AGC序列SEQIDNO:67对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的活化将JurkatT细胞白血病细胞与下列序列一起培养72小时33碱基的GTSEQIDNO:66;ll碱基的GTSEQIDNO:81(GTSEQIDNO:66的碱基1-11)、11碱基的GTSEQIDNO:82(GTSEQIDNO:66的碱基12-22)、11碱基的GTSEQIDNO:83(GTSEQIDNO:66的碱基23-33)和15碱基的ACGSEQIDNO:67。如实施例28，用FITC缀合抗体(Clone:C92-605)测定活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3(17-22kDa)。如附图2A所示，33碱基的GTSEQIDNO:66和11碱基的GTSEQIDN0s:81、82和83各自诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3，但15碱基的ACGSEQIDNO:67不诱导半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3。也可如实施例28，经比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化。如附图2B所示，在用33碱基的GTSEQIDNO:66和11碱基的GTSEQIDNOs:81、82和83处理的细胞中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活性比对照细胞中高105%、77%、100%和60%，但在用15碱基的ACGSEQIDNO:67处理的细胞中，半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化与对照细胞大致相同。实施例306碱基的GTSEQIDNO:25对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3活性的活化将JurkatT细胞白血病细胞与6碱基的GTSEQIDNO:25—起培养72小时。如实施例28，用比色法测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化。如附图3A所示，用6碱基的GTSEQIDM):25处理的细胞中半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3的活化比对照细胞中高323°/。。实施例31GTSEQIDNO:25对半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶-7的活化和PARP的分解将JurkatT细胞白血病细胞与6碱基的GTSEQIDNO:25—起培养72小时。细胞用PBS洗涤三次，用lOraM服PES(pH7.5，含5mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、1.5nM抑肽酶、10mM亮抑蛋白酶肽和2.5|im原钒酸钠)溶解并测定溶解物的蛋白质含量(BradfordJT.Anal.Biochem.72:248,訓)。通过蛋白质印迹分析测定活化的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7和PARP的分解。将溶解物与Laemmli缓冲液(LaernmUU.Nature15:680，1970)混合，振摇并与10(TC加热4分钟。将Fiftyjig蛋白质加到各泳道上，并在100V的恒定电压下(1.5h),用10%(半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶)或17%(PARP)月桂基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质。将分得的蛋白质在PVDF膜上进行电印迹。用丽春红染色该膜监测相同的蛋白质负载量。在4'C下用缓冲液将膜阻断过夜，所述缓冲液含有1%Tris-缓冲的盐水(2慮Tris-HCl，13.7mMNaCl，pH7.6和0.1%聚乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯(土温20)(TBST)+5%脱脂奶粉。洗涤该膜并在室温下与鼠单克隆IgG抗-半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7抗体(Pharmingen)(用TBST+1%BSA以1:1000稀释的)或者与鼠单克隆IgG抗-PARP抗体(用TBST+1%BSA以1:1000稀释的)(Pharmingen)—起培养1小时。用与辣根过氧化物酶(用TBST+59&脱脂奶粉以1:1000稀释的)(Pharmingen)缀合的羊抗鼠IgG测定与半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7或PARP结合的IgG。用加强的化学发光检测系统(ECL，Amersh柳,Corp.,Amersham,UK)展开印迹。如附图3B所示，6碱基的GTSEQIDNO:25诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原7(30kDa)转变为活性半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7(19-20kDa)以及活性PARP转变为失活的其85kDa降解产物。实施例32半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的正反馈放大将Jurkat人白血病T细胞与下列序列一起培养72小时NH2-YVAD-CO-GG(GT)GG、NH2-DEVD-CO_GG(GT)GG、NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG、NH厂YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC、NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC和NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC。测定半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的活化。NH2-YVAD-CO-GT、NH2-DEVD-CO-GT和NH2-IEGD-COO-GT各自诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3以及非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7，但NH2-YVAD-CO-ACG、NH2DVED-CO-ACG和NH2-IEGD-CO-ACG不诱导非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶原3转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3或者非活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7转化为活性的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7。