专利名称：作为PPARδ配体的噻唑化合物及包含其的药物、化妆品和保健食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为PPARδ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)配体的由式1表示的噻唑化合物及含有其的药物组合物、化妆品组合物、保健食品、保健饮料、食品添加剂和动物饲料，所述噻唑化合物可用于治疗肥胖症、高血脂症、动脉硬化、糖尿病、痴呆症、阿尔茨海默症和帕金森症以及用于加强肌肉或改善记忆力。
[式1]
背景技术：
在各种核受体中，已知PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)含有三种亚型PPARα、PPARγ和PPARδ(Nature，1990，347，p645-650.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，p7335-7359)。PPARα、PPARγ和PPARδ在体内具有组织特异性功能，并且在不同部位表达。PPARα主要在人的心脏、肾、骨骼肌和大肠中表达(Mol.Pharmacol.1998，53，p14-22.，Toxicol.Lett.1999，110，p119-127.，J.Biol.Chem.1998，273，p16710-16714)，并且参与过氧化物酶体和线粒体的β-氧化(Biol.Cell.1993，77，p67-76.，J.Biol.Chem.1997，272，p27307-27312)。PPARγ在骨骼肌中以低水平表达，但主要在脂肪组织中表达从而诱导脂肪细胞分化并以脂肪形式储存能量，并且参与胰岛素和葡萄糖的体内平衡的调节(Moll.Cell.1999，4，p585-594.，p597-609.，p611-617)。PPARδ在进化中保存在包括人类在内的哺乳动物和包括啮齿动物在内的脊椎动物和海鞘中。此前研究证实，PPARδ在生殖细胞表达中发挥着重要作用(Genes Dev.1999，13，p1561-1574)，并且具有分化中枢神经系统(CNS)中的神经元细胞(J.Chem.Neuroanat 2000，19，p225-232)和通过消炎效果愈合伤口(Genes Dev.2001，15，p3263-3277.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100，p6295-6296)的生理功能。近期研究还证实PPARδ参与了脂肪细胞分化和脂类代谢(Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002，99，p303-308.，Mol.Cell.Biol.2000，20，p5119-5128)。例如，PPARδ激活了参与脂肪酸分解代谢中β-氧化的关键基因(所述基因参与能量代谢)和解偶联蛋白(UCPs)的表达，从而带来了改善肥胖症的效果(Nature2000，406，p415-418，Cell 2003，113，p159-170)。PPARδ的激活增加了HDL(高密度脂蛋白)水平，改善了2型糖尿病而不带来体重变化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，p5306-5311，2003，100，p15924-15929，2006，103，p3444-3449)，并且通过抑制与动脉硬化有关的基因而有利于动脉硬化的治疗(Science，2003，302，p453-457)。因此，可以开发PPARδ配体作为用于治疗代谢性疾病(如肥胖症、糖尿病、高血脂症和动脉硬化)的药物。
PPARδ调节了线粒体的生物合成。当人为地使PPARδ在小鼠肌肉中过度表达时，除了脂肪酸β氧化酶增加外，还增加了线粒体的生物合成并且显著增加了I型肌纤维。因此，与野生型小鼠相比，上述小鼠的稳定奔跑时间和距离分别增加了67％和92％(PLoS Biology，2004，2e294)。线粒体生物合成的增加对增强脑机能具有积极影响。如果脑细胞中的线粒体被氧化应激所破坏，则记忆力会显著下降(Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002，99，p2356-2361)。痴呆症、阿尔茨海默症和帕金森症是代表性的退行性疾病，它们表现出学习力和记忆力的显著下降。因此，本发明开发的线粒体增殖剂不仅有助于改善记忆力，而且还能被发展为阿尔茨海默症和帕金森症的治疗剂。
目前所开发的合成PPARδ配体与其它PPARα和PPARγ相比具有较低的选择性。早期的选择性配体是由Merk开发的L-631033(J.SteroidBiochem.Mol.Biol.1997，63，p1-8)，它是通过将能够基于其天然脂肪酸形态而使侧链固定的官能团引入而生成的。此后，同一研究小组报导了更有效的配体L-165041(J.Med.Chem.1996，39，p2629-2654)，在该配体中称作白细胞三烯激动剂的化合物发挥着激活人的PPARδ的作用。该化合物显示了对hPPARδ的高选择性，其选择性是对PPARα或PPARγ的选择性的10倍。该化合物的EC50是530nM。其它配体L-796449和L-783483具有改善的亲和力(EC50＝7.9nM)，但对于其它hPPAR亚型却几乎不具有选择性。
