专利名称：：成纤维生长因子受体介导的血管靶向脂质体载体及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药领域，具体涉及一种成纤维生长因子受体(FGFR)介导的靶向脂质体载体及制备方法和用途。
背景技术：
：纳米技术是20世纪80年代末期诞生并迅速崛起的新技术，与信息科学及生命科学一起并称为21世纪三大支柱科学。目前，世界许多国家都已将纳米研究列入国家重点发展领域。纳米生物技术是纳米技术的研究热点之一，我国在"十五"863计划和科技攻关计划及"十一五"863、973计划期间都已启动了"纳米生物和医学技术"重大专项项目，在纳米药物制剂方面取得了一系列先进的原创性成果。纳米技术是研究粒径大小在O.1100nm的物质所具有的物理化学性质和功能的科学，并且通过直接操纵单个原子、分子来组装和创造特定功能的物质的研究领域。而在药剂学研究中，一般将纳米粒子的粒径范围定为l500nm。由于载药纳米微粒体积更小，因此具有很多大粒子不具备的优点。纳米粒子进入体内可以有效地减少人体网状内皮系统巨噬细胞的吞噬，并能穿越细胞间隙，可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障并被细胞组织吸收载药纳米微粒可以控制药物在耙点部位控制释放，减少药物用量增强药物疗效并降低药物毒性，同时药物载体系统可以避免药物活性丧失有利于药物的贮藏和运输，基因纳米复合物可以提高基因转染效率、实现体内靶向。由于载药纳米微粒的诸多优点使其成为一种很有前途的药物新剂型。作为纳米材料中的重要组成部分的脂质体在药物释放系统显示了很好的前景，由于制备脂质体材料的生物可降解性，毒性小等特点使其在药物输送方面具有许多优越性可缓释药物，延长药物作用时间；通过抗体、叶酸等耙向配体修饰可将药物输送到耙向器官；可在保证药物作用的前提下，减少给药的剂量，减轻或避免毒副作用；提高药物的稳定性，利于储存；提高难溶药物的水溶性(如紫杉醇的脂质体药物)。在基因治疗中脂质体、阳离子聚合物胶束(PEI、PAGA、PEG-PLL、壳聚糖等)由于具有生物安全性较好、稳定性好、无免疫原性、导入基因容量大、容易进行靶向性改造、容易放大生产且工艺稳定、生产成本低等优点，越来越受到青睐和重视，特别是阳离子脂质体(粒经SIOOnm)已广泛用于基因治疗的传递系统。但普通的阳离子脂质体最大问题是转染效率低，靶向性差。其主要原因在于(l)基因导入系统效率较低，缺乏靶向；(2)—些基因治疗载体随机插入和整合到宿主细胞染色体上，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险；(3)对导入的治疗基因缺乏有效的调控等。这些问题的存在，也是发展有效和安全的基因治疗方案的主要制约因素。基因治疗关键技术中的首要问题，是能够选择性(或相对特异性)地将治疗基因输送到特定的靶组织(或靶器官)，并使之进入靶细胞。基于以上原因，本领域急需开发一种新型的靶向脂质体载体，可以用以介导小分子抗肿瘤药物耙向到目的细胞，降低其对正常组织的毒性；同时，也可高效介导基因治疗药物在耙细胞的表达，提高转染效率。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的具有肿瘤血管靶向性的脂质体载体。解决本发明技术问题的技术方案是提供了一种靶向脂质体载体。该靶向脂质体由下述配比的成分制备而成由下述配比的成分制备而成DOTAP和胆固醇，其配比为摩尔比DOTAP:胆固醇=2:12，还含有tbFGF多肽，tbFGF多肽的重量含量是D0TAP和胆固醇总重量的1080%。优选的，上述靶向脂质体载体由下述配比的成分制备而成DOTAP:胆固醇=2:12(摩尔比)，tbFGF多肽的重量含量是D0TAP和胆固醇总重量的3070。/0。其中，上述的是指对成纤维生长因子(bFGF)的结构进行改造得到截短的bFGF肽段，保留其bFGF与其受体结合的片段，而缺失了刺激进一步的信号传导的活性的肽段的bFGF多肽。主要是缺失部分肝素结合位点，使其缺乏刺激进一步的信号传导的活性，不会刺激耙细胞的增殖。优选的，上述tbFGF包含bFGF的第30-115氨基酸，其具有如下所示(SeqIDNo.1)的氨基酸序列krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferles皿ynty。