专利名称：：多孔微球及其在制备多孔微球疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物可降解多孔微球及其应用，特别是涉及可吸附抗原蛋白的多孔微球及其在制备多孔微球疫苗中的应用。
背景技术：
：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的烈性传染病。近年来，世界鼠疫疫情呈上升趋势，2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病。另外，鼠疫耶尔森氏菌又是一种标准的生物战剂和生物恐怖剂，美国已将鼠疫耶尔森氏菌列为恐怖分子最有可能使用的6个生物剂之一。鼠疫灭活疫苗仅对腺鼠疫有一定的保护作用，而且保护时间短，因此这类疫苗不适合于大规模的预防接种。美军曾在越战中使用的USP灭活疫苗己于1999年停止生产。EV76疫苗株是最好的减毒活疫苗，能提供早期的保护作用，但减毒活疫苗副作用严重(RussellP，EleySM，HibbsSE，MancheeR丄StaggA丄TitballRW:AcomparisonofPlaguevaccine,USPandEV76vaccineinducedprotectionagainstYersiniapestisinamurinemodel.1995，13(16):1551-1556.)。亚单位疫苗能够克服传统疫苗的许多缺陷，不含有感染性组分,无致病性，而且对腺鼠疫和肺鼠疫均具有一定的免疫保护作用。因此，目前鼠疫疫苗的研究多集中在亚单位疫苗。鼠疫耶尔森氏菌的主要保护性抗原是F1(荚膜抗原)(AndrewsGP，HeathDG,AndersonGW,Jr.，WelkosSL，FriedlanderAM:Fraction1capsularantigen(Fl)purificationfromYersiniapestisC092andfromanEscherichiacolirecombinantstrainandefficacyagainstlethalplaguechallenge.7>/"e"/顺〃/21996，64(6):2180-2187.)禾口LcrV(V-抗原)(AndersonGW,Jr.，LearySE，WilliamsonED，TitballRW，WelkosSL，WorshamPL，FriedlanderAM:RecombinantVantigenprotectsmiceagainstpneumonicandbubonicplaguecausedbyFl-capsule-positiveand-negativestrainsofYersiniapestis.'/z/"ecf1996,64(11):4580-4585.)。Fl抗原由鼠疫耶尔森氏菌pMTl质粒上的Fl操纵子编码，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，Fl抗体通过阻断Fl蛋白的抗吞噬作用从而具有免疫保护作用(DuY，RosqvistR，ForsbergA:Roleoffraction1antigenofYersiniapestisininhibitionofphagocytosis./鹏朋2002,70(3):1453-1460.)。V抗原是一种多功能蛋白，与鼠疫耶尔森氏菌的抗吞噬能力有关，具有免疫保护和免疫抑制作用(PetterssonJ，HolmstromA，HillJ,LearyS，Frithz-LindstenE，vonEuler-MatellA，CaxlssonE,TitballR,ForsbergA，Wolf-WatzH:TheV-antigenofYersiniaissurfaceexposedbeforetargetcellcontactandinvolvedinvirulenceproteintranslocation.i/oZWcroW1999，32(5):961-976.)。虽然基于Fl抗原与V抗原的新型疫苗对腺鼠疫和肺鼠疫均有效，但F1抗原不能代表鼠疫耶尔森氏菌的全部毒力(TitballRW，WilliamsonED:Yersiniapestis(plague)vaccines.^TjOeirf。/7//3AWr力er2004，4(6):965-973.)