专利名称：：复方消炎利胆制剂的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及中药的质量控制领域，具体涉及一种含穿心莲、溪黄草和苦木三味中药的复方消炎利胆制剂的质量控制方法。
背景技术：
：中药指纹图谱是指某种或某几种中药材具有的特征性成分的色谱或光谱的图谱，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。随着中医中药的广泛推广，指纹图谱作为中药材及其提取物质量控制方法，目前已为国际所共识。但目前中药指纹图谱往往仅涉及单味药材或单方制剂的研究，对多种中药材配伍组成的中成药复方制剂的指纹图谱研究仍处于起步阶段。“消炎利胆”制剂为纯中药复方制剂，是一种治疗慢性胆囊炎、胆道炎的常用中药，属于国家中药保护产品。其组方由穿心莲(Andrographispaniculata)、溪黄草(Rabdosialophanthoidesvar.gerardiana)、苦木(Picrasmapuassioides)三味药材组成，具有清热、祛湿、利胆的功效，用于肝胆湿热引起的口苦、胁痛；急性胆囊炎、胆管炎，临床疗效确切。主药穿心莲，又名一见喜，为爵床科穿心莲属植物，具有清热解毒、凉血消肿等多种功效(中外健康文摘·医药学刊，2007，4，163-164)，临床上可治胆囊炎、咽喉肿痛等热毒炎症；溪黄草，为唇形科香茶菜属植物，具有清热利湿，凉血散瘀，清肝利胆，退黄等功效，用于治疗湿热泻痢，跌打瘀肿，急性黄疸型肝炎，急性胆囊炎等疾病(时珍国医国药，2003，14，498-500)；苦木，为苦木科苦木属植物，具有清热，祛湿，解毒的功效，用于风热感冒，咽喉肿痛，腹泻下痢，湿疹，疮疖，毒蛇咬伤(《中华人民共和国药典》2000年版)。以上药物皆具有苦寒药性，相互配伍后清热解毒、祛湿利胆功效显著。对各种胆道疾病有明显的消炎、止痛、退黄、退热作用，尤其对急、慢性胆囊炎，胆结石并发炎症等疗效显著。目前全国有133家药厂(国家食品药品监督管理局官方网站，http://app1.sfda.gov.cn/datasearch/face3/base.jsp？tableId＝25&tableName＝TABLE25&title＝国产药品&bcId＝118102890099723943731486814455)在生产该产品，其制剂主要为片剂和胶囊剂。但是，到目前为止，由穿心莲、溪黄草、苦木三味中药组成的复方消炎利胆制剂的质量控制鉴别方法落后，《中华人民共和国药典》1995年版1997增补版及卫生部药品标准中药成方制剂第十册(WS3-B-2023-95)中对复方消炎利胆片仅采用试管反应进行鉴别。而含量测定方法也仅有测定来源于穿心莲中的穿心莲内酯含量的规定，没有其余两味组成中药(苦木、溪黄草)特征成分的含量测定要求。仅以穿心莲内酯作为指标性成分，无法全面评价复方消炎利胆制剂的质量。“2010年药典编制大纲”提出中药材及中成药应“逐步由单一指标性成分的定性、定量测定，向活性、有效成分及生物测定的综合检测模式过渡，向多成分和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化”。其中，在对鉴别的技术要求中指出，所采用的色谱特征图谱，“应至少指认其中3个以上的有效成分、特征成分或主成分并对其比例作出规定，而指认峰的峰面积之和应大于总峰面积的50％。”(参见2010年版《中华人民共和国药典》一部提取物质量标准起草技术要求)。为此，有必要建立一种方法简便、稳定、精密度高的指纹图谱，用以科学、有效地控制复方消炎利胆制剂的质量。该指纹图谱应具有以下几个特点1、至少应指认出指纹图谱中3个以上的色谱峰，指认色谱峰的峰面积之和应大于总峰面积的50％；2、指认的色谱峰应能覆盖复方中的组成中药；3、指认的色谱峰中应当覆盖与组方功效大体相应的活性成分。
发明内容为解决现有技术存在的问题与不足，本发明的主要目的在于基于含穿心莲、溪黄草和苦木三味中药的复方消炎利胆制剂的指纹图谱建立一种简便、稳定、精密度高的质量控制方法。本发明的目的通过下列技术方案实现本发明提供的含穿心莲、溪黄草和苦木三味中药的复方消炎利胆制剂的质量控制方法，采用反相高效液相色谱法建立了复方消炎利胆制剂标准指纹图谱，通过检测复方消炎利胆制剂的供试指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.8来控制复方消炎利胆制剂的质量。该图谱包含15个主要色谱峰，其中8个色谱峰的化学结构已经被准确指认，以穿心莲内酯色谱峰的保留时间为1计算15个主要色谱峰的相对保留时间，并计算各色谱峰峰面积占指纹图谱总峰面积百分比，分别为1号峰0.118±0.001，3.08±0.04％；2号峰0.172±0.001，1.81±0.02％；3号峰0.322±0.002，3.71±0.06％；4号峰0.751±0.002，3.65±0.37％；5号峰0.782±0.001，3.77±0.11％；6号峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；7号峰0.876±0.001，3.73±0.06％；8号峰0.934±0.002，5.80±0.13％；9号峰1.000，25.40±0.26％，穿心莲内酯；10号峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木碱己；11号峰1.096±0.001，4.89±0.21％，异穿心莲内酯；12号峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心莲内酯苷；13号峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷；14号峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脱水穿心莲内酯；15号峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心莲内酯。