Glaxo-Smith-Kline报导了PPARα激活剂GW2433(Chem.Biol.1997，4，p909-918)，GW2433是结构与PPARδ配体口袋(ligand pocket)的晶体结构相似的Y型配体。与迄今为止已知的传统配体不同，该配体具有含苯环的Y型结构，这有利于与PPARδ配体口袋的空间结合。然而，该配体是对于hPPARα也具有活性的双活性配体，这暗示着对于PPARδ的选择性降低。最近GlaxoSmithKline开发的PPARδ选择性配体GW501516([2-甲基-4-[[[4-甲基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-1，3-噻唑-5-基]甲基]硫基]苯氧基]乙酸)显示了比先前开发的任何其它配体都好得多的生理学效果(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001，98，p5306-5311)。
GW501516具有对PPARδ的优良亲和力(1nM～10nM)，也具有对PPARα或PPARγ的优良选择性，该选择性至少是先前的配体的选择性的1000倍。
然而，迄今为止开发的所有配体所诱导的PPARδ活性仅由全部的配体结合口袋的30％～40％产生。
Glaxo小组申请的WO 2001-00603对由下式A表示的化合物进行了说明，所述化合物含有GW501516作为PPARδ的选择性激活剂。然而，该说明仅包括了使用Rhesus模型的GW501516的测试结果的一部分。
式A [其中，R′是CF3或F，R″是H、CH3或Cl，而R′″是H、CH3或CH2CH3。] Glaxo小组申请的WO 2002-62774中对作为PPARδ选择性激活剂的由式B表示的噻唑化合物进行了说明。
式B Eli Lilly申请的WO 2003-072100描述了一种含由下式C表示的化合物的用于选择性调节PPARδ的药物组合物。
式C 然而，该描述仅宣称已经制备了所述组合物，该组合物是以外消旋体而非以光学异构体(包括两种类型)而生成。并且该文件仅描述了所生成的外消旋体的质谱的M++1值，该外消旋体由1H-NMR确认并且充当PPARδ的选择性激活剂，但该文件没有提及作为PPARδ的选择性激活剂的药理学效果。
发明内容
技术问题 本发明人制备了一种光学活性化合物，所述化合物在WO2003-072100所述的噻唑衍生物的各种外消旋化合物中具有高PPARδ选择性。因此，本发明的目的是提供具有高PPARδ选择性的光学活性化合物和含有所述噻唑衍生物的光学活性化合物的药物组合物、功能化妆品组合物、保健食品用组合物和动物饲料。
技术方案 本发明涉及作为PPARδ(过氧化物酶体增殖物激活受体δ)配体的由式1表示的噻唑化合物及含有其的药物组合物、化妆品组合物、保健食品用组合物和动物饲料，所述噻唑化合物可用于治疗肥胖症、高血脂症、动脉硬化、糖尿病、痴呆症、阿尔茨海默症和帕金森症以及加强肌肉或改善记忆力。
[式1]
WO 2003-072100描述了由式C表示的噻唑化合物。但是，它仅描述了所生成的外消旋体的质谱的M++1值，该外消旋体由1H-NMR确认并充当PPARδ的选择性激活剂；它没有描述作为PPARδ的选择性激活剂的药理学效果。
式C 上述式C的化合物含有手性碳，因此存在它的立体异构体。
本发明人证实了由式1表示的R-型异构体(式C的外消旋化合物的光学活性异构体)具有对PPARδ的高选择性活性，但由式2表示的S-型异构体显示了显著降低的对PPARδ的活性。
[式2]
因此，本发明的式1的化合物被认为是WO 2003-072100的选择发明。
本发明的由式1表示的化合物可以通过下列反应式1来制备。
[反应式1]
[其中，R1是苯酚保护基，该保护基可以是C1～C4低级烷基、烯丙基、烷基甲硅烷基、烷基芳基甲硅烷基或四氢吡喃基；R2是含C1～C4烷基或烯丙基的羧酸保护基；X1是溴原子或碘原子；X2和X3独立地为氯原子、溴原子、碘原子或具有对亲核取代的反应活性的离去基团。] 下文中将对本发明的制备方法进行详细说明。然而，下列说明不能限制本发明的范围或实质。
[步骤A]由式8表示的化合物的制备 为了制备由式8表示的化合物，将式3所表示的化合物4-卤代-2-甲基苯酚用格氏试剂处理以便不用独立的分离步骤而保护苯酚基团，然后分步与有机金属试剂和硫反应，并最终与式7所表示的化合物反应。该步骤具有连续进行的4个次级反应阶段。
所述次级反应阶段将在下文中详细说明。
(步骤A-1)本步骤所用的无水溶剂选自由如乙醚、四氢呋喃、己烷和庚烷等单一溶剂以及包含至少两种上述溶剂的混合溶剂组成的组。更优选的是选择乙醚、四氢呋喃或包含乙醚和四氢呋喃的混合溶剂作为无水溶剂。
此处所用格氏试剂可以选自由甲基氯化镁、乙基氯化镁、正丙基氯化镁、异丙基氯化镁、正丁基氯化镁、仲丁基氯化镁(R2MgCl)和烷基溴化镁(R2MgBr)组成的组。在这些试剂中，最优选的是异丙基氯化镁[(CH3)2CHMgCl]。
反应温度取决于溶剂，但通常被设定在-20℃～40℃，且优选为0℃～室温(25℃)。反应时间取决于反应温度和溶剂，但通常为10分钟～60分钟且优选为10分钟～30分钟。
(步骤A-2和步骤A-3)用于卤素-锂取代的有机金属试剂可以选自由正丁基锂、仲丁基锂和叔丁基锂组成的组。在这些化合物中，最优选的是叔丁基锂。
优选具有细颗粒的硫，所述硫被直接加入溶剂中。
反应温度取决于溶剂，但通常被设定在-78℃～25℃。卤素-锂取代的反应温度优选为-75℃，而硫引入的反应温度为-75℃～室温(25℃)。卤素-锂取代反应需要10分钟～30分钟，而硫引入反应需要30分钟～90分钟。
(步骤A-4)通过已知方法(WO 03/106442)制备了在该步骤中使用的式7所表示的化合物5-卤代甲基-4-甲基-2[4-(三氟甲基)苯基]噻唑。由式7表示的化合物中的卤素选自由氯、溴和碘组成的组。并且在这些卤素中，最优选的是氯。