。最近，研究人员发现在云南感染东方型鼠疫耶尔森氏菌的病人血清中检测不到V抗原的抗体，提示某些鼠疫菌株的V抗原不具有免疫保护作用(LiB，JiangL，SongQ,YangJ，ChenZ，GuoZ，ZhouD,DuZ，SongY，WangJ<a2:ProteinmicroarrayforprofilingantibodyresponsestoYersiniapestislivevaccine.7>/"e"/鹏〃/2005，73(6):3734-3739.)。因此，目前鼠疫疫苗的研究多采用Fl和V抗原联合应用的方案。虽然亚单位疫苗对腺鼠疫和肺鼠疫均有效并且副作用小，但是亚单位疫苗需要用免疫佐剂或投递系统加强免疫。传统的亚单位疫苗常用氢氧化铝或佛氏佐剂加强免疫，这种疫苗是液体注射制剂，在常温下不稳定，需要冰箱保存。近来有文献报道，将鼠疫耶尔森氏菌V抗原和F1抗原包裹到可生物降解的高分子材料中制成微球，鼻粘膜免疫可产生对肺鼠疫的免疫保护作用(ElvinSJ，EylesJE，HowardKA，RavichandranE，SomavarappuS，AlparHO,WilliamsonED:Protectionagainstbubonicandpneumonicplaguewithasingledosemicroencapsulatedsub-unitvaccine,^cci/je2006,24(20):4433-4439.)。微球疫苗的制备主要有溶媒挥发法、喷雾干燥法、化学交联法和复凝聚法等。在制备过程中，抗原蛋白暴露于有机溶剂、较高的机械剪切力和水相-有机相界面以及高温等环境，活性往往有较大损失。
发明内容本发明的目的是提供一种可吸附抗原蛋白的多孔微球。本发明所提供的可吸附抗原蛋白的多孔微球，是将可生物降解的高分子材料溶于有机溶剂中，在搅拌下，将此混合液加入到氯化钠饱和溶液中制成初乳；初乳经冰水浴冷却后，加入含氯化钠的PVA溶液中制成复乳；再将复乳转移到含氯化钠的PVA溶液中，振荡制成微球；收集微球，清洗，再将微球转移至PVA溶液中，振摇，离心收集微球，清洗，冻干后得到多孔微球。所述可生物降解的高分子材料可为PLGA、PLG等生物材料。本发明的第二个目的是提供一种制备上述多孔微球的方法。本发明所提供的制备方法，是将可生物降解的高分子材料溶于有机溶剂中，在搅拌下，将此混合液加入到氯化钠饱和溶液中制成初乳；初乳经冰水浴冷却后，加入含氯化钠的PVA溶液中制成复乳；再将复乳转移到含氯化钠的PVA溶液中，振荡制成微球；收集微球，清洗，再将微球转移至PVA溶液中，振摇，离心收集微球，清洗，冻干后得到多孔微球。具体来讲，所述多孔微球的制备方法，是将可生物降解的高分子材料溶于按体积比为l:l混合的丙酮与二氯甲烷混合液中，然后将此混合液加入到体积比为10:1的氯化钠饱和溶液中，振荡制成初乳；将制备的初乳置冰水浴中冷却，按体积比为2:15加入含质量/体积比1-10%氯化钠的0.1-2%PVA溶液，制成复乳；再将复乳转移到另外体积比为l:10的含质量/体积比1-10%氯化钠的0.1-2%PVA溶液中，振荡制成微球；离心收集微球，清洗，再将微球转移至O.1-1X的PVA溶液中，在40-60'C下振摇，离心收集微球，清洗后冻干，得到多孔微球。所述可生物降解的高分子材料可为PLGA、PLG等生物材料。本发明的第三个目的是提供一种多孔微球疫苗。本发明所提供的多孔微球疫苗，是将具有免疫原性的抗原蛋白吸附到多孔微球中制成冻干制剂，得到多孔微球疫苗。所述具有免疫原性的抗原蛋白的选择是多种多样的，如F1、V、YscF和YopD等中的一种或几种。所述抗原蛋白的配比可任意选择。若制备鼠疫多孔微球疫苗，则选择对鼠疫具有免疫保护作用的抗原蛋白，如F1、V、YscF和YopD中的一种或几种。本发明的另一个目的是提供一种制备上述多孔微球疫苗的方法。本发明所提供的制备上述多孔微球疫苗的方法，是按重量/重量l:50-70(优选为60)的比例将抗原蛋白与多孔微球混合，在4'C下振荡吸附，离心收集微球，洗去未吸附的抗原后，冷冻干燥，得到吸附有抗原蛋白的多孔微球疫苗。为获得更好的吸附效果，所述多孔微球先用含1-3%吐温-20的PBS溶液处理，处理方法为将多孔微球悬浮于含1-3%吐温-20的PBS溶液中，在室温、300-600rpm下振荡O.5-2小时。