以上的复方消炎利胆制剂的质量控制方法，具体包括以下的步骤a、复方消炎利胆制剂标准指纹图谱的建立取中药穿心莲、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加热提取二次，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黄草150g剪碎，加水煎煮二次，合并滤液，滤过，煎液浓缩至适量，加5倍量70％乙醇，摇匀，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到9g浸膏。分别取上述穿心莲和苦木混合稠膏5g和溪黄草稠膏1.03g，合并，加入100mL70％的甲醇，超声溶解，取4mL过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液1.5mL用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，续滤液配制成终浓度为20mg/mL的供试品溶液；取穿心莲内酯对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有穿心莲内酯1mg的溶液，即得穿心莲内酯的对照品溶液；分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；以穿心莲内酯的色谱保留时间为1计算各色谱峰的相对保留时间及各色谱峰面积的百分比，得到如上所述的标准指纹图谱；b、复方消炎利胆制剂指纹图谱的建立取待测复方消炎利胆制剂20粒，若有糖衣除去糖衣，研细，分别取内容物1g，加入20mL70％的甲醇，超声提取两小时，取1mL过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，续滤液配制成浓度为20mg/mL的供试溶液；穿心莲内酯对照品溶液按步骤a所述制备；按步骤a所述条件对上述供试品和对照品溶液进行色谱分析，记录色谱图；以穿心莲内酯的色谱保留时间为1计算各色谱峰的相对保留时间及峰面积，得到供试指纹图谱；c、供试复方消炎利片指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.8。上述步骤a和b中，发明人经过反复实验，确立了较佳的色谱条件采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.02％三氟乙酸的甲醇—水溶液作为流动相，连续梯度洗脱0min时，流动相A为80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min时，流动相A为30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速为0.8mL/min；检测波长为225nm；柱温为40℃；进样体积10μL；以穿心莲内酯计算，理论塔板数不低于200000此条件下得到的标准指纹图谱包含15个主要色谱峰，发明者还利用公知的现代色谱分离手段，富集并分离得到了该标准指纹图谱中的8个主要色谱峰，并利用核磁共振波谱、多级质谱等手段，结合文献，鉴定了上述8个化合物的结构。8个主要色谱峰分别是6号峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；9号峰1.000，25.40±0.26％，穿心莲内酯；10号峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木碱己；11号峰1.096±0.001，4.89±0.21％，异穿心莲内酯；12号峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心莲内酯苷；13号峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷；14号峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脱水穿心莲内酯；15号峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心莲内酯。上述化学结构已经被准确指认的色谱峰的峰面积总和占总峰面积的68％。标准指纹图谱的15个色谱峰中的1号峰、3号峰、5号峰、7号峰、8号峰、9号峰、11号峰、12号峰、13号峰、14号峰、15号峰来源于组方中药穿心莲，2号峰、4号峰、6号峰来源于组方中药溪黄草，10号峰来源于组方中药苦木。