反应温度取决于溶剂，但通常被设定在-78℃～25℃，更优选在0℃～10℃。反应时间通常为10分钟～120分钟且优选为10分钟～60分钟。
[步骤B]由式9表示的化合物的制备 为了制备式9所表示的化合物，优选将式8所表示的化合物与通常用作苯酚保护基的化合物在碱的存在下反应。
该步骤中所用的非质子极性溶剂选自由N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿和二氯甲烷组成的组。此处的醚可以选自四氢呋喃、二氧六环、二甲氧基乙烷、二乙二醇二甲醚和三乙二醇二甲醚组成的组。芳烃的实例为苯、甲苯和二甲苯。作为此处的溶剂，优选非质子极性溶剂，且特别更优选N，N-二甲基甲酰胺、氯仿或二氯甲烷。
此处的碱是包括吡啶、三乙胺、咪唑和N，N-二甲基氨基吡啶等的胺。对于烷基或烯丙基醚化的保护基的反应，使用了如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾等碱。具体而言，更优选的是咪唑和碳酸钾。
烷基甲硅烷基卤化物或烷基芳基甲硅烷基卤化物用作甲硅烷基保护基，而3，4-二氢-2H-比喃用作四氢吡喃基保护基。
反应温度取决于溶剂，但通常被设定在10℃～80℃，更优选在0℃～室温(25℃)。反应时间取决于反应温度和溶剂，但通常需要一小时至一天。更优选的是在4小时内完成反应。
[步骤C]由式10表示的化合物的制备 为了制备式10所表示的化合物，以强碱处理式9所表示的化合物的硫醚的α-氢以得到亲核试剂，该亲核试剂可与各种亲电试剂反应。
该步骤中所用的无水试剂选自由如乙醚、四氢呋喃、己烷和庚烷等单一溶剂以及包含至少两种上述溶剂的混合溶剂组成的组。更优选的是选择乙醚、四氢呋喃或包含乙醚和四氢呋喃的混合溶剂作为无水溶剂。
用于α-氢脱去的强碱选自由叔丁氧基钾(t-BuOK)、二异丙基氨基锂(LDA)、正丁基锂、仲丁基锂和叔丁基锂组成的组，并且在这些化合物当中，最优选的是二异丙基氨基锂(LDA)。
与硫醚亲核试剂反应的亲电试剂是苄基卤化物。
反应温度取决于溶剂，但通常为-78℃～25℃。更优选的是，所述α-氢脱去反应在强碱的存在下在-75℃(在该温度下加入亲电试剂)进行。然后，将温度缓慢升高到室温(25℃)。各个反应阶段的反应时间不同。例如，通过强碱进行的α-氢脱去需要10分钟～30分钟，而与亲电试剂的反应需要30分钟～90分钟。
[步骤D]由式11表示的化合物的制备 通过从式10所表示的化合物消除苯酚保护基来得到式11所表示的化合物。
该步骤所用的极性溶剂选自由N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿和二氯甲烷组成的组。此处的醚可以选自由四氢呋喃、二氧六环、二甲氧基乙烷和二乙二醇二甲醚组成的组。醇可以为甲醇或乙醇。芳烃的实例为苯、甲苯和二甲苯。作为此处的溶剂，优选非质子极性溶剂，且特别更优选四氢呋喃。
为了消除苯酚保护基，特别是为了消除甲基、乙基、叔丁基、苄基或烯丙基醚保护基，使用了三甲基碘硅烷、乙硫醇钠盐、碘化锂、卤化铝、卤化硼或如三氟乙酸等路易斯酸，而为了消除如三甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基等甲硅烷基保护基，使用了如四丁基氟化铵(Bu4N+F-)等氟化物、氢卤酸(氢氟酸、盐酸、氢溴酸和氢碘酸)或氟化钾。优选使用氟化物来消除甲硅烷基保护基，且更优选使用四丁基氟化铵。
反应温度取决于方法和溶剂，但通常为0℃～120℃且优选为10℃～25℃。反应时间取决于反应温度，但通常需要30分钟至一天。更优选的是在2小时内完成反应。
[步骤E]由式12表示的化合物的制备 通过从式11的外消旋化合物来分离式12所表示的R-异构体和另一异构体(S-异构体)来制备所述化合物。通过使用手性正相柱的HPLC进行该分离。此时，溶剂是包含如己烷、庚烷和戊烷等非极性溶剂以及如乙醇和异丙醇等极性溶剂的混合溶剂。
[步骤F]由式13表示的化合物的制备 为了制备式13所表示的化合物，优选将式12所表示的化合物与卤化乙酸烷基酯或卤化乙酸烯丙基酯在碱的存在下反应。
所述卤化乙酸烷基酯或卤化乙酸烯丙基酯是易于获取的常规化合物。此处的卤素的实例为氯原子、溴原子和碘原子。优选使用溴乙酸甲酯、溴乙酸烯丙酯或溴乙酸乙酯作为卤素乙酸烷基酯或卤素乙酸烯丙基酯。
该步骤所用的溶剂可以为选自由N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙腈、丙酮、乙醇和甲醇组成的组中的可溶性单一溶剂，或通过将上述溶剂与1％～10％的水混合制成的混合溶剂。最优选的溶剂是通过将丙酮或二甲亚砜与1％～5％的水混合制成的混合溶剂。
该步骤所用的碱不受限制，不管是强碱或弱碱，只要该碱不会对反应产生有害影响即可，其实例为碱金属氢化物(如氢化钠和氢化锂)、碱土金属氢化物(如氢化钾)、碱金属氢氧化物(如氢氧化钠和氢氧化钾)和碱金属碳酸盐(如碳酸锂、碳酸钾、碳酸氢钾和碳酸铯)。在这些化合物当中，优选碱金属碳酸盐，且更优选碳酸钾。
反应温度不受限制，但最高仅能达到溶剂的沸点。然而，高温是不优选的，以便抑制副反应。优选的反应温度为0℃～60℃。反应时间根据反应温度而有所不同，但通常为30分钟～1天且优选为30分钟～90分钟。
[步骤G]由式1表示的化合物的制备 式1所表示的化合物通过在可溶性无机盐和醇的混合溶液中水解该化合物的羧酸酯而从式13所表示的化合物制得，或在钯催化剂的存在下从烯丙酯制得盐。