所述疫苗可经肌注、皮下、滴鼻等途径进行免疫，免疫剂量一般为5-40吗，免疫方式及免疫剂量可根据实际情况进行调整。本发明的目的是提供一种多孔微球。本发明的多孔微球可吸附具有免疫原性的抗原蛋白，用于制备多孔微球疫苗。本发明采用先制备多孔空白微球再将抗原蛋白吸附到生物可降解高分子多孔微球中制成冻干制剂的方法制成疫苗，不仅可避免不利因素(制备过程中有机溶剂、较高的机械剪切力、水相-有机相界面以及高温等环境等)对抗原蛋白活性的影响，而且该制剂具有较高的稳定性，可在室温保存；此外，这种疫苗很容易实现多种抗原以任意比例混合，制备工艺简单，便于大规模生产。动物实验的结果表明，本发明的多孔微球吸附鼠疫菌保护性抗原后具有较高的免疫保护作用，该疫苗可经肌注、皮下、滴鼻等途径免疫，对鼠疫具有较好的免疫保护作用，可作为一种鼠疫亚单位疫苗的新剂型用于鼠疫的防护。基于上述特点，本发明提供了一条制备疫苗的新途径，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为多孔微球的电子显微镜照片具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、含V-抗原蛋白的PLGA多孔微球疫苗制备及其免疫保护作用评价一.PLGA多孔微球疫苗的制备1.PLGA多孔微球的制备先将500mgPLGA溶于2mL丙酮与二氯甲烷混合液(丙酮-二氯甲烷1:1),然后将此混合液加入到200yl氯化钠饱和溶液中，9000rpm振荡15s制成初乳；将制备的初乳置冰水浴中冷却2min，加入含质量/体积比5%(1-10%均可)氯化钠的1%(0.1-2%均可)PVA溶液10mL，8000rpm振荡15s制成复乳；再将复乳转移到另外90mL的含质量/体积比5%(1-10%均可)氯化钠的1%(0.1-2%均可)PVA溶液中，300rpm振荡5h后制成微球；离心收集微球，清洗三次后，将微球转移至100mL0.2X(0.1-1%均可)的PVA溶液中，在5CTC(40-6(TC均可)、125rpm下振摇8小时，离心收集微球，清洗后冻干，得到PLGA多孔微球，其电子显微镜照片如图l所示。2.V-抗原蛋白多孔微球疫苗的制备用PBS配制2X(1-3%均可)吐温-20溶液，将60mg多孔微球悬浮于lmL的2%吐温-20溶液中，室温下450rpm(300-600rpm均可)振荡1小时(0.5-2小时均可)，8000rpm离心10min，弃掉上清后备用。lmL的V-抗原蛋白(浓度为1.33mg/mL)溶液与20u1吐温-20混合备用。将上述用吐温-20处理过的多孔空白微球与V-抗原蛋白溶液混合，于4E振荡吸附12-24小时，离心收集微球，洗去未吸附的抗原后冷冻干燥，制成吸附有V-抗原蛋白的多孔微球疫苗。洗液与上清合并后测定抗原含量，从蛋白加入量中减去上清和洗液中的抗原量即为吸附到多孔微球中的蛋白量。结果表明，60mg多孔微球吸附V-抗原蛋白689pg。二.动物免疫30只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为3组，包括1个实验组和2个对照组，每组10只小鼠。实验组小鼠每只后退肌肉免疫880Pg多孔微球疫苗(含10Pg的V-抗原)；V-抗原蛋白对照组每只免疫l(Hig的V-抗原蛋白；空白多孔微球对照组每只免疫88(mg的空白多孔微球。三.抗体滴度测定l.血清抗体滴度测定初次免疫后，分别于第6、8、IO周尾静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见《ShortProtocolsinMolecularBiology》(FrederickM.Ausubeletal.，3rdedition,JohnWiley&Sons,Inc.,1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为包被V-抗原，每孔50ng(100ul)，置4。C过夜(10-12小时)。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200ul/孔)，置37'C孵箱2小时。以正常小鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100wl/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37"C置湿盒中20分钟。