发明者进而采用脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(nitricoxide，NO)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)抑制活性模型及15-酯氧酶(15-lipoxygenase，15-LO)抑制活性模型，对来源于组方中药穿心莲中的特征性成分穿心莲内酯，溪黄草中的特征性成分迷迭香酸进行活性评价，试验结果表明穿心莲内酯对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放NO、TNF-α及IL-6有明显的抑制活性，迷迭香酸对15-LO的释放具有明显的抑制活性；而苦木中的特征性成分苦木碱己根据文献报道其具有很强的环磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)抑制活性(ChemicalandPharmaceuticalBulletin1984，32，1872-1877)。一氧化氮(NO)是由精氨酸胍基氮经过一氧化氮合成酶(NOS)的催化氧化而形成的。在脂多糖等的诱导下NOS的一种亚型iNOS会产生NO，NO不但参与了炎症疾病的发生，而且能够促进前列腺素E2等炎症介质的释放(中国风湿病学杂志1999，3，191-193)，介导和调节包括炎症在内的多种生理和病理过程(中国药理学通报1992，8，409-415)。肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种内源性化学因子，主要是由活化的单核巨噬细胞产生。受到刺激后，T细胞能够活化自然杀伤细胞(NK细胞)和肥大细胞并使其分泌TNF-α，血管内皮细胞在一定条件下也具有产生和释放TNF-α的能力(中国临床康复2005，27，123-125)。TNF-α参与多种炎症反应的过程，而且许多报道显示TNF-α诱导细胞的转变、聚合和肿瘤的发生(Nature2005，435，752-753；Cytokine&GrowthFactorReviews2002，13，135-141；Lancet2001，357，539-545；Nature2004，431，405-406)。白细胞介素-6(IL-6)也是一种内源性化学因子，它是急性炎症反应的一种重要介质，而且它是一种多功能的细胞因子。IL-6的异常表达与许多自身免疫性疾病和肿瘤的发病机制及发展进程相关(国外医学药学分册2006，33，81-85)。15-酯氧酶(15-LO)是花生四烯酸(AA)脂氧酶代谢途径的关键酶。而花生四烯酸(AA)是生物合成前列腺素(PGs)、血栓素合成酶(TXs)和白三烯(LTs)的主要前体。炎症发生时，细胞膜上的花生四烯酸(AA)在环氧化酶和脂氧化酶的作用下产生一系列具有生理活性的脂类介质，主要包括前列腺素PGE2和白三烯LT4，引起炎症反应。环磷酸腺苷(cAMP)参与调节体内多种细胞活动，是生命的重要调节物质(TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation1970，214，1281-1288)，它的变化又与多种疾病有关(NucleotidesinDisease1975，UniversityParkPress，Baltimore)，近代药理表明其能够抑制炎症细胞释放组胺、溶酶体酶、氧自由基和某些炎症介质(Therapies2002，57，163-168；Pharmacology，1989，39，19-27)。而环磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)是环磷酸腺苷(cAMP)的不可逆性水解酶(JournalofPharmaceuticalSciences1975，64，1-37)，抑制环磷酸腺苷磷酸二酯酶(PDE)可以显著降低血浆中环磷酸鸟苷(cGMP)含量，提高cAMP含量，从而起到抗炎的作用。抑制NO、TNF-α、IL-6等炎症介质的释放以及抑制15-LO、PDE等与炎症相关的酶的活性都可以治疗多种炎症疾病。炎症介质以及引起炎症的相关酶已经成为研究炎症最重要的药物靶点，寻找活性强、毒性小的抑制剂日益成为人们开发新的抗炎药物所关注的热点。鉴于穿心莲内酯、迷迭香酸、苦木碱己三种抗炎成分的作用，本发明的质量控制方法进一步还可以包括将穿心莲内酯、迷迭香酸、苦木碱己或它们的组合作为指标性成分进行含量测定的步骤。本发明提供的由穿心莲、溪黄草、苦木三味中药组成的复方消炎利胆制剂的质量控制方法的用途包括1、制定了对由穿心莲、溪黄草、苦木三味中药组成的复方消炎利胆制剂进行质量控制的鉴别方法；2、对由穿心莲、溪黄草、苦木三味中药组成的复方消炎利胆制剂，选择了高效液相指纹图谱中的特征性、活性组分色谱峰，可以作为进一步建立复方消炎利胆制剂中抗炎成分含量测定方法的基础，用以控制复方消炎利胆制剂的质量。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果1、通过供试指纹图谱与标准指纹图谱的对比，可方便的控制产品的质量的稳定性，均一性。2、在含15个色谱峰的标准指纹图谱中8个色谱峰的化学结构已被确认，有利于对有效成分的进一步研究和利用。3、发现了穿心莲内酯、迷迭香酸和苦木碱己的抗炎活性，可选择它们作为指标性成分进行含量测定控制。4、本发明的质量控制方法重现性好、稳定性高、精密度优异且操作简便。图1是复方消炎利胆制剂的高效液相标准指纹图谱；图2是复方消炎利胆制剂的高效液相标准指纹图谱的重现性；图3是相同色谱条件下，各色谱峰单体化合物的高效液相图谱；图4是市售复方消炎利胆制剂的高效液相指纹图谱相似度。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。