该步骤中所用的溶剂是能与水混合的可溶性溶剂，例如，如甲醇和乙醇等醇。该步骤所用的无机盐是通过将如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾等碱金属氢氧化物与水以0.1N～3N的浓度混合(考虑羧酸碱金属盐的类型)来制备的水溶液。用来获得式13所表示的羧酸形式的化合物的酸优选为乙酸水溶液或0.1N～3N盐酸水溶液。
所述反应优选在低温进行以便抑制副反应，该温度通常为0℃～室温。反应时间取决于反应温度，但通常为10分钟～3小时且更优选为30分钟～1小时。
根据反应式2通过使用四(三苯基膦)合钯催化剂和金属盐从式13所表示的化合物来进行烯丙酯盐置换来制备式1所表示的化合物的药用盐。该步骤所用的溶剂选自由氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、四氢呋喃和乙酸乙酯组成的组。该步骤所用的催化剂是四(三苯基膦)合钯。用于盐置换的盐是2-乙基己酸钾或2-乙基己酸钠。
[反应式2]
由式1表示的含硫的所得化合物是一种作为PPARδ蛋白配体的非常重要的材料。
本发明包括了式1所表示的化合物及其溶剂化物和盐，它们能有效地用作过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激活剂组合物。准确地说，本发明的由式1所表示的化合物及其药用盐能够非常有效地作为药物组合物用于治疗和预防动脉硬化或高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于治疗和预防糖尿病；用于治疗和预防肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；用于治疗和预防痴呆症或帕金森症；且所述化合物及其药用盐还能非常有效地作为保健食品补充剂用组合物、保健饮料、食品添加剂和动物饲料。本发明的式1所表示的化合物或其药用盐能用于预防和治疗肥胖症的功能化妆品组合物，还能用于加强肌肉和提高耐力的功能化妆品组合物。用作加强肌肉和提高耐力的功能化妆品组合物可以被配制为软膏剂、洗剂、霜剂或凝胶剂以便在锻炼前/后施用到身体部位上并且能长期使用以产生所需效果。本发明的式1所表示的化合物或其药用盐可以被配制为软膏剂并施用到身体部位上以预防或治疗糖尿病或糖尿病性足溃疡(即所谓的糖尿病溃疡)。
本发明还提供了过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激活剂组合物，所述PPARδ激活剂组合物含有由式1所表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
此处的药用盐包括所有能以式1的化合物的羧酸与碱金属离子或碱土金属离子(例如Li+、Na+、K+、Ca2+等)形成盐的盐。
本发明的由式1表示的化合物或其药用盐的有效剂量可以根据化合物类型、施用方法、目标对象和目标疾病来确定，但是基于常规药用标准来确定。式1所表示的化合物的优选剂量是1mg/kg(体重)/日～100mg/kg(体重)/日。施用频率可以为在允许的单日剂量内每日一次或数次。本发明的组合物可以口服施用或胃肠外施用，并且可以以一般形式的药物制剂来使用。例如，本发明的化合物能被配制为片剂、粉剂、干糖浆剂、咀嚼型片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、饮剂、舌下剂等。本发明的片剂可以通过以生物可利用性递送有效剂量的所述片剂的方法或途径(如口腔途径)来施用。并且施用方法或途径可以根据目标疾病的特征、阶段和其他状况来确定。当本发明的组合物被制成片剂时，它能再包括一种或多种药用赋形剂。所述赋形剂的含量和特征可通过所选片剂的溶解性和化学性质、施用途径和标准药物实践来确定。
可以将本发明的式1的化合物加入到保健食品补充剂或保健饮料中，用于预防和改善高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于预防和改善糖尿病；用于预防和改善肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；用于预防和改善痴呆症或帕金森症。此时，所述化合物在这些保健食品和饮料中的含量可以根据目的和应用来调节。除上述成分外，本发明的由式1表示的化合物还可以包含各种营养物、维生素、矿物质(电解质)、香料(包括天然香料和合成香料)、着色剂和补充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、用于加入碳酸饮料中的碳酸化剂等等。
具体实施例方式 如下列实施例所示对本发明的实用的、目前优选的实施方式进行了说明。
然而，可以理解的是，本领域技术人员在考虑到本公开时可以在本发明的实质和范围内进行变更和改良。