仅保留了bFGF与其受体结合的活性，而缺失了刺激进一步的信号传导的活性，不会刺激靶细胞增殖，将其与阳离子脂质体孵育，制备成靶向脂质体。本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述靶向脂质体载体在制备药物组合物中的应用。本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种靶向脂质体复合物。该阳离子脂质体复合物是以上述的靶向脂质体为包封层。进一步的，上述靶向脂质体复合物的包封层内包封有基因载体或小分子抗肿瘤药物。其中，上述基因载体为腺病毒载体，腺相关病毒载体、质粒载体或噬菌体载体中的至少一种。其中，上述腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。其中，上述基因载体上载有并能表达抗肿瘤细胞因子的基因序列。其中，上述的小分子抗肿瘤药物为紫杉醇、阿霉素或喜树碱中的至少一种。本发明所要解决的第四个技术问题是提供了上述的脂质体的制备方法。该方法包括以下步骤a、称取D0TAP，Chol适量置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、将bFGF多肽缓慢加入到空白脂质体溶液中，轻微震荡，孵化过夜，获得靶向空白脂质体。本发明所要解决的第五个技术问题是提供了上述靶向脂质体复合物的制备方法。当制备基因载体的靶向脂质体复合物时，包括以下步骤a、称取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入5%葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、将tbFGF缓慢加入到空白脂质体溶液中，轻微震荡，孵化过夜，获得靶向空白脂质体，再将质粒载体或病毒载体等基因载体与靶向脂质体在室温下孵育30分钟，即得。当制备小分子抗肿瘤药物的耙向脂质体复合物时，该方法包括以下步骤a、称取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入5%葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、采用薄膜超声法或冻融法先将小分子抗肿瘤药物包裹于空白脂质体中，再将tbFGF缓慢加入到脂质体溶液中，轻微震荡，孵育过夜，即得。其中，上述方法还包括步骤e:将孵化后的脂质体挤压通过0.45ym聚碳酸酯膜48次。本发明所要解决的第六个技术问题是提供了上述脂质体复合物在制备在抗肿瘤药物组合物中的应用。本发明所要解决的第七个技术问题提供了一种靶向性抗肿瘤药物组合物，它是由上述脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。根据本发明的第一个方面，为了构建好的粒径稳定的FGF蹄巴向脂质体，考察了多种脂质体配方。为了取得更好的效果，对药脂比进行了筛选，并对tbFGF多肽加入的量进行了评价，获得了本发明中的粒径和Zeta电位稳定的靶向脂质体配方。当用于包封基因或基因载体等大分子药物时，tbFGF多肽的加入量较高，如按重量比tbFGF多肽/总脂质分子为20。/。80。/0，50%70%左右较佳)。当用于包封小分子抗肿瘤药物时，可以只使用较低的tbFGF多肽，如按重量比tbFGF多肽/总脂质分子为2。/。80。/。均可，但210%左右较佳，阿霉素优选4%)根据本发明的另一个方面，对制备本发明FGF蹄巴向脂质体复合物的方法进行了确定和优化。在按照通常的工艺参数制备阳离子脂质体的基础上，采用孵育法复合tbFGF多肽。另外还对挤压次数、孵化温度等各个工艺参数进行了优化，以提高其包裹基因和小分子药物的包封率并同时获得粒径小于200nm的阳离子脂质体。根据本发明的再一个方面，本发明FGF蹄巴向脂质体装载抗肿瘤基因载体或者抗肿瘤小分子药物可用于肿瘤的治疗，并可再添加药学上可以接受的辅助性成分制备成抗肿瘤药物组合物。本发明的有益效果为由于bFGF及其受体在多种肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞上都具有高水平的表达，本发明将tbFGF多肽与阳离子脂质体孵育，制备成tbFGF修饰的纳米脂质体，它能与质粒DNA或病毒载体进行自组装形成靶向纳米脂质体/DNA复合物，同时又可包裹小分子抗肿瘤药物。