实施例1复方消炎利胆制剂高效液相标准指纹图谱的建立取中药穿心莲、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加热提取二次，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黄草150g剪碎，加水煎煮二次，合并滤液，滤过，煎液浓缩至适量，加5倍量70％乙醇，摇匀，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到9g浸膏。分别取上述穿心莲和苦木混合稠膏5g和溪黄草稠膏1.03g，合并，加入100mL70％的甲醇，超声溶解，取4mL过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液1.5mL用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，总损失率约为17％，续滤液配制成终浓度为20mg/mL的供试品溶液，根据上述供试品溶液的配置方法，配置6份终浓度为20mg/mL的复方消炎利胆制剂供试品溶液；取穿心莲内酯对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有穿心莲内酯1mg的溶液，即得穿心莲内酯的对照品溶液；分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图。液相色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；采用连续梯度洗脱，流动相A为含有0.02％三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.02％三氟乙酸的甲醇溶液；梯度洗脱程序如下0min时，流动相A为80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min时，流动相A为30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速为0.8mL/min；检测波长为225nm；柱温为40℃。获得的复方消炎利胆制剂的高效液相标准指纹图谱有15个主要色谱峰(如图1)，以穿心莲内酯的色谱保留时间为1计算的各色谱峰的相对保留时间，分别为0.118±0.001、0.172±0.001、0.322±0.002、0.751±0.002、0.782±0.001、0.867±0.001、0.876±0.001、0.934±0.002、1.000(穿心莲内酯)、1.016±0.003、1.096±0.001、1.118±0.001、1.158±0.001、1.355±0.002、1.382±0.002，各色谱峰相对保留时间的相对偏差均小于1.0％(见表1)，表明采用该方法所获得的高效液相指纹图谱具有较好的重现性(见图2)，同时计算了各色谱峰的峰面积百分比(见表2)。以穿心莲内酯计算，理论塔板数不低于200000。表1复方消炎利胆制剂高效液相指纹图谱相对保留时间重现性表2复方消炎利胆制剂高效液相指纹图谱中15主要色谱峰峰面积百分比实施例2色谱峰的分离及结构鉴定分别对组成复方消炎利胆制剂的三味中药穿心莲、苦木、溪黄草进行提取分离。取穿心莲60％乙醇提取物500g，加水混悬，分别用环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。对乙酸乙酯浸膏部位进行硅胶柱分离，以氯仿:甲醇溶剂系统进行梯度洗脱(100:0，99:1，98:2，95:5，90:10，80:20，50:50，0:100)。将洗脱得到的相似部分进行合并，得到APE-1至APE-10共十个部分。分别对各部分进行反复硅胶柱层析，分离得到了化合物II、IV～VIII。取溪黄草60％乙醇提取物600g，加水混悬，对其进行大孔树脂HP-20柱分离，以水/乙醇溶剂系统进行梯度洗脱(0％、30％、50％、70％、95％)，得到XHC-1至XHC-5共五个部分。对XHC-2进行反向ODS柱，凝胶HW-40柱，以及制备高效液相柱层析，分离得到化合物I。取苦木60％乙醇提取物100g，加水混悬，用等体积的氯仿萃取。将萃取得到的浸膏60g进行硅胶柱分离，以环己烷乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，其中环己烷乙酸乙酯(1:1)洗脱馏分在甲醇中析出结晶，得到化合物III。通过理化常数和现代波谱学手段(MS、NMR)，结合文献相关数据，鉴定了这些化合物的结构。所获得的各化合物的结构如下表3所示表3指纹图谱中所指认的各化合物结构所获得的各化合物的物理化学常数如下化合物I(迷迭香酸)白色无定形粉末，ESI-MSm/z405[M-H+2Na]+，359[M-H]-，推测其分子量为360，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C18H16O8。化合物I的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(云南植物研究，1987，9，407-411)报道的迷迭香酸(Rosmarinicacid)一致，故鉴定化合物I为迷迭香酸，其13C-NMR数据见表4。表4化合物I的13C-NMR数据(DMSO-d6)化合物II(穿心莲内酯)无色针状结晶(甲醇)，mp229-231℃。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。IR(KBr)cm-13397(OH)，1726(C＝O)，1508，1454(C＝C)。