实施例1式8的化合物的制备(步骤A) 将500mg(2.14mmol)4-碘-2-甲基苯酚在氮气存在下溶解到无水四氢呋喃中，此时将温度保持在0℃。在其中缓慢加入1.1ml异丙基氯化镁(2M-乙醚溶液，2.16mmol)，接着反应10分钟。将反应溶液冷却至-78℃，在其中缓慢加入2.77ml叔丁基锂(1.7M-庚烷溶液，4.70mmol)。反应20分钟后，向其中加入69mg的S(2.14mmol)，接着继续反应直至反应物温度达到15℃。40分钟后，将624mg(2.14mmol)的式7所表示的5-氯甲基-4-甲基-2-[(4-三氟甲基)苯基]-噻唑溶解在2ml无水THF中，在同一温度下(15℃)缓慢加入到上述反应物中。继续反应一小时后，通过加入20ml氯化铵溶液终止反应。分离出有机相并在硫酸镁上干燥。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱色谱进行纯化(己烷/乙酸乙酯＝3/1，体积/体积)从而得到728mg(产率86％)目标化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.96(d，2H，J＝8.1Hz)，7.65(d，2H，J＝8.3Hz)，7.19(d，1H，J＝1.5Hz)，7.01(dd，1H，J＝8.2，2.0Hz)，6.62(d，1H，J＝8.2Hz)，5.86(brs，1H)，4.07(s，2H)，2.19(s，3H)，2.12(s，3H) 13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ163.9，155.5，151.7，137.4，136.9，133.5.131.9(q，J＝32.6Hz)，131.7，126.8，126.3，(q，J＝3.9Hz)，125.8，123.8，115.7，33.2，16.2，14.8 实施例2式9的化合物的制备(R1＝t-Bu(CH3)2Si-，步骤B) 将500mg(1.26mmol)式8的化合物和171mg(2.52mmol)咪唑完全溶解在5ml二甲基甲酰胺中。向其中缓慢加入209mg(1.38mmol)叔丁基二甲基氯硅烷，接着在室温搅拌4小时。在反应完全后，用氯化铵溶液和乙酸乙酯萃取有机溶剂。将有机相中的水分在硫酸镁上干燥。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝10/1，体积/体积)纯化从而得到610mg(产率95％)目标化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)7.97(d，2H，J＝8.1Hz)，7.65(d，2H，J＝8.2Hz)，7.19(d，1H，J＝1.9Hz)7.07(m，1H)，6.69(d，1H，J＝8.3Hz)，4.11(s，2H)，2.21(s，3H)，2.11(s，3H)，1.01(s，9H)，0.21(s，6H) 13C NMR(75.5MHz，CDCl3)δ163.2，154.7，151.5，137.1，136.6，133.3，132.4，131.7，131.2，131.0，130.2，129.2，126.6，126.1，126.06，126.01，125.9，124.9，119.4，32.8，25.9，18.5，16.9，15.0，-4.0 实施例3式10的化合物的制备(R1＝t-Bu(CH3)2Si-，步骤C) 将300mg(0.59mmol)的实施例2中制备的式9的化合物(R1＝t-Bu(CH3)2-)在氮气存在下溶解到5ml无水四氢呋喃中并将温度降至-78℃。向其中缓慢加入619μl(2.0M乙醚溶液，1.24mmol)二异丙基氨基锂，接着反应10分钟。然后，向反应溶液中加入77μl(0.65mmol)苄基溴，接着在同一温度下(-78℃)搅拌30分钟。通过加入5ml氯化铵溶液终止反应。将有机相中的水分在硫酸镁上干燥。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝10/1，体积/体积)纯化从而得到265mg(产率75％)目标化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.97(d，2H，J＝8.1Hz)，7.65(d，2H，J＝8.2Hz)，7.03-7.26(m，7H)6.63(d，1H，J＝8.3Hz)，4.51(dd，1H，J＝9.8，5.3Hz)，3.37(dd，1H，J＝9.8，5.3Hz)，3.05(dd，1H，J＝13.6，9.9Hz)，2.10(s，3H)，1.83(s，3H)，0.98(s，9H)，0.18(s，6H) 13C NMR(75MHz，CDCl3)δ163.5，155.1，151.8，138.4，137.7，136.5，133.5，130.3，129.3，128.9，127.2，126.8，126.7，126.2，126.1，124.5，119.4，49.2，44.4，26.1，18.7，17.1，15.1，-3.81，-3.84 实施例4式11的化合物的制备(步骤D) 将200mg(0.33mmol)的实施例3中制备的式10的化合物(R1＝t-Bu(CH3)2Si-)在氮气的存在下溶解到5ml无水四氢呋喃中。在室温下向其中缓慢加入660μl(0.66mmol)四丁基氟化铵的1M四氢呋喃溶液，接着搅拌1小时。在反应完全后，加入乙酸乙酯和水使有机相分离。将有机相中的水分在硫酸镁上干燥。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝5/1，体积/体积)纯化从而得到146mg(产率91％)目标化合物。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.92(d，2H，J＝8.2Hz)，7.50(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.2Hz)，7.07-7.22(m，6H)，6.85(m，1H)，6.44(d，1H，J＝8.2Hz)，4.47(dd，1H，J＝9.7，5.4Hz)，3.39(dd，1H，J＝13.8，5.4Hz)，3.06(dd，1H，J＝13.8，9.8Hz)，2.12(s，3H)，1.73(s，3H) 13C NMR(125MHz，CDCl3)δ164.1，155.7，151.2，138.0，137.9，137.0，136.4，133.8，131.8，131.5，129.0，128.6，127.2，127.0，126.6，126.14，126.11，125.7，125.0，122.9，122.7，115.2，60.8，49.1，43.7，21.2，15.9，14.3，14.2 实施例5式12的化合物的制备(步骤E) 使90mg的在实施例4中制备的式11的化合物通过半制备手性HPLC柱(Chiralpack AD-H)从而得到45mg的由式12表示的R-型目标化合物和45mg该化合物的相应的S-型异构体。