虽不期望受到下列假设的限制，但据认为在含半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的细胞内，基础半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性调节半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶的释放，所述酶通过蛋白水解/水解NH2-XXXD-C00-GT构成物活化GT序列。这通过释放的半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活化的GT序列导致在细胞内半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶活性(半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸门冬氨酰蛋白酶7的水平增高)的正放大。实施例33诱导细胞因子的产生除非另有说明，在37°(:和5%C02中，将1x106个细胞与100叫/ml的各种测试序列一起培养48小时。在100]nl培养上清液中，用合适的市售ELISA(BioSource，CamarilloCA)测定细胞因子IL-6、IL-10、IL-12、IL-lp和TNF-a的产生(pg/ml)。IL-12ELISA测定IL-12p70络合物和游离p40亚基。结果以与对照细胞相比，处理的细胞产生的细胞因子的增加"倍数"(x)表示。将THP-l人急性单核细胞性白血病细胞与2、3、6、9、12、14、15和18碱基的GT序列一起培养并测定细胞因子IL-6的产生。(表35)。表35THP-l人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表35所示，2、3、6、9、12、14、15和18碱基的GT序列提高THP-l细胞产生的细胞因子IL-6的量。将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培养并测定细胞因子IL-12和IL-16的产生(表36)。表36THP-l人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>如表36所示，6碱基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列提高THP-1细胞产生的细胞因子IL-12和IL-6的量。表37概括了6碱基的序列对IL-12和IL-6合成的诱导。表376碱基序列诱导的IL-6和IL-12合成<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>据报道，BCG衍生的序列A-3(SEQIDNO:73)、A-4(SEQIDNO:74)、A-6(SEQIDNO:75)、A-7(SEQIDNO:76)、M3(SEQIDNO:77)和al(SEQIDNO:78)在体内活化NK细胞(Kataoka等，Jpn.J.CancerRes.83:244，1992)。将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与45碱基的BCG-衍生序列一起培养并测定细胞因子IL-12和IL-6的产生(表38)。表38TOP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的细胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。如表38所示，45碱基的BCG衍生的序列极轻微地提高THP-1细胞产生的IL-12和IL-6的量。实施例34磷酸二酯和硫代磷酸酯序列诱导IL-12的产生将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GT序列一起培养，所述序列具有作为磷酸酯基非桥接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并测定细胞因子IL-12的产生(表39)。表39THP-1急性单核细胞性白血病细胞产生的IL-12<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>GGTGGG-GG(TG),GG(6碱基)SEQIDN0:24磷酸二酯，硫代磷酸酯3.7x-0.lxGGGTGG-GG(GT),GG(6碱基)SEQIDNO:25磷酸二酯，硫代磷酸酯2.Ox0.(kTTGTTT-TT(GT),TT(6碱基)SEQIDNO:26磷酸二酯，硫代磷酸酯3.8x0.lx如表39所示，用硫原子(硫代磷酸酯)替代磷酸酯基上的非桥接氧原子(磷酸二酯)明显减少THP-1细胞产生的IL-12的量。将THP-1人急性单核细胞性白血病细胞与6碱基的GTSEQIDNO:25一起培养，所述序列具有作为磷酸酯基非桥接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并测定细胞因子IL-12的产生(表40)。表40THP-1人急性单核细胞性白血病细胞产生的IL-12序列*1增加G0G0G。T0G0G。-G。G。(G0T。)iG。G。；(oxygenatom:base1to6)SEQDNO:25-(6bases)2.0G。G。G,T。G。G。-G。G。(G,T。),G。G。；(oxygenatom:base1,2,4,5,6;sulfiiratombase3)SEQIDNO:25-(6bases)(UG。G。G。T,G。G。-G。G。(G。T,),G。G。；(oxygenatom:base1,2,3,5,6;sulfiiratoirbase4)SEQIDNO:25.(6bases)0.2xG0G。G,T,G。G。-G。G。(G,T,)iG0G。；(oxygenatom:base1,2,5,6;sulfiiratom:base3,4)SEQIDNO:25"(6bases)0.5xG,G。G。T。GoG,-G,G。(G。T。),GoG,;(oxygenatom:base2,3,4>5;sulfuratom:base1,6)SEQIDNO:25-(6bases)-O.lxG。G,G。T0G,G。-G0G,(G0T0)iG,G0;(oxygenatom:position1,3'4，6;sulftiratom:position2,5)SEQIDNO:25-(6bases)-O.lxG,G,G。T。G,G,-G,G,(GoTo),G,G,;(oxygenatom:position3,4;sulfiiratom:position1,2,5,6)SEQIDNO:25-(6bases)0G,G,G,T,G,G,-G,G,(G,T,)iG,G,;(sulfiiratom:position1to6)SEQIDNO:25(6bases)0注表中"oxygenatom"为"氧原子"；"bases"为"碱基";"sulfuratom"为"硫原子"；"position"为"位置"。*注"O"代表磷酸酯基中的氧原子，"S"代表硫原子如表40所述，用硫原子(硫代磷酸酯)替代6碱基的GTSEQIDNO:25中的非桥接氧原子(磷酸二酯)明显减少THP-1细胞产生的IL-12的量。实施例35刺激人周围血单核细胞中细胞因子的合成用Ficoll-Hypaque(AmershamPharmaciaBiotech,Baied'Urfee，Quebec,Canada),通过密度梯度离心全血，从7名健康的人分离周围血单核细胞(下文称"PBMCs")。