ESI-MSm/z349[M-H]-，373[M+Na]+，推出化合物分子量为350，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C20H30O5。化合物II的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的穿心莲内酯(Andrographolide)一致，故鉴定化合物II为穿心莲内酯，其13C-NMR数据见表6。化合物III(苦木碱己)淡黄色针状结晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈橙红色，提示为生物碱。ESI-MSm/z267[M+H]+，265[M-H]-，推出化合物分子量为266，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C15H10N2O3。UV图谱显示243nm和281nm处最大吸收峰。化合物III的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1985，33，5239-5244)报道的苦木碱己(4-Methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one)一致，故鉴定化合物III为苦木碱己，其13C-NMR数据见表5。表5化合物III的13C-NMR数据(CDCl3)化合物IV(异穿心莲内酯)无色片状结晶(甲醇)，mp207-209℃。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。IR(KBr)cm-13334(OH)，1752(C＝O)，1676(C＝C)。ESI-MSm/z349[M-H]-，373[M+Na]+，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C20H30O5。化合物IV的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的异穿心莲内酯(Isoandrographolide)一致，故鉴定化合物IV为异穿心莲内酯，其13C-NMR数据见表6。化合物V(14-去氧穿心莲内酯苷)无色片状结晶(甲醇)，mp199-201℃。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。IR(KBr)cm-13477(OH)，1751(C＝O)，1648(C＝C)。ESI-MSm/z495[M-H]-，519[M+Na]+，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C26H40O9。化合物V的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的14-去氧穿心莲内酯苷(Deoxyandrographiside)一致，故鉴定化合物V为14-去氧穿心莲内酯苷，其13C-NMR数据见表6。化合物VI(14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷)白色粉末(甲醇)。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。UV图谱显示219nm和250nm处最大吸收峰。ESI-MSm/z493[M-H]-，517[M+Na]+，结合1H-NMR、13C-NMR谱数据可推测其分子式为C26H38O9。化合物VI的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷(14-Deoxy-11，12-dihydroandrographiside)一致，故鉴定化合物VI为14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷，其13C-NMR数据见表6。化合物VII(脱水穿心莲内酯)无色针状结晶(甲醇)，mp203-204℃。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。IR(KBr)cm-13431(OH)，1740(C＝O)，1638(C＝C)。ESI-MSm/z331[M-H]-，355[M+Na]+，结合1H-NMR、13C-NMR数据可推测其分子式为C20H28O4。化合物VII的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的脱水穿心莲内酯(14-Deoxy-11，12-dihydroandrographolide)一致，故鉴定化合物VII为脱水穿心莲内酯，其13C-NMR数据见表6。化合物VIII(新穿心莲内酯)无色片状结晶(甲醇)，mp202-204℃。Legal和Kedde反应显红色，提示可能存在α，β-不饱和内酯结构。IR(KBr)cm-13449(OH)，1748(C＝O)，1648(C＝C)。ESI-MSm/z479[M-H]-，503[M+Na]+，结合1H-NMR、13CNMR数据可推测其分子式为C26H40O8。化合物VIII的1H-NMR、13C-NMR数据与文献(ChemicalandPharmaceuticalBulletin，1994，42，1216-1225.)报道的新穿心莲内酯(Neoandrographolide)一致，故鉴定化合物VIII为新穿心莲内酯，其13C-NMR数据见表6。