流动相己烷/异丙醇90/10 流速3ml/min 实施例6式13的化合物的制备(步骤F) 将20mg(0.04mmol)的实施例5中制备的式12的化合物与含5％水的10ml丙酮以及127mg(0.9mmol，2.3当量)碳酸钾在室温下充分混合。向其中加入67μl(0.6mmol，1.5当量)溴乙酸乙酯，接着剧烈搅拌4小时。在反应完全后，用氯化钠溶液和乙酸乙酯萃取有机溶剂，并将其在硫酸镁上干燥以除去有机层中的水分。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯＝5/1，体积/体积)纯化从而得到22mg(产率95％)的式13的目标化合物。
1H NMR(300MHz，CDCl3)7.98(d，2H，J＝8.1Hz)，7.65(d，2H，J8.3Hz)，7.06-7.27(m，7H)，6.55(d，1H，J＝8.4Hz)，4.59(s，2H)，4.53(dd，1H，J＝9.7，5.3Hz)，4.22(q，2H，J＝7.1Hz)，3.37(dd，1H，J＝13.7，5.3Hz)，3.17(m，1H)2.20(s，3H)，1.83(s，3H)，1.26(t，3H，J＝7.2Hz) 13C NMR(75MHz，CDCl3)169.1，163.6，156.9，151.8，138.3，137.4，137.3，136.4，133.4，129.3，128.9，128.6，127.2，126.8，126.3，126.2，126.1，125.1，111.8，65.9，61.7，49.1，44.4，16.5，15.1，14.5 实施例7式1的化合物的制备(步骤G) 将20mg(0.03mmol)的实施例6中制备的式13的化合物与添加有15μl的3N氢氧化钠溶液的15ml乙醇充分混合。在室温搅拌20分钟后，通过2N HCl将反应混合物的pH值调节至2.0。进行真空蒸馏以除去约80％的乙醇。用氯化钠溶液和乙酸乙酯萃取有机溶剂。过滤后，减压蒸馏除去溶剂，并将残留物通过LH-20柱色谱纯化从而得到16mg(产率98％)的式1的目标化合物。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.92(d，2H，J＝8.2Hz)，7.50(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.2Hz)，7.07-7.22(m，6H)，6.85(m，1H)，6.44(d，1H，J＝8.2Hz)，4.47(dd，1H，J＝9.7，5.4Hz)，3.39(dd，1H，J＝13.8，5.4Hz)，3.06(dd，1H，J＝13.8，9.8Hz)，2.12(s，3H)，1.73(s，3H) 13C NMR(125MHz，CDCl3)δ164.1，155.7，151.2，138.0，137.9，137.0，136.4，133.8，131.8，131.5，129.0，128.6，127.2，127.0，126.6，126.14，126.11，125.7，125.0，122.9，122.7，115.2，60.8，49.1，43.7，21.2，15.9，14.3，14.2 实验例1活性和细胞毒性试验 通过转染测试来测定了本发明的由式1表示的R-型化合物的PPARδ活性和由式2表示的S-型化合物的PPARδ活性。此外还测定了对PPAR亚型(PPARα和PPARγ)的选择性。通过MTT测试检测了细胞毒性，并通过使用小鼠的动物实验研究了体内活性和毒性。
[转染测试] 在该测试中使用CV-1细胞。将细胞接种到含DMEM并补充有10％FBS、DBS(脱脂)和1％青霉素/链霉素的96孔板上并在37℃、5％CO2的温育箱中培养。按照接种、转染、样品处理和确认的步骤进行实验。具体而言，将CV-1细胞接种到96孔板(5000细胞/孔)，接着在24小时后进行转染。使用了全长PPAR质粒DNA、根据PPAR的荧光素酶活性而确认其活性的报告DNA、提供有关转染效率的信息的β-半乳糖苷酶和转染试剂来进行转染。将式1和式2的化合物溶解到二甲亚砜(DMSO)中，将它们经由不同浓度的培养基对细胞进行处理。当细胞在温育箱中培养24小时后，使用裂解液裂解细胞。用光度计(Luminometer)和微孔板阅读器测定了荧光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。以β-半乳糖苷酶的值对所得的荧光素酶的值进行修正。以这些值绘图并计算EC50。
[表1]
如表1所示，本发明的由式1表示的化合物对PPARδ具有高选择性。本发明的式1的噻唑化合物显示出高100,000倍的对PPARα和PPARγ的选择性。式1的化合物对PPARδ的EC50为0.6nM，而式2的化合物对PPARδ的EC50为5.1nM。R-异构体(本发明的式1的化合物)显示出比S-异构体(式2的化合物)强10倍的活性。上述结果表明本发明的式1的化合物具有高选择性。