加显色液(50ul/孔)，置湿盒中37'C放10分钟，取出直接加入终止液(50ul/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表l所示，吸附了V抗原的多孔微球疫苗产生较高的抗体滴度，单独V抗原产生的抗体滴度明显偏低，而空白多孔微球不产生针对V抗原的抗体，表明本发明的多孔微球具有较好的佐剂作用，可用于鼠疫疫苗的制备。表l免疫小鼠血清V-抗体滴度疫苗抗体滴度(周)时间(周):微球+V-抗原V-抗原空白微球68101:8001:16001:16001:1001:2001:1001:01:01:02.免疫保护测定初次免疫后第12周，用600倍LD50鼠疫菌对所有免疫组小鼠进行皮下攻毒，然后观察14天。结果如表2所示，用本发明多孔微球疫苗免疫的小鼠全部存活，而且健康状况良好；等量V-抗原蛋白免疫的10只小鼠中9只死亡，而等量空白微球免疫的小鼠全部死亡，表明本发明的多孔微球疫苗具有良好的免疫保护作用。表2免疫保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2.含F1-抗原蛋白的PLG多孔微球疫苗制备及其免疫保护作用评价一.PLG多孔微球疫苗的制备1.PLG多孔微球的制备先将500mgPLG溶于2mL丙酮与二氯甲垸混合液(丙酮-二氯甲烷l:l)，然后将此混合液加入到200ul氯化钠饱和溶液中，9000rpm振荡15s制成初乳；将制备的初乳置冰水浴中冷却2min，加入含质量/体积比1%(1-10%均可)氯化钠的0.1%(0.1-2%均可)PVA溶液10mL，8000rpra振荡15s制成复乳；再将复乳转移到另外90mL的含质量/体积比1%(1-10%均可)氯化钠的0.1%(0.1-2%均可)PVA溶液中，300rpm振荡5h后制成微球；离心收集微球，清洗三次后，将微球转移至lOOmLO.1%(0.l-l%均可)的PVA溶液中，在40。C(40-60。C均可)、125rpm下振摇8小时，离心收集微球，清洗后冻干，得到PLG多孔微球。2.Fl-抗原蛋白多孔微球疫苗的制备用PBS配制1X(1-3%均可)吐温-20溶液，将60mg多孔微球悬浮于lmL的2%吐温-20溶液中，室温下300rpm(300-600rpm均可)振荡0.5小时(0.5-2小时均可)，8000rpm离心10min，弃掉上清后备用。lmL的F1-抗原蛋白(浓度为1.45mg/mL)溶液与20u1吐温-20混合备用。将上述用吐温-20处理过的多孔空白微球与蛋白溶液混合，于4'C振荡吸附12-24小时，离心收集微球，洗去未吸附的抗原后冷冻干燥制成吸附有Fl-抗原蛋白的多孔微球疫苗。洗液与上清合并后测定抗原含量，从蛋白加入量中减去上清和洗液中的抗原量即为吸附到多孔微球中的蛋白量。结果表明，60mg多孔微球吸附F1-抗原蛋白443jag。二.动物免疫30只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为3组，包括1个实验组和2个对照组，每组10只小鼠。实验组小鼠每只后退肌肉免疫1.364mg多孔微球疫苗(含10Pg的F1-抗原)；F1-抗原蛋白对照组每只免疫l(^g的F1-抗原蛋白；空白多孔微球对照组每只免疫1.364mg的空白多孔微球。三.抗体滴度测定l.血清抗体滴度测定初次免疫后，分别于第6、8、IO周尾静脉采血，用常规ELISA法测定抗体滴度，其主要过程为包被V-抗原，每孔50ng(100iU)，置4t:过夜。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200ul/孔)，置37'C孵箱2小时。以正常小鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100ul/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37r置湿盒中20分钟。加显色液(50ul/孔)，置湿盒中37。C放10分钟，取出直接加入终止液(50ul/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表3所示，吸附了F1抗原的多孔微球疫苗产生较高的抗体滴度，单独F1抗原产生的抗体滴度明显偏低，而空白多孔微球不产生针对F1抗原的抗体，表明本发明的多孔微球具有较好的佐剂作用，可用于鼠疫疫苗的制备。