上述分离得到的各单体化合物，采用实施例1中建立的色谱条件，参照国家药典附录中规定的反相高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图(见图3)。实施例3穿心莲内酯对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放NO、TNF-α及IL-6的抑制活性一.对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的抑制活性实验小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(ATCCTIB-71)培养于含10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素钠(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培养液中，37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育生长。由于NO极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(NO2-)，故采用Griess法测定样品中NO2-的浓度作为衡量NO水平的指标。Griess试剂A0.1％N-萘乙二胺盐酸盐(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶于水中；Griess试剂B1％对氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5％H3PO4中。使用前等体积混合试剂A和B。用RPMI1640培养液将RAW264.7细胞稀释至5×105cells/mL浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(终浓度1μg/mL)和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(加入LPS，但不加入测试样品，对NO释放的抑制率为0％)和空白对照组(不加入LPS和测试样品，仅加入0.4μLDMSO，对NO释放的抑制率为100％)，每个样品设4个平行孔。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24h，吸取100μL培养液上清至酶标板中，离心(1000×g，4℃，3min)，加入100μLGriess试剂，室温避光反应10min，于酶标仪测定其540nm处的吸光值。用浓度分别为1、5、10、50μmol/L的NaNO2绘制标准曲线，根据NaNO2标准曲线计算细胞培养上清液中NO2-的浓度进而计算测试样品对NO释放的抑制率。以氢化可的松(hydrocortisone)作为阳性对照(IC5064.3μM)。实验结果表明，穿心莲内酯的IC50值(IC501.42μM)显著优于阳性对照药氢化可的松，说明它具有抑制RAW264.7细胞释放NO的作用。二.对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放TNF-α的抑制活性实验细胞培养同NO释放抑制活性测试。对TNF-α的抑制活性测试使用mouseTNF-αELISAkit试剂盒(R&D)。用RPMI1640培养液将RAW264.7细胞稀释至5×105ce1ls/mL浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h后，每孔加入脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(终浓度1μg/mL)和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(加入LPS，但不加入测试样品，对TNF-α释放的抑制率为0％)和空白对照组(不加入LPS和测试样品，仅加入04μLDMSO，对TNF-α释放的抑制率为100％)，每个样品设3个平行孔。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进行标准曲线绘制和TNF-α的测定，计算抑制率。以氢化可的松作为阳性对照(IC5085.6μM)。实验结果表明，穿心莲内酯的IC50值(IC5027.15μM)显著优于阳性对照药氢化可的松，说明它具有抑制巨噬细胞释放TNF-α的作用。三.对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞释放IL-6的抑制活性实验细胞培养同NO释放抑制活性测试。对IL-6的抑制活性测试使用mouseIL-6ELISAkit试剂盒(R&D)。用RPMI1640培养液将RAW264.7细胞稀释至5×105cells/mL浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μL细胞悬浮液。CO2培养箱中培养1h后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(终浓度1μg/mL)和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4μL，同时设LPS组(加入LPS，但不加入测试样品，对IL-6释放的抑制率为0％)和空白对照组(不加入LPS和测试样品，仅加入0.4μLDMSO，对IL-6释放的抑制率为100％)，每个样品设3个平行孔。