[MTT测试] 进行了MTT测试以检测本发明的化合物的细胞毒性。MTT是一种黄色水溶性物质，但当它被导入活细胞时，它被线粒体中的脱氢酶转变为紫色不溶晶体。可以通过在将MTT溶在二甲亚砜中后测定OD550来确定细胞毒性。实验如下进行。
将CV-1细胞接种到96孔板中(5000细胞/孔)。将细胞在37℃、5％CO2的温育箱中培养24小时，然后用不同浓度的式1和式2的化合物处理。然后在细胞中加入MTT试剂并将其再培养24小时。培养15分钟后，产生的紫色晶体溶解在二甲亚砜中。用微孔板阅读器测定光密度以确定细胞毒性。结果，确定了本发明的式1所表示的化合物及其光学异构体(式2的化合物)即使在100,000倍EC50值的浓度下也没有细胞毒性。
[毒性试验] 使用小鼠进行了急性毒性和生殖毒性试验以评价本发明的化合物的毒性。将式1的化合物以50mg/kg、300mg/kg和2000mg/kg的剂量对6周龄的ICR小鼠进行口服施用，接着观察毒性14天。结果，即使是用最高浓度2000mg/kg，也没有观察到由于式1的化合物的施用引起的死亡，并且也没有观察到体重和饲料进食量的显著变化。尸检结果显示没有异常体征。使用C57BL/6小鼠的生殖毒性试验结果也与上述结果一致，没有观察到由式1的化合物造成的毒性。在对怀孕的雌性小鼠口服施用所述化合物后，检查了胚胎的重量增加和生长速度。结果，没有观察到由于所述化合物的施用引起的显著差异，并且没有观察到骨发育和疾病相关事件的变化。
[动物试验] [肥胖症抑制效果] 使用小鼠进行了动物试验以确定本发明的化合物的体内效果。使用了14周龄的C57BL/6(SLC Co.)小鼠。为了诱导肥胖症，对所述小鼠喂以含35％脂肪的饲料。当喂养这种高脂肪饲料35天后，对所述小鼠口服施用载体、GW501516(10mg/kg/日)和本发明的式1的化合物(10mg/kg/日)。结果，与载体治疗组(58.9％)相比，仅仅GW501516治疗组中的26.5％和本发明的化合物治疗组中的23.1％显示出体重增加，与载体治疗组相比大约是1/2的增加。因此，确定了本发明的式1的化合物具有较强的肥胖症抑制效果，该效果大大优于GW501516。
[糖尿病改善效果] 进行了GTT(葡萄糖耐受试验)以确定本发明的化合物的糖尿病改善效果。对预先用样品口服治疗了78天的小鼠在腹腔内施用葡萄糖(1.5g/kg)。每小时测定血糖。本发明的化合物治疗组的空腹血糖低于载体或GW501516治疗组。本发明的化合物治疗组显示20分钟～40分钟内血糖快速降低并且在100分钟内血糖清空。同时，载体治疗组中即使在120分钟后血糖水平仍没有恢复到正常水平。GW501516治疗组显示出低于载体治疗组的血糖但血糖水平没有恢复到正常水平。上述结果表明本发明的式1的化合物具有优良的糖尿病改善效果。
[高血脂症改善效果] 使用6周龄的C57BL/6(SLC Co.)小鼠进行了体内动物试验以确定本发明的化合物的高血脂症改善效果。在喂以高脂肪饲料的同时，对所述动物口服施用10mg/kg/日的本发明的式1的化合物和GW501516。6周后，从眼眶静脉取血。分离血清并通过生化方法测定血液HDL水平。结果，与对照相比，GW501516治疗组中HDL水平增加了36.3％。本发明的式1的化合物治疗组中HDL水平增加了44.6％。上述结果表明本发明的式1的化合物比GW501516更有效地增加了血液HDL。
[动脉硬化抑制效果] 使用ApoE-/-小鼠(动脉硬化的动物模型)进行体内动物试验以确定本发明的化合物的动脉硬化抑制效果。在喂以高脂肪、高胆固醇饲料(20％脂肪，1.25％胆固醇；AIN-93G饮食)的同时，对所述动物口服施用2mg/kg/日的本发明的式1的化合物。28天后，使用苏丹IV(Sudan IV)在整个动脉中进行血小板染色从而通过比较实验组与对照组的结果来研究所述化合物的动脉硬化抑制效果。结果，与对照相比，在用本发明的式1的化合物治疗的ApoE-/-鼠中动脉硬化被抑制了30％。
[加强肌肉耐力和增强肌肉机能的效果] 进行了动物试验以确定本发明的化合物的加强肌肉耐力和增强肌肉机能的效果。大多数肌肉产生在发育阶段。因此，对怀孕小鼠在怀孕期或哺乳期或者怀孕期和哺乳期口服施用式1的化合物(10mg/Kg/日)。在对照组和治疗组的胎儿之间体重增加和生长速率差别不大。在除去皮肤后观察肌肉。结果，与对照组不同，治疗组的肌肉为红色。进行ATP酶染色和免疫染色。结果，在用式1的化合物治疗的组中I型肌纤维增加。通过使用踏车试验来研究了肌纤维的变化在增强肌肉耐力和肌肉机能上的效果。结果，在用式1的化合物治疗的组中奔跑时间明显延长。
[表2]肌肉耐力测试结果
当用本发明的化合物治疗成年小鼠时，肌肉耐力和肌肉机能也得到增强。具体而言，对10周龄的C57BL/6小鼠以10mg/kg的浓度口服施用式1的化合物，在此期间强制所述小鼠进行锻炼。持续30天每天一次在踏车上锻炼30分钟，准确地说，以2米/分钟的速度锻炼第一个5分钟、然后以5米/分钟锻炼5分钟、以8米/分钟锻炼5分钟并以20米/分钟锻炼最后5分钟。在结束时，通过使用踏车来检测了肌肉耐力和肌肉机能的增强效果。结果，与对照相比，在用本发明的化合物治疗的组中锻炼时间(1.5倍)和距离(1.6倍)都增加了。