另外，本发明还对bFGF的结构进行改造得到截短的bFGF肽段(tbFGF)，包含bFGF的第30-115氨基酸，仅保留了bFGF与其受体结合的活性，而缺失了刺激进一步的信号传导的活性，不会刺激靶细胞增殖，将其与阳离子脂质体孵育，制备成靶向脂质体。实验证明使用该靶向脂质体的稳定性和包封各种抗肿瘤药物后的转染效率和稳定性均同时得到了提高，具备体内靶向性，肿瘤组织药物分布得到了很大的提高，同时药物的体内清除率大为降低。能很好地有选择性地把治疗基因和小分子药物输送到特定的肿瘤组织的效果，且既可包裹小分子抗肿瘤药物又可包裹基因药物，还可实现同时包裹小分子抗肿瘤药物和基因药物，是一种对肿瘤具有特异靶向性的优秀载药体系。通过携带抗肿瘤活性基因survivin，重组survivin腺病毒，阿霉素，紫杉醇等药物在多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等模型中显示良好的抗肿瘤效果，抑制了肿瘤的生长，并显著延长荷瘤小鼠的生存期，为肿瘤的耙向治疗产品的开发和应用提供了新的思路，具有较好的临床应用前景。图1:tbFGF多肽所采用的表达载体pET-32a(+)。图2:空脂质体复合tbFGF多肽前后粒径的变化。图3:空脂质体复合tbFGF多肽前后Zeta电位的变化。图4:FGFR靶向脂质体-p0RF9-mSurvivinT34A复合物治疗小鼠黑色素瘤(B16)的肿瘤生长曲线。图5:FGFR靶向脂质体-p0RF9-mSurvivinT34A复合物治疗小鼠黑色素瘤(B16)的生存期曲线。图6:FGFR靶向脂质体-阿霉素复合物治疗小鼠前列腺瘤(Tramp-Cl)的肿瘤生长曲线。图7:FGFR靶向脂质体-阿霉素复合物治疗小鼠前列腺瘤(Tramp-Cl)的生存曲线。图8:FGF蹄巴向脂质体-紫杉醇复合物治疗小鼠黑色素瘤(B16)的肿瘤生长曲线。图9:FGF蹄巴向脂质体-紫杉醇复合物治疗小鼠小鼠黑色素瘤(B16)的生存曲线。图10:藻酸盐实验检测FGF蹄E向脂质体抑制新生血管的作用A.生理盐水组，B.游离紫杉醇组，C.普通阳离子脂质体包裹紫杉醇组，D.FGF蹄巴向脂质体，E，各组中藻酸盐球中右旋糖酐荧光强度。具体实施例方式以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。实施例一脂质体配方的选择及优化材料1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(D0TAP)购于Avanti公司；胆固醇(Chol)购于Sigma公司；tbFGF为自行构建载体、表达制备，纯度大于99%。tbFGF的构建与表达:分析人bFGF序列，设计扩增tbFGF(aa.30-115)的引物，上游引物5'端引入限制性内切酶Kpn頂每切位点和肠激酶(EK酶)切位点，下游引物5'端引入限制性内切酶Hindin酶切位点，由上海英俊生物技术有限公司合成。上游引物〔Seqmis-o.2):下游引物(SeqEDN。.3〕5,CCCAAGCTTAGTAAGTATTGTAGTTATTAGATTC3,。以pBLAST45-hbFGF(购自美国Invivogen公司)为模板扩增tbFGF片段，将PCR产物KpnI/Hind11I双酶切后插入表达载体pET-32a(+)(购自美国Novagen公司，结构示意图见图l)。鉴定正确后，将重组质粒pET32a-tbFGF转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导目的蛋白表达。结果表明，pET32a-tbFGF/BL21(DE3)在IPTG诱导下可表达与预计分子量一致(21kDa左右)的融合蛋白，表达量达到40%以上。破菌上清经金属螯合柱亲和层析一步得到纯化，融合蛋白Trx-tbFGF纯度可达95X以上，产量可达400—500mg/L。经Ni柱纯化的融合蛋白Trx-tbFGF，EK酶酶切后可得到硫氧还蛋白和分子量为9.lkDa左右的tbFGF多肽，纯度可达到99%以上。经测定，该多肽的序列为ii'-krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferles皿ynty-C'在体外用NIH-3T3细胞检测tbFGF的刺激细胞增殖的活性，结果表明tbFGF的ED50值为500ng/ml，比标准bFGF蛋白的ED50值(〈5ng/ml)高100倍以上。说明该tbFGF多肽刺激靶细胞的活性基本丧失，可以用于以后的耙向实验研究。