表3免疫小鼠血清F1-抗体滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.免疫保护测定初次免疫后第12周，用600倍LD50鼠疫菌对所有免疫组小鼠进行皮下攻毒，然后观察14天。结果如表4所示，多孔微球疫苗免疫的小鼠全部存活，而且健康状况良好，等量F1-抗原蛋白免疫的10只小鼠中8只死亡，而等量空白微球免疫的小鼠全部死亡，表明本发明的多孔微球疫苗具有良好的免疫保护作用。表4免疫保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3、含YscF-抗原蛋白的PLGA多孔微球疫苗制备及其免疫保护作用评价一.PLGA多孔微球疫苗的制备1.PLGA多孔微球的制备先将500mgPLGA溶于2mL丙酮与二氯甲烷混合液(丙酮-二氯甲烷1:1)，然后将此混合液加入到200ul氯化钠饱和溶液中，9000rpm振荡15s制成初乳；将制备的初乳置冰水浴中冷却2min，加入含质量/体积比10%(1-10%均可)氯化钠的2%(0.1-2%均可)PVA溶液10mL，8000rpm振荡15s制成复乳；再将复乳转移到另外90mL的含质量/体积比10%(1-10%均可)氯化钠的2%(0.1-2%均可)PVA溶液中，300rpm振荡5h后制成微球；离心收集微球，清洗三次后，将微球转移至100mL1%(O.l-l%均可)的PVA溶液中，在60。C(40-60。C均可)、125rpm下振摇8小时，离心收集微球，清洗后冻干，得到PLGA多孔微球。2.YscF-抗原蛋白多孔微球疫苗的制备用PBS配制3X(1-3%均可)吐温-20溶液，将60mg多孔微球悬浮于lmL的2%吐温-20溶液中，室温下600rpm(300-600rpm均可)振荡2小时(0.5-2小时均可)，8000rpm离心10min，弃掉上清后备用。lmL的YscF-抗原蛋白(浓度为1.24mg/mL)溶液与20u1吐温-20混合备用。将上述用吐温-20处理过的多孔空白微球与YscF-抗原蛋白溶液混合，于4"C振荡吸附12-24小时，离心收集微球，洗去未吸附的抗原后冷冻干燥，制成吸附有YscF-抗原蛋白的多孔微球疫苗。洗液与上清合并后测定抗原含量，从蛋白加入量中减去上清和洗液中的抗原量即为吸附到多孔微球中的蛋白量。结果表明，60mg多孔微球吸附YscF-抗原蛋白438|ug。二.动物免疫30只6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为3组，包括1个实验组和2个对照组，每组10只小鼠。实验组小鼠每只后退肌肉免疫1380Pg多孔微球疫苗(含10Pg的YscF-抗原)；YscF-抗原蛋白对照组每只免疫10l^g的YscF-抗原蛋白；空白多孔微球对照组每只免疫138(mg的空白多孔微球。三.抗体滴度测定1.血清抗体滴度测定初次免疫后，分别于第6、8、IO周尾静脉采血，用ELISA法(所用的ELISA法为常规方法，具体步骤可参见《ShortProtocolsinMolecularBiology》(FrederickM.A画beletal.，3rdedition,JohnWiley&Sons,Inc.,1995)。)测定抗体滴度。其主要过程为包被YscF-抗原，每孔50ng(100nl)，置4。C过夜(10-12小时)。然后用O.1%干酪素溶液封闭(200iU/孔)，置37。C孵箱2小时。以正常小鼠血清作阴性对照，加系列稀释的实验动物血清(100ul/孔)，置37。C孵箱内湿盒中30分钟。取出用洗液洗5遍后加入对应的二抗(羊抗鼠IgG，辣根过氧化物酶标记)，37"C置湿盒中20分钟。加显色液(50nl/孔)，置湿盒中37'C放10分钟，取出直接加入终止液(50lU/孔)，用光电比色测定抗体效价。结果如表5所示，吸附了V抗原的多孔微球疫苗产生较高的抗体滴度，单独YscF抗原产生的抗体滴度明显偏低，而空白多孔微球不产生针对YscF抗原的抗体，表明本发明的多孔微球具有较好的佐剂作用，可用于鼠疫疫苗的制备。_表5免疫小鼠血清V-抗体滴度_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.