将PBMCs与6碱基的GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培养并测定细胞因子IL-1卩、IL-6、IL-10和IL-12的产生。表41人PBMC产生的细胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>注表中"bases"为"碱基"。实施例36通过黑猩猩外周血液单核细胞合成细胞因子如实施例35所述从4只健康的黑猩猩中分离PBMCs。将PBMCs与6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培养，并测定细胞因子IL-10、IL-12和TNF-a的生成(表41)。表41通过黑猩猩PBMC生成细胞因牙<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>注表中"bases，，为"碱基"。如表41所示，6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了黑猩猩PBMC细胞生成细胞因子IL10和IL-12以及TNF-a。实施例37通过恒河猴外周血液单核细胞合成细胞因子如实施例35所述从4只健康的恒河猴中分离PBMCs。将PBMCs与6碱基GT、AGT'、CGT、AG、CG和GG序列一起培养，并测定细胞因子IL-10、IL-12和TNF-a的生成(表42)。表42通过恒河猴PBMC生成细胞因子<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如表42所示，6碱基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了恒河猴PBMC细胞生成细胞因子ILIO、IL-12以及TNF-a。实施例386碱基GTSEQIDNO:25+5-氟尿嘧啶和6碱基GTSEQIDNO:25+他莫昔芬中的6碱基GTSEQIDNO:25对MCF-7人乳腺肿瘤的影响将MCF-7人乳腺癌细胞作为异种皮移植物皮下植入到雌性裸BALB/c小鼠中。将小鼠分成6组，每组10只。在第0天，第l组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受6碱基GTSEQIDNO:25，第3组小鼠接受5-氟尿嘧啶，第4组小鼠接受他莫昔芬，第5组小鼠接受6碱基GTSEQIDNO:25+5-氟尿嘧啶，第6组小鼠接受6碱基GTSEQIDN0:25+他莫昔芬。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第1组小鼠具有最大的肿瘤质量，第2、3和4组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小，第5和6组小鼠的肿瘤质量比第l、2、3和4组小鼠小。实施例393和6碱基GT序列和45碱基BCGA-3序列对LNCaP人前列腺癌肿瘤的影响将LNCaP人前列腺癌细胞作为异种皮移植物皮下植入到雄性裸nu/nu小鼠中。将小鼠分成5组，每组10只小鼠。在第0天，第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受3碱基SEQIDN0:8，第3组小鼠接受6碱基GTSEQIDN0:25，第4组小鼠接受6碱基AGSEQIDN0:45,第5组小鼠接受45碱基BCGA-3SEQIDN0:69。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第1组小鼠具有最大的肿瘤质量，第5组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小，第2、3和4组小鼠的肿瘤质量比第1和5组小鼠小。实施例413、6、8和27碱基序列对EL-4鼠T淋巴瘤的影响将EL-4鼠T淋巴细胞植入到C57/BL6小鼠体内。将小鼠分成6组，每组10只小鼠。在第0天，第l组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受3碱基GTSEQIDN0:8，第3组小鼠接受6碱基SEQIDNO:25，第4组小鼠接受6碱基AGSEQIDNO:45，第5组小鼠接受18碱基GTSEQIDNO:18,第6组小鼠接受27碱基GTSEQIDN0:1。治疗4周后，将小鼠处死，并测定肿瘤质量。第l组小鼠具有最大的肿瘤质量，第2、3、4、5禾n6组小鼠的肿瘤质量比第1组小鼠小。实施例42将人结肠癌细胞系作为粘着细胞培养物维持。将处于指数生长期的细胞用2—20碱基GT、GA、GC或GG序列以Oug/ml—100"1/ml的剂暈处理24—72小时。通过MTT还原测定对细胞增殖的抑制，通过流动血细胞计数测定细胞周期停滞，通过膜联蛋白-V结合或NuMA释放测定细胞凋亡。在结肠癌细胞系中，GT、GA、GC或GG序列抑制增殖，诱导细胞周期停滞，并诱导细胞凋亡。用盐水或者用在体外具有抗人结肠直肠癌细胞系的抗癌活性的2—20碱基GT、GA、GC或GG序列治疗皮下携带人结肠直肠癌细胞系的SCID小鼠。用在体外具有抗人结肠直肠癌细胞系的抗癌活性的2—20碱基GT、GA、GC或GG序列治疗的小鼠的肿瘤质量比用盐水治疗的小鼠显著减小。虽然已经详细描述了本发明，并提供了其具体实施方案，但是显然本领域技术人员可在不背离其实质和范围的情况下对其作各种改变和改进。序列表<no>拜昂尼科生命科学有限公司<120>治疗用合成寡核苷酸<130>OIUS0811888<150>60/170,325<151>1999-12-13<150>60/228,925<151>2000-08-29<160>87<170>Patentlnversion3.0<210>1<21>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>Igt卿gtgt卿g鹏gtgtgtg27<210>2<2U>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>2gggtgggtgggtgggtgggtgggtggg27<2103<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>3gggggtgggggtgggggtgggggtggg27<210>4<2>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>4g鹏gg魄ggggg魄ggggggtggg27<210>5<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>5tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt27<210>6<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>6tctctctctctctctctctctctctct27<210>7<211>3<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>7tgt3<210>8<211>3<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>8gtg3<210>9<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>9魄tg<210>10<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>10g鹏<210>11<