大规模制备该tbFGF多肽用于本发明具体实施方式中的各项实验研究。在材料方面，通过预实验发现使用DOTAP/Chol体系所得的脂质体毒性很低，且更有利于复合tbFGF，故脂质分子选用DOTAP和Chol。通过改变DOTAP:Chol的比例(摩尔比)，观察对tbFGF复合后粒径和表面电荷的变化。发现DOTAP:Chol的比例(摩尔比)为l:l时，可以得到稳定的粒径和电荷，结果见图2。在复合tbFGF的比例上，当保持DOTAP:Chol的比例(摩尔比)为l:l时，加入不同比例的tbFGF偶联，考察在不同比例的tbFGF基础上粒径和表面电位的变化，当DOTAP:Chol=l:1(摩尔比)、tbFGF多肽占1080。/。时可以得到稳定的粒径和表面电荷。当tbFGF多肽占65呢(重量比)，其复合的多肽占整个脂质体重量比的65%时可以得到稳定的粒径和表面电荷，结果见图2。实施例二靶向空白脂质体制备工艺条件的进一步优化整个工艺过程中，空白脂质体与tbFGF多肽的复合主要依靠阳离子脂质体的正电荷与tbFGF多肽所带的负电荷之间的静电力来得以实现，通过阳离子脂质体与tbFGF多肽的共同孵育可获得靶向空白脂质体。为了获得稳定的靶向空白脂质体，我们tbFGF多肽与阳离子脂质体的复合条件进行了优化。其中，冻融次数对tbFGF包封率有较大影响。首先，考察冻融次数对tbFGF结合的影响。靶向空白脂质体与不同比例tbFGF结合后，经反复冻融l、2、3、4、5、6次时的包封率变化见表1。数据显示，开始冻融时，冻融次数的增加有利于脂质体与tbFGF的结合；但是反复冻融6次之后，其粒径会变大，且对包封率没有明显的变化。冻融2-6次均能基本达到目的，最佳次数为3次。表i:冻融次数对复合率的影响:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其次，我们对冻融孵化条件进行优化。在孵化条件考察上，分别考察孵化温度、孵化时间对包封率的影响。孵化温度上选择4。C、8°C、10°C，孵化时间上选择40、60、80、100、120分钟。结果表明，孵化温度对包封率影响不大，应保持1(TC以下水浴，4'C最佳；孵化时间上，4080分钟在得到高包封率上比较满意，60分钟最佳。过膜挤压除菌的考察脂质体在经过冻融后，得到是一个较宽的粒径分布而且平均粒径也偏大，如果通过薄膜挤压可以得到较窄的粒径分布以及改善平均粒径，提高整体性能。同时通过O.2mm膜挤压还能达到除菌的目的。经过上述工艺优化，可得到一最佳的靶向FGFR的空白脂质体制备工艺按处方精确称取DOTAP、Chol，置于茄形瓶中，加入氯仿甲醇=1:l的有机溶剂溶解，33。C真空旋转蒸发得脂质体膜，放入真空干燥箱常温真空干燥过夜，加入超纯水超声水化(200W，IO分钟)得空白脂质体溶液。将tbFGF(按重量比tbFGF多肽/总脂质分子可为20。/。80。/。，65%左右为佳)加入脂质体溶液，4摄氏度孵化过夜，再使用挤压法经过O.20mm聚碳酸酯膜除菌，得tbFGF脂质体复合物，即靶向空白脂质体。该靶向空白脂质体适宜与制备与基因或基因载体的复合物实施例三、靶向脂质体包裹质粒DNA或腺病毒的制备工艺靶向脂质体基因复合物的制备则是通过靶向空白脂质体与质粒DNA或腺病毒合适的比例孵育，自组装形成的。实施例二得到的靶向空白脂质体与质粒DNA按1:3比例(重量比)混合，4'C孵育过夜，即可得到靶向脂质体质粒DNA复合物。同样，实施例二得到的靶向空白脂质体与重组腺病毒按比例2.5X109VP重组腺病毒/mg阳离子脂质体混合，室温孵育1030分钟，即可得到靶向脂质体腺病毒复合物。实施例四、靶向脂质体包裹小分子抗肿瘤药物的制备工艺包裹小分子抗肿瘤药物的制备工艺以阿霉素为例。其优选的制备工艺如下参考实施例二的方案，按处方精确称取一定比例的DOTAP、Chol、阿霉素置于茄形瓶中，加入氯仿甲醇=1:i的有机溶剂溶解，33'c真空旋转蒸发得脂质体膜，放入真空干燥箱常温真空干燥过夜，加入超纯水超声水化(200W，IO分钟)得阿霉素脂质体溶液。再将tbFGF加入脂质体溶液(按重量比tbFGF多肽/总脂质分子可菜用的范围较大，4%左右较佳)，摄氏4度孵化过夜，再使用挤压法经过O.45mm聚碳酸酯膜，得到靶向脂质体阿霉素复合物。同样也得到本发明靶向脂质体包封紫杉醇的复合物。