[记忆力改善] 进行了动物试验从而来研究本发明的化合物基于其记忆力改善效果的对痴呆症和帕金森症的治疗效果。为了确定本发明的化合物在脑发育期的效果，对怀孕小鼠在怀孕期和哺乳期以10mg/kg的浓度口服施用所述化合物。进行了Morris水迷宫试验以检测治疗组和对照组的脑机能变化。结果，在用式1的化合物治疗的组中找到平台所花费的平均时间与对照组相比短得多；准确地说，治疗组平均花费6.8秒来找到平台，而对照组平均花费24.2秒，表明式1的化合物具有优良的记忆力改善效果。
使用脑疾病动物模型(10周龄的C57BL/6小鼠)研究了本发明的化合物基于其记忆力改善效果在痴呆症和帕金森症上的治疗效果。首先，将LPS注射到小鼠脑内以构建脑疾病动物模型。将所述小鼠按照施用和锻炼分为四组。锻炼在踏车上进行，以2米/分钟的速度进行第一个5分钟，以5米/分钟进行5分钟，以8米/分钟进行5分钟并以20米/分钟进行最后5分钟。结束时，进行Morris水迷宫试验。结果总结于表3中。结果，在脑疾病动物模型中确定了本发明的式1的化合物经由该化合物和锻炼产生的记忆力增强在痴呆症和帕金森症上的治疗效果。
[表3]水迷宫试验结果
工业实用性 作为PPARδ配体的本发明的噻唑衍生化合物具有来自在先发明的选择性意义，该噻唑衍生化合物能有效地作为药物组合物用于治疗和预防动脉硬化或高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于治疗和预防糖尿病；用于治疗和预防肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；用于治疗和预防痴呆症或帕金森症；且所述化合物还能有效地用作保健食品补充剂用组合物、保健饮料、食品添加剂、功能化妆品和动物饲料。
权利要求
1.由式1表示的噻唑化合物或其药用盐
[式1]
2.一种用于预防和治疗动脉硬化或高血脂症的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
3.一种用于增加高密度脂蛋白(HDL)水平的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
4.一种用于预防和治疗糖尿病的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
5.一种用于预防和治疗肥胖症的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
6.一种用于加强肌肉或提高耐力的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
7.一种用于改善记忆力或者用于预防和治疗痴呆症或阿尔茨海默症或帕金森症的药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
8.一种保健食品佐剂或保健饮料，所述保健食品佐剂或保健饮料含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
9.如权利要求9所述的保健食品佐剂或保健饮料，其中，所述保健食品佐剂或保健饮料用于预防和改善动脉硬化或高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于预防和改善糖尿病；用于预防和改善肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；和用于预防和改善痴呆症或阿尔茨海默症或帕金森症。
10.一种食品添加剂，所述食品添加剂含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
11.如权利要求10所述的食品添加剂，其中，所述食品添加剂用于预防和改善动脉硬化或高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于预防和改善糖尿病；用于预防和改善肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；和用于预防和改善痴呆症或阿尔茨海默症或帕金森症。
12.一种动物饲料组合物，所述动物饲料组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
13.如权利要求12所述的动物饲料组合物，其中，所述动物饲料组合物用于预防和改善动脉硬化或高血脂症；用于增加高密度脂蛋白(HDL)；用于预防和改善糖尿病；用于预防和改善肥胖症；用于加强肌肉或提高耐力；用于改善记忆力；和用于预防和改善痴呆症或阿尔茨海默症或帕金森症。
14.一种功能化妆品组合物，所述功能化妆品组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
15.如权利要求14所述的功能化妆品组合物，其中，所述功能化妆品组合物用于预防和改善肥胖症；和用于加强肌肉或提高耐力。
16.一种过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的激活剂组合物，所述激活剂组合物含有权利要求1所述的由式1表示的噻唑化合物或其药用盐作为活性成分。
全文摘要
本发明涉及作为过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的激活剂的噻唑化合物或其药用盐，以及含有该噻唑化合物或其药用盐的药物组合物、功能化妆品组合物、保健食品、保健饮料、食品添加剂和动物饲料。
文档编号A61P25/28GK101605769SQ200880001841
公开日2009年12月16日 申请日期2008年1月8日 优先权日2007年1月8日
发明者姜宪中, 高在濚, 黄厚商 申请人:财团法人首尔大学校产学协力财团