免疫保护测定初次免疫后第12周，用600倍LD50鼠疫菌对所有免疫组小鼠进行皮下攻毒，然后观察14天。结果如表6所示，用本发明多孔微球疫苗免疫的小鼠全部存活，而且健康状况良好；等量V-抗原蛋白免疫的10只小鼠中6只死亡，而等量空白微球免疫的小鼠全部死亡，表明本发明的多孔微球疫苗具有良好的免疫保护作用。表6免疫保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种多孔微球，是将可生物降解的高分子材料溶于有机溶剂中，在搅拌下，将此混合液加入到氯化钠饱和溶液中制成初乳；初乳经冰水浴冷却后，加入含氯化钠的PVA溶液中制成复乳；再将复乳转移到含氯化钠的PVA溶液中，振荡制成微球；收集微球，清洗，再将微球转移至PVA溶液中，振摇，离心收集微球，清洗，冻干后得到的多孔微球。2、根据权利要求1所述的多孔微球，其特征在于所述可生物降解的高分子材料为PLGA或PLG。3、一种制备权利要求1或2所述的多孔微球的方法，是将可生物降解的高分子材料溶于有机溶剂中，在搅拌下，将此混合液加入到氯化钠饱和溶液中制成初乳；初乳经冰水浴冷却后，加入含氯化钠的PVA溶液中制成复乳；再将复乳转移到含氯化钠的PVA溶液中，振荡制成微球；收集微球，清洗，再将微球转移至PVA溶液中，振摇，离心收集微球，清洗，冻干后得到多孔微球。4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述多孔微球的制备方法，是将可生物降解的高分子材料溶于按体积比为1:1混合的丙酮与二氯甲垸混合液中，然后将此混合液加入到体积比为10:l的氯化钠饱和溶液中，振荡制成初乳；将制备的初乳置冰水浴中冷却，按体积比为2:15加入含质量/体积比1-10%氯化钠的0.1-2%PVA溶液，制成复乳；再将复乳转移到另外体积比为1:10的含质量/体积比1-10%氯化钠的0.1-2°%PVA溶液中，振荡制成微球；离心收集微球，清洗，再将微球转移至O.1-1X的PVA溶液中，在40-60'C下振摇，离心收集微球，清洗后冻千，得到多孔微球。5、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于所述可生物降解的高分子材料为PLGA或PLG。6、一种多孔微球疫苗，是将具有免疫原性的抗原蛋白吸附到权利要求l所述的多孔微球中制成冻干制剂，得到多孔微球疫苗。7、根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述具有免疫原性的抗原蛋白为Fl、V、YscF和YopD中的一种或几种。8、一种制备权利要求6所述的多孔微球疫苗的方法，是按l:50-70的比例将抗原蛋白与所述多孔微球混合，在4"C下振荡吸附，离心收集微球，洗去未吸附的抗原后，冷冻干燥，得到吸附有抗原蛋白的多孔微球疫苗。9、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述多孔微球先用含1-3%吐温-20的PBS溶液处理。10、根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述处理方法为将多孔微球悬浮于含1-3%吐温-20的PBS溶液中，在室温、300-600rpm下振荡0.5-2小时。全文摘要本发明公开了一种多孔微球及其在制备多孔微球疫苗中的应用。该多孔微球是将可生物降解的高分子材料溶于有机溶剂中，在搅拌下，将此混合液加入到氯化钠饱和溶液中制成初乳；初乳经冰水浴冷却后，加入含氯化钠的PVA溶液中制成复乳；再将复乳转移到含氯化钠的PVA溶液中，振荡制成微球；收集微球，清洗，再将微球转移至PVA溶液中，振摇，离心收集微球，清洗，冻干后得到的多孔微球。将具有免疫原性的抗原蛋白吸附到上述多孔微球中制成冻干制剂可得到多孔微球疫苗。本发明提供了一条制备疫苗的新途径，应用前景广阔。文档编号A61P31/04GK101361716SQ200810223950公开日2009年2月11日申请日期2008年10月10日优先权日2008年10月10日发明者斌倪,帅尚,朱紫雯,杨瑞馥,旺王,王效义,邱业峰,兵陆申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所