实施例五FGFR靶向脂质体包裹pCMV-GFP测定体外转染效率为了验证FGF蹄巴向脂质体包裹基因后的耙向性，我们以几种高表达FGFR的细胞株和低或不表达FGFR的细胞株进行体外验证，检测FGF蹄巴向脂质体包裹pCMV-GFP在这几种细胞株中的转染效率。高表达FGFR的细胞株人肝癌细胞株H印-G2，小鼠前列腺癌细胞株Tramp-cl，人卵巢癌细胞株A2780，人脐静脉内皮细胞株HUVEC。低或不表达FGFR的细胞株小鼠结肠癌细胞株CT26，小鼠卵巢癌细胞株4T1。质粒pCMV-GFP(购自美国Clontech公司)。操作步骤细胞接种于六孔板中(40000个细胞/孔)，待每孔细胞长满75%时，开始转染实验。将10ugtbFGF修饰的阳离子脂质体缓慢加入到2ygpCMV-GFP(均用无血清培养基稀释)，室温下孵化2040分钟后，加入到六孔板内，4小时后，将各孔中的无血清培养基全都换成有血清培养基，24小时后荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光出现，收获细胞用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。对照标准阳离子脂质体Lipofectamine2000(购自美国Invitrogene公司)的操作按说明书进行。实验结果见表2，结果表明，本发明的FGFR靶向脂质体能特异地提高FGFR高表达细胞株的转染效率，而不影响FGFR低或不表达细胞株的转染效率，具有FGFR耙向性。表2.不同类型的脂质体在不同细胞株中的转染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以下通过试验例的方式对本发明的有益效果做进一步详述。试验例一、FGFR靶向脂质体包裹质粒pORF9-mSurvivinT34A治疗小鼠黑色素瘤通过测定抑制肿瘤的生长情况来表明本发明靶向脂质体复合物的体内活性。动物8周龄C57小鼠，每只接种2X105B16细胞后分组(每组10只)，待可扪及肿瘤时开始尾静脉给药，每周两次，连续给药八次，每三天测定肿瘤体积。考察肿瘤生长和生成期，待停止治疗后，取各组织病理切片分析。质粒pORF9-mSurvivinT34A(购自美国Invivogen公司)分组FGFR耙向脂质体-pORF9-mSurvivinT34A组(25yg质粒/只/次)FGFR阳离子脂质体-空载组(pORF9)(25yg质粒/只/次)普通阳离子脂质体-survivin组pORF9-mSurvivinT34A组(25yg质粒/只/次)普通阳离子脂质体-空载组(pORF9)(25yg质粒/只/次)生理盐水组抑瘤曲线见图4，结果表明本发明的tbFGF耙向脂质体-pORF9-mSurvivinT34A复合物治疗小鼠黑色素抑制肿瘤生长率为40.3%，p〈0.001，而FGFR靶向脂质体-pORF9-mSurvivinT34A复合物治疗小鼠黑色素的抑制肿瘤生长率为68.3%，p〈0.001，具有显著性差异。生存期曲线见图5，结果表明FGFR靶向脂质体-pORF9-mSurvivinT34A复合物能显著延长荷瘤小鼠的生存期。试验例二、tbFGF靶向脂质体包裹抗癌药物阿霉素的抗肿瘤作用的研究分组tbFGF耙向脂质体包裹阿霉素组(包裹的阿霉素剂量为100yg/只)普通脂质体包裹阿霉素(包裹的阿霉素剂量为100yg/只)空脂质体组(脂质体剂量为500yg/只)游离阿霉素组(阿霉素剂量为100yg/只)生理盐水组动物8周龄C57小鼠，接种小鼠前列腺癌细胞株Tramp-Cl细胞后分组(每组10只)，待可扪及肿瘤时开始尾静脉给药，每周两次，连续给药八次，每三天测定肿瘤体。考察肿瘤生长和生成期，待停止治疗后，取各组织病理切片分析。抑瘤曲线见图6，结果表明游离阿霉素的肿瘤抑制率仅为68.2%，而普通阳离子脂质体包裹阿霉素肿瘤抑制率并未提高(51.7%)，而FGFR靶向脂质体包裹阿霉素治疗前列腺癌，其肿瘤抑制率为87.9%，p〈0.001。生存曲线见图7，结果表明FGF蹄巴向脂质体包裹阿霉素治疗前列腺癌后，小鼠的生成率直到90天以后还有30%老鼠存活，而其它几组老鼠在78天已全部死亡。FGFR靶向脂质体包裹阿霉素能显著延长荷瘤小鼠的生存期。试验例三、FGF蹄E向脂质体包裹抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤作用的研究分组FGF蹄E向脂质体包裹紫杉醇组(包裹的紫杉醇剂量为200yg/只)普通脂质体包裹紫杉醇(包裹的紫杉醇剂量为200yg/只)空脂质体组(脂质体剂量为800yg/只)游离紫杉醇组(包裹的紫杉醇剂量为200yg/只)生理盐水组动物8周龄C57小鼠，接种小鼠黑色素瘤细胞B16后分组(每组10只)，待可扪及肿瘤时开始尾静脉给药，每周两次，连续给药八次，每三天测定肿瘤体。