在37℃，5％CO2恒温培养箱中培养6h后吸取培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书方法进行标准曲线绘制和IL-6的测定，计算抑制率。以氢化可的松作为阳性对照(IC5063.8μM)。实验结果表明，穿心莲内酯的IC50值(IC506.75μM)显著优于阳性对照药氢化可的松，说明它具有抑制巨噬细胞释放IL-6的作用。实施例4迷迭香酸对15-脂加氧酶(15-LO)的抑制活性15-脂加氧酶(15-LO)是最主要的脂加氧酶，其通常作用底物为亚油酸盐和花生四烯酸盐。本实验利用纯化的15-LO作用于亚油酸，测定反应过程中的产物过氧化物的含量，反映相应的脂加氧酶的活性。对15-LO的抑制活性测试使用脂加氧酶抑制剂筛选试剂盒(LipoxygenaseInhibitorScreeningAssayKit，760700)。使用前等体积混合DevelopingRegent1(Cayman，760711)和DevelopingRegent2(Cayman，760712)配置成显色剂Chromogen；取10μL15-LO(Cayman，760714)加入990μLTris-HCl(0.1M，pH7.4)，配置成15-LO试剂，混匀置于冰上备用；取亚油酸溶液(Cayman，760716)25μL，加入0.1MKOH溶液(Cayman，760713)25μL，涡旋混合后，加入950μL去离子水稀释，即为底物溶液，备用。实验在96孔酶标板中进行，设定空白对照组[每孔加入100μLTris-HCl(0.1M，pH7.4)]，100％酶活性组[每孔加入90μL相应的15-LO试剂，10μLDMSO]及测试样品组[每孔加入90μL相应的15-LO试剂，10μL用DMSO溶解的测试样品]，每组设两个平行孔。以上所有孔中各加入10μL配制好的底物溶液，开始反应，将96孔酶标板置于水平摇床上振摇5min。每孔加入100μL显色剂Chromogen终止酶反应，用封板膜封板，置于水平摇床上振摇5min。取掉封板膜，测定500nm下的吸光值。根据A500计算测试样品对15-LO的抑制率实验结果(见表-7)表明，迷迭香酸对15-LO具有较强的抑制作用。表-7迷迭香酸(1mM)对15-LO的抑制活性实施例5市售复方消炎利胆片中药制剂的质量分析购买市售的广州白云山和记黄埔中药有限公司生产的三个批号复方消炎利胆片(生产批号E7A001、E7A002、E7A003)，广东万年青制药有限公司生产的一个批号的复方消炎利片(生产批号0802106)以及广东罗浮山药业有限公司生产的一个批号的复方消炎利胆片(生产批号LO7G060)。分别取20片制剂，除去糖衣，研细，再各取内容物1g，加入20mL70％的甲醇，超声提取两小时，取1mL过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，各厂家制剂的总损失率分别约为73％(广州白云山和记黄埔中药有限公司)、68％(广东万年青制药有限公司)、72％(广东罗浮山药业有限公司)，续滤液配制成终浓度为20mg/mL的各制剂供试溶液。分别精密取供试液10μL，采用实施例1中建立的色谱条件，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图。获得的各市售复方消炎利胆片制剂的色谱图与复方消炎利胆片制剂的高效液相标准指纹图谱比较，五个市售制剂色谱图至少检出15个指标色谱峰中的11个(见表-8)，保留时间相对标准偏差小于1％；使用药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》软件计算，五种中药制剂供试液高效液相色谱图的相似度分别为0.898，0.879，0.832，0.833和0.854(见附图4)。其中S1为复方消炎利胆片的标准指纹图谱，S2为广州白云山和记黄埔中药有限公司生产的E批号为7A001的复方消炎利胆片制剂，S3为广州白云山和记黄埔中药有限公司生产的批号为E7A002的复方消炎利胆片制剂，S4为广州白云山和记黄埔中药有限公司生产的批号为E7A003的复方消炎利胆片制剂，S5为广东万年青制药有限公司生产的批号为0802106的复方消炎利胆片制剂，S6为广东罗浮山药业有限公司生产的批号为LO7G060的复方消炎利胆片制剂。表-8市售复方消炎利胆片的中药制剂高效液相指纹图谱相似度由表-8可以看出，市售的各厂家生产的多批次复方消炎利片指纹图谱有一定的波动性，一些成分的含量有所变化，一些成分有缺失情况，但基本一致，与标准指纹图谱的相似度不小于0.8。采用本发明提供的反相高效液相方法，能够全面反映产品的质量，有效的控制复方消炎利胆片的产品质量。