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>11tgtg,<210>12<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>12魄鹏g<210>13<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>13tgtgtgtgtgtg<210>14<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>14gtgtgtgtgtgt<210>1512<211>14<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>15,gtgtg柳14<210>16<211>15<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>16g眺t卿gtgtg15<210>17<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>17t卿gtgtg卿gtg18<210>18<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>18gt卿卿gtgt卿18<210>19<211>21<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>19tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt2〗<210>20<211>21<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>20gt魄鹏gt卿gtgtg21<210>21<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>21t卿卿gt卿gtgtgtgtg24<210>22<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>22gt卿gtgtgt卿gtgt卿24<210>23<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>23tttgtt6<210>24<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>24ggtggg6<210>25<211>6<22>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>25gggtgg6<210>2654<211>6<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>26ttgttt<210>27<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>27<210>28<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>28ccgtcc<210>29<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>29tggttg<20>30<211>6<2I2>DNA<213>合成寡核苷酸<400>303tgtat<210>31<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>31鹏ga6<210>32<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>32gagtga6<210>33<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>33gggtct6<210>34<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>34c鹏g6<210>35<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>35鹏tcc6<210>36<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>36ctgtct6<210>3756<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>37tcgttc6<210>38<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>38cggtgc6<210>39<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>39ttgtgg6<210>40<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>40gggttt6<210>41<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>41ggttggG<210>42<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸57<400>42ggaagg<210>43<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>43ggccgg<210>44<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>44gggggg<210>45<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>45gggagg<20>46<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>46gggcgg<210>47<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>47ggaggg<210>48<21I>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>48gtgggg^<210>49<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>49ttaggg6<210>50<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>50gt2<210>51<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>51tg2<210>52<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>52魄g4<210>53<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸59<400>53ttgt<210>54<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>54卿<210>55<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>55ttgg<210>56<