考察肿瘤生长和生成期，待停止治疗后，取各组织病理切片分析。抑瘤曲线见图8，结果表明游离紫杉醇对小鼠黑色素瘤的肿瘤抑制率仅为35.7%，普通阳离子脂质体包裹紫杉醇的肿瘤抑制率有所提高(49.9%，p〈0.001)，而FGFR靶向脂质体包裹紫杉醇治疗小鼠黑色素瘤取得很好的抑制肿瘤生长效果，其肿瘤抑制率达到77.7%，p〈0.001。生存曲线见图9，FGF蹄巴向脂质体包裹紫杉醇治疗小鼠黑色素瘤，普通阳离子脂质体包裹紫杉醇后，小鼠在36天全部死亡，而FGFR靶向脂质体包裹紫杉醇组还有50。/。老鼠存活，直到试验结束的60天有30%老鼠存活。实验结果表明该靶向脂质体能显著延长荷瘤小鼠的生存期。1以上三个试验例表明，本发明的FGFR靶向脂质体复合物能有效抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，具有显著的抗肿瘤效果。试验例四、藻酸盐实验证明FGF蹄巴向脂质体抑制肿瘤血管生成的作用将小鼠结肠癌细胞CT26重悬于1.6%的藻酸盐的生理盐水溶液中，再将其缓慢加入到250mmol/L氯化钙溶液中，形成藻酸盐颗粒(1乂105细胞/颗粒)。之后每只BalB/c小鼠背部皮下植入四颗藻酸盐颗粒，手术缝合伤口。从第二天开始，每三天给药一次，并于第12天，每只小鼠尾静脉注射O.lmLFITC-葡聚糖溶液(100mg/kg)，20分钟后取出藻酸盐颗粒，拍照，并用荧光分光光度计检测每个颗粒中FITC-葡聚糖的含量。实验结果见图IO，经bFGF修饰的阳离子脂质体包裹紫杉醇治疗后在肿瘤组织中的藻酸盐颗粒几乎观察不到肿瘤血管，而在普通阳离子脂质体包裹紫杉醇治疗组和游离紫杉醇组中仍能观察到肿瘤血管。而生理盐水组中大量的肿瘤血管存在。实验结果表明，FGFR靶向脂质体具有肿瘤血管的耙向性。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的发明构思及所附上的权利要求书定义的范围之内。SEQUENCELISTING〈110>四川大学〈120>成纤维生长因子受体介导的血管靶向脂质体载体及制备方法和用途〈130>A080301k〈160>3〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>86〈212>PRT〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>1LysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArglieHisPro151015AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHislieLys202530LeuGinLeuGinAlaGluGluArgGlyValValSerlieLysGlyVal354045CysAlaAsnArgTyrLeuAlaMetLysGluAspGlyArgLeuLeuAla505560SerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGluArgLeuGluSer65707580AsnAsnTyrAsnThrTyr85〈210>2〈211>45〈212>DNA〈213>artificial〈220><223>artificial〈400>2ggggtaccgacgacgacgacaagaagcggctgtactgcaaaaacg45〈210>3<211>34<212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3cccaagctta.gtaagtattgtagtta.tta.ga.ttc3权利要求1.靶向脂质体，其特征在于由下述配比的成分制备而成DOTAP、胆固醇和tbFGF多肽，其配比为DOTAP与胆固醇的摩尔比DOTAP胆固醇＝2:1～2，tbFGF多肽的重量含量是DOTAP和胆固醇总重量的2～80％。2.根据权利要求l所述的靶向脂质体，其特征在于由下述配比的成分制备而成所述tbFGF多肽的重量含量是DOTAP和胆固醇总重量的37(Fo。