权利要求1、一种复方消炎利胆制剂的质量控制方法，该复方消炎利胆制剂含穿心莲、溪黄草和苦木三味中药，其特征在于采用反相高效液相色谱法建立复方消炎利胆制剂的标准指纹图谱和供试指纹图谱，以供试指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.8做为质量控制标准，所述标准指纹图谱(采用UV检测器)包含15个主要色谱峰，其中8个色谱峰的化学结构已经被准确指认，以穿心莲内酯色谱峰的保留时间为1计算15个主要色谱峰的相对保留时间，并计算各色谱峰峰面积占指纹图谱总峰面积百分比，分别为1号峰0.118±0.001，3.08±0.04％；2号峰0.172±0.001，1.81±0.02％；3号峰0.322±0.002，3.71±0.06％；4号峰0.751±0.002，3.65±0.37％；5号峰0.782±0.001，3.77±0.11％；6号峰0.867±0.001，3.67±0.64％，迷迭香酸；7号峰0.876±0.001，3.73±0.06％；8号峰0.934±0.002，5.80±0.13％；9号峰1.000，25.40±0.26％，穿心莲内酯；10号峰1.016±0.003，4.31±0.19％，苦木碱己；11号峰1.096±0.001，4.89±0.21％，异穿心莲内酯；12号峰1.118±0.001，3.53±0.29％，14-去氧穿心莲内酯苷；13号峰1.158±0.001，4.21±0.14％，14-去氧-11，12-二去氢穿心莲内酯苷；14号峰1.355±0.002，17.01±0.54％，脱水穿心莲内酯；15号峰1.382±0.002，5.56±0.33％，新穿心莲内酯。2、根据权利要求1所述的复方消炎利胆制剂的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤a、复方消炎利胆制剂标准指纹图谱的建立取中药穿心莲、苦木各150g，切碎混合，用80％～85％乙醇加热提取二次，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到43.5g浸膏；取溪黄草150g剪碎，加水煎煮二次，合并滤液，滤过，煎液浓缩至适量，加5倍量70％乙醇，摇匀，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏，得到9g浸膏；分别取上述穿心莲和苦木混合稠膏5g和溪黄草稠膏1.03g，合并，加入100mL70％的甲醇，超声溶解，取4mL溶液过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液1.5mL，用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，续滤液配制成终浓度为20mg/mL的供试品溶液；取穿心莲内酯对照品，以适量甲醇溶解，制成每1mL甲醇中含有穿心莲内酯1mg的溶液，即得穿心莲内酯的对照品溶液；分别精密取上述供试品及对照品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的反相高效液相法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图；以穿心莲内酯的色谱保留时间为1计算各色谱峰的相对保留时间及各色谱峰面积的百分比，得到标准指纹图谱；b、复方消炎利胆制剂供试指纹图谱的建立取待测复方消炎利胆制剂20粒，若有糖衣除去糖衣，研细，分别取内容物1g，加入20mL70％的甲醇，超声提取两小时，取1mL过0.45μm微孔滤膜，然后取滤过液用固相萃取柱(DIKMAProElutTMC18)净化，续滤液配制成终浓度为20mg/mL的供试溶液；穿心莲内酯对照品溶液按步骤a所述制备；按步骤a所述条件对上述供试品和对照品溶液进行色谱分析，记录色谱图；以穿心莲内酯的色谱保留时间为1计算各色谱峰的相对保留时间及峰面积，得到供试指纹图谱；上述复方消炎利胆制剂的剂型是任何一种药剂学上的剂型；c、供试复方消炎利胆片指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不小于0.8。3、根据权利要求2所述的复方消炎利胆制剂的质量控制方法，其特征在于所述复方消炎利胆制剂的剂型是复方消炎利胆片。4、根据权利要求2所述的复方消炎利胆制剂的质量控制方法，其特征在于所述反相高效液相色谱法的色谱条件是采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；采用连续梯度洗脱，流动相A为含有0.02％三氟乙酸的水溶液；流动相B为含有0.02％三氟乙酸的甲醇溶液；连续梯度洗脱程序如下0min时，流动相A为80％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为20％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；70min时，流动相A为30％的0.02％的三氟乙酸水溶液，流动相B为70％的0.02％的三氟乙酸甲醇溶液；流速为0.8mL/min；检测波长为225nm；柱温为40℃；进样体积10μL；以穿心莲内酯计算，理论塔板数不低于200000。全文摘要本发明涉及中药的质量控制领域，具体涉及一种复方消炎利胆制剂的质量控制方法及其应用。包括标准指纹图谱的建立，供试品指纹图谱的建立以及二者的比对。本发明建立的复方消炎利胆制剂标准指纹图谱，在225nm显示15个主要色谱峰，并确认了其中8个色谱峰的化学结构。从8个化学结构中进一步确认了穿心莲内酯、迷迭香酸和苦木碱己这3个组分为抗炎作用的活性成分。作为方法的补充，可选择上述3个组分或它们的组合作为指标性成分进行含量测定。本方法重复性高，稳定性好，操作方法简便，且科学、有据，可有效的控制复方消炎利胆制剂的质量。文档编号A61P1/00GK101361793SQ200810198869公开日2009年2月11日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者姚新生,昊高,峰赵,李晨阳,王国才,焦伟华,龙张,飞贺,毅戴,姚志红,周光雄,叶文才申请人:暨南大学