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>56g魄<210>57<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>57tgtt<210>58<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>58ggtt<210>5944444460<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>59tgtg4<210>60<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>60ggtgg5<210>61<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>61gggtg5<210>62<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>62ggg魄g:<210>63<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>63gggtggg:<210>64<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸61<柳>64tgggtgg<210>65<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>65gggtggt<210>66<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>66卿卿gtgtgt卿gt卿gtg<210>67<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>67gggtgggtgggtgggtgggtgggtggg<210>68<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>68gggggtgggggtgggggtgggggtggg<210>69<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<柳>69gggggggtgggggggtgggggggtggg<210>70<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>70tgtgtg6<210>71<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>71gtgtgt6<210>72<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>72卿t6<210>73<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>73鹏ggG<210>74<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>74gggtgg6<210>75<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸63<400>75ttgttt6<210>76<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>76gccgagaaggtgcgcaacctgccggctggccacggactgaacgct45<210>77<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>77acgccgacgtcgtctgtggtggggtgtctaccgccaacgcgacgg45<210>78<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>78cgactacaacggctgggatatcaacaccccggcgttcgagtggta45<210>79<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>79ccaccc6<210>80<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>80cggta5<210>8164<211>11<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>81卿gtttggt11<210>82<211>U<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>82ggttttgtttg11<210>83<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>83ttgttttttttg12<210>84<211>4<212>PRT<213>合成肽<柳>84TyrValAiaAsp1<210>85<211>4<212>PRT<213>合成肽<柳>85AspGluValAsp1<210>86<211>5<212>PRT<213>合成肽65<220><221>SITE<222>(4)..(4)<223>X=任意氨基酸<400>86lieLeuGluXaaCys<210>.87<211>4<212>PRT<213>合成肽<400>87lieGluGlyAsp权利要求1.包含具有选自SEQIDNOs7-18、22-66、70-75、79和80-83序列的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸的组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。2.根据权利要求l所述的应用，其中，所述序列选自SEQIDNOs:7、8、9、10、22-65、70-75、79和80。3.根据权利要求l所述的应用，其中，所述组合物还包含可药用载体。4.根据权利要求l所述的应用，其中，所述组合物还包含化疗剂。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述化疗剂选自抗代谢剂、烷化剂和激素拮抗剂。6.根据权利要求l所述的应用，其中，所述癌症选自原发性癌症、继发性癌症、原发性肉瘤和继发性肉瘤。7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和骨癌。全文摘要本发明提供一种包含2-20个碱基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)的组合物和方法，所述寡核苷酸选自(G_xT_y)_n、(T_yG_x)_n、a(G_xT_y)_n、a(T_yG_x)_n、(G_xT_y)_nb、(T_yG_x)_nb、a(G_xT_y)_nb、a(T_yG_x)_nb，其中x和y是1-7的整数，n是1-12的整数，a和b是一个或多个As、Cs、Gs或Ts，其中所述序列诱导选自下列的反应诱导细胞周期停滞、抑制增殖、活化癌细胞中的半胱氨酸门冬氨酰特异性蛋白酶和诱导癌细胞的细胞凋亡以及刺激免疫系统细胞产生细胞因子。文档编号A61P35/00GK101491536SQ200810174018公开日2009年7月29日申请日期2000年12月12日优先权日1999年12月13日发明者奈杰尔·C·菲利普斯,马里翁·C·菲利翁申请人:拜昂尼科生命科学有限公司