3.根据权利要求l所述的靶向脂质体，其特征在于所述tbFGF多肽片段具有如SEQIDNO.l所示的氨基酸序列。4.权利要求13任一项所述的靶向脂质体在制备药物组合物中的应用。5.一种靶向脂质体复合物，其特征在于以权利要求13任一项所述的靶向脂质体为包封层。6.根据权利要求5所述的靶向脂质体复合物，其特征在于所述的包封层内包封有基因表达载体或小分子抗肿瘤药物。7.根据权利要求6所述的靶向脂质体复合物，其特征在于所述的基因表达载体为腺病毒载体，腺相关病毒载体、质粒载体或噬菌体载体中的至少一种。8.根据权利要求7所述的靶向脂质体复合物，其特征在于所述的腺病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。9.根据权利要求6所述的靶向脂质体复合物，其特征在于所述的基因表达载体上载有且能表达抗肿瘤细胞因子的基因序列。10.根据权利要求9所述的靶向脂质体复合物，其特征在于所述的小分子抗肿瘤药物为紫杉醇、阿霉素或喜树碱中的至少一种。11.制备权利要求13任一项所述的靶向空白脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤a、称取D0TAP，Chol适量置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；C、在脂质体膜中加入葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、将tbFGF多肽缓慢加入到空白脂质体溶液中，轻微震荡，孵化过夜，获得靶向空白脂质体。12.一种制备权利要求49任意一项所述的靶向脂质体复合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、称取D0TAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解；b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入5%葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、将tbFGF缓慢加入到空白脂质体溶液中，轻微震荡，孵化过夜，获得靶向空白脂质体，再将质粒载体或病毒载体等基因载体与靶向脂质体在室温下孵育1(T30分钟，即得。13.根据权利要求4或10所述的制备靶向脂质体复合物的方法，其特征在于包括以下步骤a、称取DOTAP，Chol置于旋蒸瓶中，加入氯仿使之完全溶解b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；c、在脂质体膜中加入5%葡萄糖溶液超声水化得空白脂质体溶液；d、小分子活性药物则采用薄膜超声法或冻融法先将小分子抗肿瘤药物包裹于空白脂质体中，再将tbFGF缓慢加入到脂质体溶液中，轻微震荡，孵育过夜，即得。14.根据权利要求12或13所述的制备靶向脂质体小分子抗肿瘤药物复合物的方法，其特征在于还包括步骤e:将孵化后的脂质体挤压通过0.45um聚碳酸酯膜48次。15.权利要求41O任意一项所述的靶向脂质体药物复合物在制备在抗肿瘤药物组合物中的应用。16.一种靶向性抗肿瘤药物组合物，是由权利要求410任意一项所述的靶向脂质体药物复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。全文摘要本发明属于生物医药领域，涉及一种成纤维生长因子受体介导的血管靶向脂质体载体及制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题是提供一种转染效率高且具有肿瘤血管靶向性的阳离子脂质体。该靶向脂质体由下述配比的成分制备而成DOTAP、胆固醇和tbFGF多肽，其配比为摩尔比DOTAP∶胆固醇＝2∶1～2，tbFGF多肽的重量是DOTAP和胆固醇总重量的10～80％。本发明脂质体能特异性地与肿瘤新生血管细胞表面FGF受体(FGFR)结合，通过包裹多种小分子抗肿瘤药物、治疗基因、载有治疗基因的腺病毒载体等，进而实现肿瘤血管靶向性治疗的制备方法和用途。文档编号A61K31/4745GK101361712SQ20081030473公开日2009年2月11日申请日期2008年9月28日优先权日2008年9月28日发明者莉杨,霞赵,陈俐娟,魏于全申请人:四川大学